CN102827288A - 一种酸激活csp靶向抗菌肽及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成。另外，本发明提出了酸激活CSP靶向抗菌肽的制备方法及两种应用。本发明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过2，3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对氨基的保护而降低了抗菌肽melittin的毒性，当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。

Description

一种酸激活CSP靶向抗菌肽及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种多肽，具体地，涉及一种酸激活CSP靶向抗菌肽及其制备和应用。 
背景技术
龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生的慢性进行性破坏性感染性疾病                                                   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE001
。WHO将其列为仅次于心血管病、肿瘤之后的第三大非传染性重点防治疾病
Figure 42442DEST_PATH_IMAGE002
。变形链球菌(Streptococcus mutans，SM)是龋病的主要致病菌   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE002
，为革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧，抑制其生长可有效治疗龋   。 
变形链球菌以生物膜（SM biofilm）的形式存在并致龋。以生物膜形式存在的细菌与以浮游态存在的细菌相比，在代谢特点和生理现象方面存在着众多明显的不同点，如对抗菌剂的敏感性、基因表达和信号传导、耐酸性等。细菌生物膜对多数抗菌剂有较强的抵抗力，其抗性水平约为浮游态细菌的101-103倍
Figure 31761DEST_PATH_IMAGE005
。SM生物膜在红霉素和青霉素浓度为5000倍MIC作用1 h时及浓度为1000倍MIC作用3 h时，未能被完全杀死；在洗必泰浓度为500倍MIC作用1 h及浓度为100倍MIC作用3 h，也未能被完全杀死。类似地，Noiri等发现，牙龈卟啉菌单胞生物膜在160倍MIC浓度的甲硝唑中仍能生长，其耐药机制与单个细菌迥然不同   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE004
。细菌生物膜耐药性的增强与其结构特点密切相关：以生物膜形式存在的细菌，其生长速度显著低于浮游态细菌，常处于静止期，不易被常规的抗菌剂杀灭
Figure 913632DEST_PATH_IMAGE008
。而且，临床常用的抗菌剂如洗必泰、氟制剂等，还具有副作用并易导致细菌耐药、耐氟。 
抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有独特的抗菌机制、抗菌谱广、种类多、不易产生耐药性等特点。Batoni等报道，AMP主要通过膜攻击途径作用于生物膜内生长缓慢或不生长的细菌，从而抑制细菌及其生物膜的生长。此外，与传统抗生素相比，AMP还具有快速杀灭细菌的动力学特征，将更适用于动态且快速变化的微生物群落(如生物膜)    
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE005
。但AMP的广谱抗菌性也容易造成菌群失调等不良后果
Figure 44716DEST_PATH_IMAGE010
。同时，天然AMP具有生物效能低、筛选难度高、蛋白水解不稳定等缺点
Figure 799045DEST_PATH_IMAGE011
Figure 129533DEST_PATH_IMAGE012
。 
特异性靶向抗菌肽(Specifically Targeted AntiMicrobial Peptides, STAMPs) 是一种可设计并具有特异性的AMP，由靶向定位区域、AMP区域和(或)连接体区域组成。靶向定位区通过增高靶细菌表面AMP浓度，使AMP的特异性、杀伤效力和动态性能全面提升   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE006
。SM感受刺激多肽(CSP)是SM密度感应系统(quorum- sensing，QS)中的菌种间特异性信号分子   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE007
，具有介导SM进入基因感受态，影响SM的转化突变、遗传性状、粘附聚集等重要作用。Eckert等利用固相合成法将CSP与来自于羊髓的AMP novispirin G10杂合成C16G2，可特异性破坏SM生物膜而将其杀灭，但不影响人口腔中正常菌群的生长，与单独使用novispirin G10相比，其杀伤能力提高了20倍以上，但是表现出了一定的细胞毒性及溶血性   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE008
。Melittin是从蜂毒中提取发现的一类高破膜活性的抗菌肽，其对SM细菌的杀伤能力明显强于C16G2   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE009
。但是缺乏选择性以及高毒性限制了melittin的临床应用。 
由于变形链球菌是厌氧细菌，因而代谢过程中产生大量的乳酸，从而导致其生存的微环境呈酸性。此外，因而我们利用这一特点，设计了一类酸激活的CSP靶向抗菌肽：用2,3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对抗菌肽melittin中赖氨酸的侧链氨基进行保护，从而使抗菌肽失去阳离子特征而降低活性。当pH低于6.8时，DMMAn就可以从氨基上脱掉，使抗菌肽melittin恢复活性；将DMMAn保护的melittin通过二硫键与CSP靶向分子相连，以提高变形链球菌表面melittin的数量。这种新型的CSP靶向抗菌肽即可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过DMMAn对氨基的保护而降低了melittin的毒性。当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。 
细菌生物膜对多数抗菌剂有较强的抵抗力，其抗性水平约为浮游态细菌的101-103倍(唐子圣. 2006; 张耀超 2009; . 2011)。SM生物膜在红霉素和青霉素浓度为5000倍MIC作用1 h时及浓度为1000倍MIC作用3 h时，未能被完全杀死；在洗必泰浓度为500倍MIC作用1 h及浓度为100倍MIC作用3 h，也未能被完全杀死(唐子圣. 2006)。类似地，Noiri等发现，牙龈卟啉菌单胞生物膜在160倍MIC浓度的甲硝唑中仍能生长，其耐药机制与单个细菌迥然不同(Noiri. 2003)。细菌生物膜耐药性的增强与其结构特点密切相关：以生物膜形式存在的细菌，其生长速度显著低于浮游态细菌，常处于静止期，不易被常规的抗菌剂杀灭(Stewart . 2001)。而且，临床常用的抗菌剂如洗必泰、氟制剂等，还具有副作用并易导致细菌耐药、耐氟。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种酸激活CSP靶向抗菌肽， 它可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过2，3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对氨基的保护而降低了抗菌肽melittin的毒性，当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。 
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案： 
一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成。具体地，所述2，3-二甲基马来酸酐的三个分子分别与抗菌肽melittin的三个赖氨酸侧链氨基反应后连接；所述CSP靶向分子通过二硫键连接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巯基上。
本发明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽，通过以下步骤制备完成： 
（1）Psy- CSPC16的合成
a. 靶向肽CSPC16的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPC16；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. 靶向肽CSPC16中半胱氨酸侧链巯基的活化：将0.4 mmol二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将0.04 mmol Cys-MitP溶于1ml甲醇/水，其V/V为1:1~1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Pys- CSPC16； 
其反应式为：
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE010
在式中，化学式中方块内的字母为氨基酸的简写；
Figure 369387DEST_PATH_IMAGE020
代表MBHA树脂；
SPPS代表固相多肽合成；
TFA代表三氟乙酸；
TIS代表三异丙基硅烷；
代表CSPC16；
Figure 946179DEST_PATH_IMAGE022
代表二硫二吡啶；
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE012
代表中产物Pys- CSPC16，是活化后的CSP靶向分子
（2）DMMAn-melittin的合成
a. 抗菌肽melittin的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin靶向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. DMMAn-melittin的合成：将与0.04 mmol melittin溶于4ml含有100mM HEPES和125mM NaOH的水溶液中，然后10ml含有0.6 mmol 2,3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应0.5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin；
反应式如下：
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE013
其中，   
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE014
代表抗菌肽melittin；
Figure 965770DEST_PATH_IMAGE026
代表DMMAn；
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE015
代表中产物DMMAn-Melittin； 
（3）CSP靶向抗菌肽的合成
将0.02 mmol Pys- CSPC16与0.02 mmolDMMAn-melittin溶于2 ml 甲醇/水中，其V/V为1:1~1:10，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物－具有酸激活特性的CSP靶向抗菌肽化合物。
其中，反应式为： 
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE016
酸激活CSP靶向抗菌肽在制备变形链球菌抗菌剂中的应用。
酸激活CSP靶向抗菌肽在制备治疗龋病药物中的应用。 
本发明具有以下有益效果： 
用2,3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对抗菌肽melittin中赖氨酸的侧链氨基进行保护，从而使抗菌肽失去阳离子特征而降低活性。当pH低于6.8时，DMMAn就可以从氨基上脱掉，使抗菌肽melittin恢复活性；将DMMAn保护的抗菌肽melittin通过二硫键与CSP靶向分子相连，以提高变形链球菌表面抗菌肽melittin的数量。这种新型的CSP靶向抗菌肽即可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过DMMAn对氨基的保护而降低了抗菌肽melittin的毒性。当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性，可以大大降低龋病的发病率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 
图1是本发明酸激活CSP靶向抗菌肽对SM的抑菌效果示意图。
具体实施方式
产品实施例：
实施例1：
酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐（DMMAn）、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成，具有以下化学式：
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE017
具体地，所述2，3-二甲基马来酸酐的三个分子分别与抗菌肽melittin的三个赖氨酸侧链氨基反应后连接；CSP靶向分子通过二硫键连接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巯基上。
制备实施例：
实施例2
酸激活CSP靶向抗菌肽，通过以下步骤制备完成：
（1）Psy- CSPC16的合成
a. 靶向肽CSPC16的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPC16；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. 靶向肽CSPC16中半胱氨酸侧链巯基的活化：将0.4 mmol二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将0.04 mmol Cys-MitP溶于1ml甲醇/水，其V/V为1:1，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Pys- CSPC16； 
（2）DMMAn-melittin的合成
a. 抗菌肽melittin的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin靶向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. DMMAn-melittin的合成：将与0.04 mmol melittin溶于4ml含有100mM HEPES和125mM NaOH的水溶液中，然后10ml含有0.6 mmol 2,3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应0.5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin； 
（3）CSP靶向抗菌肽的合成
将0.02 mmol Pys- CSPC16与0.02 mmolDMMAn-melittin溶于2 ml 甲醇/水中，其V/V为1:1，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物－具有酸激活特性的CSP靶向抗菌肽化合物。
实施例3
与实施例2不同的是，步骤中所使用的甲醇/水的V/V均为1:5。
实施例4
与实施例2不同的是，步骤中所使用的甲醇/水的V/V均为1:10。
应用实施例：
抑菌活性和特异性测试
浮游态单一菌与混合菌的抑菌活力测试
以SM UA159，血链球菌(Streptococcus sanguis)ATCC 10556，格登链球菌(Streptococcus gordonii)ATCC 10558为作用菌，取酸激活CSP靶向抗菌肽加入供试菌菌液。放置 37℃厌氧环境中(80%N2，10%H2，10%CO2)孵育 0、5、10、15、20、25、30 min后，接入固体培养基进行培养，计数法测定单一菌的杀伤活性。两种混和菌(SM和S.sanguis，SM和S. gordonii)液体培养时，按1：1比例混和培养，在血平板固体培养后测定混合菌的杀伤活性。
结果：发现其对混合菌并无杀伤活性，而对SM SM UA159有杀灭活性，具体如图1所示，在MS培养皿上培养SM UA159，滤膜片上浸润酸激活CSP靶向抗菌肽，培养48h后，可见抑菌圈。 
酸激活CSP靶向抗菌肽的MIC测定
以SM UA159、S.sanguisATCC 10556、S. gordoniiATCC 10558为作用菌。培养基采用BHI，酸激活CSP靶向抗菌肽采用二倍稀释法依次配置工作液。经测定，微孔内液体清亮无混浊或沉淀生长的最低酸激活CSP靶向抗菌肽液浓度为其 MIC。
阴性对照：对照管中加入 PBS 溶液、105CFU/ml的菌悬液和等量的液体培养基。
空白对照：对照管中只加入105CFU/ml的菌悬液和等量的液体培养基。
其MIC为：0.5
不同单一菌生物膜的抑菌活性测试
以SM UA159，S. sanguisATCC 10556，S. gordoniiATCC 10558为作用菌，分别以终浓度0.5%(wt/vol)蔗糖和终浓度0.5%(wt/vol)甘露糖和葡萄糖，诱导其形成生物膜；用含有相应浓度酸激活CSP靶向抗菌肽的PBS，处理1 min，清洗，定时用M2型多功能读板仪在600 nm的波长下对平板进行扫描，测定其OD600。
SM UA159 OD600为：0.612；S. sanguisATCC 10556 OD600为 ：1.862 ；S. gordoniiATCC 10558 OD600为 ：3.820。 
稳定性测试
pH值稳定性测定
以SM UA159为作用菌，挑取供试菌单菌落接种于pH值不同的新鲜TH培养基，加入相应浓度的酸激活CSP靶向抗菌肽，在不同pH值环境下，以平板计数法分别测定酸激活CSP靶向抗菌肽的活性。
盐、氟耐受性测定 
以SM UA159为作用菌，分别接种于不同浓度的NaCl THYE培养基及含有10 ppm NaF的THYE培养基中，并分别加入相应浓度的酸激活CSP靶向抗菌肽，以平板计数法分别测定酸激活CSP靶向抗菌肽的活性，其盐耐受性为1.8q/l。
在人类唾液中测定其活性和稳定性 
从5-10名志愿者口腔内收集非刺激性唾液，配制含有1/5(v/v)唾液的THYE培养基，并悬浮SM UA159，稀释至107 CFU/mL，添加相应浓度的酸激活CSP靶向抗菌肽和含有或不含有1 mM EDTA，以平板计数法测定酸激活CSP靶向抗菌肽的活性。
结果：SM UA159在人唾液环境处理过酸激活CSP靶向抗菌肽的作用下，并未生长。 
本发明提出的酸激活的CSP靶向抗菌肽，用2,3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对抗菌肽melittin中赖氨酸的侧链氨基进行保护，从而使抗菌肽失去阳离子特征而降低活性。当pH低于6.8时，DMMAn就可以从氨基上脱掉，使抗菌肽melittin恢复活性；将DMMAn保护的melittin通过二硫键与CSP靶向分子相连，以提高变形链球菌表面melittin的数量。这种新型的CSP靶向抗菌肽即可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过DMMAn对氨基的保护而降低了melittin的毒性。当这种CSP靶向抗菌肽进入到蛀牙内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性，       具体原理如下反应式所示： 
Figure 2012103148143100002DEST_PATH_IMAGE018
。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成。
2.根据权1所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述2，3-二甲基马来酸酐的三个分子分别与抗菌肽melittin的三个赖氨酸侧链氨基反应后连接。
3.根据权利要求1所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述CSP靶向分子通过二硫键连接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巯基上。
4.根据权利要求1所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，通过以下步骤制备完成：
（1）Psy- CSPC16的合成
a. 靶向肽CSPC16的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPC16；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. 靶向肽CSPC16中半胱氨酸侧链巯基的活化：将0.4 mmol二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将0.04 mmol Cys-MitP溶于1ml甲醇/水，其V/V为1:1~1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Pys- CSPC16； 
（2）DMMAn-melittin的合成
a. 抗菌肽melittin的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin靶向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. DMMAn-melittin的合成：将与0.04 mmol melittin溶于4ml含有100mM HEPES和125mM NaOH的水溶液中，然后10ml含有0.6 mmol 2,3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应0.5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin； 
（3）CSP靶向抗菌肽的合成
将0.02 mmol Pys- CSPC16与0.02 mmolDMMAn-melittin溶于2 ml 甲醇/水中，其V/V为1:1~1:10，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物－具有酸激活特性的CSP靶向抗菌肽化合物。
5.权利要求1-3任一项所述酸激活CSP靶向抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）Psy- CSPC16的合成
a. 靶向肽CSPC16的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPC16；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. 靶向肽CSPC16中半胱氨酸侧链巯基的活化：将0.4 mmol二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将0.04 mmol Cys-MitP溶于1ml甲醇/水，其V/V为1:1~1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Pys- CSPC16； 
（2）DMMAn-melittin的合成
a. 抗菌肽melittin的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂上，通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin靶向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b. DMMAn-melittin的合成：将与0.04 mmol melittin溶于4ml含有100mM HEPES和125mM NaOH的水溶液中，然后10ml含有0.6 mmol 2,3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应0.5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin； 
（3）CSP靶向抗菌肽的合成
将0.02 mmol Pys- CSPC16与0.02 mmolDMMAn-melittin溶于2 ml 甲醇/水中，其V/V为1:1~1:10，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物－具有酸激活特性的CSP靶向抗菌肽化合物。
6.权利要求1-4任一项所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制备变形链球菌抗菌剂中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制备治疗龋病药物中的应用。
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