CN101511382A - 特异性靶向抗微生物肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能特异性结合微生物(例如，绿脓杆菌或突变链球菌)得到导向肽、具有抗微生物活性的抗微生物肽以及特异性/选择性靶向抗微生物肽(STAMP)。另外，本发明还提供了通过使用本发明提供的肽或组合物选择性杀伤或抑制微生物的方法。

Description

特异性靶向抗微生物肽及其应用
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年9月6日提交的美国临时申请号60/842,871的优先权，本文已纳入作为参考。
发明领域
本申请涉及抗微生物组合物及治疗领域。
发明背景
人粘膜表面所发现的固有微生物群落对于获取营养以及防止致病微生物定居来说是十分关键的。当正常菌群被各种因素破坏后，粘膜表面通常会发生微生物感染，这种感染影响着世界范围内的许多人群。粘膜表面缺乏有效的免疫反应使医生只能利用常规的抗生素或抗微生物药物来治疗粘膜感染。不幸的是，对于正常菌群来说，大多数小分子抗生素具有广谱活性，会不加区别地杀死良性微生物和致病微生物。这种效应通常会导致严重的抗生素伴随感染，因为已经空出了适于致病群落生长的生态位。难辨梭菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌是典型的机会致病菌的例子，这些致病菌能够利用抗生素治疗后出现的增大的生态位。使用广谱抗生素导致的问题以及耐药菌株的出现强化了开发新型“靶向性”抗生素药物的基本需要，这种药物能够杀伤粘膜致病菌，同时对正常微生物群落的影响又是最小的。
以前为了达到靶特异性抗微生物治疗而进行的努力包括将抗生素连接到单克隆抗体上，或构建包含杀菌域和细菌识别域的大分子融合蛋白(Qiu等，2005)。但是还没有一种方法能够达到有功能的有效治疗效果，原因是低效率的化学连接、不稳定的大蛋白或较高的制备成本。
虽然已经开发出了一种特异性靶向抗微生物肽(STAMP)G10KHc，并且证明其抗靶细菌的杀伤能力、特异性和动力学有明显提高(Eckert等，2006)，但是依然需要开发出能够特异性或选择性杀伤或抑制不良靶微生物生长的新型STAMP。
发明概述
本发明的一个方面涉及包含导向肽和抗微生物肽的选择性/特异性靶向抗微生物肽(STAMP)。STAMP还包含接头肽。
在一个实施方式中，导向肽选自：C16或CSPC16(TFFRLFNRS FTQALGK，SEQ ID NO.2)、M8或CSPM8(TFFRLFNR，SEQ ID NO 5)和肽1903(NIFEYFLE，SEQ ID NO 10)。
在另一实施方式中，接头肽选自如下一组：GGG(SEQ ID NO 17)、AAA(SEQID NO 18)、SAT(SEQ ID NO 19)、ASA(SEQ ID NO 20)、SGG(SEQ ID NO 21)、PYP(SEQ ID NO 22)、SGS(SEQ ID NO 23)、GGS(SEQ ID NO 24)、SPS(SEQ IDNO 25)、PSGSP(SEQ ID NO 26)、PSPSP(SEQ ID NO 27)、GGSGGS(SEQ ID NO28)或上述肽的任意两个(二聚物)、三个(三聚物)、四个(四聚物)、五个(五聚物)或五个以上的组合。
在另一实施方式中，抗微生物肽选自如下一组：G2(诺弗斯匹林(novispirin)G10的衍生物，KNLRRIIRKGIHIIKKY*，如SEQ ID NO 3所示)(*代表C端酰胺化)、包含氨基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQ ID NO 7)的S6L3-33和包含氨基酸序列KLFKFLRKHLL(SEQ ID NO 11)的BD2.21。
在另一实施方式中，STAMP包含导向肽和抗微生物肽，其中导向肽与抗微生物肽通过肽键共价连接，其中导向肽选自C16(SEQ ID NO 2)、M8(SEQ ID NO5)或1903(SEQ ID No 10)；以及其中抗微生物肽选自G2(SEQ ID NO 3)、S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)。
在另一实施方式中，STAMP包含通过肽键共价连接到接头肽上的导向肽和通过肽键共价连接到接头肽上的抗微生物肽，其中导向肽选自C16(SEQ ID NO2)、M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10)；其中抗微生物肽选自G2(SEQ IDNO3)、S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)；以及其中接头肽选自：GGG(SEQ ID NO 17)、AAA(SEQ ID NO 18)、SAT(SEQ ID NO 19)、ASA(SEQID NO 20)、SGG(SEQ ID NO 21)、PYP(SEQ ID NO 22)、SGS(SEQ ID NO 23)、GGS(SEQ ID NO 24)、SPS(SEQ ID NO 25)、PSGSP(SEQ ID NO 26)、PSPSP(SEQID NO 27)和GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
在另一实施方式中，STAMP选自下组：C16G2(SEQ ID NO.4)；C16-33(SEQID NO.8)；C16-BD2.21(SEQ ID NO.14)；M8G2(SEQ ID NO.15)；M8-33(SEQID NO.9)；M8-BD2.21(SEQ ID NO.6)；1903-G2(SEQ ID NO.12)；1903-33(SEQID NO.16)和1903-BD2.21(SEQ ID NO.13)。
在另一实施方式中，STAMP内的氨基酸是D-氨基酸对映异构体。
本发明的另一方面涉及包含STAMP和抗生素的STAMP组合物，其中STAMP组合物具有杀伤或抑制靶微生物生长的协同抗微生物效应。在一个实施方式中，STAMP是G10KHc(SEQ ID NO 36)。在另一个实施方式中，抗生素是妥布霉素。在一个优选实施方式中，STAMP组合物包含G10KHc(SEQ ID NO36)和妥布霉素。
本发明的另一方面涉及包含STAMP和能增强、维持或促进STAMP功能或活性的试剂的STAMP组合物。在一个实施方式中，所述试剂是蛋白酶抑制剂或rhDNA酶。在一个优选实施方式中，STAMP组合物包含G10KHc(SEQ ID NO36)和蛋白酶抑制剂和/或rhDNA酶。
本发明的另一方面涉及包含导向肽和可检测试剂的诊断试剂。在一个实施方式中，导向肽连接于偶联于可检测试剂。
本发明的另一实施方式涉及本发明的组合物(例如，STAMP或STAMP组合物)在特异性杀伤、抑制或降低机体内或生物膜上靶微生物生长或治疗靶微生物相关疾病中的用途。
附图简述
图1：C16G2抗变异链球菌的选择性杀伤活性。变异链球菌、血链球菌和格氏链球菌浮游细胞暴露于25μM STAMP C16G2或其非靶向亲本抗微生物肽G2 1分钟。检测并比较存活cfu/mL。数据代表至少3次独立试验的平均值。
图2：G2和C16G2抗单一物种生物膜的抑制活性。培养格式链球菌(S.gordonii)(A)、血链球菌(S.sanguinis)(B)和突变链球菌(S.mutans)(C)的单一培养生物膜，然后暴露于25μM STAMP或STAMP组分(如图中所示)1分钟，洗涤后用新鲜培养基继续培养。生物膜随时间的恢复情况由OD600显示。数据代表3次独立试验的平均值。
图3：C16G2抗多物种生物膜内变异链球菌的活性。变异链球菌、血链球菌和格氏链球菌的混合培养物培养后在唾液内形成生物膜，然后暴露于25μMC16G2、CSPC16或G2。洗涤后使生物膜在新鲜培养基/唾液中生长。通过测定OD600处的吸光度来监测生物膜随时间的从新生长情况，同时通过荧光素酶活性(RLU产物)来测定生物膜内变异链球菌的健康度。数据标示为RLU/OD600，代表至少3次独立试验的平均值。
图4：M8G2抗生物膜内的口腔细菌的活性。变异链球菌(A)或血链球菌(B)单一物种生物膜进行模拟处理或暴露于25μM M8G2(图中特地标明的)。去除STAMP并添加新鲜培养基后，通过测定OD600处的吸光度来监测生物膜随时间的恢复情况。数据代表3次独立试验的平均值。
图5：S6L3-33和包含S6L3-33的STAMP的生物膜抑制活性。变异链球菌(A)或血链球菌(B)的单一物种生物膜用M8-33、C16-33或S6L3-33单独处理1分钟(图中特地标明的)。去除药物并彻底洗涤后，加入新鲜培养基，通过测定OD600处的吸光度来监测生物膜在4小时内的从新生长情况。数据代表至少3次独立试验的平均值
图6：G10KHc的HPLC和MALDI谱。通过HPLC(a)和MALDI质谱(b)分析纯化的G10KHc的质量。通过监测UV 215，在HPLC中监测到了单一峰(处于10.06mL处)，说明G10KHc有正确的分子量(4267.44)。
图7：G10KHc、G10和妥布霉素的抗微生物动力学。绿脓杆菌菌株ATCC15692进行模拟处理或者用STAMP G10KHc、非靶向性的G10或妥布霉素(10μM)处理，1、5、30分钟和2小时后测定存活cfu/mL。实验在30％小鼠血清中进行，代表至少3次独立试验的平均值。
图8：抗高密度浮游绿脓杆菌的时间-杀伤实验。培养物(1×108cfu/mL)暴露于5μM G10KHc或G10，添加和不添加等摩尔的妥布霉素进行协同处理，以及单独用妥布霉素处理。24小时后，通过接种确定存活cfu/mL。数据点代表3次独立试验的平均值。
图9：G10KHc和妥布霉素抗绿脓杆菌生物膜的增强的抗微生物活性。生物膜在圆盘状反应器上生长，按照图中所示用100μg/mL的药物处理。4小时和24小时后，收获存活的细菌并接种以进行定量分析，至少进行三次独立的试验。*表示G10KHc/妥布霉素处理培养物的cfu/mL太小而无法在对数刻度上标示。
图10：亚抑制浓度的G10KHc所介导的染料摄取。(a)绿脓杆菌用培养基(左侧柱)或2μM G10KHc(右侧柱)处理5分钟，然后添加PI染料。采集同一区域的亮视野(上图)和荧光(下图)图像，分析细胞内的染料积聚情况(红色荧光)，(b)显影并以5倍系列稀释接种后定量测定未处理培养物(只加染料)和G10KHc处理培养物的cfu/mL。
图11：G10KHc和G10KHc-D在唾液中的活性和稳定性。(A)外源添加的绿脓杆菌用25μM G10KHc(含或不含PMSF)、25μM G10KHc-D处理，或不进行处理(图中特地标示的)，添加药物后4小时测定复苏的(rescued)存活cfu/mL。复苏的cfu/mL表示为3次独立实验的平均值加标准差。(B)G10KHc(含和不含PMSF，图中特地标示)添加到痰液内持续一段特定时间，通过HPLC监测肽的稳定性(毫吸光度单位，mAU)。逐渐升高的流动相线性梯度用黑色标记。(**)在滞留体积10.29mL时MALDI质谱鉴定的G10KHc。(*)收集的用于抗微生物分析的组分(表1)。
图12：rhDNA酶对G10KHc和G10KHc-D在浓缩痰液中的活性的影响。添加外源绿脓杆菌的最低限度稀释的痰液样品在用或不用rhDNA酶处理后1小时再用25μM G10KHc(含PMSF)或50μM G10KHc-D处理。定量测定恢复的细胞，标示为输入cfu/mL的百分数。数据代表至少三次独立试验的平均值加标准差。
图13：利用C16-BD2.21和1903-BD2.21杀伤单一物种突变链球菌成熟生物膜。图中显示，只需用肽处理生物膜20分钟，C16-BD2.21和1903-BD2.21就可将成熟生物膜(生长18-24小时)内33％和15％的活突变链球菌杀死。
图14：C16-BD2.21和1903-BD2.21对口腔链球菌多物种生物膜的影响。(A)显示C16-BD2.21对总cfu/mL群没有影响，1903-BD2.21可将总群落降低约30％。(B)显示用C 16-BD2.21处理后存活突变链球菌与总链球菌的比例为0.075，用1903-BD2.21处理后该比例约为0.2。
优选实施方式的详细描述
本发明的一个方面涉及选择性/特异性靶向抗微生物肽(STAMP)及其用途。
术语“选择性/特异性靶向抗微生物肽”或“STAMP”是指包含导向肽和抗微生物肽的嵌合多肽，其中导向肽以其C端或N端共价连接或偶联(例如通过肽键)到抗微生物肽上。例如，一种STAMP可包含如下两种结构中的一种：1)导向肽以其C端共价连接到抗微生物肽的N端[氨基末端-导向肽-肽键-抗微生物肽-羧基末端]，以及抗微生物肽以其C端连接到导向肽的N端[氨基末端-抗微生物肽-肽键-导向肽-羧基末端]。
在本发明的一个实施方式中，STAMP还包含接头肽，导向肽通过它共价连接或偶联到抗微生物肽上。在这种例子中，STAMP可包含如下两种结构中的一种：1)导向肽以其C端共价连接到接头肽的N端，抗微生物肽以其N端共价连接到接头肽的C端(氨基末端-导向肽-肽键-接头肽-抗微生物肽-肽键-羧基末端)，以及2)导向肽以其N端共价连接到接头肽的C端，抗微生物肽以其C端连接到接头肽的N端(氨基末端-抗微生物肽-肽键-接头肽-肽键-导向肽-羧基末端)。
按照本发明，导向肽可以是能够识别或结合靶标(例如，靶细胞、靶组织、靶微生物)的任何合适肽。优选的是，导向肽可与靶标特异性地相互作用，或者特异性地识别靶标，例如，通过细胞表面的附属物如鞭毛和菌毛，以及靶标表面暴露的蛋白、脂质和多糖。在一个实施方式中，导向肽能够特异性地识别一个或几个靶标或与其相互作用，同时基本不识别非靶标或不与其相互作用。在另一实施方式中，导向肽是能特异性结合微生物如靶微生物的肽。
在一个实施方式中，本发明提供的导向肽可通过筛选肽文库来鉴定。例如，用靶微生物或其理想抗原或表位来筛选噬菌体展示肽文库。更具体地说，噬菌体展示肽文库(例如，新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的Ph.D 7、Ph.D.12、Ph.D C7C文库)包含超过109个独特的含随机肽序列的噬菌体克隆。Ph.D.-C7C文库可展示含二硫键的7聚肽，而Ph.D.-7和Ph.D.-12文库分别包含完整的随机7聚和12聚残基。可用于该方法的M13丝状噬菌体携带随机插入片段，以其N端融合到小包被蛋白丸上。在筛选能特异性识别靶标或靶微生物的导向肽时，1010pfu/ml噬菌体文库与109导向肽的目标微生物(如细菌细胞)共孵育。离心以后通过抽吸去掉未结合的噬菌体。沉淀物包含与噬菌体结合的靶微生物，用含温和去污剂的缓冲液洗涤几次以去除松散结合的噬菌体颗粒，然后洗脱牢固结合的噬菌体颗粒。这个过程被称为淘洗。洗脱下来的噬菌体通过感染大肠杆菌F+株进行扩增。经过3-4轮的淘洗和扩增以后，得到噬菌体群，其中包含与淘洗细菌有高结合活性的克隆。随机挑选该群中的10到20个噬菌体克隆进行DNA测序，从中可以确定肽插入片段的氨基酸序列。将同一噬菌体群来源的多个克隆的氨基酸序列排列在一起，可以构建出结合/导向肽的共有序列。这个共有序列代表了一种特定微生物特异性的结合/导向肽。为了确认共有序列的结合特异性，化学合成该肽并偶联于染料(如，FITC，绿色荧光染料)上。标记的肽与微生物共孵育，然后通过荧光显微镜分析其靶微生物种特异性的结合。这种方法可确保噬菌体展示筛选出的肽与独立于M13噬菌体颗粒的游离肽具有相同的结合特异性。
本发明的导向肽还可以是基于合理设计而获得的肽。例如，人们可以根据氨基酸和微生物表面的生物化学和生理学特征设计导向肽。一般而言，带正电荷的肽可能会与细胞表面带负电荷的组分结合，反之依然。同样，疏水性肽可基于疏水性相互作用与细胞表面的疏水性口袋结合，而肽的二级或三级结构可能与微生物表面的某些结构相匹配。
通过筛选方法或设计而得到的肽可用作能特异性识别靶微生物的导向肽。这种导向肽的例子可见于美国专利申请号10/706，391(美国出版号20040137482)的描述，其中包括，例如1)能特异性结合或识别假单胞菌属的细菌，尤其是绿脓杆菌的导向肽(例如，导向肽12:1、12:2、12:3、12:4、12:5、12:6、12:7、12:8、12:9和12:10)；2)能特异性结合葡萄球菌属的细菌，尤其是金黄色葡萄球菌的导向肽(例如，导向肽SA5:1、SA5:3、SA5:4、SA5:5、SA5:6、SA5:7、SA5:8、SA5:9、SA5:10、SA2:2、SA2:4、SA2:5、SA2:6、SA2:7、SA2:8、SA2:9、SA2:10和SA2:11)；以及3)能特异性识别大肠杆菌的导向肽(例如，导向肽DH5.1、DH5.2、DH5.3、DH5.4、DH5.5、DH5.6、DH5.7、DH5.8和DH5.9)。
在本发明的一个实施方式中，能特异性结合或识别假单胞菌属的细菌，尤其是绿脓杆菌的导向肽包括，例如，cat-1(或KH)域，KKHRKHRKHRKH(SEQID NO 31)。能特异性结合或识别葡萄球菌属细菌的导向肽包括，例如，细菌信息素如CSP(SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK，SEQ ID NO 1)、CSP1(EMRLSKFFRDFILQRKK，SEQ ID NO 29)和CSP2(EMRISRIILDFLFLRKK，SEQ ID NO 30)及其片段。另外，能特异性结合或识别肺炎链球菌的导向肽包括，例如，CSP1和CSP2。能特异性结合或识别突变链球菌的导向肽包括，例如，CSP、C16或CSPC16(TFFRLFNRSFTQALGK，SEQ ID NO 2)、M8或CSPM8(TFFRLFNR，SEQ ID NO 5)和肽1903(NIFEYFLE，SEQ ID NO 10)。
本发明提供的导向肽可以是天然的或非天然的肽。例如，本发明提供的导向肽可以是重组制备的、化学合成的或天然存在的肽。在一个实施方式中，导向肽包含天然存在的氨基酸序列(例如，CSP、CSP1和CSP2)。在另一实施方式中，导向肽包含组成天然多肽内部部分的氨基酸序列(例如，本发明的C16和M8)。在另一实施方式中，导向肽包含天然存在于基因组中的序列所编码的氨基酸序列，这种氨基酸序列不与其天然邻近的任何氨基酸序列相邻，例如，这种氨基酸序列与导向肽中的异源序列相邻。
本发明提供的导向肽还包括含有本发明特别阐释的靶向氨基酸序列来源的或修饰的氨基酸序列的肽，只要这种衍生的或修饰的序列还保留与其靶微生物的特异性，或者特异性更高。例如，可通过缺失、突变、添加氨基酸或其他结构体，或者任何其他结构改变来对靶向氨基酸序列进行结构修饰，只要这种改变不会改变靶向氨基酸序列与其靶微生物的结合能力或对其结合能力产生副作用就可以。
本发明的导向肽可通过不同的分子间相互作用如离子相互作用、范德华力、配基-受体相互作用或疏水性相互作用与靶微生物特异性相互作用或结合(例如，通过微生物的外表面)。例如，本发明的导向肽还可以是能特异性识别靶微生物的肽配基、受体或其片段。在一个实施例中，本发明的导向肽可以是突变链球菌的葡聚糖结合蛋白，该结合蛋白可特异性结合突变链球菌表面的不溶性葡聚糖。在另一实施例中，导向肽可以是细菌信息素或其片段。
本发明的导向肽包含约4-40、5-30、6-20个氨基酸。在一个优选实施方式中，导向肽的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。
应当注意的是，导向肽包括能特异性结合靶细胞或靶组织(例如，植物细胞、动物细胞或真菌)的导向肽。这些导向肽的例子包括壳多糖酶、外源凝集素及其靶向片段。
本发明的导向肽可利用本领域技术人员熟知的任何方法单独制备，或者组合接头肽和抗微生物肽制备。例如，导向肽可利用合成仪化学合成，或者利用表达系统重组制备，例如，细菌、酵母或真核细胞表达系统。在化学合成方法中，导向肽可利用L-氨基酸对映异构体或D-氨基酸对映异构体制备。实验证实，包含D-对映异构体的导向肽稳定性升高，同时导向肽的活性并没有降低。
本发明的接头肽是可用于将导向肽连接到抗微生物肽上但是不会影响或降低导向肽或抗微生物肽的活性的肽。接头肽约含2到20个氨基酸，或者3到12个氨基酸。接头肽的例子包括，例如，GGG(SEQ ID NO 17)、AAA(SEQ IDNO 18)、SAT(SEQ ID NO 19)、ASA(SEQ ID NO 20)、SGG(SEQ ID NO 21)、PYP(SEQ ID NO 22)、SGS(SEQ ID NO 23)、GGS(SEQ ID NO 24)、SPS(SEQ IDNO 25)、PSGSP(SEQ ID NO 26)、PSPSP(SEQ ID NO 27)或所列接头肽的任何两个(二聚体)、三个(三聚体)、四个(四聚体)、五个(五聚体)或5个以上的组合(多聚体)。在一个实施方式中，接头肽是GGG(SEQ ID NO 17)。在另一实施方式中，接头肽是(SEQ ID NO 24)二聚体，是GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
本发明的接头肽可利用本领域技术人员熟知的任何方法单独制备，或者组合导向肽和抗微生物肽制备。例如，接头肽可利用合成仪化学合成，或者利用表达系统重组制备，例如，细菌、酵母或真核细胞表达系统。在化学合成方法中，接头肽可利用L-氨基酸对映异构体或D-氨基酸对映异构体制备。实验证实，包含D-对映异构体的肽稳定性升高，同时肽的活性并没有降低。
本发明的抗微生物肽是能够杀伤微生物或抑制其生长的肽。本发明的抗微生物肽的抗微生物活性包括而不限于抗菌、抗病毒或抗真菌活性。抗微生物肽包括各类肽，例如，从植物以及动物中分离的肽。在动物中，抗微生物肽通常通过各种细胞表达，其中包括中性粒细胞和上皮细胞。在哺乳动物中，其中包括人，抗微生物肽通常见于舌、气管和上部肠的表面。天然抗微生物肽一般是短于100个氨基酸的双亲性分子。这些肽中许多肽都是带正电荷的(即，阳离子的)，多数情况下形成双螺旋结构。
在一个实施方式中，本发明的抗微生物肽包含约2到100个氨基酸、约5到50个氨基酸、或者约7到20个氨基酸。在一个优选实施方式中，导向肽的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。
在另一实施方式中，抗微生物肽的抗微生物活性为最低抑菌浓度(MIC)不超过约40μM、不超过约30μM、不超过约20μM、或不超过约10μM。
在另一实施方式中，抗微生物肽包括表7所列的那些(SEQ ID Nos 34-35和54-97)。在另一实施方式中，抗微生物肽包含一种或多种抗微生物肽，其中包括而不限于阿莱克西霉素(alexomycin)、安德罗平(andropin)、阿皮德新(apidaecin)、大肠杆菌素、β-折叠大肠杆菌素、贝可替新(bactenecin)、布弗林(buforin)、卡斯力克丁(cathelicidin)、α-螺旋可莱弗宁(α-helical clavanin)、天蚕抗菌肽、十二肽(dodecapeptide)、防卫素、β-防卫素、α-防卫素、杰古林(gaegurin)、组肽、吲哚素(ndolicidin)、滑爪蟾素、蜂毒素、乳酸链球菌肽、诺弗斯匹林G10、内源性抗微生物多肽、瑞莱新(ranalexin)、中国鲎肽、以及上述物质的衍生物。
在这些已知的抗微生物肽中，已知中国鲎肽具有抗真菌和抗细菌活性。安德罗平、阿皮德新、贝可替新(bactencin)、可莱弗宁、十二肽(dodecappeptide)、防卫素和吲哚素(indolicidin)是具有抗菌活性的抗微生物肽。布弗林、乳酸链球菌肽和天蚕抗菌肽已被证明对大肠杆菌、痢疾志贺菌(Shigella disenteriae)、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有抗微生物活性。滑爪蟾素和瑞莱新已被证明对上面相同的微生物有抗微生物活性，另外还对白色念珠菌、新型隐球菌克鲁氏念珠菌和幽门螺旋菌有这种效应。滑爪蟾素也被证明对单纯疱疹病毒有抗微生物效应。阿莱克西霉素已被证明对空肠弯曲杆菌、粘膜炎莫拉菌和流感嗜血杆菌有抗微生物效应，而防卫素和β-折叠防卫素已被证明对肺炎链球菌有抗微生物效应。组肽及其衍生物是另一类抗微生物肽，具有抗包括突变链球菌在内的各种微生物的抗真菌和抗细菌活性(MacKay，B.J.等，Infect.Immun.44：695-701(1984)；Xu等，J.Dent.Res.69：239(1990))。
在一个实施方式中，本发明抗微生物肽包含一个或多个来源于富组蛋白类及其衍生物的抗微生物肽。例如，本发明的抗微生物肽包含富组蛋白的一个或多个衍生物，其中包括而不限于包含氨基酸序列DSHAKRHHGYKRKFHEKHHS HRGY(SEQ ID NO 32)的富组蛋白5或包含氨基酸序列KRLFKELKFS LRKY(SEQ ID NO 33)的dhvar-1。
在另一实施方式中，本发明抗微生物肽包含一类内源性抗微生物多肽及其衍生物来源的一个或多个抗微生物肽。例如，本发明的抗微生物肽包含具有氨基酸序列RGGRLCYCRRRFCVCVGR(SEQ ID NO 33-34)的内源性抗微生物多肽PG-1。内源性抗微生物多肽已被证明对突变链球菌、淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体和流感嗜血杆菌有抗微生物效应。内源性抗微生物多肽可见于美国专利Nos.5,693,486、5,708,145、5,804,558、5,994,306和6,159,936的描述，本文都已纳入作为参考。
在另一实施方式中，本发明的抗微生物肽包含用于治疗生龋齿微生物如突变链球菌或绿脓杆菌的一类诺弗斯匹林及其衍生物来源的一个或多个抗微生物多肽。例如，本发明的抗微生物多肽包括具有氨基酸序列KNLRRJIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO 35)的诺弗斯匹林G10和G2(诺弗斯匹林G10的衍生物)，G2含有一个C端氨基酸缺失、一个G10来源的内部缺失和含有氨基酸序列KNLRIIRKGIHIIKKY*(SEQ ID NO 3)的酰胺化的C末端(*代表C端酰胺化)。
在另一实施方式中，本发明的抗微生物肽包含经过合理设计并通过检测证明具有抗微生物(例如，突变链球菌)活性的肽。这些肽的例子包括而不限于含有氨基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQ ID NO 7)的S6L3-33和含有氨基酸序列KLFKFLRKHLL(SEQ ID NO 11)的BD2.21。
本发明的抗微生物肽可利用本领域技术人员熟知的任何方法单独制备，或者组合导向肽和接头肽制备。例如，抗微生物肽可利用合成仪化学合成，或者利用表达系统重组制备，例如，细菌、酵母或真核细胞表达系统。在化学合成方法中，抗微生物肽可利用L-氨基酸对映异构体或D-氨基酸对映异构体制备。
在另一实施方式中，STAMP包含导向肽和抗微生物肽，其中导向肽与抗微生物肽通过肽键共价连接，其中导向肽选自C16(SEQ ID NO 2)、M8(SEQ ID NO5)或1903(SEQ ID No 10)；以及其中抗微生物肽选自G2(SEQ ID NO 3)、S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)。
在另一实施方式中，STAMP包含通过肽键共价连接到接头肽上的导向肽和通过肽键共价连接到接头肽上的抗微生物肽，其中导向肽选自C16(SEQ ID NO2)、M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10)；其中抗微生物肽选自G2(SEQ IDNO 3)、S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)；以及其中接头肽选自：GGG(SEQ ID NO 17)、AAA(SEQ ID NO 18)、SAT(SEQ ID NO 19)、ASA(SEQID NO 20)、SGG(SEQ ID NO 21)、PYP(SEQ ID NO 22)、SGS(SEQ ID NO 23)、GGS(SEQ ID NO 24)、SPS(SEQ ID NO 25)、PSGSP(SEQ ID NO 26)、PSPSP(SEQID NO 27)和GGSGGS(SEQ ID NO 28)。这种STAMP的例子包括而不限于表1所列的STAMP：C16G2(SEQ ID NO 4)；C16-33(SEQ ID NO 8)；C16-BD2.21(SEQID NO 14)；M8G2(SEQ ID NO 6)；M8-33(SEQ ID NO 9)；M8-BD2.21(SEQ IDNO 15)；1903-G2(SEQ ID NO 12)；1903-33(SEQ ID NO 16)；和1903-BD2.21(SEQ ID NO 13)。
本发明的另一方面涉及包含一组STAMP的组合物，其中组合物包含第一STAMP和第二STAMP，其中第一STAMP不同于第二STAMP。在一个实施方式中，第一STAMP包含通过肽键共价连接到第一抗微生物肽上的第一导向肽。第二STAMP包含通过肽键共价连接到第二抗微生物肽上的第二导向肽。第一STAMP和第二STAMP之间是有区别的，因此两个STAMP至少有一个相应基序是彼此不同的。例如，在一个实施方式中，第一导向肽与第二导向肽不同，或者第一抗微生物肽与第二抗微生物肽不同。在另一实施方式中，第一导向肽与第二导向肽不同，以及第一抗微生物肽与第二抗微生物肽不同。
在另一实施方式中，第一STAMP包含通过肽键共价连接到第一接头肽上的第一导向肽和通过肽键共价连接到第一接头肽上的第一抗微生物肽。第二STAMP包含通过肽键共价连接到第二接头肽上的第二导向肽和通过肽键共价连接到第二接头肽上的第二抗微生物肽。第一STAMP和第二STAMP之间是有区别的，因此两个STAMP至少有一个相应基序是彼此不同的。例如，在一个实施方式中，第一导向肽与第二导向肽是不同的(第一接头肽与第二接头肽相同，第一抗微生物肽与第二抗微生物相同)；或者第一接头肽与第二接头肽是不同的；或者第一抗微生物肽与第二抗微生物肽是不同的。在另一实施方式中，第一导向肽与第二导向肽是相同的(第一接头肽与第二接头肽是不同的，第一抗微生物肽与第二抗微生物是不同的)；或者第一接头肽与第二接头肽是相同的；或者第一抗微生物肽与第二抗微生物肽是相同的。在另一实施方式中，第一导向肽与第二导向肽是不同的，第一接头肽与第二接头肽是不同的；以及第一抗微生物肽与第二抗微生物肽是不同的。
本发明的STAMP可利用本领域技术人员熟知的任何方法制备。在一个实施方式中，编码STAMP的核苷酸序列可通过DNA合成仪合成，或者编码导向肽的核苷酸序列可以被直接连接到编码抗微生物肽基序的核苷酸序列上，或者通过编码接头肽的核苷酸序列连接到编码抗微生物肽基序的核苷酸序列上。核苷酸可在合适的表达系统中表达，例如，商业化的细菌、酵母或真核细胞表达系统。在化学合成方法中，STAMP可利用L-氨基酸对映异构体或D-氨基酸对映异构体制备。实验证实，包含D-对映异构体的STAMP稳定性升高，同时STAMP的活性并没有降低。
本发明的另一方面涉及包含STAMP和抗生素的STAMP组合物。当STAMP与杀伤或抑制靶微生物生长的抗生素共同给药时意外地观察到具有协同抗微生物效应。适于和STAMP共同给药的抗生素包括能抑制微生物生长或杀伤微生物的合成的或天然的物质。这种抗生素的例子包括而不限于β-内酰胺类抗生素(例如，氨苄青霉素、阿洛西林(aziocillin)、氨曲南、羧苄青霉素、头孢哌酮、头孢三嗪、头孢噻啶、头孢菌素、邻氯青霉素、羟羧氧酰胺菌素、青霉素、哌拉西林和替卡西林)、阿莫西林、杆菌肽、氯霉素、克林霉素、卷曲霉素、粘菌素M、环丙沙星、强力霉素、红霉素、夫西地酸、磷霉素、夫西地酸钠、短杆菌肽、庆大霉素、林可霉素、米诺环素、大环内酯类、单酰胺菌素、萘啶酸、新生霉素、氧氟沙星(ofloxcin)、利福霉素、四环素、万古霉素、妥布霉素和甲氧苄氨嘧啶。在一个实施例中，STAMP组合物包含G10KHc STAMP(SEQ IDNO 36)和妥布霉素，对生物膜和浮游培养物中的绿脓杆菌的抗微生物活性有协同增强效应。
本发明的另一方面涉及包含STAMP和能增强、维持或促进STAMP的功能或活性的试剂的STAMP组合物。在一个实施方式中，化学物质是蛋白酶抑制剂。STAMP组合物暴露于存在蛋白酶的环境中，其中蛋白酶的存在可降低STAMP的活性，例如，通过酶催化降解。蛋白酶抑制剂和STAMP的组合可稳定STAMP，防止其被蛋白酶降解，因而能增强STAMP的活性。存在蛋白酶的环境包括，例如，体液(例如，尿液、血液、血清、唾液、痰、粘液)。蛋白酶包括，例如，中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白水解酶-3、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或来源于细胞和/或宿主的其他蛋白酶。蛋白酶抑制剂的例子包括，例如，BMF、EDTA、PMFS、苄眯、和/或重组α-1抗胰蛋白酶(rAAT)。
在另一个实施方式中，所述试剂是rhDNA酶。STAMP组合物的一个例子是STAMP(G10KHc(SEQ ID NO 36)和DNA酶的组合。组合物可用于抑制痰中的绿脓杆菌，可增强G10KHc的抗微生物活性，因为DNA酶可降低痰的粘滞度，促进STAMP的扩散。
本发明的另一方面涉及包含STAMP和合适药物载体的药物组合物。术语“药学上可接受的”用于本文中是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体充填剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包裹材料，参与携带STAMP或将STAMP从一个部位、体液、组织、气管或身体的一部分转移到另一个部位、体液、组织、气管或身体的一部分。每一种载体都必须是“药学上可接受的”，即，与制剂中的其他组分如STAMP相容，并且适用于与人和动物的组织或器官接触，不会产生过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，具有合理的获益/风险比。可用作药学上可接受的载体的材料的例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；以及(21)其他用于药物制剂中的无毒相容物质。
本发明的另一方面涉及包含导向肽和可检测试剂的诊断试剂。本发明的诊断试剂可用于诊断试验，例如，用于检测靶微生物易于存在的部位(例如，组织、器官、体液、痰液、身体或器官表面、粘膜表面、植入物、生物膜、或血清、装置、空气、液体、细胞培养物、工业品或装置的表面)是否存在靶标或靶微生物或者其存在的量，或者用于检测靶微生物相关的疾病(例如，感染或疾病)的起始、发展或缓解。
在一个实施方式中，导向肽通常用可检测试剂标记或偶联到可检测试剂上。很多可检测试剂都可以使用，这些试剂通常可分为以下几类：
(a)放射性同位素，如35S、14C、13C、15N、125I、3H和131I。利用本领域熟知的技术可用放射性同位素标记肽，利用液闪计数可测定放射活性；另外，肽可进行自旋标记，用于碳和氮标记的电子顺磁共振。
(b)荧光剂，如BODIPY、BODIPY类似物、稀土金属螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、FITC、5，6羧基荧光素、若丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白和得克萨斯红。荧光强度可利用荧光计定量检测。
(c)各种酶-底物试剂，例如，荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、虫荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳酸过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的例子包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶可氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为发色底物的对硝基苯基磷酸；以及(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-GaI)和生色底物(例如p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或发荧光底物A-甲基伞基(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶。
在另一实施方式中，可检测试剂无需偶联于导向肽，但是能够识别导向肽的存在，并且试剂是可以被检测的。例如，可检测试剂是可与导向肽特异性结合的抗体。然后通过本领域熟知的各种方法检测抗体(参见，Harlow和Lane，《抗体—实验室操作手册》(Antibodies-A Laboratory Manual)(1988))。
在另一实施方式中，本发明的诊断剂可以试剂盒的方式提供，即，预定量的试剂和操作诊断试验的说明书的包装组合。如果导向肽用酶标记，那么试剂盒应该包含酶需要的底物和辅助试剂(例如，提供可检测发色基团或荧光基团的底物前体)。另外，试剂盒还可以包含其他附属物，如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量的变化范围很大，只要试剂溶液中的浓度可以使试验的敏感性达到最佳即可。更具体地说，试剂可以干粉的形式提供，通常是冷冻干燥的，其中包括溶解后可使试剂溶液达到合适浓度的赋形剂。
根据本发明的另一方面，本发明的组合物(例如，STAMP或STAMP组合物)可用于杀伤、抑制或降低靶微生物的生长，其中导向肽可与靶微生物特异性结合。
在一个实施方式中，本发明的组合物可提供对靶微生物的抗微生物效应，并且可用于治疗靶微生物相关的疾病或感染。抗微生物效应包括抑制靶微生物的生长、杀伤靶微生物或干扰靶微生物的任何生物学功能。一般而言，本发明的组合物可用于治疗宿主体内任何部位的疾病或感染，例如，任何组织内的，其中包括任何组织或植入物的表面。在一个实施方式中，组合物可用于特异性地杀伤或抑制体液(例如，血液、痰液)内的浮游靶微生物。在一个实施方式中，本发明的组合物可用于治疗粘膜表面或包含生物膜的表面上疾病或感染。
术语“生物膜”是指积聚在一起的微生物产生细胞外多糖和蛋白物质，这些物质作为天然胶固定或包埋微生物。生物膜可形成在固体生物或非生物表面。生物膜基本由非毒性非致病性的共生微生物组成，是维持健康的正常微生物菌群以防止其他致病性微生物侵入和建立如酵母感染所必须的。但是，如果生物膜内的微生物群落被过密的致病微生物(例如，生龋齿微生物如突变链球菌)破坏，就会导致生物膜相关的微生物感染。生物膜相关的微生物感染的例子包括口腔软组织、牙齿和牙科植入物；中耳；胃肠道；泌尿生殖道；气管/肺组织；眼；尿道假体；腹膜和腹膜透析导管，血液透析留置导管和化疗药物慢性给药所需的留置导管(Hickman导管)；心脏植入物如起搏器、人工瓣膜、心室辅助装置和合成的人造血管和支架；假体、骨内固定装置和经皮缝合线；以及气管和通风换气管道的感染。内置的和皮下的生物医学植入物或装置是微生物或生物膜感染的潜在位点，是控制感染、炎症和免疫反应的重要靶位。生物医学系统如血液充氧器、气管灌洗机、牙科水单位和透析机也易于被细菌污染和形成生物膜。
在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于破坏含病原体的生物膜的平衡(例如，包含过密致病微生物的生物膜)，这样不良的致病微生物(靶微生物)就可以被选择性地杀伤、抑制或减少，良性的非致病微生物群(非靶微生物)受到的影响很小。组合物可用于动物和人体内的许多部位，这些部位具有粘膜表面，可被多物种微生物膜定居。这些部位的例子包括口腔、阴道、胃肠道(GI)、食道、呼吸道、植入物。例如，在人口腔内通常存在许多不同的微生物，其中包括酵母和细菌。大多数细菌是无毒的共生菌。给予本发明的组合物能够特异性地靶向到，例如，生龋齿微生物(例如，突变链球菌)，对非靶微生物的影响很小，因此不会对非靶微生物产生不良的效应。
本发明的组合物还可用于抑制人体外的靶微生物或应用到人体外的各种生物膜表面，例如，工业品或设备。例如，在食品加工工业中，本发明的组合物可用于食品加工设备或食品本身上以防止食品消耗相关的感染，例如，家禽加工设备内的沙门氏菌。
本发明的靶微生物可以是任何细菌、立克次体、真菌、酵母、原虫或诸虫。在一个实施方式中，靶微生物是生龋齿微生物如突变链球菌。在另一实施方式中，本发明的靶微生物包括而不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、念珠菌(Candida)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)和假单胞菌(Pseudomonas)，特别是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌(Candida albicans)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、流感嗜血杆菌(Haempohilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylor)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeroginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺菌(Shigella disenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
例如，突变链球菌感染通常见于口腔，可导致龋齿。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、各种放线菌属的细菌、螺旋菌和黑色色素拟杆菌属的细菌通常与龋齿及周围结缔组织的感染有关，可导致牙周病。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或粘膜炎莫拉菌感染常见于急性中耳炎(AOM)和渗出性中耳炎(OME)，这是幼儿上呼吸道感染的并发症。
幽门螺旋杆菌(H.pylori)可见于胃粘膜层或粘附到胃的粘膜上皮上，90％以上的十二指肠溃疡和80％以上的胃溃疡都是由幽门螺旋杆菌引起的。其他胃肠道感染包括而不限于弯曲杆菌感染、主要由空肠弯曲杆菌引起的腹泻、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)血清群引起的霍乱、沙门氏菌如鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)引起的沙门氏菌感染、志贺氏菌如痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)引起的志贺氏菌痢以及肠毒性大肠杆菌(ETEC)引起的旅行者腹泻。艰难梭状芽孢杆菌也常见于胃肠道或食道。
研究证明，假单胞菌通常与同源医院内爆发有关；另外，假单胞菌也被认为是引起麻醉药成瘾者菌血症、心内膜炎和骨髓炎的原因。假单胞菌感染也会发生于患者的耳、肺、皮肤或尿道，一般发生在原始病原体被抗生素清除后。严重感染几乎无一例外地与局部组织损伤或宿主抵抗力下降相关。囊性纤维化和中性粒细胞减少症患者特别容易发生严重的绿脓杆菌(P.aeruginosa)感染。早产儿；先天异常儿童和白血球过多症患者；烧伤病人；以及老年消耗性疾病患者可能会发生假单胞菌感染。该微生物在尿容器和导管以及医院工作人员的手上流行。
葡萄球菌是定居于大多数人类皮肤上的耐寒(hardy)革兰氏阳性细菌，其中金黄色葡萄球菌是最重要的人病原体。如果皮肤或粘膜被手术或创伤破坏，葡萄球菌可能会接近皮下的组织并在其中增殖，形成典型的局部浅脓肿。虽然这些皮肤感染在大多数情况下不会造成损伤，但是繁殖的微生物可能会侵入淋巴系统和血液，导致葡萄球菌的潜在严重并发症。
这些并发症包括脓毒性休克和严重的转移感染，其中包括几乎所有器官内的心内膜炎、关节炎、骨髓炎、肺炎和脓肿。金黄色葡萄球菌的某些菌株可产生引起皮疹或介导多系统机能障碍的毒素，如中毒性休克综合征。凝固酶阴性葡萄球菌，特别是表皮葡萄球菌是重要的医院致病原，特别容易感染脉管导管和假体装置。腐生葡萄球菌是尿道感染的常见原因。
酵母或念珠菌感染(念珠菌病)通常发生在口腔(口咽念珠菌(OropharyngealCandida)或OPC)或阴道(外阴阴道念珠菌(Vulvovaginal Candida)或VVC)。念珠菌病由皮肤和粘膜表面已经存在的念珠菌菌株(最常见的是白色念珠菌)转移到局部环境如口腔和阴道进行不受抑制的繁殖而引起的。淋病衣原体、梅毒和滴虫病是生殖道内的感染，可引起性传播疾病，例如，盆腔炎。
本发明组合物的给药。STAMP或STAMP组合物可通过本领域熟知的任何给药途径给予患者，其中包括而不限于口服、肠内给药、含服、鼻内给药、局部给药、直肠内给药、阴道给药、气溶胶、透粘膜给药、表皮给药、经皮给药、眼部给药、肺内给药、和/或胃肠外途径给药。胃肠外途径给药是指一般与注射有关的给药途径，其中包括而不限于静脉注射、肌肉注射、动脉内注射、鞘内注射、囊内注射、眼眶内注射、心内注射、真皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节内注射、被膜下注射、蛛网膜下注射、椎管内注射和/或胸骨内注射和/或输注
STAMP或STAMP组合物可以适应不同给药途径的制剂形式给予患者。用于本发明的方法中的制剂包括一种或多种STAMP、一种或多种药学上可接受的载体以及任选其他治疗性组分。制剂可以单位剂量的形式存在，可通过药学领域熟知的任何方法制备。可与制备单个剂型的载体材料组合使用的活性组分的量可根据被治疗的患者以及特定给药模式而变化。可与形成药学有效量的载体材料组合使用的STAMP的量通常是可产生疗效的STAMP的量。一般而言，这个量的范围可以是STAMP占约1％到约99％，优选约5％到约70％。
制备这些制剂或组合物的方法包括使STAMP和一种或多种药学上可接受的载体以及任选一种或多种辅助成分混合的步骤。一般而言，制剂通过STAMP与液体载体或精细的固体载体立即均匀混合而制备，然后如果需要使产品成型。
适于口服的制剂可以是胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用有香味的基底，通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、粉末、颗粒的形式，或者用水性或非水液体制成的溶液或悬液，或者水包油或油包水液体乳剂，或者酏剂或糖浆，或者锭剂(使用惰性基底，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或口腔洗剂等，每种剂型都含有预定量的STAMP作为活性成分。化合物可以丸剂、药糖剂或糊剂的形式给药。例如，在一个实施方式中，本发明的化合物可用于治疗或预防生龋齿微生物感染，如与龋齿相关的突变链球菌感染，可作为食品添加剂或直接接触口腔环境的任何产品的形式制备，特别是易于生龋齿的口腔环境。为了治疗或预防龋齿，本发明的一种或多种组合物可以制备成儿童制剂、漱口剂、锭剂、凝胶、涂剂、牙膏、牙签、牙刷或其他洁齿装置、局部转移装置如缓释聚合物或微囊、通过机械方式转移的各种口腔洗液，或者口腔灌洗剂、假乳头，以及任何食品，其中包括而不限于口香糖、糖果、饮料、面包、饼干和牛奶。
在口服固体制剂(例如，胶囊、片剂、丸剂、锭剂、粉末、颗粒等)中，STAMP与一种或多种药学上可接受的载体如枸橼酸钠或磷酸二钙和/或下列任何物质混合：充填剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵类化合物；(7)湿润剂，如乙醇和单硬脂酸甘油；(8)吸收剂，如高岭土和粘土；(9)润滑剂，如硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的例子中，药物组合物还可以包含缓冲剂。相同类型的固体组合物还可以用作软胶囊和硬胶囊的填充物，使用赋形剂如乳糖或奶糖，以及高分子聚乙二醇等。
片剂可通过压缩或塑型制备，任选添加一种或多种辅料。压缩片剂可利用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。塑型片剂可通过在合适的机器内塑型粉末肽或惰性液体稀释剂湿润的肽模拟物(peptidomimetic)混合物而制备。可选的是，片剂和其他固体制剂如锭剂、胶囊、丸剂和颗粒可以用包被和外壳压痕或制备，如肠衣和药剂学领域熟知的其他包被。它们还可以制成能缓释或控释STAMP的制剂，例如，利用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供理想的释放模式、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可通过，例如，除菌滤膜过滤除菌，或者通过加入固体组合物形式的能在使用前立即溶于无菌水或某些其他可注射介质的灭菌剂来除菌。可选的是，这些组合物还可以包含乳浊剂(pacifying agent)，可以是只释放STAMP的组合物，或者优选在胃肠道的某些部位以延迟的方式释放。包埋组合物的例子包含聚合物和蜡。STAMP还可以是微囊形式，如果合适，用上述一种或多种赋形剂制备。
用于口服的液体制剂包括药用乳剂、微乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂。除了STAMP之外，液体制剂还可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、炭酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及上述物质的混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、香料、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
除了STAMP之外，悬液还可以包含悬浮剂，例如，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨坦酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、粘土、琼脂和西黄蓍胶，以及上述物质的混合物。
用于直肠或阴道给药的制剂可以是栓剂，这种剂型可通过一种或多种STAMP与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯混合而制成，这种制剂在室温下是固体的，但是在体温下是液体的，因而会在直肠或阴道腔内溶解而释放活性剂。适于阴道给药的制剂还包括阴道栓剂、塞子、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷剂，其中含有本领域熟知的合适载体。
用于局部给药或者经皮或表皮给药的STAMP组合物的剂型包括粉末喷雾剂、软膏、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、膏药和吸入剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。除了STAMP组合物之外，软膏、糊剂、乳剂和凝胶剂还可以包含赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、粘土、硅酸、滑石粉、氧化锌，或者上述物质的混合物。除了STAMP组合物之外，粉末和喷雾剂还包含赋形剂如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。喷雾剂还可以添加常用的喷射剂，如含氯氟碳氢化合物和挥发性的非取代碳氢化合物，如丁烷和丙烷。
STAMP组合物还可以通过气溶胶给药。这可以通过制备含STAMP的水性气溶胶、脂质体制剂或或固体颗粒完成。非水性(例如，碳氟化合物喷射剂)悬液也可以使用。声波喷雾器也可以使用。水性气溶胶可通过制备药物和常用的药学上可接受的载体和稳定剂的水性溶液或悬液而制备。根据特定化合物的不同可选择不同的载体和稳定剂，但是一般包括非离子型表面活性剂(吐温类、普流罗尼类或聚乙二醇)、无毒的蛋白质如血清白蛋白、山梨坦酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气溶胶通常用等渗溶液制备。
透皮贴剂也可用于将STAMP组合物转移到注射部位。这种制剂可通过将药物溶解或分散到合适的介质中而制备。吸收增强剂还可用于增加肽模拟物透过皮肤的流量。这种流动的速度可通过提供速度控制膜或将肽模拟物分散到聚合物基质或凝胶剂中而加以控制。
眼用制剂、眼药膏、粉末、溶液等也包括在本发明的范围之内。
适于胃肠外途径给药的制剂包含STAMP和一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬液或乳剂，或者能够在使用前重组成无菌注射溶液或悬液的无菌粉末，其中包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂(bacterostat)、使制剂与受者血液等渗的溶质，、或者悬浮剂或增稠剂。
可用于胃肠外途径给药合适制剂所使用的合适水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇等)，以及上述物质的合适混合物，蔬菜油，如橄榄油，和可注射有机酯类，如油酸乙酯。通过使用包被材料如卵磷脂，通过保持分散剂中所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。
适于胃肠外途径给药的制剂还可以包含佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过添加各种抗洗剂和抗真菌药物，如氨甲酸苄苯酯、三氯丁醇、酚山梨酸等可以防止微生物的滋生。在组合物中添加等渗剂如糖、氯化钠等可能也是需要的。另外，通过添加使药物延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以使注射剂具有延迟吸收的特性。
长效注射剂可通过将STAMP加入到生物可降解的聚合物如聚乳酸-聚乙醇酸交酯的微囊基质内而制备。根据STAMP与聚合物的比例，以及所用特定聚合物的性质可以控制药物的释放速率。其他可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。长效注射剂也可以通过将STAMP包裹到和身体组织相容的脂质体或微乳剂内而制备。
在本发明的一个优选实施方式中，STAMP组合物可以治疗有效量转移到发病部位或注射部位。正如药理学领域所熟知的，在治疗一个给定患者时可产生最大疗效的药物有效量的STAMP的精确剂量要根据特定STAMP的活性、特性、药代动力学、药效学和生物利用度，以及患者的生理条件(种族、年龄、性别、体重、饮食、病种和阶段、一般物理状况、对给定剂量和药物的反应性)、制剂中药学上可接受的载体的性质、给药途径和给药频率以及致病靶微生物所引起的疾病的严重程度或习性等而定。但是，上述原则可作为调整治疗方案的基础，例如，确定最佳给药剂量，而无需再进行额外的常规试验来监测患者和调整给药剂量。Remington：《药物科学与实践》(The Science and Practice ofPharmacy)(Gennaro编辑，20增刊，Williams & Wilkins PA，USA)(2000)。
实施例
实施例1.通过给予一组抗微生物肽靶向杀伤突变链球菌。
1.1用于本实施例的STAMP的设计和构建以及STAMP组分(例如，选择性导向域/肽、抗微生物肽和接头肽)。本实施例设计和合成的STAMP及其组分列于表1中。原始的STAMP是通过合成全长突变链球菌-特异性感受态刺激肽(CSP，21个氨基酸，SEQ ID NO 1，突变链球菌产生的信息素)并在其C端或N端添加抗微生物肽G2(SEQ ID NO 3)(16个氨基酸，来源于广谱抗微生物肽诺弗斯匹林G10(SEQ ID NO 35)(Eckert等2006)而构建的。CSP C端的16个氨基酸被称为CSPC16(SEQ ID NO 2)，以前的研究证实它还具有信息素活性(Qi等，2005))，可用作CSP的替代物。然后合成在G2的N端或C端包含CSPC16的肽，二者之间是含易弯曲氨基酸的接头区，筛选其抗微生物活性(数据未列出)。从潜在的STAMP中选择出由CSPC16、短接头肽(GGG)和G2(从N端到C端)(表1)组成的C16G2(SEQ ID NO 4)作进一步研究，因为其具有更优良的最低抑菌浓度(MIC)、明显提高的杀伤动力学和抗突变链球菌的选择性(与单独的G2相比)，如下面详细描述的。
表1-选择出的STAMP和STAMP组分的肽序列(单字母氨基酸密码)
*代表肽的C端酰胺化
下划线部分为导向肽和杀伤肽之间的接头区
为了确定在CSPC16序列内是否有负责突变链球菌特异性结合的区，我们合成了一系列荧光素标记的CSPC16片段，并分析其结合突变链球菌的能力。利用下面的策略仔细分析CSPC16序列(表2)：首先，通过沿CSPC16序列从N端到C端制造3或4个氨基酸的缺失构建一系列片段(C 16-1到C16-5)。另外再合成缺乏CSPC16C端或N端较大片段的肽。另外，构建包含精氨酸到天冬酰胺(正电荷到负电荷的变化)(C16-4)或苯丙氨酸到甘氨酸取代(疏水性总体下降)的肽以及代表C16序列的4残基丙氨酸扫描的肽(C 16-15到C16-18)。按照以前描述的方法(15)进行结合试验，结果总结在表2中。测定CSPC16和包含CSP的苏氨酸6到精氨酸13(TFFRLFNR，SEQ ID NO 5)的任何肽与突变链球菌UA159或comD细胞的结合，与CSPC16相比，任何通过缺失、取代或丙氨酸扫描而造成的对该区的中断的荧光素结合能力都有下降。只包含Thr6-Phe11和Phe7-Phe11的某些肽如C16-3、-11、-16和-17具有结合能力，但是与CSPC16或包含完整Thr6-Arg13区的任何其他肽相比其结合活性更弱。另外，我们观察到精氨酸到天冬酰胺或苯丙氨酸到甘氨酸的取代不利于细胞结合，说明TFFRLFNR(SEQ ID NO 5，被称为M8或CSPM8)内的这些残基是与突变链球菌结合所必须的。CSPM8与表3所列的其他口腔链球菌的结合能力很弱或者根本不结合，说明CSPM8可能还与突变链球菌表面特异性结合。总之，表中所列的与突变链球菌有阳性结合的肽都可用作抗突变链球菌的导向肽。这些肽包括C16(SEQ ID NO 1)、C16-3(SEQ ID NO 39)、C16-4(SEQ ID NO 40)、C16-5(SEQID NO 41)、C16-6(SEQ ID NO 42)、C16-11(SEQ ID NO 47)、C16-12(SEQ IDNO 5)、C16-16(SEQ ID NO 51)、C16-17(SEQ ID NO 52)和C16-18(SEQ ID NO53).
表2-CSP片段肽与突变链球菌的结合
报道的相对结合代表UA159和comD的结果
Figure A200780032853D00291
突变链球菌1903(SEQ ID NO 10)特异性的导向肽和抗微生物肽S6L3-33(SEQ ID NO 7)和BD2.21(SEQ ID NO 13)是在发明者的实验室开发的(参见实施例4)。导向肽通过接头GGG(SEQ ID NO 17)偶联于抗微生物肽形成STAMPS C16-33(SEQ ID NO 8)、M8-33(SEQ ID NO 9)、1903-BD2.21(SEQ IDNO.13)和C16-BD2.21(SEQ ID NO 14)，所有这些都以C16G2和M8G2相同的方式进行检测。
表1和表3所列的所有肽都是按照以前文献描述的方法(Eckert等，2006)利用双偶联循环通过标准的9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成方法(431A肽合成仪，应用生物科技公司(Applied Biosciences)或Apex396，高级化学计数公司(Advanced Chemtech))合成的。完整的肽用95％的三氟乙酸(TFA)和合适的清除剂从树脂上裂解下来，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)(ACTA纯化仪(ACTAPurifier)，爱默生公司(Amersham))纯化至90-95％。肽的分子量通过衬质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱确定。带有用酰胺化的C末端的肽C16G2、G2和M8G2用Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide MBHA树脂合成(Anaspec)。其他所有肽都用适当取代的Wang树脂合成。
1.2 肽的荧光标记和荧光显微镜。CSPc16(SEQ ID NO 2)、CSP-片段肽(表2)和C16G2(SEQ ID NO 4)按照以前描述的方法(Eckert等，2006)用羧基荧光素(西格玛公司)标记。在肽裂解下来以后，进行细菌标记试验之前，利用荧光计数仪测定每μM肽所具有的荧光强度(λex＝488nm，λem＝520nm，VersaFluor，伯乐公司(BioRad))，结果发现是相对一致的(数据未显示)。为了评价肽与细菌的结合水平，用磷酸盐缓冲液(1×PBS)洗涤的过夜培养物(OD600＝0.7-1.0)来源的链球菌，用1×PBS按1:2稀释，并于25℃暴露于肽(16μM)5分钟。与肽共孵育以后，通过三次离心(5分钟，16,000xg)从细菌上洗去未结合的肽，悬浮于1×PBS中。口腔链球菌的标记利用40倍放大的亮视野和荧光显微镜(NikonE400)评价。利用厂家提供的软件(SPOT，诊断学公司(Diagnostics))获取数字图像用于半定量结合分析。
1.3 确定抗微生物活性。肽抗浮游细菌的抗微生物总活性通过在TH肉汤中进行MIC试验(所有链球菌)来确定(Qi等，2005)。
突变链球菌、格式链球菌Challis(DL1)和血链球菌NY101株用Todd Hewitt(TH，Fisher)肉汤培养基在37℃缺氧条件(80％ N2，10％ CO2和10％ H2)下培养。突变链球菌菌株UA159(Ajdic等，2002)、ATCC 25175和T8(Rogers，1975)是野生型的临床分离株，而comD是敲除突变株，是以前从野生型UA140背景中构建出来的(Qi等，2005)。表达荧光素酶的突变链球菌菌株JM11构建自UA140，如文献所述(Merritt等，2005)。处于指数生长期的细菌细胞用TH稀释到约1×105cfu/mL，加入到96孔板(Fisher)中。然后对肽进行系列稀释，加入到细菌内。通过测定孵育约24小时后能完全抑制细菌生长的肽的浓度来确定MIC。
1.4 确定杀菌动力学。为了确定C16G2和G2的短期杀伤率和选择性，我们基本按照以前文献描述的方法(Eckert等，2006)进行了时间-杀伤试验。突变链球菌UA159、格式链球菌或血链球菌培养到指数生长期，用培养基稀释到～1×105cfu/mL。在缺氧条件下将25μM G2或C16G2加入到细胞悬液内，25℃孵育。在1分钟时，取出10μL细胞悬液，通过稀释到生长培养基(1:50)内使其复苏，置于冰上。为了接种，20-500μL复苏细胞涂布在生长培养基琼脂板上，在37℃缺氧条件下孵育过夜，然后计数长出的克隆。我们将60cfu/mL设定为本试验的检测下限。存活cfu/mL的值表示为C16G2处理培养物的存活细菌数与暴露于G2的样品的cfu/mL之比。
1.5 抗单一物种生物膜的抗微生物活性的检测。为了启动生物膜的形成，每孔约1×107细菌(来源于过夜培养物)接种到96孔平底培养板内，培养基为TH培养基(100μL)。除突变链球菌外，所有链球菌所用的培养基都添加0.5％(w/v)甘露糖和葡萄糖。突变链球菌UA159生物膜在含0.5％(w/v)蔗糖的培养基内生长。然后短时离心培养板使细胞成团，然后在37℃孵育3-4小时以便于生物膜形成。孵育以后，小心去除上清液，生物膜用25μM 1×PBS稀释的肽或1×PBS处理1分钟。然后去除肽溶液，加入100μL进一步稀释残留的肽。为了使生物膜的损失达到最少，在加入TH后短暂离心细胞，然后去除上清液，加入含合适糖的新鲜培养基。然后在37℃缺氧条件下培养，通过用微孔板分光光度计(Benchmark Plus，伯乐公司)测定OD600处的吸光度值来监测生物膜随时间的生长情况。
1.6 抗唾液内细菌生物膜的抗微生物活性的评价。为了进行这些试验，我们采用了与以前报道的那些方法(Bleher等，2003)相似的方法。在试验前一天，收集5个成人志愿者的唾液并储存在实验室内，用TH肉汤按1:4稀释，2,000×g离心10分钟。然后上清液过滤除菌(0.2μm滤膜，Nunc)，储存于4℃。一部分储存的唾液用1×PBS按1:2稀释，按照上述方法处理。在试验的那一天，JM11和其他口腔链球菌的过夜培养物调整到OD6001.0，每一种细菌以～3×106cfu/mL的浓度加到10mL TH稀释的唾液内。然后添加蔗糖、甘露糖和葡萄糖(浓度都为1％w /v)，混合溶液。将唾液和细菌的部分(500μL)混合物加到1.5mL离心管(Fisher)内。短暂离心(4,000×g，2min)后，试管于37℃孵育3-4小时以形成多物种生物膜。然后去除上清，加入100μL PBS稀释的唾液(1:2)加25μM(新鲜加入的)肽。生物膜暴露于药物5分钟后，去除PBS-唾液，细胞短暂离心，然后加入500μL含糖的新鲜TH-唾液。在每一个时间点，通过读取OD600的吸光度值测定总生物膜生长情况，按照以前描述的方法(Merritt等，2005)根据荧光素酶的相对表达水平(相对光单位，(RLU)产量)确定菌群内突变链球菌的健康度。简言之，通过振荡和抽吸重悬生物膜，将每种100μL样品转移到新离心管内，其中包含悬浮于0.1M、pH6.0的柠檬酸缓冲液中的25μL1mMD-荧光素(西格玛公司(Sigma))溶液。在2小时时间点，在记录荧光素酶活性前半小时通过加入1％蔗糖重悬以刺激生物膜。利用TD 20/20发光计(腾纳生物系统公司(Turner Biosystems))测定RLU产量，报道的数值来源于3个独立样品的平均值。数据标示为随时间的RLU/OD600。
1.7 C16G2具有升高的抗浮游突变链球菌细胞的抗微生物活性。为了评价C16G2抗微生物活性和一般特异性，进行抗一组细菌其中包括突变链球菌的各种菌株以及密切相关的口腔链球菌的最低抑制浓度(MIC)试验(Gilmore等，1987)。如图3所示，C16G2对所有检测的突变链球菌菌株的MIC值都在3-5DM之间，比亲本抗微生物肽G2的抗微生物活性(12-20DM)高4-5倍。但是，我们观察到G2和C16G2抗格式链球菌和血链球菌的敏感性差异不大(2倍或更低)。
孵育24小时以后，G10KHc(SEQ ID No 36)的MIC并没有多大升高，但是在短时间暴露过程中其抗靶细菌的杀伤动力学和特异性都有明显提高(与非靶向亲本抗微生物肽相比时(Eckert等，2006)。因此，我们进行了比较试验以检测在短时间暴露后C16G2和G2抗其靶和非靶细菌的杀伤能力。如图1所示，经过1分钟的暴露后，C16G2抗其靶细菌突变链球菌的活性比G2高20倍以上，而其抗其他链球菌的活性与G2相似。这些结果首先说明在G2上添加CSPC16导向区可赋予其抗突变链球菌而不是其他密切相关的口腔链球菌的选择性抗微生物活性。
表3-含G2的STAMP和STAMP组分抗菌MIC
MIC代表至少三个独立试验的平均值加标准差
Figure A200780032853D00331
1.8 C16G2也具有抗生物膜细胞的活性。突变链球菌主要存在于体内处于生长状态的生物膜内。本领域熟知的是，生物膜相关细胞对抗生素的耐药性会升高100-1000倍(Donlan等，2002)。为了检测C16G2是否还具有抗体外的突变链球菌生物膜的活性，用25DM C16G2、G2、CSP、CSPC16或1×PBS处理生物膜相关的突变链球菌、格式链球菌或血链球菌1分钟，洗涤，监测其随时间的从新生长情况。如图2所示，在加入和去除肽以后，暴露于所有被测肽的格式链球菌或血链球菌生物膜的生长与未处理的生物膜相似(图2A-B)。与此相反，经C16G2处理后，突变链球菌菌株UA159(图2C)以及T8和25175(数据未显示)的生长受到明显抑制，但是用其他肽处理的菌株的生长未受影响。这些结果说明C16G2可以作为抗突变链球菌STAMP，只需很短的一段暴露时间(1分钟)就能在生物膜环境中发挥功能，这段时间与口腔的临床治疗时间相似(Axelsson & Lindhe，1987)。
1.9 C16G2可以选择性地从混合物种生物膜中清除突变链球菌。除了作为体内的生物膜生长以外，突变链球菌通常还会存在于唾液中，因为它们会粘附在牙齿表面。为了检测C16G2是否能够选择性地杀伤这些条件下的突变链球菌，将两种非生龋齿口腔链球菌(格式链球菌和血链球菌)与突变链球菌JM11混合，JM11中包含一个位于荧光素酶(luc)和组成性活化基因乳酸脱氢酶(ldh)启动子之间的转录融合因子，该菌株对C16G2的敏感性与野生型UA159相似。在以前的研究中，JM11被用于检测突变链球菌菌群的适应性，结果发现相对光单位(RLU)产量的下降与细胞活力的降低密切相关(Merritt等，2005)。利用唾液制备混合物种生物膜，然后在唾液中加入肽(25μM)，处理5分钟，去除肽以后继续监测生物膜在处理后的生长情况。同时通过测定荧光素酶的表达来定量测定生物膜内活突变链球菌的细胞数。研究发现，经过5分钟的暴露后，与CSPC16和G2相比，C16G2能够明显抑制混合物内的突变链球菌菌群(反映在低荧光素酶活性上)(图3)。令人感兴趣的是，即使在处理后120分钟时，混合物内的突变链球菌总是依然很低(图3)。总之，这些结果说明短时间暴露于C16G2就能够选择性地抑制唾液存在的条件下多物种生物膜内的突变链球菌的生长最少达2小时，同时不会损害其他细菌或影响生物膜的健康度。
1.10 C16G2升高的抗微生物活性与CSPC16和突变链球菌靶向ComD非依赖的结合有关。为了进一步探究C16G2抗突变链球菌的活性升高的机制，CSPC16和C16G2用荧光素标记，检测它们与突变链球菌以及其他链球菌结合的能力。根据所观察到的杀伤活性，我们发现CSPC16和C16G2能够在很短的时间暴露后(1-2分钟)特异性地结合突变链球菌，但是不与其他口腔链球菌结合(数据未显示)。以前的遗传学研究表明CSP可与ComD相互作用，活化突变链球菌内DNA的感受性(Li等，2001)。我们意外地发现UA159和comD菌株具有相似的MIC(表3)。根据这个结果，我们还发现荧光素标记的CSPC16和C16G2以相同的方式与UA159和comD突变株结合，说明CSP与突变链球菌的特异性结合能力是ComD非依赖性的。
1.11 M8G2与C16G2具有相似的抗突变链球菌活性。根据上述数据，我们推测CSPM8可能也能够作为另一个导向区发挥抗突变链球菌STAMP的功能，为了验证我们的推测，将CSPM8和G2合成在一起形成STAMP M8G2(表1)。如表3所示，与C16G2相比，M8G2具有相似的抗突变链球菌及其他口腔链球菌MIC。另外，单一物种生物膜抑制试验表明，经过1分钟的暴露后，M8G2与C16G2一样能够抑制突变链球菌生物膜的恢复(图4A)，但是不能抑制血链球菌的恢复(图4B)。由于CSPM8区比CSPC16更短，因此更容易化学合成，这些结果为下一步设计更短的基于CSPM8的抗突变链球菌STAMP提供了基础。
1.12 CSPC16/CSPM8引导的STAMP作为另一种杀伤区是有功能的。由于STAMP的靶向组分和抗微生物组分在功能上是独立的，因此尽管它们是作为一个肽合成的(Eckert等，2006)，但是我们有理由确信CSPC16或CSPM8与不同的通用抗微生物肽的组合对突变链球菌的杀伤活性和选择性比单独的非靶向杀伤肽相比要高。因此，两种导向肽以C16G2和M8G2相同的排列方式与广谱抗微生物肽S6L3-33偶联形成STAMP C16-33和M8-33(表1)。如表4所示，S6L3-33与衍生的STAMP之间抗突变链球菌和其他口腔链球菌的MIC差异为2-3倍。但是，在进行单一物种生物膜试验时(图5所示)，STAMP的突变链球菌选择性活性是很容易观察到的，C16-33和M8-33在短时间暴露后都能够抑制突变链球菌生物膜的生长(图5A)，而血链球菌培养物不受STAMP处理的影响(图5B)。这些结果说明突变链球菌生物膜特异性的STAMP的活性明显升高。
表4-用S6L3-33抗微生物区构建的STAMP的MIC
MIC代表至少三个独立试验的平均值加标准差
Figure A200780032853D00351
总之，我们合成并评价了具有突变链球菌而不是其他口腔链球菌特异性的一系列STAMP。我们通过插入一部分天然信息素设计出了具有突变链球菌选择性活性的STAMP，其中天然信息素是由这些生龋齿细菌(CSP)产生的，这种插入的片段作为线性STAMP肽内的导向区。通过只利用短(小于3kD)线性肽作为导向区和抗微生物区，我们能够通过固相化学合成方法快速合成和分离一条完整的STAMP分子，与以前所描述的(Qiu等，2005)构建大的(大于70kD)蛋白靶向抗微生物肽所需的重组表达和复杂纯化途径相比，本发明的方法具有明显的优势。另外，在构建抗突变链球菌的STAMP时通过导向区(CSPM8和CSPC16)和杀伤区(G2和S6L3-33)的不同组合之间的转换，使合成途径具有了很大的灵活性，因而能够使我们很容易地提高STAMP的多样性，否则要完成这一任务就需要复杂的克隆过程。
如图5所示，CSPC16和CSPM8能够与其他抗微生物肽(S6L3-33)偶联而不会丢失突变链球菌选择性杀伤能力。这一发现进一步证明了STAMP导向区和抗微生物区在功能上是互相独立的，并且能够以不同的组合相连接而不会丢失活性这一概念。这说明未来构建STAMP将是一个无限的“和谐”过程，因为可以合成抗微生物区、接头区和导向区的无数组合以便于筛选出具有最佳特异活性的STAMP。另外，通过转换成其他功能类似的STAMP组分，可以很容易地克服STAMP的细菌耐药性(应该是进化出的)(Perron等，2006)，正如本研究中用G2和S6L3-33所做的。另外，肽信息素被致病性细菌广泛使用，尤其是革兰氏阳性微生物，因此它代表一个大的而且不断增大的群，可以从中筛选出其他导向肽用于STAMP构建。
C16G2、M8G2、C16-33和M8-33表现出了很强的抗浮游培养物中的以及单一物种和多物种生物膜内的靶向突变链球菌的特异性活性，说明我们能够构建一系列能够区分突变链球菌和其他非生龋齿口腔链球菌的功能性STAMP。这种选择性活性与这些肽的低细胞毒性(Eckert等，未发表的数据)的组合说明它们可用于开发抗龋齿治疗药物。目前，治疗突变链球菌感染的方法包括禁止吃糖、机械清除牙菌斑和常用的杀菌漱口剂。所有这些方法都只能达到不同程度的临时效果，同时机械清除或常用的抗生素治疗会不可避免地导致正常菌群的丢失，这样会使突变链球菌很容易地在口腔内重新建立生态位(Caufield等，2000)。因此，具有病原体选择性(如突变链球菌选择性)杀伤能力的STAMP是一种理想的解决方法，能够选择性地杀伤或抑制菌群内的致病菌(例如，突变链球菌)，同时使影响突变链球菌菌群的正常菌群过度生长。这种“抗生素-益生元”(antibiotic-probiotic)治疗方法可帮助预防龋齿发展，减少治疗这种疾病所需的高额医疗费用(Anderson & Shi，2006)。
实施例2.通过共同给予G10KHc和妥布霉素提高抗绿脓杆菌的抗微生物活性。
2.1 绿脓杆菌是常见的人机会致病菌，与致命的急性感染和囊性纤维化期间的慢性呼吸道定居有关。在美国专利申请出版号NO.20040137482中，一个广谱抗微生物肽诺弗斯匹林G10被转化成选择性靶向抗微生物肽(STAMP)G10KHc。与诺弗斯匹林G10相比，G10KHc STAMP抗门多萨假单胞菌的杀伤能力升高。在这个试验中，我们研究了G10KHc的抗绿脓杆菌抗微生物活性，发现G10KHc STAMP与妥布霉素共同给药对杀伤活性具有协同增高效应。
2.2 G10KHc STAMP及其组分。G10Hc STAMP包含如下序列和组分：
G10KHc[导向肽-接头肽-抗微生物肽，下划线部分是接头肽]：
KKHRKHRKHRKHGGSGGSKNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO 36)
G10(诺弗斯匹林)抗微生物肽：KNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO 35)
Cat-1(也被称为KH)导向肽：KKHRKHRKHRKH(SEQ ID NO 31)
接头肽：GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
利用Fast-Fmoc(9-芴甲氧羰基)法在431A肽合成仪(应用生物科技公司)上进行肽G10(KNLRRIIRKGIHIIKKYG，SEQ ID NO 35)和G10KHc(KKHRKHRKHRKHGGSGGS-KNLRRIIRKGIHIIKKYG，SEQ ID NO 36)的固相合成。利用95％ TFA和合适的清除剂从树脂上裂解下完整肽。肽的分子量通过衬质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱(Voyager系统4291，应用生物系统公司(Applied Biosystems))确定，粗肽用反相高压液相色谱(HPLC，ACTA纯化仪，爱默生公司)纯化，同时监测UV215。HPLC过程中的流动相包含水/乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流速为0.5mL/分(Source 15 RPC层析柱，爱默生公司)。纯化的G10KHc的HPLC和MALDI结果显示于图6中。纯化后，在保留体积10.06mL处观察到了G10KHc的单一峰(图6A)，这与G10KHc的预测分子量一致(预测的为4267.08，观察到的是4267.44)，如图6B所示。
2.3 抗微生物活性。利用以前文献报道的(Eckert等，2006)最低抑菌浓度(MIC)试验来评价G10KHc、G10和妥布霉素抗绿脓杆菌临床分离株的抗微生物总活性，结果显示在表5中。MIC表示为μM，1μM妥布霉素＝0.468μg/mL。绿脓杆菌生长到指数生长期，用马一欣二氏(MH)肉汤调整到～1×105cfu/mL的浓度，加到96孔板内。然后将二倍系列稀释的肽加到细菌上，培养板在37℃孵育18-24小时。根据最后一个清晰孔(无细菌生长)的肽的浓度来确定MIC。正如所预期的，与单独的G10相比，G10KHc的抗绿脓杆菌临床分离株活性明显升高(斯氏t检验，p＝0.001)：G10KHc的MIC为0.5到29μM(平均6.22μM)，而G10的MIC为10到60μM(平均23.4μM)。由于KH区(或Cat-1肽)自身不具有任何抗微生物活性，因此G10KHc抗绿脓杆菌活性的升高可能是由KH与假单胞菌spp的靶向结合能力导致的，如以前所报道的(Eckert等，2006)。与妥布霉素不同，G10KHc还能有效地抑制对氨基糖甙类抗生素和多抗生素耐药的分离自CF患者(AGR1O，MR15)的绿脓杆菌。另外，由于粘膜绿脓杆菌通常与对抗微生物药物的敏感性下降有关，因此当我们发现G10KHc具有抗此类菌株PDO300的活性时倍受鼓舞。总之，G10KHc抗被测敏感分离株的活性与妥布霉素不同(一般低1-2个稀释步骤)。
表5-妥布霉素、G10和G10KHc抗绿脓杆菌实验室和临床分离株的MIC。表中所示的是至少三次独立试验的MIC平均值。单独的KH导向区没有抗微生物活性(数据未列出)。作为参考，1μM妥布霉素＝0.468μg/mL。
                               MIC(μM)
菌株               G10KHc        诺弗斯匹林G10     妥布霉素
PAO1               6             23                2.5
PA14               5.5           10                0.7
PAK                5.5           13                2.12
PDO300*            6             45                nt
ATCC 15692         6             16                3.05
ATCC 27583         6             16                1.75
ATCC 10145         4.5           14.5              1.75
ATCC 9027          5.5           15                2.12
AGR10              1.1           18                55
MR15               0.5           14                55
S40                29            60                0.4
S60                3.13          30                0.4
S100               1.1           30                3.5
*类粘蛋白表型，nt：未检测到
时间-杀伤(杀伤动力学)试验基本按照以前文献报道的方法进行(Eckert等，2006)。简言之，绿脓杆菌培养到指数生长期后用含30％小鼠血清(MP生物药品公司(MP Biomedicals))的LB稀释到～1×105cfu/mL(中等密度的浮游培养物)，然后在细胞悬液中加入10μM妥布霉素、G10或G10KHc。在每一个时间点取10μL培养物，稀释到500μL LB中以恢复绿脓杆菌细胞，置于冰上直到接种。接种到LB琼脂上，在缺氧条件下37℃孵育过夜，然后测定存活cfu/mL。
如图7所示，杀伤动力学试验结果表明G10KHc抗绿脓杆菌的杀伤活性明显高于G10：用10μM G10KHc处理培养物就可以使活绿脓杆菌数下降(30分钟时降到100cfu/mL以下)，而G10在整个试验周期中都是无效的。G10KHc抗微生物活性率与等摩尔剂量的妥布霉素(4.68μg/mL)相似。这些结果说明G10KHc与妥布霉素具有相似的抗临床分离株和实验室株的能力，G10KHc可抑制耐药性绿脓杆菌的生长。另外，数据还说明G10KHc发挥有效的绿脓杆菌细胞杀伤作用需要KH假单胞菌属导向区：单独的G10的活性很低，除非孵育18-24h(表5)。
2.4 G10KHc和妥布霉素的协同杀伤效应。为了评价G10KHc与妥布霉素之间升高的抗高密度浮游培养物的活性，ATCC 15692培养过夜，用ddH2O(pH 7.4)调整到～1×10cfu/mL，然后暴露于5μM妥布霉素、5μM G10KHc或二者的组合(5μM妥布霉素(2.34μg/mL)和5μM G10KHc或G10的组合)。24小时后通过稀释来复苏10μL经处理的培养物，接种到LB上，在LB琼脂上生长后计数，计算存活cfu/mL。
如图8所示，我们观察到当妥布霉素和STAMP(但不是G10)共同给药时杀伤活性明显升高。共处理培养物的存活cfu/mL(～1×103cfu/mL)比未处理培养物的水平(～1×108cfu/mL)或暴露于妥布霉素或G10KHc的那些cfu/mL(分别为1×107cfu/mL和～1×108cfu/mL)低5个数量级。这些结果说明，当联合使用时，这些药物比单一组分具有明显升高的抗浮游绿脓杆菌活性，24小时后几乎可以清除所有的高细胞密度培养物，即使G10KHc的使用浓度低于被测菌株的MIC。
2.5 G10KHc和妥布霉素对生物膜的协同杀伤效应。我们还观察了妥布霉素和G10KHc之间抗生物膜相关绿脓杆菌的协同杀伤效应。在该试验中，旋转平皿生物膜反应器系统用于测定生物膜对妥布霉素、G10和G10KHc的敏感性定量数据。系统包括一个反应器，其中包含250mL稀释的胰酶解大豆酪蛋白肉汤(TSB)(1:100)培养基。反应器用过夜培养物接种(1％，v/v)。在TSB中静态生长过夜后，开始启动新鲜培养基流(稀释速率为0.7h-1)。在培养基流中培养24小时以后，按照无菌操作从旋转皿上取下附着有生物膜细菌的聚碳酸酯小片，用ddH2O(pH7.4)洗涤三次，然后在1mL ddH2O中孵育。按照说明加入G10(100μg/mL)、G10KHc(100μg/mL)、妥布霉素(100μg/mL或者二者的混合物。然后将小片放入24孔组织培养板(Falcon，编号353047；BD实验室设备公司(BectonDickinson Labware)，富兰克林湖(Franklin Lakes)，纽约州)孵育4小时或24小时。为了估计剩余活绿脓杆菌数，平皿置于1mL PBS中，利用组织匀浆器(布林克曼仪器公司(Brinkmann Instruments)，西拜瑞(Westbury)，纽约州)分散细胞，通过系列稀释和接种到LB琼脂上确定每个小片上的总cfu。
如图9所示，单独的100μg/mL G10KHc或100μg/mL妥布霉素在处理4小时后，甚至是24小时后，其抗绿脓杆菌生物膜的杀伤效应也是很有限的。但是100μg/mL G10KHc和100μg/mL妥布霉素的混合物在4小时后就能明显降低存活cfu/mL的水平，与单个药物相比杀伤活性提高4个数量级。更引人注目的是，当组合药物与绿脓杆菌共孵育24小时以后，没有检测到cfu/mL(下降近5个数量级)。这些数据说明当G10KHc和妥布霉素用于在体外抑制绿脓杆菌生物膜时可以使杀伤活性明显升高。另外，这些结果与图8的结果一致，说明G10KHc和妥布霉素可以发挥协同效应以抑制绿脓杆菌浮游或生物膜模式的生长，尽管还需要做进一步的试验来确立完整的协同活性。
2.6 G10KHc介导的膜渗透性。图8和图9的结果说明G10KHc共同处理可提高妥布霉素的细胞杀伤率。在缺少肽时，细菌对妥布霉素的有效摄取是一个需要完整ΔΨ梯度(质子动力势的电位)的主动过程，在有氧呼吸期间达到最大水平。这个过程在缺氧环境中可能是缓慢的，或者缺少这个过程，(例如在生物膜内部)，说明妥布霉素弥散透过绿脓杆菌膜(或者缺乏这个过程)在这些细菌对氨基糖甙类抗生素耐药的至少一个机制中发挥关键作用(14，33，40)。因此，由于G10KHc内含有可破坏膜的AMP区，并且以前文献报道G10KHc具有抗外膜活性(11)，因此我们推测G10KHc可能会导致绿脓杆菌的外膜和内膜透化，增加妥布霉素的摄取，产生所观察到的协同效应。
为了确认G10KHc对膜的破坏可以介导小分子在细胞内的积聚，将绿脓杆菌的过夜培养物按1:50稀释到LB内，使其生长到指数生长期(3-4小时，～1×105cfu/mL)，然后进行模拟处理，或者用2μM G10KHc处理。5分钟后，在存在或缺少亚致死浓度的G10KHc(2μM)的情况下，按照厂家的说明书用碘化丙啶(PI)(LIVE/DEAD Baclight Viable Stain，因维曲根公司(Invitrogen))染色膜破损的细胞。PI是能够结合双链DNA的小分子，在激发时能发出红色荧光，在不易分析氨基糖甙类抗生素的内化时可作为妥布霉素的替代物。该染料不能透过完整的浆膜，通常用于细胞活力分析。利用40倍放大的荧光显微镜(Nikon E400)可检测插入到DNA内的染料(红色染色)。采用厂家默认的参数(SPOT，诊断学公司)采集亮视野图像和红色荧光图像。为了确定肽处理和PI染色后的杀菌活性，与直观培养物平行制备的样品按1:5系列稀释后接种到LB琼脂上。利用带QuantityOne软件的GelDoc(伯乐公司)采集存活cfu/mL的图像。
我们预计，与单独的PI相比，G10KHc诱导的膜破裂将导致核酸染色的增强。如图10所示，单独用PI处理的细菌未被染色。但是，暴露于PI和G10KHc的培养物可以清楚地观察到胞内PI染色。另外，所观察到的红色荧光的量与G10KHc的量和处理时间成正比(数据未显示)。为了确保我们不仅仅是对G10KHc杀伤的绿脓杆菌染色，分析直观培养物的活cfu/mL。从下面图10的图像所示的系列稀释结果来看，可以清楚地看到单独PI处理的和PI/G10KHc处理的培养物之间的复苏活绿脓杆菌数是相似的。总之，这些数据说明亚致死剂量的G10KHc能够诱导膜损伤并促进小分子的摄取，例如妥布霉素或PI进入代谢活跃的绿脓杆菌细胞内。
2.7 结论。总之，在本试验中，我们研究了G10KHc抗绿脓杆菌的抗微生物活性。结果发现G10KHc具有抗绿脓杆菌临床分离株的高活性(与妥布霉素相似)。最令人感兴趣的是，我们发现当绿脓杆菌的生物膜和浮游培养物用G10KHc和妥布霉素共同处理时对杀伤活性有协同增强效应。数据说明活性升高的机制可能包括因G10KHc介导的细胞膜破裂而产生的妥布霉素摄取增多。这些结果说明G10KHc可用于抑制急性和慢性感染状态下的绿脓杆菌，尤其是与妥布霉素共同使用时。
绿脓杆菌是一种持久存在和反复发作的机会致病菌，是导致CF期间致命复发感染的原因。经常能够分离出抗生素耐药的绿脓杆菌说明，在现有治疗选项不再有效前开发出一种能抑制和治疗绿脓杆菌定居于呼吸道粘膜表面的新治疗措施是十分关键的。
本试验的结果显示，与其广谱的亲本肽G10相比，G10KHc的活性得到明显改善，与妥布霉素的活性相似。另外，G10KHc可在体外有效抑制高密度的浮游培养物和绿脓杆菌生物膜(图3-4)。与妥布霉素相比，每μM的G10KHc降低生物膜活力的能力几乎提高10倍(100μg/mL妥布霉素＝213μM，100μg/mL G10KHc＝23.5μM)。但是，对于抗高密度浮游细胞来说，处理24小时后，单独的5μM(2.34μg/mL)妥布霉素的杀菌活性比5μM G10或G10KHc都要高(高出1-2个数量级)。妥布霉素活性的差异可能与绿脓杆菌生物膜内部的缺氧环境有关，这种缺氧环境可抑制细胞有效摄取氨基糖甙类抗生素。
当两种药物联合使用时可以在浮游培养物或生物膜培养物内产生最高水平的抗绿脓杆菌活性。共同给予妥布霉素和G10KHc可使杀伤活性明显增强：在浮游培养物或生物膜培养物中，共同处理比任一单一处理所清除的细菌数几乎高10,000倍。尽管以前已有文献报道过抗微生物肽和妥布霉素之间(Saiman等，2001)以及妥布霉素和许多其他常规小分子抗生素之间(Bonacorsi等，1999)具有抗绿脓杆菌的加合效应和协同效应，但是，本试验首先报道了利用氨基糖甙类抗生素/肽组合可以协同地或加合地清除生物膜相关的绿脓杆菌。
妥布霉素气溶胶已被批准用于治疗CF患者的绿脓杆菌感染，不出意外的是，已经从CF患者的痰液中分离出了绿脓杆菌和其他微生物的妥布霉素和氨基糖甙类抗生素耐药株。这一事实连同治疗后呼吸困难、支气管痉挛和咳嗽增加相对较高的发生率说明妥布霉素的最佳使用方案是较小剂量的妥布霉素与其他药物联合使用。我们的结论是G10KHc可以成为共同给药的候选药物，因为它具有经过改造的假单胞菌选择性和强大的抗绿脓杆菌生物膜和多药耐药株及氨基糖甙类抗生素耐药株的抗微生物效应。
实施例3.利用D氨基酸对映异构体合成STAMP和/或化学拮抗剂(例如，rhDNA酶)可以提高G10KHc STAMP的稳定性和活性
3.1 材料和方法。按照以前文献描述的方法，利用从Anaspec(圣何塞(SanJose)，加州)购买的用于合成G10KHc-D的D-氨基酸，通过快速Fmoc(Fast-Fmoc)(9-芴甲氧羰基)方法在431A肽合成仪(应用生物科技公司)上合成G10KHc(KKHRKHRKHRKHGGSGGSKNLRRIIRK GIHIIKKYG，SEQ IDNO 36，[导向域-接头-抗微生物域])和D-对映异构体G10KHc-D。
来自于不同患者的8个痰液样品收集自洛杉矶儿童医院(洛杉矶，加州，美国)的CF患者，在常规临床实践期间收集，在收集后的1小时内储存于-80℃。用于本研究的痰液样品的收集经过了洛杉矶儿童医院伦理委员会的批准(CCI#05-00040)。所有个人标示，其中包括年龄、性别和预后，都对本实验室设盲。
3.2G10KHc和G10KHc-D在痰液中的活性和稳定性。肽在痰液中的抗微生物效应或活性的测定以以前文献报道相似的方式进行(Sajjan等，2001)。为了分析G10KHc和G10KHc-D在痰液中抑制外源添加的绿脓杆菌的活性，收集的痰液样品用10mM PBS(PBS)以1:10的比例稀释并储存(被称为储存痰液)。在100μL储存的痰液中加入浓度为～5×106cfu/mL的ATCC 15692，然后添加25μM肽。
在用于检测蛋白酶抑制剂对肽活性的效应的样品中，储存的痰液样品用1mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、β巯基乙醇(BME)或乙二胺四乙酸(EDTA)预处理30分钟，然后加入25μM G10KHc和ATCC 15692(～5×106cfu/mL)。
经过肽处理后存活下来的细胞用生长培养基稀释(1:50)，使其复苏4小时，在进行适当稀释前置于冰上放置4小时，然后接种到添加氨苄青霉素(25μg/mL)的LB琼脂上。37℃孵育过夜后计数长出的克隆，计算存活cfu/mL。对所有接种方法来说100cfu/mL都被认为是可计数的下限。在储存痰液中已经存在内源性微生物，但是与外源添加的细胞相比，只占少数(低于1％，数据未显示)。作为结果，在这些培养物中内源性和外源性cfu/mL是无法区分的。
通过杀伤动力学试验评价G10KHc在CF患者痰液样品中的抗微生物总效应。如图11A所示，在加入肽后4小时，G10KHc未显现出抗外源添加到储存痰液样品中的绿脓杆菌的活性。这一结果与生长培养基中的G10KHc活性相反，在生长培养基中，暴露于G10KHc STAMP 10分钟后就可以使可复苏cfu/mL下降90％以上，处理2小时就可以清除所有绿脓杆菌cfu/mL(参见试验2)。
考虑到可能是因G10KHc降解而导致的活性丢失，我们又测定了G10KHcSTAMP在痰液中随时间的稳定性。通过HPLC监测肽在痰液中的稳定性。简言之，储存的痰液样品用PBS按1:10稀释，重复离心以去除不溶性物质。然后在100μL稀释的储存痰液(用或不用1mM PMSF预处理1小时)中加入G10KHc或G10KHc-D(100μM)，在室温下混合。在指定时间点加入20μL10％HCl以终止肽降解，样品过滤两次(0.2μm尼龙膜，Nunc)，然后上载到层析柱上(Source 15 RPC，爱默生公司)。含0.1％三氟乙酸的水/乙腈用作流动相，样品用逐渐升高的线性梯度的乙腈组合物(从10％到～35％)洗脱，流速为0.25mL/min，每轮用11.5mL流动相。通过UV(215nm)监测完整G19KHc及其降解产物，在图中所示处收集组分。收集自连续流程的组分混合在一起，冻干过夜，然后利用上述MIC试验评价其抗微生物活性。利用厂家推荐的操作方法(Unicorn，爱默生公司)收获HPLC图，利用Photoshop 7.0(Adobe)进行不同着色和重叠以绘制图11B。
如图11B所示，G10KHc的标记峰(滞留体积10.29)在暴露于痰液后30分钟几乎完全降解。收集得到的几个组分，利用质谱鉴定可能的降解产物，结果发现所有组分抗几个绿脓杆菌临床分离株的MIC都在100μM以下(表6)。
表6-G10KHc、G10KHc-D和痰液消化产物的MIC(μM)
Figure A200780032853D00441
a三次独立试验的MIC范围
b以前报道的数据用于比较(6)
c图1B所示的组分
本领域已知的是，痰液中存在的丝氨酸蛋白酶的水平是升高的。因此，我们推测这一类蛋白酶是造成所观察到的G10KHc快速降解的原因，蛋白酶抑制剂应该能够稳定痰液中的G10KHc，恢复其抗微生物功能。为了验证这种可能性，将绿脓杆菌和G10KHc添加到用各种蛋白酶抑制剂预处理的储存痰液样品中，计数存活的细菌数。用BME(一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂)或EDTA(金属蛋白酶抑制剂)处理的样品中G10KHc的活性或稳定性没有恢复(数据未显示)。然而，如图11A所示，在通用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF预处理的样品中绿脓杆菌可以被G10KHc STAMP有效杀伤(存活cfu/mL下降超过3个数量级)。单独的抑制剂对绿脓杆菌活力只有很小的影响。相应的，在利用HPLC检测时发现，PMSF处理的痰液中G10KHc信号可以在4小时内维持高水平(图11B)。总之，这些数据说明在防止被丝氨酸蛋白酶降解后，G10KHc具有抗痰液内绿脓杆菌的活性。
3.3 D-对映异构体G10KHc STAMP及其活性。由于大多数丝氨酸蛋白酶具有手性要求(Milton等，1992)，我们合成了包含全D氨基酸对映异构体的G10KHc、G10KHc-D作为另一种无需使用抑制剂就可以抑制蛋白酶活性的方式。利用上述标准固相方法合成G10KHc-D，通过质谱加以确认。
如图11A所示，在暴露于肽后4小时，G10KHc-D可以使复苏的绿脓杆菌水平降低3-4个数量级(与未处理的样品相比)，说明G10KHc-D在痰液中的活性水平与经过稳定的L-G10KHc相似。但是，在生长培养基中，用对映异构体处理24小时不会对其绿脓杆菌抑制活性产生影响，说明G10KHc-D和L-G10KHc的活性并不完全一致。
3.4 rhDNA酶对STAMP在痰液中的活性的影响。rhDNA酶常用于治疗CF以降低痰液的粘滞度和促进呼吸道清洁(Fuchs等，1994)，将其加入到储存的浓缩痰液样品中以确定在这些条件下共同处理是否能够提高G10KHc/PMSF和G10KHc-D的活性。为了确定rhDNA酶(基因技术公司(Genentech)，旧金山，加州)对STAMP杀伤能力的影响，将不同痰液样品按1:2稀释到100μg/mLrhDNA酶中，简单混合后在室温下孵育10分钟。然后收集处理的样品，加入1mM PMSF，孵育1小时。然后加入25μM G10KHc或G10KHc-D和～5×106cfu/mL ATCC 15692，孵育4小时。复苏存活的细菌，按照上述接种方法进行计数。
如图12所示，我们观察到当rhDNA酶与G10KHc/PMSF或G10KHc-D联合使用时，与未用rhDNA酶处理的样品相比(复苏的未处理cfu/mL约为30％)，抗微生物活性明显升高(剩余的未处理cfu/mL低于5％)。单独用rhDNA酶处理对绿脓杆菌没有影响。这些结果说明G10KHc/PMSF或G10KHc-D在痰液中的杀伤效应可通过与痰液溶粘蛋白剂共处理而进一步增强，后者可降低痰液的粘滞度，促进肽的扩散。
3.5 结论。总之，当通过构建D版本肽和/或共同给予蛋白酶抑制剂和/或联合rhDNA酶以防止蛋白酶裂解后G10KHc的活性得以扩展。尤其是我们发现，如果通过化学拮抗剂或通过构建D氨基酸对映异构体G10KHc抑制了与痰液相关的丝氨酸蛋白酶依赖的降解，那么G10KHc STAMP在痰液中的高活性就能够保持。另外我们还发现，当样品用肽和rhDNA酶联合处理后，STAMP在痰液中的活性进一步升高。这些结果说明探索CF联合治疗方法的重要性，尤其是用蛋白酶敏感的肽药物如G10KHc作为常规小分子抗生素的替代物或与其联合使用时。
实施例4.肽1903和BD2.21的鉴定及其STAMP。
导向肽1903是通过扫描突变链球菌UA140的基因组序列获得的。我们分析了公开的基因组的预测开放阅读框架(ORF)，记录下编码50个氨基酸以内的蛋白的那些ORF，经过扫描整个基因组后重新分析。筛选出多个经预测可被这些ORF编码的肽，用荧光素标记物合成，检测其与突变链球菌的结合能力。结果发现肽1903具有与突变链球菌结合的活性，然后用它来合成以1903为基础的STAMP。
BD2.21是作为“β缺失2”抗微生物肽文库的一部分经过合理设计获得的。在指定位置上用带最多正电荷(C)和最疏水(H)的残基取代常见的α螺旋残基排列HHCCHHCHHH(n)。在我们所使用的残基模式中有某些变化，插入了一些非疏水残基和不带电荷的残基。每个肽中的取代限制在3-5个阳离子氨基酸和4-7个疏水残基(总共9到12个)。测定修饰对肽的抗微生物效应的影响，结果发现BD2.21抗浮游突变链球菌的MIC为5.5uM。然后利用BD2.21合成以BD2.21为基础的STAMP，如1903-BD2.21，其中包含如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列NIFEYFLE-GGG-KLFKFLRKHLL，以及包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-KLFKFLRKHLL的C16-BD2.21。
单一物种突变链球菌成熟生物膜的杀伤。突变链球菌生物膜用105细胞/孔接种，在48孔板(总体积400μL)中用1％蔗糖(TH培养基)培养。孵育以后，从生物膜上去除上清，替换以200μL含50μM STAMP的PBS。单纯PBS为阴性对照(100％存活)，乙醇为生物膜完全杀伤对照(0％存活)。生物膜用肽处理20分钟，然后用1×PBS洗涤。为了测定生物膜的存活情况，每孔加入20μL用160μL TH培养基稀释的CellTiterBlue。3-5分钟以后，将上清液转移到96孔板内，测定570nm处的吸光度值。在570处有高吸光度值说明有较多的底物被生物膜内剩余的活细胞还原。如图13所示，结果说明只需经过20分钟的处理，C16-BD2.21和1903-BD2.21就能分别杀死生物膜内66％和85％的活突变链球菌。
STAMP抗口腔链球菌多物种生物膜的选择性。为了测定STAMP的选择性，将混合生物膜接种到48孔板内。草绿色链球菌、龋齿链球菌、格式链球菌和血链球菌与突变链球菌菌株JM11(壮观霉素耐药的)按1:1:1:1:10的比例混合，每孔细胞总数为105。生物膜在含1％蔗糖、1％葡萄糖和1％甘露糖的TH培养基内过夜培养18-24小时。然后按照单一物种生物膜试验的方法用PBS加STAMP处理成熟生物膜，设定的对照组相同。处理以后，生物膜用PBS洗涤两次，每孔加入100μL PBS，用无菌吸管物理破坏生物膜。然后将细胞悬液无菌稀释10倍到106。稀释的悬液接种到TH培养基和添加800μg/mL壮观霉素的TH上。通过计数只含TH的平皿上的克隆数来确定生物膜的杀伤总量(所有链球菌)。对照：未处理为100％，对应于从未处理生物膜记录的cfu/mL数，乙醇无菌样品得到的数据为0％存活。通过计数TH-壮观霉素平皿上的克隆来确定突变链球菌杀伤数，组合的总cfu/mL用于计算突变链球菌:总菌群的比例。1:1说明没有选择性。
如图14所示，C16-BD2.21对总cfu/mL群没有影响，说明STAMP对非突变链球菌没有明显影响(参见图14(A))。这一点可被所观察到的存活突变链球菌与总链球菌的比例所证实，这一比例为0.075(参见14(B))。1903-BD2.21也具有选择比(远低于1，参见图14(B))，尽管其对其他口腔链球菌也有某些影响(参见图14(A))。
表7.抗微生物肽
雄抗菌肽(SEQ ID NO 54)
VFDILDKMENAIHKAAQAGIGIAKPIEKMILPK
阿皮德新(SEQ ID NO 55)
GNRPVYIPPPRPPHPRL
细菌素留可辛(leucocin)A(SEQ ID NO 56)
KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAFSAGVHRLANGGNGFW
贝可替新(SEQ ID NO 57)
RLCRIVVIRVCR
布弗林II(SEQ ID NO 58)
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
抗菌肽(人LL-37)(SEQ ID NO 59)
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES
可莱弗宁A(SEQ ID NO 60)
VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF
天蚕抗菌肽(SEQ ID NO 61)
RWKIFKKIEKVGQNIRDGIVKAGPAVAVVGQAATI
环十二肽(SEQ ID NO 62)
RICRIIFLRVCR
β-防卫素I(人)(SEQ ID NO 63)
DFASCHTNGGICLPNRCPGHMIQIGICFRPRVKCCRSW
α-防卫素(HNP-1)(SEQ ID NO 64)
ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGTLWAFCC
杰古林(SEQ ID NO 65)
SLFSLIKAGAKFLGKNLLKQGACYAACKASKQC
组肽(SEQ ID NO 66)
DSHEERHHGRHGHHKYGRKFHEKHHSHRGYRSNYLYDN
吲哚素(SEQ ID NO 67)
ILPWKWPWWPWRR
滑爪蟾素II(SEQ ID NO 68)
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS
蜂毒肽B(SEQ ID NO 69)
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
乳链球菌素A(SEQ ID NO 70)
ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK
诺弗斯匹林G10(SEQ ID NO 35)
KNLRRIIRKGIHIIKKYG
普特格林(Protegrin)(SEQ ID NO 34)
RGGRLCYCRRRFCVCVGR
牛蛙防御肽(SEQ ID NO 71)
LGGLIKIVPAMICAVTKKC
中国鲎肽(SEQ ID NO 72)
KWCFRVCYRGICYRRCR
极大肽H5(Maximin H5)(两栖动物)(SEQ ID NO 73)
ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL
表面活性剂提取物1(SEQ ID NO 74)
DDDDDD
DCD-1(SEQ ID NO 75)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV
SSL-25(SEQ ID NO 76)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA
SSL-23(SEQ ID NO 77)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGK
皮抑菌肽DS5(SEQ ID NO 78)
GLWSKIKTAGKSVAKAAAKAAVKAVTNAV
家蚕抗菌肽(昆虫)(SEQ ID NO 79)
AKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKA
铃蟾抗菌肽(蛙)(SEQ ID NO 80)
GIGALSAKGALKGLAKGLAEHFAN
胸膜肽(Pleurocidin)(白鲽)(SEQ ID NO 81)
GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALHTYL
SMAP29(绵羊)(SEQ ID NO 81)
RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG
PMAP-23(猪)(SEQ ID NO 83)
RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR
VCP-5h(黄蜂)(SEQ ID NO 84)
FLPIIGKLLSGLL-NH2
艾比新(Abaecin)(蜜蜂)(SEQ ID NO 85)
YVPLPNVPQPGRRPFPTFPGQGPFNPKIKWPQGY
果蝇菌素(果蝇)(SEQ ID NO 86)
GKPRPYSPRPTSHPRPIRV
吡咯霍可瑞新(Pyrrohocoricin)(吸汁啄木鸟臭虫)(SEQ ID NO 87)
VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN
L15K7(SEQ ID NO 88)
KLLKLLLKLLKLLLKLLLKLLK
KLApep(SEQ ID NO 89)
KLALKLALKAWKAALKLA-NH2
D2A21(SEQ ID NO 90)
FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF
建模肽(Modelin)-1(SEQ ID NO 91)
KLWKKWAKKWLKLWKAW
LARL(SEQ ID NO 92)
Ac-LARLLARLLARL-Ac
YLK-P(SEQ ID NO 93)
YKLLKLLLPKLKGLLFKL-NH2
KSL2(SEQ ID NO 94)
KKVVFKFKFK-NH2
CAM135(SEQ ID NO 95)
GWRLIKKILRVFKGL-NH2
PGAa(SEQ ID NO 96)
GILSKLGKALKKAAKHAAKA-NH2
PGYa(SEQ ID NO 97)
GLLRRLRDFLKKIGEKFKKIGY-NH2
本说明书中的参考文献列于下文，本文已完整纳入作为参考。
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Claims (27)

1.一种包含具有如SEQ ID NO.2、5或10所示的氨基酸序列的导向肽的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述导向肽连接于接头肽的一个末端，所述接头肽的另一个末端连接有抗微生物肽。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述接头肽具有选自如下一组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述抗微生物肽选自下组：SEQ ID NOs 34-35和SEQ ID NOs 54-97。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗微生物肽所具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 3、7和11。
6.如权利要求1所述的组合物，该组合物还包含可检测试剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述导向肽连接于偶联于可检测试剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述可检测试剂选自放射性同位素、荧光剂或酶底物剂。
9.一种包含具有如SEQ ID NO.3、7或11所示的氨基酸序列的抗微生物肽的组合物。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗微生物肽连接于接头肽的一个末端，所述接头肽的另一个末端连接有导向肽。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述接头肽具有选自如下一组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28。
12.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述导向肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNOs 2、5和10。
13.一种STAMP组合物，该组合物包含：
a)导向肽，所述导向肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、5和10；
b)接头肽，所述接头肽的一个末端连接有导向肽；以及
c)抗微生物肽，所述抗微生物肽连接于接头肽的另一个末端。
14.如权利要求13所述的STAMP组合物，其特征在于，所述接头肽具有选自如下一组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28。
15.如权利要求13所述的STAMP组合物，其特征在于，所述抗微生物肽选自下组：SEQ ID NOs 34-35和SEQ ID NOs 54-97。
16.如权利要求13所述的STAMP组合物，其特征在于，所述抗微生物肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 3、7和11。
17.如权利要求16所述的STAMP组合物，其特征在于，所述STAMP具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID Nos 4、6、8、9、12、13、14、15和16。
18.一种STAMP组合物，该组合物包含：
a)抗微生物肽，所述抗微生物肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.3、7或11；
b)接头肽，所述接头肽的一个末端连接有抗微生物肽；以及
c)导向肽，所述导向肽连接于接头肽的另一个末端。
19.如权利要求18所述的STAMP组合物，其特征在于，所述接头肽具有选自如下一组的氨基酸序列：SEQ ID NOs 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28。
20.一种STAMP组合物，该组合物包含
a)导向肽，所述导向肽具有长度为4-50个氨基酸的氨基酸序列；
b)接头肽，所述接头肽的一个末端连接有导向肽；
c)抗微生物肽，所述抗微生物肽连接于接头肽的另一个末端；以及
d)抗生素。
21.如权利要求20所述的STAMP组合物，其特征在于，所述抗生素选自下组：β-内酰胺类抗生素、阿莫西林、杆菌肽、氯霉素、克林霉素、卷曲霉素、粘菌素M、环丙沙星、强力霉素、红霉素、夫西地酸、磷霉素、夫西地酸钠、短杆菌肽、庆大霉素、林可霉素、米诺环素、大环内酯类、单酰胺菌素、萘啶酸、新生霉素、氧氟沙星、利福霉素、四环素、万古霉素、妥布霉素和甲氧苄氨嘧啶。
22.一种STAMP组合物，该组合物包含：
a)导向肽，所述导向肽具有长度为4-50个氨基酸的氨基酸序列；
b)接头肽，所述接头肽的一个末端连接有导向肽；
c)抗微生物肽，所述抗微生物肽连接于接头肽的另一个末端；以及
d)能增强或维持所述肽的活性的药物。
23.STAMP组合物，所述试剂是蛋白酶抑制剂或rhDNA酶。
24.选择性杀伤或抑制对象内靶微生物的方法，该方法包括给予对象如权利要求13、18、20或22所述的STAMP的步骤，所述导向肽可特异性结合靶微生物。
25.选择性杀伤或抑制生物膜内靶微生物的方法，该方法包括给予生物膜如权利要求13、18、20或22所述的STAMP的步骤，所述导向肽可特异性结合靶微生物。
26.一种STAMP组合物，该组合物包含：
a)导向肽，所述导向肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、5或10；以及
b)抗微生物肽，所述抗微生物肽通过肽键连接到导向肽上。
27.一种STAMP组合物，该组合物包含：
a)抗微生物肽，所述抗微生物肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.3、7或11；以及
b)导向肽，所述导向肽通过肽键连接到抗微生物肽上。
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