CN114340648A

CN114340648A - 引导性抗微生物肽的益生菌递送

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Publication number: CN114340648A
Application number: CN202080061002.5A
Authority: CN
Inventors: C·M·卡尼; A·乔杜里; P·奥尔蒂斯
Original assignee: Baylor University
Current assignee: Baylor University
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-04-12
Also published as: WO2021034879A1; AU2020333754A1; JP2022545085A; MX2022002049A; CA3145919A1; EP4017514A1; US20210052679A1; BR112022001845A2

Abstract

本公开涉及对抗所选择的肠道中的细菌(例如幽门螺杆菌(H.pylori))的治疗策略。该策略使用基于益生菌(probiotic‑based)的系统来表达引导性抗微生物肽并将该引导性抗微生物肽递送至肠道。该引导性抗微生物肽由杂合基因表达，该杂合基因编码与引导肽融合的抗微生物肽，该引导肽与靶细菌的蛋白结合。该技术可以从肠道微生物中选择性且特异性地消除靶细菌。在株(strain)、种(species)或属(genus)水平上的靶向特异性取决于用于提供靶向的引导肽的序列。治疗可以通过口服施用，例如通过使用可摄取的益生素。

Description

引导性抗微生物肽的益生菌递送

背景

本公开涉及消除特定肠道菌种(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))而不改变微生物群系(microbiome)的方法。

肠道微生物群以多种方式影响人类健康。肠道微生物群系含有100+万亿个细菌，并且主要参与介导宿主的免疫应答，同时还执行其他基本功能，包括从食物中提取营养和能量。肠道的细菌构成使人们易出现健康问题，范围从肥胖到癌症再到心理障碍。对微生物群系的破坏(失调)导致包含人的正常保护性微生物群落(mircoflora)在内的细菌类型和数量的不平衡。有许多因素导致失调，包括摄入病原菌和抗生素介导或免疫抑制介导的微生物群系耗竭。失调与许多人类疾病有关，包括肠道以及肠道外疾病。文献表明，失调牵涉IBS即炎症性肠病和结直肠癌以及过敏、心血管疾病和精神疾病的发病机理。另外，鉴于在无病菌动物模型中已显示疾病的严重程度和/或发病率降低，因此肠道微生物群(microbiota)被认为是自身免疫性疾病的前兆。

在其他情况下，肠道细菌的变化是由于摄入可能产生肠病的危险病原体所致。几乎没有(若有)已被报道的有效消除作为活跃病原体或作为使人易患各种疾患的微生物群系的参与者导致肠道问题的特定菌种的方法。

幽门螺杆菌是一种肠道细菌，其是导致消化性溃疡和胃癌的主要原因。在癌症中胃癌导致的死亡人数居全球第三，且在远东地区尤为常见(Bahkti等人，2020)。仅有1/5的胃癌患者在诊断后活得过5年。幽门螺杆菌被国际癌症研究机构认定为第1类致癌物。据估计，有44亿人感染幽门螺杆菌，其中发展中国家的感染率最高(非洲的患病率为70％)(Hooi等人，2017)。在美国，幽门螺杆菌在非白人人群中的发生频率是白人人群的两倍(Everhart等人，2000)，并且与全世界较低的社会经济状态有关。

尚没有针对幽门螺杆菌的商业疫苗。尽管在一些使用抗生素治疗的国家，在降低幽门螺杆菌患病率方面取得了一些进展，但现在在幽门螺杆菌分离株中发现抗生素耐药率大幅增加。在韩国，幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率在仅4年(2005-2009年)内从11％升高至60％，中国和日本也报道了类似的增长(Thung等人，2016)。尽管标准治疗实际上是三联抗生素疗法，但抗生素耐药率继续上升。因此，很难看到通过抗生素治疗幽门螺杆菌的前景。其他细菌也面临类似的挑战。

概述

本公开涉及对抗所选择的肠道中的细菌(例如幽门螺杆菌)的治疗策略。该策略使用基于益生菌的系统表达引导性抗微生物肽和将引导性抗微生物肽递送至肠道。该引导性抗微生物肽由益生菌DNA中的杂合基因表达，并且可以是与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，该引导肽负责与靶细菌的蛋白结合。融合可以在有或没有接头序列即不依赖于接头序列的存在的情况下进行。该技术可以从肠道微生物群中选择性地且特异性地消除靶细菌。在株、种或属水平上的靶向特异性取决于用于提供靶向的引导肽的序列。治疗可以通过口服施用，例如通过使用可摄取的益生素。

本文所述的优选实施方案涉及用于控制靶细菌例如幽门螺杆菌的方法，该方法不包括抗生素。为了递送活性蛋白，该方法使用工程化益生菌。优选实施方案利用乳酸菌，包括乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)的种，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，它们是食品级细菌，对于人类食用具有安全性或已被FDA授予GRAS状态(公认安全)，并且广泛商业地用于加工乳制品。益生素是一项被充分认可的技术，其价格低廉、高度可扩展且在商业上非常成功。这些商业特性使这项技术特别适合大规模应用，特别是在发展中国家。

益生菌可以被配制为益生素市场上常见的被认可食品，例如干酸奶颗粒，其无需冷藏即可储存数月。以这种形式，前往国外的旅行者或长期移居国外的人员或士兵可以与食物一起服用该产品，可能每周两次，作为疾病预防剂(“预防性”)。这种治疗也可以作为患者生病后食用的疗方。

这项技术是重要且有利的，因为它利用的引导性抗微生物肽仅消除靶细菌而微生物群落的所有其他成员不受干扰。使用被摄入并在消化系统中保持有活性以直接在患者肠道中分泌引导性重组抗微生物肽的益生菌也与先前的技术极为不同。

附图说明

图1显示了用于在大肠杆菌BL21细胞中表达的携带AMP的pE-SUMOstar载体。SUMO蛋白酶位点位于SUMO和A12C-AMP之间。

图2显示了SUMO/AMP在大肠杆菌中的表达和AMP的切割(使其)不含SUMO融合配偶体)。

图3显示了针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的eurocin和假黑盘菌素(plectasin)的非靶向和靶向类似物的最小抑制浓度(MIC)(以μM计)的对数值。

图4显示了枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(顺时针)的细胞动力学曲线，通过对细菌在每种肽存在下生长的log CFU/ml作图创建。

图5显示了对于4种细菌(枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)，通过相对于4种AMP的浓度对结晶紫(540nm)的吸光度作图评价的生物膜抑制活性。

图6显示了对反向管饲法(reverse gavage)的胃提取物的PCR分析结果，证明摄入后三天，小鼠胃中存在携带空载体、具有抗微生物肽的载体以及具有抗微生物肽和来自多聚蛋白的引导肽的载体的乳酸乳球菌。

图7显示了根据本文描述的优选实施方案的用于转化乳酸乳球菌的载体。

图8显示了大肠杆菌在不同抗生素稀释液以及分泌抗微生物肽与引导肽或分泌抗微生物肽但不分泌引导肽的乳酸乳球菌肉汤培养物上清液的存在下的存活率。

图9显示了用于乳酸乳球菌分泌AMP和gAMP的示例性载体。

图10显示了对VacA基因的qPCR结果，显示通过在体外与表达gAMP或AMP的乳酸乳球菌(L.lactis)共培养消除了幽门螺杆菌。

图11显示了与表达空载体(pTKR)、AMP(alyteserin、laterosporulin或CRAMP)或gAMP(MM1-alyteserin、MM1-laterosporulin或MM1-CRAMP)的乳酸乳球菌共培养24小时后植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的生长。

图12显示了与表达空载体(pTKR)、AMP(alyteserin、laterosporulin或CRAMP)或gAMP(MM1-alyteserin、MM1-laterosporulin或MM1-CRAMP)的乳酸乳球菌共培养24小时后大肠杆菌(Esherichia coli)的生长。

图13显示了幽门螺杆菌的CFU/μl与qPCR C_T值的标准曲线。

图14显示了在接种幽门螺杆菌后第5天用分泌AMP或gAMP的乳酸乳球菌益生素处理的小鼠中进行的关于幽门螺杆菌的CFU/μl与接种后天数的治疗试验。

图15显示了一项预防性试验，对于对照小鼠(空白)以及接种空载体(pTKR)或分泌AMP或gAMP的乳酸乳球菌益生素(其中MM1＝多聚蛋白1引导肽)的小鼠、之后在第4天接种幽门螺杆菌，显示了小鼠胃液中幽门螺杆菌的CFU/μl。

图16显示了在不存在幽门螺杆菌的情况下采用四种不同处理的小鼠胃细菌群的分类多样性差异：抗生素处理、具有空载体的乳酸乳球菌益生素、缓冲液模拟接种、表达AMP的益生菌、表达gAMP的益生菌。

图17显示了不同处理下四种细菌指示性菌种的相对丰度差异；葡萄球菌属(Staphylococcus)和不动杆菌属(Acinetobacter)与失调有关，而乳杆菌属和Muribacter与微生物群健康有关；第0天是在任何处理之前；第5天是感染幽门螺杆菌5天后；第8天和第10天分别是在各种治疗性处理(具有空载体或表达AMP或gAMP的益生菌)之后的3天和5天。

图18显示了四个处理组(空载体组(仅携带空载体的益生菌)、空白组(模拟接种缓冲液)、靶向组(表达gAMP的益生菌)和非靶向组(表达AMP的益生菌)的小鼠胃中发现的菌种的测序数据与空载体组相比的分类学差异(距离)。

图19显示了四个处理组(空载体组(仅携带空载体的益生菌)、空白组(模拟接种缓冲液)、靶向组(表达gAMP的益生素)和非靶向组(表达AMP的益生素)的小鼠胃中发现的菌种的测序数据与空白组相比的分类差异(距离)。

图20显示了在四种不同处理(空载体(仅携带空载体的益生菌)、空白(模拟接种缓冲液)、靶向组(表达gAMP的益生素)和非靶向组(表达AMP的益生素))后，累积五天在小鼠胃中发现的菌种的测序数据的累积分类学差异(香农熵)。

优选实施方案的详细描述

本公开涉及使用表达和分泌杀死破坏性细菌而不损害其他细菌的蛋白的益生素靶向和消除靶细菌的手段。

在优选实施方案中，本技术涉及益生菌，该益生菌已被转化成包括DNA构建体以获得引导性抗微生物肽。在优选实施方案中，该益生菌是对于人类食用安全的细菌，例如乳酸乳球菌。编码引导性抗微生物肽的序列包括与编码抗微生物肽的序列融合的编码靶向(引导)肽的序列，并被益生菌表达为杂合蛋白。引导肽对靶细菌具有特异性，并将抗微生物肽的作用局限于特定细菌。

因此，本文描述的优选实施方案涉及一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的靶细菌引起的病症的益生素，其包含益生菌。该益生菌优选为乳酸菌，例如乳球菌属的细菌，且优选为乳酸乳球菌。该益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码该引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，该引导肽与靶细菌的蛋白结合。该靶细菌的蛋白是毒力因子。在优选实施方案中，该靶细菌是幽门螺杆菌并且该毒力因子是VacA。该引导肽可以是多聚蛋白-1。该引导性抗微生物肽杀死受试者的胃肠道中的靶细菌。在与非引导性抗微生物肽、抗生素或其他广谱治疗相比时，该引导性抗微生物肽还最小限度地破坏受试者的胃肠道中存在的其他细菌。

如本文所用，“最小限度地破坏”意指引导性抗微生物肽不引起将导致健康影响的破坏，与导致细菌丰度的技术变化截然相反。“最小限度地破坏”还意指引导性抗微生物肽不明显破坏其他非靶细菌，因为这种破坏将导致健康影响。

优选实施方案涉及一种益生系统，该益生系统将抗微生物肽(AMP)递送至肠道。抗微生物肽是植物、动物和真菌产生用于防止细菌感染的天然产物(Ngyuen等人，2011)。然而，AMP本身具有广谱活性，类似于抗生素。抗生素的广泛活性已被充分证明导致微生物群失调。许多出版物已经证明抗生素引起的失调与类风湿性关节炎、炎性肠病、糖尿病、肥胖和其他疾患之间的联系(参见Keeney等人，2014的综述)。这是过度使用抗生素的后果之一，并且非选择性AMP拥有同样的弱点。本文描述的优选实施方案中使用的示例性AMP包括laterosporulin相关的抗微生物肽、alyteserin相关的抗微生物肽和cathelin相关的抗微生物肽(CRAMP)。

为了解决这种失调问题，本文描述的优选实施方案包括与AMP融合的引导肽，该融合物由益生菌的相应引导肽-AMP杂合基因产生。这使得由此产生的引导性AMP(gAMP)能够与靶细菌(例如幽门螺杆菌)特异性地结合，从而使肠道的共生细菌在很大程度上不受干扰。通过这种方式，表达gAMP的益生菌将在胃中繁殖并选择性地杀死靶病原体幽门螺杆菌，而没有与抗生素和其他广谱治疗相关的健康问题。其他靶细菌也可以经类似处理，而本文使用幽门螺杆菌作为例子。

在优选实施方案中，本文描述的引导肽的特异性基于细菌毒力因子与其所结合的宿主受体的天然特异性。VacA是由所有幽门螺杆菌分离株产生的毒力因子蛋白(Fitchen等，2005)。它虽是分泌型，但也粘附在幽门螺杆菌细胞的表面(Fitchen等人，2005)。VacA天然地结合人受体蛋白多聚蛋白-1。本文描述的优选实施方案利用了多聚蛋白-1蛋白的VacA结合序列(aa321-340)(Satoh等人，2013)作为gAMP的引导肽。如此，这些gAMP将通过与VacA结合而定位于幽门螺杆菌的表面，然后AMP部分可以发挥作用而使细菌膜不稳定并特异性杀死幽门螺杆菌细胞。

优选实施方案中描述的益生gAMP不同于类似技术。它们具有抗生素和非引导性AMP不存在的选择性。益生素的使用使得可能比从异源表达系统纯化gAMP蛋白或化学合成gAMP蛋白便宜得多地生产益生gAMP。这种选择性和低成本可扩展性的结合对于廉价且丰富的抗生素的任何替代品在商业上取得成功并因此到达预期患者至关重要。

本文公开的优选实施方案涉及可食用乳酸乳球菌益生菌，其中该益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码该引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，该引导肽与幽门螺杆菌的VacA肽结合，该引导性抗微生物肽由乳酸乳球菌的相应杂合基因产生，其中抗微生物肽是laterosporulin、alyteserin或cathelin相关的抗微生物肽，并且其中引导性抗微生物肽杀死患者的胃肠道中的幽门螺杆菌而不对其他菌种造成明显的破坏作用。换言之，表达引导性抗微生物肽的益生菌不破坏胃微生物群的分类学平衡并且不造成长期损害。

另外的优选实施方案涉及一种治疗与幽门螺杆菌相关的疾病或病症的方法，该方法通过向受试者施用可食用的益生素，其中该可食用的益生素被摄入并在受试者的肠道中保持足够长时间有活性，以分泌杀死幽门螺杆菌的引导性抗微生物肽。

在本发明的另一方面，提供了一种益生素组合物，该益生素组合物包括治疗有效量的转化的乳酸乳球菌益生菌(该乳酸乳球菌表达引导性抗微生物肽)和可接受的赋形剂、佐剂、载体、缓冲液或稳定剂。“治疗有效量”应理解为足以显示对幽门螺杆菌的抑制作用的示例性益生素的量。施用的实际量、速率和时程取决于所治疗的病症或疾病的性质和严重程度。治疗处方在一般的从业者和其他医生的责任范围内。可接受的赋形剂、佐剂、载体、缓冲液或稳定剂应该是无毒的并且不应干扰所分泌的抗微生物蛋白的有效性。载体或其他材料的确切性质取决于施用途径，优选为口服。

可用于所公开的益生素组合物中的乳酸乳球菌可以以活培养物、休眠材料或其组合提供。本领域技术人员将理解，可以通过例如本领域技术人员熟知的冻干方法使细菌乳酸乳球菌进入休眠状态。

合适的冻干工艺的实例可以从携带合适的乳酸乳球菌的培养基开始，可以向该培养基中添加合适的保护剂以保护细胞，然后冻干。合适的保护剂的实例包括但不限于蒸馏水、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、脱脂牛奶、木糖、半纤维素、果胶、直链淀粉、支链淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、淀粉(例如马铃薯淀粉或大米淀粉)和聚乙烯吡咯烷酮。可用于冻干工艺的气体包括但不限于氮气和二氧化碳。

在一方面，所公开的益生素组合物中的乳酸乳球菌可以作为在溶液或介质中的分散体提供。在另一方面，所公开的益生素中的乳酸乳球菌可以以半固体或饼状物(cake)提供。在另一方面，所公开的益生素中的乳酸乳球菌可以以粉末形式提供。

可以使用发酵工艺产生大量合适的乳酸乳球菌。例如，可向无菌、厌氧发酵罐装入培养基，例如葡萄糖、多糖、寡糖、单糖和二糖、酵母提取物、蛋白质/氮源、大量营养素和微量营养素(维生素和矿物质)，并且可以向该培养基中添加期望的乳酸乳球菌的培养物。在发酵过程中，可以监测浓度(菌落形成单位/克)、纯度、安全性和无污染物，以确保最终质量结果。发酵后，乳酸乳球菌细胞可以使用各种熟知的技术例如过滤、离心等从培养基中分离。分离的细胞可以通过例如冻干、喷雾干燥、加热干燥或其组合被干燥，并根据需要添加保护溶液/培养基。

益生素组合物可以以各种形式(例如胶囊、栓剂、片剂、食品/饮料等)制备。益生素组合物可以包括多种药学上可接受的赋形剂，例如微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、脱脂乳粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉及其组合。

益生素组合物可以被制备成胶囊。胶囊(即载体)可以是由各种物质例如明胶、纤维素、碳水化合物等形成的中空的、通常为圆柱形的胶囊。胶囊可以将益生菌容纳于其中。任选地，且除了合适的益生菌之外，胶囊可以包括但不限于着色剂、调味剂、大米淀粉或其他淀粉、甘油、焦糖色和/或二氧化钛。

益生素组合物可以被制备成栓剂。栓剂可以包括但不限于合适的益生菌和一种或多种载体，例如聚乙二醇、阿拉伯胶、乙酰化甘油单酯、巴西棕榈蜡、邻苯二甲酸醋酸纤维素、玉米淀粉、邻苯二甲酸二丁酯、多库酯钠、明胶、甘油、氧化铁、高岭土、乳糖、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、药用糖衣(glaze)、聚维酮、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、山梨糖醇单油酸酯、蔗糖、滑石、二氧化钛、白蜡和着色剂。

益生素组合物可以被制备成片剂。片剂可以包括适当的益生菌和一种或多种压片剂(即载体)，例如磷酸氢钙、硬脂酸、交联羧甲基纤维素、二氧化硅、纤维素和纤维素包衣。片剂可以使用直接压制工艺形成，但本领域技术人员将理解可以使用各种技术来形成片剂。胶囊也可用于容纳组合物。

益生素组合物可以被制成食品或饮料，可选地，被制成食品或饮料的添加剂，其中将适量的益生菌添加到食品或饮料中以使该食品或饮料成为载体。

益生素组合物中益生菌的浓度可以根据尤其是，期望的结果、所使用的细菌类型、施用的形式和方法等而变化。例如，基于制剂的总重量，可以制备在制剂中具有益生菌计数不小于约1×10⁶个菌落形成单元(CFU)/克的益生素组合物。

当乳酸菌用作肠道表达媒介物时，在具有或没有以上提到的辅助剂或载体的情况下，可以使用各种乳制品(例如酸奶、酸奶粒或其他乳制品)作为用于口服施用的物理载体。

在另一方面，提供了治疗有效量的如上定义的益生素在生产用于向受试者施用的药物中的用途。

术语“治疗有效量”意指无毒但足以提供期望的治疗效果的量的益生素。“有效”的量将因受试者而异，其取决于个体的年龄和一般状况、被施用的特定浓度和组合物等。因此，并不总是可以指定确切的有效量。然而，任何个体实例的适当有效量可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。此外，有效量是在足以允许制剂易于应用以便递送治疗有效范围内的药物量的范围内的浓度。

预期其最终形式的益生素将具有非常低的生产成本并且是高度可扩展的。此外，它应该具有长的保质期且无需冷藏。可以不需要医生的处方。因此，预期市场特别广。预期该益生素将以非常低的价格提供高水平的控制。

本文描述的益生素组合物可用于预防或治疗人和动物中的幽门螺杆菌感染或者由幽门螺杆菌引起的疾病或疾患。在暴露于幽门螺杆菌之前或用幽门螺杆菌激发之前，益生素组合物可以作为预防剂施用。在发生幽门螺杆菌感染后，益生素组合物可以治疗性地施用。益生素组合物可以掺入到动物饲料或动物饮用水中。

实施例1

已开发了特异性杀死某些病原菌而不损害无关共生细菌的工程化蛋白。杀伤的特异性是由杂合基因表达的附接至抗微生物肽的靶向(引导)肽带来的。在本实施例中，皮肤病原体金黄色葡萄球菌使用由大肠杆菌表达系统产生的纯化的引导性抗微生物蛋白来靶向。但是，可以修饰该靶向系统以特异性杀死任何细菌。

在本实施例中，两种常用的抗微生物肽(AMP)假黑盘菌素和eurocin与靶向肽A12C基因融合，A12C选择性地结合葡萄球菌属的种。应该注意的是，A12C肽使用通用生物淘选技术开发；理论上，使用这种方法来生产引导蛋白可以靶向任何细菌。A12C由另一实验室开发，以用作囊泡的引导蛋白，这也说明为了其他目的开发的肽可以被重新目的化以用作抗微生物肽的引导蛋白。靶向肽并未降低针对待靶向的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的活性，但显著降低了针对非靶向物种粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的活性。这种效果跨两种不同的AMP、两种不同的葡萄球菌属的种、两种不同的阴性对照细菌以及针对细菌的生物膜和浮游生物形式同样明显。

方法：

试剂。使pE-SUMOstar载体(LifeSensors)在10-β和BL21大肠杆菌(New EnglandBiolabs)中生长，并使用内部生产的Ulp1蛋白酶从表达的融合物/AMP中释放AMP。AMP，假黑盘菌素(GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY(SEQ ID NO:1)；MW 4408)和eurocin(GFGCPGDAYQCSEHCRALGGGRTGGYCAGPWYLGHPTCTCSF(SEQ ID NO:2)；MW 4345)由pE58 SUMOstar表达为A12C-假黑盘菌素(MW6137)和A12C-eurocin(MW 6074)，二者均具有A12C靶向肽(加下划线的)加上与相应AMP序列的N端基因融合的短接头(GVHMVAGPGREPTGGGHM)(SEQ ID NO:3)。作为对照，假黑盘菌素和eurocin还在N端与AgrD1细菌信息素序列(YSTCYFIM)(SEQ ID NO:4)(Mao等人2013)缀合。合成A12C肽(Biosynthesis)用作“仅靶向肽”对照。图1显示了用于在大肠杆菌BL21细胞中表达的携带AMP的pE-SUMOstar载体。SUMO蛋白酶位点位于SUMO和A12C-AMP之间。

融合蛋白的表达、纯化和分析。合成AMP的DNA序列(Integrated DNATechnologies)并连接到pE66 SUMOstar载体中并克隆到大肠杆菌10-β细胞中。使用来自这些的质粒转化大肠杆菌BL21细胞以进行蛋白表达。根据标准程序培养转化的培养物并用IPTG诱导。将得到的细菌沉淀物重悬于PBS/25mM咪唑/0.1mg/ml溶菌酶中并冷冻过夜。然后将细胞解冻、超声处理并在4℃以80,000×g超速离心1h，并通过镍柱层析纯化上清液中的6his/SUMO/AMP融合蛋白。在4℃使用Ulp1(每100μg融合蛋白1U)通过蛋白水解将AMP与SUMO分离，并通过SDS-PAGE评价切割。由SDS-PAGE数据计算产量，使用NIH ImageJ和用于质量参考的标记泳道条带测量条带密度。使用质谱法确保AMP从SUMO载体蛋白正确切割。对从SDS-PAGE凝胶切除的AMP进行凝胶内胰蛋白酶消化(Thermo Fisher)。在贝勒大学质谱中心通过LC-ESI-MS(Synapt G2-S，Waters)检查消化物。MS数据的分析通过MassLynx(v4.1)完成。每种蛋白的光谱，无论是非靶向的还是靶向的，均以峰为中心并进行MaxEnt3处理，然后与通过相应蛋白的模拟胰蛋白酶消化产生的肽的假设峰进行匹配。

溶血活性测定。通过暴露于洗涤过的人红细胞，评估引导性AMP、非引导性AMP和合成A12C肽的人溶血活性。使用标准程序(Evans等人2013)采集健康志愿者的全血细胞，并将细胞在磷酸盐缓冲盐水中稀释至5×10⁸个细胞/ml。为了引发溶血，将190μl细胞加入20μl的在磷酸盐缓冲盐水中2倍连续稀释的肽/检测试剂。不含肽的孔用作阴性对照，而含有1％85Triton X-100的孔用作阳性对照。

体外杀菌活性测定。针对以下四种细菌菌株测试Ulp-1蛋白酶切割的蛋白的抗微生物测定：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌。选择这四个物种是因为它们是革兰氏阳性菌，并且AMP假黑盘菌素和eurocin对革兰氏阳性菌具有特异性活性(Mygind等人2005，Oeemig等人2012)。组分对照是游离SUMO蛋白和合成产生的A12C肽。万古霉素用作阳性对照。使用伴随连续稀释的微量滴定板测定的标准方案，其中受试肽的连续2倍稀释在96孔板中进行，该96孔板在肽稀释液之间含有一致的细菌接种。使细菌在肽存在下生长后，用刃天青(resazurin)测定细胞活力。针对所有菌种的所有肽的实验均以各自进行>5次重复。

体外细胞动力学研究。测定Ulp-1蛋白酶切割的肽以确定它们对正在生长的培养物中的细菌的动态作用。使细菌在37℃振荡生长并稀释至～1×10⁸CFU/mL。向这些培养物中加入假黑盘菌素或eurocin(浓度为各自的最小抑制浓度的3倍)，或处于这些相同的相应浓度的A12C靶向形式。万古霉素对照浓度是所使用的假黑盘菌素或eurocin的摩尔浓度的平均值。然后从加入肽后2-10h起监测生长，将10μl培养物稀释在培养基中并铺涂到Mueller-Hinton琼脂板上。第二天记录菌落数量。

体外生物膜抑制测定。除了浮游培养物外，还使用标准程序(O’Toole2011)使用生物膜培养物测定肽的抑制作用。简言之，将过夜培养物以1:100稀释并加入连续稀释的肽中。在不振荡培养下允许生物膜生长24-36h。去除液体，洗涤生物膜、干燥并用甲醇固定，然后用结晶紫染色，随后用30％乙酸溶解，并测量所得溶液在540nm处的吸光度以对所形成的生物膜的量定量。所有测定均运行三次或更多次。

结果：

蛋白表达和纯化。有或没有A12C靶向结构域的AMP/SUMO融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中高表达。这些融合蛋白被SUMO蛋白酶(Ulp-1)成功切割成它们的组成部分AMP和SUMO载体蛋白，并通过SDS-PAGE清楚地显示为4-6kDa游离AMP和～17kDa SUMO/AMP融合蛋白。图2显示了大肠杆菌中SUMO/AMP的表达和AMP的切割(使其不含SUMO融合配偶体)，其中泳道1：游离SUMO对照，泳道2-9：完整的融合蛋白(偶数泳道)和切割产物(奇数泳道)，顺序如下：SUMO/假黑盘菌素、SUMO/A12C-假黑盘菌素、SUMO/eurocin、SUMO/A12C-eurocin。箭头：游离AMP。蛋白，假黑盘菌素、A12C-假黑盘菌素、eurocin和A12C-eurocin的平均产量(n>＝3)为每L培养物15-26mg(3-4μmoles)。对于肽确认，从SDS-PAGE凝胶条带中提取肽，用胰蛋白酶消化并通过质谱分析。使用MassLynx(v4.1)应用程序(Waters)确认肽的身份。

溶血活性测定。与先前发表的关于假黑盘菌素和eurocin的单独研究一致(Mygind等人2005、Oeemig等人2012、Yacoby等人2006)，与20％Triton-X阳性对照相比，引导性和非引导性融合肽以及游离A12C肽对照未显示对人红细胞的溶血作用(数据未示出)。

体外杀菌活性测定。随着向AMP中加入A12C靶向肽，观察针对脱靶细菌的不同毒性。A12C-AMP保留对两种靶葡萄球菌菌种的毒性，但对脱靶菌种的毒性相对于未修饰的AMP显著降低。图3显示了eurocin和假黑盘菌素的非靶向和靶向类似物对枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC，以μM计)的对数值。箱形区代表50％的值，而条代表95％。未修饰的假黑盘菌素和eurocin具有的预期平均MIC值为3-6μM，该值是大肠杆菌表达系统中产生的具有连续的三个二硫键的AMP的典型值(Li等人2010，Parachin等人2012，Li等人al.2017)。相比而言，加入A12C引导肽使这些AMP对脱靶细菌基本上没有抑制作用，MIC值>70μM。在所有情况下，对于脱靶细菌粪肠球菌和枯草芽孢杆菌，A12C/AMP与AMP的MIC值显著不同(p<0.001；ANOVA2-139尾检验)。阴性对照(单独的SUMO和单独的A12C)未显示出抗微生物活性(数据未示出)并且这些对于所有实验均运行。

体外细胞动力学研究。8至10小时的生长动力学更决定性地证明了A12C/AMP缺失对脱靶菌种的抗微生物活性。对于这些细菌，A12C/AMP处理导致细菌生长仅略落后于缓冲液对照处理的培养物。图4显示了枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(顺时针)的细胞动力学曲线，通过对细菌在每种肽存在下生长8-10小时的log CFU/ml作图建立，间隔2-3小时采集细菌。未修饰的AMP具有与万古霉素对照相似的杀菌作用。相比而言，所有的肽-无论是引导的还是非引导的-均表现出类似于万古霉素阳性对照的对靶细菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的强杀菌作用。枯草芽孢杆菌对照培养物的相对较平坦的生长曲线反映了其生长动力学远比其他细菌慢。

体外生物膜抑制测定。具有肽的细菌生长培养物证明了靶向的AMP优先于非葡萄球菌属细菌抑制葡萄球菌属菌株的细菌生物膜。图5显示了对于4种细菌-枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(顺时针)，通过相对于4种AMP的浓度对结晶紫(540nm)的吸光度作图来评价的生物膜抑制活性。(*＝p<0.1，**＝p<0.05，n>＝3)。当用非引导性肽处理时，所有4种细菌的吸光度读数(由此得出形成的生物膜的量)随着肽浓度的增加而降低，但引导肽对枯草芽孢杆菌和粪肠球菌没有类似的影响，在浓度超过6.25μM时，靶向和非靶向AMP之间的吸光度值具有显著差异(p<0.10或p<0.05)。

本实施例证实了AMP假黑盘菌素和eurocin对两种葡萄球菌属细菌的成功靶向。重要的是，这是通过基本上消除被检测的两种脱靶细菌的活性来实现的。这是抗微生物疗法的期望结果，该疗法可以在杀死病原靶细菌的同时保留微生物群系的共生成员。这也是Mao等人(2013)使用细菌信息素肽靶向假黑盘菌素对金黄色葡萄球菌获得的结果。正如Mao等人(2013)所报道的，除了未修饰的假黑盘菌素本身的MIC较低外，观察到针对脱靶细菌粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的活性相同程度地急剧下降。因此，证明生物淘选来源的配体与信息素来源的配体一样有效，信息素来源的配体是迄今为止用于所有靶向AMP中的靶向肽类别。应该注意的是，信息素来源的配体比A12C更特异，对金黄色葡萄球菌具有活性，但对表皮葡萄球菌没有活性，而A12C/假黑盘菌素对这两个物种均具有高活性。

存在四种主要的配体来源以用作AMP的引导肽。首先，细菌信息素是触发反应能力(competence)、毒力或其他能力发育的种特异性肽信号，并且已经确定了针对许多病原菌的信息素肽(Monnet等人，2016)。第二，生物淘选是筛选随机肽库结合靶序列(例如细菌细胞上的受体)的能力的手段。通常，噬菌体用于展示肽库的成员(Wu等人2016)。第三，噬菌体受体结合蛋白可用作开发AMP靶向肽的资源。噬菌体针对许多病原菌的受体结合蛋白已经得到表征(Dowah和Clokie 2018，Nobrega等人2018)。此外，可以针对研究较少的细菌病原体筛选新的噬菌体(Weber-

等人2016)。第四，靶细菌病原体的毒力因子可以通过使用由细菌毒力因子结合的宿主受体序列组成的靶向(引导)肽来靶向。通过这种方式，宿主受体序列被用作引导肽将AMP回引至细菌病原体。这在本专利申请的实验中得到证明。

实施例2

示例性益生菌乳酸乳球菌已被证明在小鼠的胃中存活良好。通过经口管饲向小鼠强制喂食重组益生菌，并且在引入后整3天从小鼠的胃中回收重组细菌DNA。如通过反向管饲胃提取物的PCR(使用载体特异性引物)证明的，在图6中，可以看到在通过经口管饲将携带pT1bin1表达载体(其具有抗微生物肽laterosporulin(AMP1)或抗微生物肽alyssaserin(AMP2)的开放阅读框或者具有与源自多聚蛋白(靶向AMP1)的引导肽开放阅读框基因融合的laterosporulin)的乳酸乳球菌引入小鼠3天后，这些细菌都存在。这表明重组乳酸乳球菌在小鼠的胃中茁壮成长。使用强制喂食(经口管饲)确保向每只小鼠递送一致量的细菌。使用反向经口管饲，用缓冲液冲洗小鼠胃并收集胃内容物进行PCR分析。在图6中，阳性对照是pT1bin1/laterosporulin DNA的PCR，阴性对照是无模板DNA的PCR，在这两个对照PCR中使用的载体特异性引物与其他泳道中用于小鼠提取物的PCR相同。图6的最后一个泳道是带有DNA梯形条带的标记物泳道。所有阳性条带均包含预期大小的DNA。

还开发了极大地促进乳酸乳球菌工程化的载体。为了构建这种载体(如图7所示)，通过添加大肠杆菌复制起点和卡那霉素抗性盒(都来自基于SUMO的大肠杆菌表达载体，pE-SUMOstar)来修饰原始乳酸乳球菌载体pT1NX。在图7中，卡那霉素抗性区块代表kanR盒和大肠杆菌复制起点。这种二元载体(pT1bin1)可以在大肠杆菌中生长，以促进通过重组DNA技术添加AMP或引导序列插入片段。可以通过标准质粒制备技术产生大量质粒，以简化乳酸乳球菌的转化。后一种转化很难用连接产物实现，但用来自质粒制备物的DNA更容易。

已在体外证明，工程化的乳酸乳球菌分泌可在体外杀死其他细菌的抗微生物肽。这在图8中被报告为大肠杆菌在分泌抗微生物肽与引导肽或分泌抗微生物肽但无引导肽的乳酸乳球菌肉汤培养物的存在下的存活率。图8显示了大肠杆菌在不同抗生素稀释液和上清液存在下的存活率。应该注意的是，图例与线条的顺序相反，从上到下，图中最上面的线条是缓冲液对照，而最下面的线条是万古霉素。为了获得图8中所示的结果，将含有空pT1bin1载体、携带抗微生物肽laterosporulin的pT1bin1或携带与来自多聚蛋白的引导肽基因融合的laterosporulin的pT1bin1的乳酸乳球菌培养物离心以除去细菌细胞，并将所得上清液加入分离的大肠杆菌起始培养物中，以检查对大肠杆菌生长的抑制作用。供应所有重复实验使用的起始培养物由稀释在50ml LB肉汤中的500μl过夜培养的大肠杆菌组成。每种处理重复进行三次，图中的每个点代表具有相应误差线的平均值。为了进行处理和重复，使用96孔微量滴定板。对于每个孔，将100μl稀释的乳酸乳球菌上清液加入100μl大肠杆菌起始培养物中。如图8的x轴所示，使用的稀释范围从未稀释(将100μl的100％上清液加入100μl大肠杆菌)到1/200稀释上清液(加入100μl的0.5％上清液)。抗生素阳性对照同样稀释，起始浓度(未稀释)在图例中说明。图8的y轴代表这些上清液和抗生素稀释液对大肠杆菌活力的抑制。在暴露于上清液或抗生素4小时后，通过将每个孔中的培养物铺板到LB琼脂板上来测量大肠杆菌的存活率。记录出现在板上的所得菌落，未稀释的缓冲液对照处理被设置为100％，而所有其他处理被转换为该值的分数，如y轴上绘制的。

参考图8，可以看出缓冲液对照未抑制大肠杆菌。然而，即使没有重组抗微生物肽(空载体对照)，乳酸乳球菌肉汤培养物(去除了细胞)也的确抑制大肠杆菌。这被认为是检查分泌的重组蛋白的作用的基线。与该基线相比，乳酸乳球菌表达的laterosporulin导致大肠杆菌的活力显著降低。然而，空载体基线和多聚蛋白引导(靶向)的laterosporulin之间没有显著差异。这意味着引导肽完全消除了laterosporulin对非靶细菌大肠杆菌的抗微生物活性。这与实施例1中对葡萄球菌属显示的结果一致。该数据支持这些提取物杀死不同靶细菌(例如幽门螺杆菌)的能力。

实施例3

乳酸乳球菌表达的gAMP对幽门螺杆菌的体外控制。

目的

本实施例表明，当益生菌与幽门螺杆菌在体外共培养时，与多聚蛋白来源的幽门螺杆菌特异性引导肽融合、由杂合基因表达并由益生乳酸乳球菌分泌的抗微生物肽(AMP)可以特异性杀死幽门螺杆菌。这是在小鼠中进行体内研究之前的体外原理证明。

实验设计

在共培养中，使用不同稀释度的乳酸乳球菌，但每孔均含10μl的幽门螺杆菌培养物(～3000CFU)。乳酸乳球菌分泌AMP、gAMP或包含空表达载体。Alyteserin和CRAMP是被检测的AMP。这些被构建为与多聚蛋白衍生的引导肽融合(引导性AMP或gAMP)或不融合(AMP)。在任何给定时间点，共培养物中存在的幽门螺杆菌的量使用对VacA基因本身特异的引物通过qPCR测量，VacA基因编码gAMP结合的受体蛋白。整个实验重复进行三次，并且幽门螺杆菌在表达各种AMP或gAMP的乳酸乳球菌存在下24h后的生长如图10所示。

方法

基因构建体

图9显示了用于乳酸乳球菌分泌AMP和gAMP的载体。通过将针对乳酸乳球菌进行密码子优化的AMP的ORF通过在限制酶位点BamHI和SpeI之间替换原始质粒的spaX蛋白克隆到修饰的pT1NX-kanR(pTKR)载体中以便于乳酸乳球菌表达/分泌。BamHI切割位点上游的P1启动子作为组成型启动子控制下游表达，该启动子通过低pH值被上调。紧邻BamHI位点上游的usp45基因编码乳酸乳球菌的内源信号肽，该信号肽允许所得融合肽的分泌。将AMP/tAMP连接到pTKR载体中后，将其转化到大肠杆菌(10β，NEB)中并铺板到卡那霉素选择性平板上。pT1NX质粒(LMBP 3498)具有红霉素抗性，但被修饰而产生如图9所示的pTKR，它还具有卡那霉素抗性，可用于克隆到电感受态大肠杆菌(10β，NEB)中以进行质粒繁殖。然后将从大肠杆菌中提取的质粒电穿孔到电感受态乳酸乳球菌MG1363(LMBP 3019)中并铺板在红霉素选择性GM17平板上(30℃，微需氧，过夜)。在用PCR筛选AMP/gAMP ORF的存在后，将被选择的菌落在红霉素(5μg/ml)存在下在具有葡萄糖(0.5％w/v)的M17肉汤的液体培养物中繁殖。

本实验中使用的AMP/gAMP

以下AMP和引导性AMP(gAMP)被克隆到分泌型载体pTKR中。多聚蛋白1(MM1)引导肽序列MQKMTDQVNYQAMKLTLLQK(SEQ ID NO:5)用下划线表示，并且丝氨酸/甘氨酸接头序列用粗体表示。

乳酸乳球菌/幽门螺杆菌共培养和qPCR分析

将乳酸乳球菌AMP/gAMP克隆从甘油储存物繁殖，并在GM17肉汤中用红霉素(5μg/ml)培养过夜，不振荡。将幽门螺杆菌储存物先在微需氧条件和>5％CO₂环境下在Blood-TS琼脂上繁殖过夜。然后将平板上的菌落转移到含有新生小牛血清(5％)的TS肉汤中，并在微需氧条件和>5％CO₂环境下生长过夜。将乳酸乳球菌培养物在96孔培养板中用TSB肉汤连续稀释至100μL。向每孔中加入10μL的幽门螺杆菌过夜培养物，并用更多的TS肉汤将每孔的体积补足至200μL。使该板在具有>5％CO₂的微需氧环境中静置生长过夜。24h后，将培养板中的孔内容物转移到96孔PCR板中。将该PCR板密封并在100℃加热15min并在4℃冷却5min。然后将板在2000g离心2min，并将上清液用作qPCR的模板。使用针对VacA基因的引物进行qPCR以定量幽门螺杆菌(正向：5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3'(SEQ ID NO:12)，反向：5'-CTGCTTGAATGCGCCAAAC-3'(SEQ ID NO:13)并使用针对acma基因的引物来定量乳酸乳球菌。幽门螺杆菌和乳酸乳球菌的标准曲线通过在qPCR板中确定相应细菌的过夜培养物的不同稀释液(1/10、1/100、1/1000、1/10000)的C_T值构建，稀释液的CFU通过在其相应的琼脂板上铺板来确定。

结果

图10显示了与表达gAMP或AMP的乳酸乳球菌共培养的幽门螺杆菌的VacA基因的qPCR结果。表达带有或不带有引导肽的AMP的乳酸乳球菌将幽门螺杆菌培养物敲低至低于该实验的检测基线(C_T值为40)。单纯AMP用空心符号表示，而gAMP用实心灰色符号表示。除非与引导肽融合，否则alyteserin不是很有效。对照实验(实线)，即使用携带空载体的乳酸乳球菌，表明乳酸乳球菌益生菌其本身在24小时内对幽门螺杆菌的生长几乎没有影响。误差线代表95％置信限。

结论

表达两种不同AMP的乳酸乳球菌能够在体外将具有活力的幽门螺杆菌培养物敲低至基线水平。多聚蛋白引导肽序列显示不干扰CRAMP中AMP的毒性，并且靶向和非靶向CRAMP对幽门螺杆菌具有同等毒性。在所有情况下，gAMP(“MM1”前缀的)比相应的AMP毒性更大(在y轴上更低)。在alyteserin AMP/gAMP对的情况下，引导肽似乎是对幽门螺杆菌高毒性的必要条件。

实施例4

益生gAMP对脱靶细菌的作用。

目的

为了确定表达AMP或gAMP的乳酸乳球菌益生菌对脱靶细菌的体外作用。

实验设计。

实验设计与以上在实施例3中描述的相同，不同之处在于脱靶细菌替换靶幽门螺杆菌。使用的脱靶细菌是植物乳杆菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)。

方法

所有方法均在以上实施例3中描述。

结果

图11显示了植物乳杆菌与表达空载体(pTKR)、AMP(alyteserin、laterosporulin或CRAMP)或gAMP(MM1-alyteserin、MM1-laterosporulin或MM1-CRAMP)的乳酸乳球菌共培养24小时后的生长。与仅使用益生菌的对照(带有空载体pTKR的乳酸乳球菌)相比，植物乳杆菌与表达AMP或gAMP的益生菌共培养导致脱靶滴度随所用益生菌用量的增加而降低。然而，对于所有三种检测的AMP，益生菌/AMP处理对脱靶生长的不利作用明显大于益生菌/gAMP处理。具体地，在实施例3中对杀死幽门螺杆菌最有效的100,000/μl CFU水平下，所有益生菌/AMP处理均导致qPCR无法检测到的低乳杆菌水平。相比而言，对于alyteserin和laterosporulin gAMP的益生菌/gAMP水平为10,000CFU/μl，而CRAMP gAMP为2500。在较低的益生菌水平下，gAMP和AMP益生菌处理之间发生5至7倍差异，并且益生菌/gAMP对脱靶乳杆菌的危害明显低于益生菌/AMP。误差线代表95％置信限。

图12显示了与表达空载体(pTKR)、AMP(alyteserin、laterosporulin或CRAMP)或gAMP(MM1-alyteserin、MM1-laterosporulin或MM1-CRAMP)的乳酸乳球菌共培养24小时后大肠杆菌的生长。如图12中所见，对大肠杆菌的脱靶效应的结果与上面描述的其对植物乳杆菌的脱靶效应相似。

结论

从这些体外脱靶结果可以得出结论，与益生菌递送系统中的AMP相比，gAMP对这两种脱靶细菌的危害显著较小。这些体外结果显示了益生菌AMP和gAMP的脱靶效应的情况的至少一部分。如下文进一步讨论的，在整个小鼠胃微生物群中取平均值，益生菌gAMP没有比未经工程化的乳酸乳球菌益生菌更具破坏作用。

实施例5

对小鼠中幽门螺杆菌的治疗性控制。

目的

在小鼠体内检测表达gAMP的乳酸乳球菌对幽门螺杆菌的控制。治疗性检测比预防性检测更严格，因为在引入益生菌之前，病原体被给予了在小鼠体内定植和复制的时间。选择该最严格的检测是为了评价不同AMP的作用，以引导和未修饰的形式检测三种不同的AMP。

实验设计

益生菌对照小鼠。这些小鼠仅接受益生菌，按前面的述实施例描述的制备。在接种前第0天通过反向口服管饲采集胃样本；通过经口管饲向小鼠喂食重悬的乳酸乳球菌；在第3、5和7天采集胃样本。

对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗性处理。对这些小鼠接种幽门螺杆菌，并允许幽门螺杆菌在小鼠胃中自身定植3天，每天接种以确保建立。然后给予小鼠分泌AMP或gAMP的乳酸乳球菌以治疗性处理幽门螺杆菌感染。在幽门螺杆菌接种前第0天采集胃样本；通过经口管饲喂食重悬的幽门螺杆菌，每天1次，连续3天；然后在第5天采集胃样本以检测幽门螺杆菌的存在，并在第5天向小鼠喂食重悬的乳酸乳球菌；随后在第8天和第10天采集胃样本。

未被处理的幽门螺杆菌感染对照小鼠。使这些小鼠感染幽门螺杆菌，但未提供预防剂或治疗剂。在幽门螺杆菌接种前第0天采集胃样本；通过经口管饲喂食重悬的幽门螺杆菌，每天1次，连续3天；然后在第5、8和10天采集胃样本以检测幽门螺杆菌的存在。

方法

对小鼠经口管饲施用乳酸乳球菌和幽门螺杆菌。如上所述，使乳酸乳球菌培养物繁殖过夜。将过夜培养物在4℃以4000g离心15min。将沉淀物重悬于无菌PBS中。如上所述，使幽门螺杆菌储存物在Blood-TS琼脂上生长过夜，然后用无菌环刮取并重悬于无菌PBS中。使用1.5ga经口管饲针向小鼠喂食任一细菌悬浮液，但不超过其胃体积的一半(～250μL)。通过将重悬液稀释1/1000和1/10000倍并在适当的平板上铺板来确定被喂食的重悬液的菌落形成单位(CFU)。通过用过量的PBS(～300μL)冲洗其胃来收集小鼠胃在接种前和接种后的样本，并通过反向经口管饲注射直至保持真空来收集胃液。

通过qPCR测定幽门螺杆菌和乳酸乳球菌的存在。将采集的胃样本在100℃加热15min，然后在4℃冷却5min。收集上清液并铺板在96孔板中，并使用针对VacA基因的引物进行qPCR以定量幽门螺杆菌，而使用针对acma基因的引物来定量乳酸乳球菌。通过在qPCR中包括相应细菌的过夜培养物的不同稀释液(1/10、1/100、1/1000、1/10000)并将这些稀释液铺板在相应平板上，构建每种细菌相对于其CT值的标准曲线，以确定相应的CFU值。每个数据点代表至少3只重复小鼠。

qPCR值标准化。幽门螺杆菌培养物CFU/μl与CT值的的标准曲线如图13所示。这在图14中被用于从qPCR CT值生成CFU/μl数据。

结果

在接种幽门螺杆菌之前，在第0天，小鼠体内具有极低水平的带有VacA基因的天然幽门螺杆菌(8-200CFU/μl)(图14)。在接种幽门螺杆菌后5天，记录幽门螺杆菌为2,000-12,000CFU/ul，表明在小鼠胃中强烈复制。在第5天，除空白对照外，对小鼠接种益生菌。幽门螺杆菌在空白对照小鼠体内继续很好地复制，在第5天后增加了3倍，并在第10天达到40,000CFU/μl。在第5天进行益生菌治疗性处理后，至第10天，pTKR(空载体)益生菌对照增加2倍。在pTKR处理的小鼠中，幽门螺杆菌接种不是那么有效，因此在第5天，幽门螺杆菌滴度低于其他小鼠组，甚至低于益生菌处理之前。

相比而言，在第5天递送益生菌治疗后，给予表达AMP或gAMP的益生菌的所有小鼠经历胃中幽门螺杆菌的强烈下降(图14)。取决于AMP或gAMP处理，该下降在15倍至320倍，这导致第5天后最终幽门螺杆菌水平比未接受益生菌治疗并继续幽门螺杆菌生长的空白对照低100至1000倍。此外，在三个AMP/gAMP对中的每一对中，AMP处理在控制幽门螺杆菌方面明显不如gAMP处理有效。具体来说，在第10天，对于alyteserin和CRAMP，使用AMP的幽门螺杆菌为使用gAMP的幽门螺杆菌的15倍，而对于laterosporulin，使用AMP的幽门螺杆菌是使用gAMP的幽门螺杆菌的2.5倍。误差线代表95％置信限。

图14显示了对照小鼠(空白)和接种空载体(pTKR)或分泌AMP或gAMP的乳酸乳球菌益生菌(其中MM1＝多聚蛋白1引导肽)的小鼠胃液中幽门螺杆菌的CFU/μl。

结论

AMP或gAMP在益生乳酸乳球菌中的表达导致先前接种幽门螺杆菌的小鼠胃中幽门螺杆菌滴度极大降低(15至320倍)。因此，经工程化为表达AMP或gAMP的益生乳酸乳球菌可预期成为幽门螺杆菌的强效治疗方法。此外，可以在AMP和gAMP效应蛋白之间进行显著区分，并且这种差异适用于所有三种检测的AMP。对于laterosporulin、alyteserin和CRAMP，gAMP在消除幽门螺杆菌方面的效果分别是AMP的2.5、15和15倍。因此，当通过益生菌递送来用于对抗幽门螺杆菌时，gAMP技术在功能上的杀伤效率优于AMP技术。

实施例6

对小鼠中幽门螺杆菌的预防性控制。

目的

对小鼠接种分泌gAMP或AMP的益生乳酸乳球菌来作为预防性治疗，以防止在3天后的刺激接种后幽门螺杆菌的定植。尽管益生gAMP技术的任何医学应用均有望是治疗性而非预防性的，并且尽管这是一项不如治疗性检测严格的有效性检测，但为了完整性进行了本实验。

实验设计

益生菌对照小鼠。这些小鼠仅接受益生菌，如上述实施例中制备。在接种前第0天通过反向经口管饲采集胃样本；通过经口管饲向小鼠喂食重悬的乳酸乳球菌；在第3、5和7天采集胃样本。

幽门螺杆菌对小鼠的益生菌预防性处理的刺激。这些小鼠接受表达AMP或gAMP的益生菌，然后在3天后用幽门螺杆菌刺激。在乳酸乳球菌接种前第0天采集胃样本；在同一天通过经口管饲喂食重悬的乳酸乳球菌；然后在第3天采集胃样本以检测乳酸乳球菌的存在，并在第3天向小鼠喂食重悬的幽门螺杆菌，每天一次，连续3天；随后在第8天和第10天采集胃样本。

结果

图15显示了对照小鼠(空白)以及接种空载体(pTKR)或分泌AMP或gAMP的乳酸乳球菌益生菌(其中MM1＝多聚蛋白1引导肽)接下来另外喂食幽门螺杆菌的小鼠胃液中幽门螺杆菌的CFU/μl。在乳酸乳球菌接种前第0天，所有小鼠均开始出现170-300CFU/μl的天然幽门螺杆菌。至第4天，就在外源幽门螺杆菌激发之前，天然幽门螺杆菌已增加至500-700CFU/μl。至第12天，在用MM1-Alyteserin(gAMP)或Alyteserin(AMP)处理的益生菌预防性处理的小鼠中，幽门螺杆菌仅增加至1500(gAMP)和2000(AMP)CFU/μl。相比而言，在使用空载体(pTKR)或不使用预防性益生菌进行预防性预处理的小鼠中，幽门螺杆菌分别增加至13,000和18,000CFU/μl。误差条代表95％置信限。

结论

被工程化以递送AMP或gAMP的益生菌均提供了针对幽门螺杆菌刺激的强的预防性保护。使用益生菌/AMP或益生菌/gAMP预处理，在幽门螺杆菌刺激后的7天内，幽门螺杆菌仅增加了2倍。相比而言，使用空载体益生菌，幽门螺杆菌在7天内增加了26倍。这表明预防性处理对幽门螺杆菌感染非常有效。

实施例7

微生物群系序列分析表明小鼠胃的微生物群仅受到轻微破坏

目的

通过下一代测序检查预防性和治疗性实验中小鼠的胃微生物群落。确定这些处理对胃中微生物多样性的影响。预期由于gAMP的选择性毒性，益生菌/gAMP治疗的小鼠的微生物群将比益生菌/AMP治疗的小鼠更具有多样性。

背景

已发现幽门螺杆菌导致人肠道菌群的失调(Liou等人，2019)。在人体中，已发现肠道微生物多样性随幽门螺杆菌感染的增加而降低，而幽门螺杆菌的根除通常与微生物多样性的增加有关(Li等人，2017)。然而，通常抗生素治疗与分类学和肠道细菌丰度的减少有关(Lange等人，2016)。在这项研究中，幽门螺杆菌处理的小鼠在第5天接受多种治疗性处理，然后进行比较。通过这种方式，可以比较幽门螺杆菌感染对分类学的影响与用单独的益生菌、益生菌/AMP、益生菌/gAMP或抗生素处理对感染的影响。

实验设计

治疗性和预防性研究的实验创建了用于上述实施例5(治疗性)和6(预防性)中的qPCR的小鼠反向经口管饲样本。使用下一代测序分析这些相同样本的胃微生物群的群体变化。因此，实验设计与实施例5和6相同。

方法

如对于实施例5和6所述，将通过反向经口管饲采集的小鼠胃样本在100℃加热15min并在4℃冷却5min。采集上清液并铺板在96孔板中，以进行下一代测序的上游处理。样本用16s引物扩增，然后用Illumina索引引物扩增，随后进行清理和纯化。将样本合并成文库，并使用Illumina MiSeq v3试剂盒进行测序。使用QIIME2对数据进行去多重化、去噪和分析。

结果

治疗对胃总细菌多样性的影响：稀疏估值(rarefaction estimate)。来自Illumina MiSeq下一代测序的稀疏曲线用于估计总细菌丰度。这些代表在数据集的不同部分中被检测到的物种的数量(操作分类单位，OTU)。数据集的不同部分是随机选择的子样本。稀疏曲线用于确定可以使用的最小样本数量，同时仍代表整个OTU范围，以减少计算时的计算机载荷。为了我们的目的，此标准图形显示了每种处理的物种多样性。

在实施例5详述的治疗性研究的第8天和第10天的数据中观察到细菌多样性的显著差异(图16)。在这项研究中，至第5天，幽门螺杆菌感染已经发展5天。在第5天，施用治疗。至第8天或第10天，治疗分别已进行3天或5天而影响胃微生物群。如图16所示，抗生素四环素/阿莫西林的联合使用导致物种多样性最低。重要的是，与使用空载体的益生菌或无治疗相比，通过益生菌递送的AMP(来自此处展示的所有三种AMP的数据)的使用导致多样性降低，但与使用抗生素相比，多样性更高。最大多样性是由用表达gAMP的益生菌治疗产生的(来自图16中呈现的所有三种AMP的数据)。

实施例2的体外实验中看到的在脱靶效应方面的差异很可能在该体内数据中广泛观察到。由于脱靶效应减少，益生菌表达gAMP导致与AMP相比更广泛的菌种存活。对于益生菌/空载体或无治疗看到的较低多样性可能是由于它们在杀死幽门螺杆菌方面无效，这已在之前的研究中被证明降低细菌多样性(Lange等人，2016)。即使AMP和抗生素都能够杀死幽门螺杆菌，但它们自身的广泛毒性在此处被认为将降低细菌多样性。

治疗对指示性物种的影响

仅少数出版物将小鼠胃部细菌鉴定对肠道微生物群有益。鼠杆菌(Muribactermuris)(同种异名鼠放线菌(Actinobacter muris))是常见的小鼠共生菌，且已被用作成功消除小鼠流感嗜血杆菌病原体的生态位替代物，从而降低炎症(Granland等人，2020)。鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)是主要的小鼠肠道共生细菌，已被证明减少肠道炎症(Pan等人，2018)。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)已被证明阻止小鼠肠道中的自身免疫(He等人，2017)，并已被用于保护小鼠免受产肠毒素大肠杆菌感染(Wang等人，2018)，并且在许多研究中也被证明对人具有抗炎作用(Mu等人，2018)。由于在我们的下一代测序结果中发现所有这些物种占主导地位，我们将它们用作健康肠道微生物群的指示性种属。

为了挑选微生物群失调指示菌，选择了在幽门螺杆菌感染期间丰度最高的前10种细菌中的两个菌属，即葡萄球菌属和不动杆菌属。

对于不同的时间点和处理，由下一代测序数据确定的这些细菌的丰度如图17所示。可以看出，有益指示菌乳杆菌属和Muribacter均响应于幽门螺杆菌感染而降低，但在用益生菌/gAMP治疗后反弹至高于感染前水平的水平。这种反弹效应大于用益生菌/AMP所观察到的。对于失调指示菌，葡萄球菌属和不动杆菌属响应于幽门螺杆菌感染而大量增加，但响应于表达gAMP或AMP的益生菌大量减少。

在这些治疗性实验中，难以通过下一代测序分析在小鼠胃中检测到的成千上万种细菌。此外，由于缺乏已发表的关于单一细菌分类群对小鼠胃微生物群的群体健康的益处或危害的信息，因此很难检查此类单一种属的数据。然而，这四种细菌确实对小鼠胃微生物群健康具有重要意义，并且表达gAMP的益生菌对这四种指示菌物种的作用支持我们关于益生菌/gAMP治疗的有益效果的整体假设。益生菌/gAMP治疗增加已知有益指示菌物种的丰度，并减少治疗幽门螺杆菌感染后最多的失调指示菌物种。

治疗随时间推移对未感染小鼠的影响

多种治疗随时间推移对未感染小鼠的影响是要问的重要问题。任何治疗性或预防性治疗均应尽可能具有最小的对天然肠道菌群的不利影响。作为标准治疗基线，已表明抗生素对肠道微生物多样性具有破坏性影响(Lange等人，2016)。在多样性评价方面，预期幽门螺杆菌感染和治疗性消除幽门螺杆菌分别是不利和有利的混杂因素(Liou等人，2019；Li等人，2017)。因此，适当的实验设计不包括幽门螺杆菌。出于这个原因，比较了各种治疗处理对未感染小鼠的影响。

小鼠胃微生物群由成千上万种菌种组成。为了描述这些物种中的每个种在处理前后发生的数量变化，有必要使用某些统计学指标。以下指标表明，gAMP处理导致的胃微生物群的改变远小于AMP处理。

在图18中，在以下四个处理组之间比较来自小鼠胃的所有菌种：空载体组(仅携带空载体的益生菌)、空白组(用缓冲液模拟接种)、引导组(表达gAMP的益生菌)和非引导组(表达AMP的益生菌)。在该图中，将后三种处理与空载体处理进行比较。通常来说，y轴表示每个处理的菌种的集与空载体处理的菌种的集相比的分类学距离。具体地，所使用的指标(y轴)是QIIME的插件，称为非参数微生物相互依赖性测试(NMIT)(Zhang等人，2017)。

重要的是，发现gAMP处理(“引导”)与简单的益生菌处理(“空载体”)的相关性远比与AMP处理(“非引导性”)或仅用缓冲液模拟接种的小鼠(“空白”)更密切相关。这意味着表达gAMP的益生菌处理更像是正常的益生菌处理。

在图19中，使用相同的指标，但与“空白”(模拟接种)处理进行比较。同样，如空载体对照一样，在益生菌/gAMP(“引导性”)处理中发现的物种集合与模拟接种的胃微生物集合更密切相关。“非引导性”(益生菌/AMP)集合再次具有更远的相关性。

图20测量了来自相同处理但在不同时间点的物种集合的差异。使用的指标是香农熵，并在y轴上报告。更负的值(在y轴上更低)表示自第0天接种小鼠以来的5天内群体的变化更多。可以看出，益生菌AMP(“非引导性”)处理在5天内导致最大的群体变化。相比而言，阴性对照(“空载体”和“空白”)和益生菌/gAMP(“引导”)处理仅导致适度的群体变化。对于所有三幅图，误差条代表所有95％置信限。

参考文献

以下专利和出版物在此被通过引用并入。

WO 2017/009373

WO 2019/055781

美国专利号9925223

澳大利亚专利号2016/204543

美国专利申请公开号US 2013/0259834

美国专利申请公开号US 2008/0044481

美国专利申请公开号US 2014/0066363

Baktash A，Terveer EM，Zwittink RD，et al.Mechanistic insights in thesuccess of fecal microbiota transplants for the treatment of clostridiumdifficile infections.Front Microbiol.2018；9：1242.doi：10.3389/fmicb.2018.01242

RA，Kandasamy V，Axelsen AM，Nielsen AT，Bosma EF.Genome cditingof lactic acid bacteria：opportunities for food，feed，pharma and biotecH.FEMSMicrobiol Lett.2019；366(1)：fny291.doi：10.1093/femsle/fny291

Borrero J，Chen Y，Dunny GM，Kaznessis YN.Modified lactic acid bacteriadetect and inhibit multiresistant enterococci.ACS Synth Biol.2015；4(3)：299-306.doi：10.1021/sb500090b

Choudhury A，Islam SMA，Ghidey MR，Kearney CM.Repurposing a drugtargeting peptide for targeting antimicrobial peptides againstStaphylococcus.Biotechnol Lett.2020；42(2)：287-294.doi：10.1007/s10529-019-02779-y

Deng T，Ge H，He H，et al.The heterologous expression strategies ofantimicrobial peptides in microbial systems.Protein Expr Purif.2017；140：52-59.doi：10.1016/j.pep.2017.08.003

Ilan Y.Why targeting the microbiome is not so successful：canrandomness overcome the adaptation that occurs following gut manipulation？.Clin Exp Gaxtroenterol.2019；12：209-217.Published 2019May 8.doi：10.2147/CEG.S203823

Dowah ASA，Clokie MRJ(2018)Review of the nature，diversity andstructure of bacteriophage receptor binding proteins that target Gram-positive bacteria.Biophys Rev 10：535-542.doi：10.1007/s12551-017-0382-3

Eckert R，He J，Yarbrough DK，et al(2006)Targeted killing ofStreptococcus mutans by a pheromone-guided“smart”antimicrobialpeptide.Antimicrob Agents Chemother50：3651-3657.doi：10.1128/AAC.00622-06

Eckert R，Sullivan R，Shi W(2012)Targeted Antimicrobial Treatment toRe-establish 194a Healthy Microbial Flora for Long-term Protection.Adv DentRes 24：94-97.doi：10.1177/0022034512453725

Evans BC，Nelson CE，Yu SS，et al(2013)Ex vivo red blood cell hemolysisassay for the evaluation of pH-responsive endosomolytic agents for cytosolicdelivery of biomacromolecular drugs.J Vis Exp e50166.doi：198 10.3791/50166

Everhart JE，Kruszon-Moran D，Perez-Perez GI，Tralka TS，McQuillanG.Seroprevalence and ethnic dfiferences in Helicobacter Pylori infectionamong adults in the United States.J Infect Dis.2000；181(4)：1359-1363.doi：10.1086/315384

Fitchen N，Letley DP，O′Shea P，Atherton JC，Williams P，Hardie KR.Allsubtypes of the cytotoxin VacA adsorb to the surface of Helicobacter pyloripost-secretion.J Med Microbiol.2005；54(Pt 7)：621-630.doi：10.1099/jmm.0.45946-0

Forkus B，Ritter S，Vlysidis M，Geldart K，Kaznessis YN.AntimicrobialProbiotics Reduce Salmonella enterica in Turkey Gastrointestinal Tracts.SciRep.2017；7：40695.Published 2017Jan 17.doi：10.1038/srep40695

Geldart K，Forkus B，McChesney E，McCue M，Kaznessis YN.pMPES：A ModularPeptide Expression System for the Delivery of Antimicrobial Peptides to theSite of Gastrointestinal Infections Using Probiotics.Pharmaceuticals(Basel).2016；9(4)：60.Published 2016Oct 5.doi：10.3390/ph9040060

Geldart KG，Kommineni S，Forbes M，et al.Engineered E.coli Nissle1917for the reduction of vancomycin-resistant Enterococcus in the intestinaltract.Bioeng Transl Med.2018；3(3)：197-208.Published 2018Sep 8.doi：10.1002/btm2.10107

Ghidey M，Islam SMA，Pruett G，Kearney CM.Making plants into cost-effective bioreactors for highly active antimicrobial peptides.NBiotechnol.2020；56：63-70.doi：10.1016/j.nbt.2019.12.001

Granland CM，Scott NM，Lauzon-Joset JF，et al.Nasal Delivery of aCommensal Pasteurellaceae Species Inhibits NontyPeable Haemophilus influenzaeColonization and Delays Onset of Otitis Media in Mice.Infect Immun.2020；88(4)：e00685-19.Published 2020Mar 23.doi：10.1128/IAI.00685-19

He B，Hoang TK，Wang T，et al.Resetting microbiota by Lactobacillusreuteri inhibits T reg deficiency-induced autoimmunity via adcnosine A2Areceptors.J Exp Med.2017；214(1)：107-123.doi：10.1084/jem.20160961

Hooi JKY，Lai WY，Ng WK，et al.Global Prevalence of HeliCobacter pyloriInfection：Systematic Review and Meta-Analysis.Gastroenterology.2017；153(2)：420-429.doi：10.1053/j.gastro.2017.04.022

Islam SMA，Kearney CM，Baker EJ(2017)CSPred：A machine-learning-basedcompound model to identify the functional activities of biologically-stabletoxins.In：2017IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine(BIBM).pp2254-2255

Islam SMA，Sajed T，Kearney CM，Baker EJ(2015)PredSTP：a highly accurateSVM based model to predict sequential cystine stabilized peptides.BMCBioinformatics 16：210.doi：10.1186/s12859-015-0633-x

Keeney KM，Yurist-Doutsch S，Arrieta MC，Finlay BB.Effects ofantibiotics on human microbiota and subsequent disease.Annu RevMicrobiol.2014；68：217-235.doi：10.1146/annurev-micro-091313-103456

Lange K，Buerger M，Stallmach A，Bruns T.Effects of Antibiotics on GutMicrobiota.Dig Dis.2016；34(3)：260-268.doi：10.1159/000443360

Li C，Blencke H-M，Paulsen V，et al(2010)Powerful Workhorses forantimicrobial peptide expression and characterization.Bioeng Bugs 1：217-220.doi：10.4161/bbug.1.3.11721

Li，T.，Qin，Y.，Sham，P.et al.Alterations in Gastric Microbiota AfterH.pylori Eradication and in Different Histological Stages of GastricCarcinogenesis.Sci Rep 7，44935(2017).doi.org/10.1038/srep44935

Li Z，Wang X，Wang X，et al(2017)Research advances on plectasin and itsderivatives as new potential antimicrobial candidates.Process Biochemistry56：62-70.doi：10.1016/j.procbio.2017.02.006

Liou JM，Lee YC，El-Omar EM，Wu MS.Efficacy and Long-Term Safety ofH.pylori Eradication for Gastric Cancer Prevention.Cancers(Basel).2019；11(5)：593.doi：10.3390/cancers11050593

Mao R，Teng D，Wang X，et al(2013)Design，expression，and characterizationof a novel targeted plectasin against methicillin-resistant Staphylococcusaureus.Appl Microbiol Biotechnol 97：3991-4002.doi：10.1007/s00253-012-2104508-z

Monnet V，Juillard V，Gardan R(2016)Peptide conversations in Gram-positive bacteria.Crit Rev Microbiol 42：339-351.doi：10.3109/1040841X.2014.948804

Mu Q，Tavella VJ，Luo XM.Role of Lactobacillus reuteri in Human Healthand Diseases.Front Microbiol.2018；9：757.Published 2018Apr 19.doi：10.3389/fmicb.2018.00757

Mygind PH，Fischer RL，Schnorr KM，et al(2005)Plectasin is a peptideantibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.Nature 437：975-980.doi：10.1038/nature04051

Nguyen LT，Haney EF，Vogel HJ(2011)The expanding scope of antimicrobialpeptide structures and their modes6 of action.Trends Biotechnol 29：464-472.doi：10.1016/j.tibtech.2011.05.001

Nobrega FL，Vlot M，de Jonge PA，et al(2018)Targeting mechanisms oftailed bacteriophages.Nat Rev Microbiol 16：760-773.doi：10.1038/s41579-018-0070-8

Oeemig JS，Lynggaard C，Knudsen DH，et al(2012)Eurocin，a new fungaldefensin：structure，lipid binding，and its mode of action.J Biol Chem 287：42361-42372.doi：10.1074/jbc.M112.382028

O’Toole GA(2011)Microtiter dish biofilm formation assay.J VisExp.doi：10.3791/2437

Pan F，Zhang L，Li M，et al.Predominant gut Lactobacillus murinus strainmediates anti-inflammaging effects in calorie-restrictedmice.Microbiome.2018；6(1)：54.Published 2018Mar 21.doi：10.1186/s40168-018-0440-5

Parachin NS，Mulder KC，Viana AAB，et al(2012)Expression systems forheterologous production of antimicrobial peptides.Peptides 38：446-456.doi：10.1016/j.peptides.2012.09.020

Peschel A，Sahl H-G(2006)The co-evolution of host cationicantimicrobial peptides and microbial resistance.Nat Rev Microbiol 4：529-536.doi：10.1038/nrmicro1441

Saeidi N，Wong CK，Lo TM，et al.Engineering microbes to sense anderadicate Pseudomonas aeruginosa，a human pathogen.Mol Syst Biol.2011；7：521.Published2011Aug 16.doi：10.1038/msb.2011.55

Satoh K，Hirayama T，Takano K，Suzuki-Inoue K，Sato T，Ohta M，Nakagomi J，Ozaki Y(2013)VacA，the vacuolating cytotoxin of Helicobacter pylori，binds tomultimerin 1 on human platelets.Thrombosis J11：23.doi：10.1186/1477-9560-11-23

Thung I，Aramin H，Vavinskaya V，et al.Review article：the globalemergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance.Aliment PharmacolTher.2016；43(4)：514-533.doi：10.1111/apt.13497

Vilander AC，Dean GA.Adjuvant Strategies for Lactic Acid BacterialMucosal Vaccines.Vaccines(Basel).2019；7(4)：150.Published 2019Oct16.doi：10.3390/vaccines7040150

Wang T，Teng K，Liu G，et al.Lactobaacillus reuteri HCM2 protects miceagainst Enterotoxigenic Escherichia coli through modulation of gutmicrobiota.Sci Rep.2018；8(1)：17485.Published 2018Nov 30.doi：10.1038/s41598-018-35702-y

Weber-

B，

-Matysiak E，

M，et al(2016)Bacteriophage Procurement for TheraPeutic Purposes.Front Microbiol7：1177-1177.doi：10.3389/fmicb.2016.01177

Worthington RJ，Melander C(2013)Combination approaches to combatmultidrug-resistant bacteria.Trends Biotechnol 31：177-184.doi：10.1016/j.tibtech.2012.12.006

Wu C-H，Liu I-J，Lu R-M，Wu H-C(2016)Advancement and applications ofpeptide phage display technology in biomedical science.J Biomed Sci23：.doi：10.1186/s12929-016-0223-x

Yacoby I，Shamis M，Bar H，et al(2006)Targeting Antibacterial Agents byUsing Drug-Carrying Filamentous Bacteriophages.Antimicrobial Agents andChemotherapy50：2087-2097.doi：10.1128/AAC.00169-06

Zhang L，Wu WK，Gallo RL，et al.Critical Role of Antimicrobial PeptideCathelicidin for Controlling Helicobacter pylori Survival and Infection.JImmunol.2016；196(4)：1799-1809.doi：10.4049/jimmunol.1500021

Zhang Y，Han SW，Cox LM，Li H.A multivariate distance-based analyticframework for microbial interdependence association test in longitudinalstudy.Genet Epidemiol.2017；41(8)：769-778.doi：10.1002/gepi.22065

序列表

<110> 贝勒大学

<120> 引导性抗微生物肽的益生菌递送

<130> 208614.00239

<150> US 62/888,757

<151> 2019-08-19

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 假黑盘菌素AMP

<400> 1

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

<210> 2

<211> 42

<212> PRT

<213> eurocin AMP

<400> 2

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1 5 10 15

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

20 25 30

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

35 40

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头肽

<400> 3

Gly Val His Met Val Ala Gly Pro Gly Arg Glu Pro Thr Gly Gly Gly

1 5 10 15

His Met

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> AgrD1细菌信息素

<400> 4

Tyr Ser Thr Cys Tyr Phe Ile Met

1 5

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 多聚蛋白1引导肽

<400> 5

Met Gln Lys Met Thr Asp Gln Val Asn Tyr Gln Ala Met Lys Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys

20

<210> 6

<211> 49

<212> PRT

<213> laterosporulin AMP

<400> 6

Ala Cys Gln Cys Pro Asp Ala Ile Ser Gly Trp Thr His Thr Asp Tyr

1 5 10 15

Gln Cys His Gly Leu Glu Asn Lys Met Tyr Arg His Val Tyr Ala Ile

20 25 30

Cys Met Asn Gly Thr Gln Val Tyr Cys Arg Thr Glu Trp Gly Ser Ser

35 40 45

Cys

<210> 7

<211> 74

<212> PRT

<213> MM1-laterosporulin gAMP

<400> 7

Met Gln Lys Met Thr Asp Gln Val Asn Tyr Gln Ala Met Lys Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ala Cys Gln Cys Pro Asp Ala

20 25 30

Ile Ser Gly Trp Thr His Thr Asp Tyr Gln Cys His Gly Leu Glu Asn

35 40 45

Lys Met Tyr Arg His Val Tyr Ala Ile Cys Met Asn Gly Thr Gln Val

50 55 60

Tyr Cys Arg Thr Glu Trp Gly Ser Ser Cys

65 70

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> alyteserin AMP

<400> 8

Gly Leu Lys Asp Ile Phe Lys Ala Gly Leu Gly Ser Leu Val Lys Gly

1 5 10 15

Ile Ala Ala His Val Ala Asn

20

<210> 9

<211> 48

<212> PRT

<213> MM1-alyteserin gAMP

<400> 9

Met Gln Lys Met Thr Asp Gln Val Asn Tyr Gln Ala Met Lys Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Leu Lys Asp Ile Phe Lys

20 25 30

Ala Gly Leu Gly Ser Leu Val Lys Gly Ile Ala Ala His Val Ala Asn

35 40 45

<210> 10

<211> 38

<212> PRT

<213> cathelin相关的抗微生物肽 (CRAMP)

<400> 10

Ile Ser Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly

1 5 10 15

Glu Lys Leu Lys Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys

20 25 30

Leu Val Pro Gln Pro Glu

35

<210> 11

<211> 63

<212> PRT

<213> MM1-CRAMP gAMP

<400> 11

Met Gln Lys Met Thr Asp Gln Val Asn Tyr Gln Ala Met Lys Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ser Arg Leu Ala Gly Leu

20 25 30

Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys Ile Gly

35 40 45

Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln Pro Glu

50 55 60

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VacA正向引物

<400> 12

atggaaatac aacaaacaca c 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VacA反向引物

<400> 13

ctgcttgaat gcgccaaac 19

Claims

1.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的靶细菌引起的病症的益生素，包含：

益生菌，其中所述益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码所述引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，所述引导肽与所述靶细菌的蛋白结合，其中所述引导性抗微生物肽杀死所述受试者的胃肠道中的所述靶细菌，并且其中在与非引导性抗微生物肽或抗生素相比时，所述引导性抗微生物肽最低限度地破坏所述受试者的胃肠道中存在的其他细菌。

2.根据权利要求1所述的益生素，其中所述益生菌包含乳酸菌。

3.根据权利要求2所述的益生素，其中所述乳酸菌包含乳球菌属(Lactococcus)的细菌。

4.根据权利要求3所述的益生素，其中所述乳球菌属的细菌包含乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

5.根据权利要求1所述的益生素，其中所述靶细菌的蛋白是毒力因子。

6.根据权利要求5所述的益生素，其中所述毒力因子是VacA肽。

7.根据权利要求1所述的益生素，其中所述抗微生物肽是laterosporulin、alyteserin或cathelin相关的抗微生物肽。

8.根据权利要求1所述的益生素，其中所述靶细菌包含幽门螺杆菌(H.pylori)。

9.根据权利要求1所述的益生素，其中所述引导肽具有包含SEQ ID NO:5的序列。

10.根据权利要求1所述的益生素，其中所述抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10的序列。

11.根据权利要求1所述的益生素，其中所述引导性抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的序列。

12.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的靶细菌引起的病症的益生素组合物，包含：

权利要求1所述的益生素；和

可接受的赋形剂或载体。

13.根据权利要求1所述的益生素组合物，其中所述益生菌是可食用的，并且其中所述可接受的赋形剂或载体是可食用的。

14.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存在的靶细菌引起的患者的病症的方法，包括：

向所述受试者施用益生素组合物，其中所述益生素组合物包含益生菌和可接受的赋形剂或载体，其中所述益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码所述引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，所述引导肽与所述靶细菌的蛋白结合；以及

允许所述引导性抗微生物肽杀死所述受试者的胃肠道中的所述靶细菌，并且其中在与非引导性抗微生物肽或抗生素相比时，所述引导性抗微生物肽最小限度地破坏所述受试者的胃肠道中存在的其他细菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述益生菌包含乳酸菌。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述乳酸菌包含乳球菌属的细菌。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述乳球菌属的细菌包含乳酸乳球菌。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶细菌的蛋白是毒力因子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述毒力因子是VacA肽。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗微生物肽是laterosporulin、alyteserin或cathelin相关的抗微生物肽。

21.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶细菌包含幽门螺杆菌。

22.根据权利要求14所述的方法，其中所述引导肽具有包含SEQ ID NO:5的序列。

23.权利要求14的方法，其中所述抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的序列。

24.根据权利要求14所述的方法，其中所述引导性抗微生物肽具有包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的序列。

25.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是动物。

26.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是人。

27.根据权利要求14所述的方法，其中所述益生菌是可食用的，并且其中可接受的赋形剂或载体是可食用的。

28.根据权利要求14所述的方法，其中所述益生素组合物通过口服施用。

29.一种用于预防或治疗由受试者的胃肠道中存活的幽门螺杆菌引起的病症的益生素，包含：

乳酸乳球菌益生菌，其中所述乳酸乳球菌益生菌已被转化成包含表达引导性抗微生物肽的DNA构建体，其中编码所述引导性抗微生物肽的序列包含与编码引导肽的序列融合的编码抗微生物肽的序列，所述引导肽与幽门螺杆菌的VacA肽结合，其中所述引导性抗微生物肽杀死所述受试者的胃肠道中的幽门螺杆菌，并且其中在与非引导性抗微生物肽或抗生素相比时，所述引导性抗微生物肽最小限度地破坏所述受试者的胃肠道中存在的其他细菌。

30.根据权利要求29所述的益生素，其中所述引导肽衍生自多聚蛋白-1的序列。

31.根据权利要求29所述的益生素，其中所述抗微生物肽是laterosporulin、alyteserin或cathelin相关的抗微生物肽。