JPH01299299A

JPH01299299A - マゲイニン様ペプチド

Info

Publication number: JPH01299299A
Application number: JP63127177A
Authority: JP
Inventors: Osanori Numao; 沼尾　長徳; Nobuko Ando; 安藤　宣子
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1989-12-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は下記アミノ酸配列（１）Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　［、ｙｓ　Ｘ＋　Ｌｅｕ旧ｓ
　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＸｔＧｌｙ　Ｌｙ
ｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　Ｉｌ
ｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　　−（１）〔式中、χ１
とＸ２は各々独立に０または１個の任意のアミノ酸を意
味する。但し、Ｘ、及びＸ、は同時にはＰｈｅにはなり
えない、〕を有するマゲイニン様ペプチドに関するもの
である０本発明のマゲイニン様ペプチドは様々な微生物
に対する抗生物質として、又制癌剤として使用すること
ができる。

〔従来の技術〕

抗生物質は、主として感染症および癌の治療に用いられ
医薬品として非常に重要なものである。

感染症の治療では、宿主に対して不都合な効果を有さず
、広範囲の種類の微生物に対して殺生物活性を存する化
合物が求められている。一方、制癌剤としては、副作用
がなく、選択毒性の高い化合物が強く望まれている。ペ
プチド性化合物は、アレルギー反応、局所作用、溶血な
どを起こし易く、経口吸収性、溶解性、安定性の悪いこ
とから、この系統の抗生物質のスクリーニングは余り行
われていない、しかし、ペプチド性抗生物質は、脂溶性
と水溶性の中間的な性状を有し、他の系統の抗生物質と
はほとんど交差耐性を示さないという特徴から非常に有
効なペプチド性抗生物質が開発される可能性がある。

アフリカッメガエルは、外科的手術後、特に殺菌などの
処置を施さなくとも感染死することはなく、自己殺菌作
用の物質の存在が示唆されている。

Ｚａｓｌｏｆｆはアフリカッメガエルの皮膚から２３ア
ミノ酸残基よりなる新規殺菌性ペプチド、マゲイニン１
と２を単離、同定した。これらのペプチドは、ダラム陽
性菌、陰性菌、糸状菌の広範囲にわたる微生物に対し殺
活性を示した”’　、　５ｏｒａｖｉａらはアフリカッ
メガエルの皮膚に存在するペプチド２種（ＸＰＦ、　Ｐ
ＧＬａ）を化学合成し、マゲイニン２と同等の抗菌活性
をもっていることを見い出した。

また、彼らはこれらのペプチドが溶血活性をもっていな
いことも報告している（２）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、マゲイニン２よりも抗菌活性の高いペプ
チド性抗生物質及び新規制癌剤を開発するために鋭意検
討した結果、本発明に到った。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は前記アミノ酸配列＋１）を有するマゲイニン様
ペプチドである９本発明に於いて、任意のアミノ酸とは
天然型及び非天然型のアミノ酸を含むものである。

五潜遼μ口陶斑ｌ１ｌ　　ペプチド本発明のペプチドの第１の具体例として、天然アミノ酸
配列の第５位と第１２位のフェニルアラニンがトリプト
ファンへ置換しているペプチド（ＤＩと称する）を挙げ
ることができる。この配列を第１図中の（Ｂ）に示す、
この図中、（Ａ）は天然マゲイニン２のアミノ酸配列を
表し、上列の番号はアミノ酸の順位を示す。

本発明のペプチドの第２の具体例として、天然アミノ酸
配列の第５位のフェニルアラニンがトリプトファンへ置
換しているペプチド（Ｄ２と称する）を挙げることがで
きる。この配列を第１図中の（Ｃ）に示す。

また、本発明のペプチドの第３の具体例として、天然ア
ミノ酸配列第１２位のフェニルアラニンがトリプトファ
ンへ置換しているペプチド（Ｄ３と称する）を挙げるこ
とができる。この配列を第１図中の（Ｄ）に示す。

（２）　目的ペプチドの合成本発明のペプチドの合成方法は液相法や固相法に依って
容易に合成しうるちのである０本発明に於いては実施例
に於いて記載されているように、自動アミノ酸合成機（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、４３０Ａ型
）を用いて合成を行った。

（３）　　抗菌活性の測定前記の方法により得られたペプチドの抗菌活性は、例え
ば拡散法により測定することができる。

この測定方法及び結果は、後の実施例において詳細に説
明する。

（４）　　殺細胞活性の測定ペプチドの殺細胞活性は、例えばマイクロプレート法に
より測定することができる。測定方法及び結果は後の実
施例において詳細に説明する。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実　施　例　１　　ペプチドの合成目的ペプチドは、固相ペプチド合成のｔ−Ｈｏｅポリア
ミドモードによる自動アミノ酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社：　ＰＥＰＴＩＤ　ＳＹＮＴ
Ｉ（ＥＳＴＺＥＲＭＯＤＥＬ　４３０Ａ）を用い合成し
た。−船釣な手順は以下の通りである。

フェニルアセトアミドメチルリンカ−の結合したスチレ
ン−１％−ジビニルベンゼンポリマー（ＰＡＭ樹脂）　
へ０．７５０ｍｍｏ　ｌ／Ｂのｔ−Ｈｏｅセリンが結合
したものを目的のペプチドを調整する樹脂に使用した。

　ｔ−Ｂｏｃアミノ酸（２ｍｍｏ＋）をジクロロメタン
（ＤＣＭ）中に熔解し、Ｎ、Ｎ−ジクロロへキシルカル
ボジイミド（Ｄ　ＣＣ）法で対称性無水物へ活性化し、
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）へ溶媒変換後
、この溶液を脱保護及び洗浄した樹脂に加え結合反応を
進行させた。ただしアスパラギンについては、ｌ−オキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を用いエステル化し
、活性化した０通常の合成過程は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社の開発したプログラムに従った。各
段階におけるアミノ酸結合収率は、ニンヒドリンテスト
試薬を用いて監視した。

使用したｔ−Ｂｏｃアミノ酸は、以下の通りである。

ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ、　ｔ−Ｈｏｅ−Ｌ−Ａｓｎ＋
　ｔ−ＢｏＣ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　。

ｔ−Ｒｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ、　ｔ−Ｂｏｅ−Ｌ−Ｔｌｅ　
・１／２１（ｔＯ，ｔ−Ｈｏｅ−Ｌ−Ｌｅｕ　−ＨｔＯ
，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）、ｔ−ＢｏＣ−
Ｌ−Ｍｅｔ（０）、　　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ、ｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、ｔ−Ｂｏｅ−Ｌ−Ｔｒ
ｐ（ＣＩＯ）。

ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔ
ｏｓ）’ＤＥＣＡ＋１）　　ペプチドマゲイニン２の合
成ペプチド合成後、１ｇペプチド樹脂をｍ−クレゾール
１　ｍ　ｌ　、ジメチルスルオキシド（ＤＭＦ）３　ｍ
　ｌ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌ、トリフルオ
ロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）１ｍｌの混合溶液で
一５〜０℃、３時間処理してメチオニンの側鎖保護基を
除去した。濾過後、チオアニソールｌ　ｍ　１　、エタ
ンジチオール（ＥＤＴ）０．５ｍｌ混合溶液で室温１０
分、ＴＦＡｌｏｍｌを加えて０℃２０分、さらにＴ　Ｆ
　Ｍ　Ｓ　Ａ　１　ｍ　ｌを加えて室温２５分処理する
ことにより、他のアミノ酸の側鎖の保護基及びＮ末端の
ｔ−Ｂｏｃ保護基を除去、樹脂からペプチドを切断した
。濾過、エーテル洗浄後、ＴＦＡ１２ｍｌにペプチドを
溶解し１５０ｍ１エーテル中に滴下し白色沈澱物を得た
。濾過、エーテル洗浄後、１０％酢酸溶液に熔解し凍結
乾燥後白色固体１８７■を得た。）ＩＰＬＣ（００５−
８０７Ｍ直径４．６鶴長さ１５ｃｍ、直線勾配２０−５
０χ０．１χＴＦ＾／ＣＨＩＣＮ　−０，１↑ＦＡ／Ｈ
，０３０分間、２５４ｒｖ　）によれば生成物は、主と
して１つの生成物から成ることが示された。上記条件で
目的ペプチドの分取精製を行い、凍結乾燥し白色固体を
得た。この化合物をアミノ酸配列分析装置（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社：ＰＲＯＴＥＩＮ　　Ｓ
！！ＱＵＥＮＳＥＲＭＯＤＥＬ　４７０Ａ）で分析し、
アミノ酸配列の確認を行った。

（２）　　ペプチドＤ１、Ｄ２、Ｄ３の合成ペプチド合
成後これらのペプチドは、１ｇペプチド樹脂をＥＤＴ２
００μｌＳｍ−クレゾール８００１）１２ＳＤＭＳ３ｍ
１．ＴＦＡ　　５ｍｌ。

ＴＦＭＳＡ　　１ｍｌの混合溶液で一５〜Ｏ℃、３時間
処理し、メチオニンとトリプトファンの側鎖保護基を除
去した。ペプチドの樹脂からの切断は、ペブチドマゲイ
ニン２と同様である。凍結乾燥後、ペプチドＤＩは１４
８曙、ペプチドＤ２は２１２■、ペプチドＤ３は６０■
の白色固体として得られた。

上記と同様にして、）ＩＰＬＣによる分取精製を行い、
アミノ酸配列分析からそれらのアミノ酸配列を確認した
。

実　施　例　２　　抗菌活性の測定本発明ペプチドの抗菌活性を大腸菌（［！５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ対して試験した。微生物をＬＢ・アガー・プレ
ート（１０％トリトリンＤＩＰＣＯ１５％　イーストエ
キストラクトＤＩＦＣＯ１５％　Ｎａ（ｌ　　和光純薬
、１．５％　アガーＤＩＦＣＯ）上に維持し、単コロニ
ーからの生物を５　ｍ　ｌのＬＢジブロース中導入し、
３０℃にて一晩培養した。０．１ｍｌのこの中間培養物
を５ｍｌの新鮮なＬＢブロースで希釈し、さらに３０℃
で培養した。定常期培養混合物は、８Ｘ１０’細胞／　
ｍ　Ｉの細菌を含有した。１００μｌのこの培養混合物
を、１００ｍ１のソフト・ＬＢ・アガー（１０％　トリ
プトン　ＤＩＦＣＯ１５％　イーストエキストラクト　
ＤＩＰＣｏ　、　５％ＮａＣ１和光純薬、０．７％　ア
ガー　ＤＩＦＣＯ）　テ希釈し、このうちの３．２ｍｌ
を２０ｍ１　　ＬＢ・アガー・プレート上に維持した。

このプレート上へ、段階的に希釈したサンプル３μ！を
直接滴下し、３０℃にて１８時間から２４時間培養して
充分な菌の増殖を行い、形成される阻止円のサンプル濃
度依存性を測定した。

マゲイニン２、ペプチドＤＩ、ペプチドＤ２、ペプチド
Ｄ３に対する大腸菌ＡＤ３１株の感受性を第２図に示す
。

第２図から明らかなように本発明の前記−数式ｆｌ＋で
表されるペプチドはマゲイニン２よりも高い活性を示し
た。

実　施　例　３　　殺細胞活性の測定リンホトキシン活性測定法（３）に準じてマイクロプレ
ート法により測定した。５％ウシ胎児血清を含有するＭ
ＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）にマウスＬ−Ｍ細胞を培養し、
その３Ｘ１０”細胞１５０μｌをウェルにいれ、リン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ　：　０．０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７，２，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１）により２
倍系列で１０段階希釈したサンプル２０μｌを加えて５
％　ＣＯ，存在下、３７℃にて６２時間培養した。上清
をアスピレータ−で除去したのち、０．０５Ｍクリスタ
ルバイオレット・ホルマリン・エタノール溶液１００μ
ｌを加えて、３０分間細胞を染色した。プレートを水で
洗浄したのち、５０％エタノール溶液１００μｌで色素
を溶出し、光度計（ミニリーダー■、グイナテック社）
を用いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度（通常
目盛り）とサンプル濃度（対数目盛り）とを片対数グラ
フにプロットし、５０％殺細胞に要するサンプル濃度を
殺細胞活性値とした。ポジティブコントロールとして、
ヒトＴリンパ球性白血病細胞株ＨＵＴ−１０２培養上清
を用いた。マゲイニン２、ペプチドＤ１、ペプチドＤ２
．及びペプチドＤ３の殺細胞活性を第３図に示す。

引用文献（１）　　Ｍ、Ｚａｓｌｏｆｆ　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾＋２１　　［！、５ｏｒ
ａｖｉａ　ｅｔ　　ａｌ、　ＦＥＢＳ　Ｌｌ！ＴＴＥＲ
（１９８８）　　２２８＋３１　　Ｅ、Ａ、Ｃａｒｓ綽
ｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７５）　７２　３６６６

【図面の簡単な説明】

第１図は、天然型マゲイニン２及び本発明のマゲイニン
様ペプチドＤｉ（図中Ｂ）、Ｄ２（図中Ｃ）、Ｄ３（図
中Ｄ）のアミノ酸配列を示す。第２図は、第１図に示す各ペプチドの大腸菌に対する抗
菌活性を示す阻止円のスケッチである。第３図は、第１図に示すペプチドの殺細胞活性を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】〔式中、Ｘ＿１とＸ＿２は各々独立に０または１個の任
意のアミノ酸を意味する。但し、Ｘ＿１及びＸ＿２は同
時にはＰｈｅにはなりえない。〕を有するマゲイニン様
ペプチド。