DE4142157B4 - Opioid-Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung - Google Patents

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Abstract

Opioid-Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen
Gly-Tyr-Tyr-Pro,
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr,
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser oder
Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu
und deren physiologisch akzeptable Salze.

Description

  • Die Erfindung betrifft Opioid-Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie aufhaltende pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß den Patentansprüchen. Sie sind von Weizenproteinen, insbesondere Weizengluten, abgeleitet.
  • Es ist bekannt, daß die von Lebensmittelproteinen (Casein, Gluten) abgeleiteten Peptide Opioid-Aktivitäten aufweisen, wie z.B. Morphin-artige narkotische, analgetische Aktivitäten, und daß sie physiologisch wichtig sein können.
  • C. Zioudrou et al haben darüber berichtet, daß Peptide mit einer Opioid-Aktivität in Pepsin-Hydrolysaten von Weizengluten und α-Casein gefunden wurden und es wurde auch deren Aktivität nachgewiesen durch Anwendung von Bioassays einschließlich der Naloxon-reversiblen Inhibierung von Adenylat-Cyclase in Homogenaten von Neuroplastom-X-Gliom-Hybridzellen und von elektrisch stimulierten Kontraktionen des Maus-Vas deferens (Samenleiters der Maus) ("J. Biol. Chem.", Band 254, Nr. 7, Seiten 2446-2449 (1979)).
  • F.R. Huebner et al haben die Opioid-Aktivitäten in den von der Gliadin-Fraktion abgeleiteten Fragmenten mittels des Radiorezeptor-Assays erkannt ("Peptides", Band 5, Seiten 1139-1147 (1984)).
  • John E. Morley et al haben darüber berichtet, daß hydrolysiertes Gluten die Intestinal-Durchgangszeit verlängert und daß dieser Effekt umgekehrt wird durch die gleichzeitige Verabreichung von Naloxon und daß auch hydrolysiertes Gluten eine Naloxon-reversible Erhöhung der Somatostatinartigen Aktivität im Plasma mit sich bringt, die für die verzögerte Durchgangszeit verantwortlich sein kann ("Gastroenterology", Band 84, Nr. 6, S. 1517-1523).
  • In diesen Berichten wurde zwar erkannt, daß Opioid-Peptide in Gluten-Hydrolysaten nachgewiesen wurden, es hat sich bis jetzt aber als nicht möglich erwiesen, die Struktur und den Charakter dieser Peptide aufzuklären.
  • Es wurde nun gefunden, daß die aktiven Peptide aus den Pepsinhydrolysaten von Weizengluten nicht isoliert werden konnten wegen ihrer sehr geringen Aktivität. Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis fortgesetzter Bemühungen, neue Opioid-Peptide mit den angegebenen Strukturen aus den Gluten-Hydrolysaten zu isolieren.
    •
  • Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Opioid-Peptide mit der angegebenen Aminosäuresequenz, die aus den Hydrolysaten von Weizenproteinen isoliert wurden, zur Verfügung zu stellen. Ziel der Erfindung ist es ferner, Verfahren zur Herstellung von Opioid-Peptiden durch enzymatische Hydrolyse anzugeben. Ziel der Erfindung ist es schließlich, pharmazeutische Zusammensetzungen zu schaffen, welche die Opioid-Peptide als aktive Komponente (Wirkstoff) enthalten.
  • Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
  • 1 die Trennung von aktiven Opioid-Fraktionen I, II, III und IV in einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne; und
  • 2 die Gewinnung der aktiven Opioid-Fraktion V aus der ODS-Kolonne.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide mit einer Opioid-Aktivität (Opioid-Peptide), die hergestellt werden durch Hydrolyse von Weizenptroteinen mittels Proteasen. Gegenstand der Erfindung sind daher Opioid-Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen
    Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID NO:1)(1)
    Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID NO:2)(2)
    Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID NO:3)(3)
    Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID NO:4)(4)
    und deren physiologisch akzeptable Salze.
  • Die vier Opioid-Peptide mit den Sequenzen (1), (2), (3) und (4), nämlich (SEQ ID NO:1), (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3) und (SEQ ID NO:4) sind neu und werden hier der Einfachheit halber als "Peptid A", "Peptid B", "Peptid C" bzw. "Peptid D" bezeichnet. Soweit bekannt, gibt es bisher keinen Bericht über die Herstellung und Isolierung der vier Peptide aus Weizenproteinen durch enzymatische Hydrolyse oder chemische Synthese.
  • Opioid-Peptide, welche jeweils die nachfolgende Aminosäuresequenz aufweisen
    Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID NO:5)(5)
    Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID NO:6)(6)
    sind bekannt aus „J. Med. Chem." 1978, Band 21, Nr. 11, S. 1110-1115, es gibt jedoch keinen Bericht über die Herstellung und Isolierung dieser beiden Peptide aus Weizenproteinen durch enzymatische Hydrolyse. Die beiden Opioid-Peptide mit den Sequenzen (5) und (6) (SEQ ID NO:5) und (SEQ ID NO:6) werden hier der Einfachheit halber als "Peptid E" bzw. "Peptid F" bezeichnet. Die die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide aufbauenden Aminosäuren können in jeder beliebigen der D-, L- und DL-Konfigurationen vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide sowie die Opioid-Peptide mit den vorstehenden Sequenzen (5) und (6) können hergestellt werden durch ein einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildendes enzymatisches Verfahren, das umfasst die Hydrolyse von Weizenproteinen mittels einer sauren Protease, die weitere Hydrolyse der Hydrolysate mittels einer neutralen Protease oder einer alkalischen Protease und die Fraktionierung, Isolierung und Reinigung des resultierenden Peptidgemisches auf konventionelle Weise. Die Aminosäuresequenz der so isolierten Peptide kann beispielsweise durch Verwendung eines Protein-Sequenzers festgelegt werden.
  • Auf der Basis der festgelegten Aminosäuresequenz können die erfindungsgemäßen Peptide auch unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens synthetisiert werden, beispielsweise durch eine Festphasen-Synthese nach der t-Boc-Strategie.
  • Die Weizenproteine, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können Gluten allein oder ein Gemisch aus Gluten mit ande ren Proteinen im Weizen, wie Albumin, Gliadin und Globulin, umfassen.
  • Die sauren Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Pepsin und Asparagin-Proteinasen, die aus Pycnoporus coccineus, Aspergillus und Penicillium stammen. Sie können entweder allein oder in Kombination untereinander verwendet werden, so lange sie keinen nachteiligen Einfluß aufeinander haben. Wenn eine Vielzahl von sauren Proteasen verwendet wird, kann die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unterschiedlicher Proteasen oder aufeinanderfolgende Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.
  • Die neutralen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Metallproteasen, die aus Mikroorganismen stammen einschließlich der wärmebeständigen Proteasen aus Bacillus, wie z.B. Thermolysin, derjenigen, die aus Aspergillus streptomyces und Rhizopus stammen; derjenigen, die aus Pflanzen, wie Papain, Bromelain stammen; und derjenigen, die in vivo in Tieren vorkommen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Thrombin.
  • Die alkalischen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Cerin-Proteasen, die aus Bacillus stammen.
  • Die neutralen oder alkalischen Proteasen können allein oder in Kombination untereinander verwendet werden, so lange sie keinen nachteiligen Einfluß aufeinander haben. Wenn eine Vielzahl von neutralen Proteasen verwendet wird, kann die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unterschiedlicher Proteasen oder aufeinanderfolgende Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.
  • Die Fraktionierung, Isolierung und Reinigung kann auf bekannte Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Membrantrennung und unter Anwendung eines chromatographischen Verfahrens. In dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ist eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) einschließlich der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne, einer Phenyl-Kolonne, einer Cyanopropyl-Kolonne und einer Phenethyl-Kolonne.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide weisen Opioid-Aktivitäten auf, die beteiligt sind an der Analgesie, der Narkose, der Affektion, der Atmung, dem Pulsschlag, der Körpertemperatur, der Gastrointestinalfunktion, der Athrocytose, der Immunität, der Regulierung der Hormonsekretion, wie Insulin und Somatostatin, der verbesserten Elektrolytabsorption und der regulierten Kontraktion des Myocards, so daß sie verwendbar sein können als Analgetikum und Narkotikum, als Hypnotikum, als Gastrointestinalhormmon-Sekretionsver besserungsmittel oder als Elektrolyt-Absorptionsverbesserungsmittel.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) Opioid-Peptide enthalten, die jeweils die Aminosäuresequenz der obengenannten Formeln (1) bis (4) aufweisen, oder physiologisch akzeptable Salze davon in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide oder ihre Salze können, da sie ein wasserlösliches weißes Pulver darstellen, in der Form, in der sie vorliegen, oder in einer in Wasser gelösten Form oral oder parenteral verabreicht werden. Je nach Art der Verabreichung kann das Opioid-Peptid mit einer großen Vielzahl von physiologisch akzeptablen Trägern formuliert sein. Die Dosierungsformen können umfassen Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Pastillen, Sirupe, Granulate, Pulver, injizierbare Lösungen oder Suspensionen.
  • Die geeignete Dosis kann ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Dosierungsform, dem Alter und dem Geschlecht der Patienten oder dem Grad der Symptome.
  • Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide können Lebensmitteln und Futtermitteln zugesetzt werden.
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.
  • Hydrolyse von Weizengluten
  • Weizengluten wird mit Proteasen hydrolysiert zur Herstellung einer wasserlöslichen Peptidmischung. Anfänglich wird Weizengluten mit einer Säureprotease hydrolysiert in der Weise, daß es in einer Säurelösung, beispielsweise in verdünnter Chlorwasserstoffsäure, dispergiert und gelöst wird. Danach wird das Hydrolysat neutralisiert oder alkalisch gemacht und weiter hydrolysiert mit einer neutralen oder alkalischen Protease zur Herstellung einer Peptidmischung. In diesem Falle kann die Peptidmischung, welche die Petide A (SEQ ID NO:1), B (SEQ ID NO:2), E (SEQ ID NO:5) und F (SEQ ID NO:6) enthält, erhalten werden durch Verwendung von neutraler oder alkalischer Protease. Die Peptidmischung, die das Peptid D (SEQ ID NO:4) enthält, kann erhalten werden durch Verwendung von solchen Proteasen als neutraler Protease, die in vivo in Tieren vorkommen, wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin. In diesem Falle können Trypsin und Chymotrypsin gleichzeitig oder nacheinander angewendet werden.
  • Bei der Herstellung der Peptide wird Pepsin vorzugsweise als saure Protease verwendet, da das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.
  • Bei der Herstellung der Peptide A (SEQ ID NO:1), B (SEQ ID NO:2), E (SEQ ID NO:5) und F (SEQ ID NO:6) werden vorzugs weise Thermolysin, das aus Bacillus stammt, oder solche, die aus Aspergillus (insbesondere Aspergillus oryzae) stammen, bevorzugt als neutrale Proteasen verwendet, da das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.
  • Die sauren, neutralen und alkalischen Proteasen können in freier Form oder im immobilisierten Zustand verwendet werden. Die verwendete Menge der Protease kann in dem Bereich von etwa 5000 bis etwa 100 000 Einheiten pro 100 g trockenem Gluten liegen. Die Aktivität (Einheit) der verwendeten Protease wird bestimmt nach dem Casein-Folin-Färbeverfahren A, wie es von S. Akabori in "Method of Studying Enzymes", Band 2, S. 238 (1961), beschrieben ist, unter Verwendung einer 1 % Hamerstein-Caseinlösung als Substrat, die von der Firma American Merk Co. erhältlich ist. Die Reaktion wird 30 min lang bei 30°C durchgeführt. Die für die Freisetzung von 1 μg Tyrosin für 1 min erforderliche Enzymmenge wird als eine Einheit bezeichnet.
  • Eine Proteasebehandlung wird zweckmäßig durchgeführt unter optimalen Bedingungen des pH-Wertes, der Temperatur, der Menge der Protease, der Rate und Dauer der Behandlung, die entsprechend den Situationen, beispielsweise der Arten und der Verwendungsformen der Protease, ausgewählt werden. Bei der Durchführung der Hydrolyse von Gluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin oder mit Pepsin und danach mit Trypsin-Chymotrypsin wird beispielsweise eine wäßrige Lösung oder wäßrige Dispersion von Gluten auf einen pH-Wert zwischen etwa 1,5 und 5,0 eingestellt und bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C mit Pepsin hydrolysiert. Anschließend wird die Lösung auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0 eingestellt und weiter hydrolysiert mit Thermolysin oder Trypsin-Chymotrypsin bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C, bis die Löslichkeit in 0,75 M Trichloressigsäure in dem Bereich von etwa 40 bis 80 % liegt.
  • Zu dem Zeitpunkt, wenn eine Hydrolyse bis zu dem gewünschten Grad erreicht ist, werden die Proteasen durch Erhitzen und/oder Einstellung des pH-Wertes desaktiviert. Das desaktivierte Enzym und eventuelle unlösliche feste Materialien, wie z.B. nicht-hydrolysiertes Gluten, werden abgetrennt und entfernt auf geeignete Weise, beispielsweise durch Zentrifugieren, wobei man eine Peptidmischung aus der zurückbleibenden Lösung durch Trocknen oder erhält.
  • Dann wird die in Wasser gelöste Peptidmischung einer HPLC, beispielsweise einer HPLC an einer Umkehr-Kolonne, unterworfen, um das gewünschte Peptid in reiner Form zu isolieren.
  • Die Isolierung der Opioid-Peptide aus der Petidmischung kann auf die folgende Weise erfolgen.
  • Isolierung der Peptide A, B, E und F
    • a1) Die durch Hydrolyse von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin hergestellte Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne (wie z.B. Cosmosil 5 C18-AR, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05 % TFA enthält (Lösung B) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 40 % der Lösung B eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I), die in einer ACN-Konzentration zwischen etwa 22,5 und 23,5 % eluiert wird, eine Peak-Fraktion (Fraktion II), die zwischen etwa 24 und 25 % eluiert wird, eine Peak-Fraktion (Fraktion III), die zwischen etwa 28 und 29 % eluiert wird, und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV), die zwischen etwa 34 und 35 % eluiert wird, werden jeweils fraktioniert und bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
    • b1) Die in der Stufe (a1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen werden einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (a1) verwendeten unterworfen (wie z.B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in der Stufe (a1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-1), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 24 und 25 % eluiert wird, wird von der Fraktion I abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion II-1), die zwischen etwa 33 und 34 % eluiert wird, wird von der Fraktion II abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III-1), die zwischen etwa 30 und 31 % eluiert wird, wird von der Fraktion III abgetrennt und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-1), die zwischen etwa 36 und 37 % eluiert wird, wird von der Fraktion IV abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
    • c1) Die in der Stufe (b1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen werden der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (b1) verwendeten unterworfen (wie z.B. Cosmosil 5 CN-R, Nacalai Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in den Stufen (a1) und (b1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 18 und 19 % eluiert wird, wird von der Fraktion I-1 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion II-2), die in der ACN-Konzentration von etwa 27 % eluiert wird, wird von der Fraktion II-1 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III-2), die zwischen etwa 26 und 27 % eluiert wird, wird von der Fraktion III-1 abgetrennt und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-2), die zwischen etwa 32 und 33 % eluiert wird, wird von der Fraktion IV-1 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
    • (d1) Von den in der Stufe (c1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen werden die Fraktionen I-2, III-2 und IV-2 der in (a1) angewendeten Kolonnenchromatographie unter worfen und dann mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50 %igen ACN-Lösung, die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) enthält (Lösung D) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100 % der Lösung D eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-3), die in der ACN-Konzentration von etwa 18 % eluiert wird, wird von der Fraktion I-2 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III-3), die bei etwa 21 % eluiert wird, wird von der Fraktion III-2 abgetrennt, und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-3), die bei etwa 28 % eluiert wird, wird von der Fraktion IV-2 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
    • e1) Von den in der Stufe (d1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-3 der in (a1) angewendeten Kolonnenchromatographie unterworfen und dann unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in den Stufen (a1), (b1) und (c1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-4), die in der ACN-Konzentration von etwa 31 eluiert wird, wird von der Fraktion IV-3 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivität bestimmt wird.
    • f1) Von den in der Stufe (e1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-4 einer Umkehrphasen-Chromatographie an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in den Stufen (a1), (b1) und (c1) verwendeten unterworfen (z.B. Develosil PhA-5, Nomura Chemical Inc.) und dann auf ähnliche Weise wie in der Stufe (d1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-5), die in der ACN-Konzentration von etwa 29 % eluiert wird, wird von der Fraktion IV-4 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivität bestimmt wird.
    • g1) Aus der in der Stufe (c1) erhaltenen aktiven Opioid-Fraktion (Fraktion II-2), aus den in der Stufe (d1) erhaltenen aktiven Opioid-Fraktionen (Fraktion I-3, Fraktion III-3) und aus der in der Stufe (f) erhaltenen aktiven Opioid-Fraktion (IV-5) werden zur Gewinnung durch Trocknung die Lösungsmittel entfernt.
    • h1) Die Aminosäuresequenz der in der Stufe (g1) erhaltenen getrockneten Materialien wird mittels eines Protein-Sequenzers (wie z.B. 477 A Protein-Sequenzer, Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die Fraktion I-3 wurde identifiziert als Peptid B (SEQ ID NO:2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, die Fraktion II-2 wurde identifiziert als Peptid A (SEQ ID NO:1), Gly-Tyr-Tyr-Pro, die Fraktion III-3 wurde identifiziert als Peptid F (SEQ ID NO:6), Tyr-Gly-Gly-Trp und die Fraktion IV-5 wurde identifiziert als Peptid E (SEQ ID NO:5), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu.
  • Isolierung des Peptids D
    • (a2) Die durch Hydrolyse von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Trypsin-Chymotrypsin erhaltene Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne (beispielsweise Cosmosyl 5 C18-AR, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05 % TFA enthält (Lösung B) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 40 % der Lösung 8 eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 31 und 32 % eluiert wird, wird abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu identifizieren.
    • b2) Die in der Stufe (a2) hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V) wird einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (a2) verwendeten (wie z.B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und auf ähnliche Weise wie in der Stufe (a2) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-1), die in der ACN-Konzentration von etwa 33 % eluiert wird, wird abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu ermitteln.
    • c2) Die in der Stufe (b2) hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-1) wird einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als die in den Stufen (a2) und (b2) verwendeten unterworfen (beispielsweise Cosmosil 5 CN-R, Nacalei Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in den Stufen (a2) und (b2) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 27 und 28 % eluiert wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.
    • d2) Die in der Stufe (c2) hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-2) wird der in der Stufe (a2) angewendeten Kolonnenchromatographie unterworfen und dann mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50 %igen ACN-Lösung, die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) enthält (Lösung D) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100 % Lösung D eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-3), die in der ACN-Konzentration von etwa 24 % eluiert wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.
    • e2) Die aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-3) wird getrocknet zur Entfernung des Lösungsmittels und abgetrennt.
    • f2) die Aminosäuresequenz der in der Stufe (e2) erhaltenen getrockneten Materialien wird mittels eines Protein-Sequenzers (beispielsweise 477 A Protein-Sequenzer, Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die Fraktion V-3 wurde identifiziert als Peptid D (SEQ ID NO:4).
  • Alternativ können die Peptide A bis F (SEQ ID NOS:1-6) der Erfindung durch chemische Synthese, beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
  • Chemische Synthese von Peptiden
  • Das Peptid wird synthetisiert mittels eines Sam 2-Peptid-Synthesizers (Biosearch Inc.) entsprechend einem Standard- Protokoll des Synthesizers. Ein Boc(butoxycarbonyl)-Proharz wird mit einer Deblockierungslösung, die 45 Trifluoressigsäure enthält, behandelt und dann mit Boc-Tyr(Cl2-Bzl) in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid gekuppelt. Nach dem Deblockieren auf ähnliche Weise wie oben angegeben wird das Harz nacheinander mit Boc-Tyr (Cl2Bzl) und Boc-Gly gekuppelt zur Herstellung eines Boc-Gly-Tyr-(Cl2-Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Harzes. Dieses Peptidharz wird in Fluorwasserstoff, der 10 % Anisol enthält, eingeführt und 1 h lang bei 0°C gerührt. Nachdem der Fluorwasserstoff abdestilliert worden ist, wird der Rückstand mit Äther gewaschen und ein Peptid wird mit 30 %iger Essigsäure extrahiert. Die Reinigung des rohen Peptids durch HPLC an der ODS-Kolonne ergibt das Peptid A (SEQ ID NO:1).
  • Die Peptide B-F (SEQ ID NOS:2-6) können auch nach einem ähnlichen Verfahren wie oben synthetisiert werden.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
    •
  • Beispiel 1
  • Herstellung der Peptide A, B, E und F aus Weizengluten-Hydrolysaten
    • 1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100 ml 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Zu dieser Glutenlösung wurden 5000 Einheiten Pepsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugegeben und die Lösung wurde 15 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt, es wurden 5000 Einheiten Thermolysin (erhältlich von der Firma Peptide Research Institute Inc.) zugegeben und die Mischung wurde 4 h lang bei 37°C inku biert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20 min lang auf 90°C erhitzt, um das Pepsin und das Thermolysin zu desaktivieren. Das Hydrolysat wurde 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und die resultierende überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,5 g Weizengluten-Hydrolysat erhielt.
    • 2) 80 mg des Weizengluten-Hydrolysats wurden einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR, Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und dann mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05 TFA enthielt (Lösung B) in einer Strömungsrate von 10 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % der Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 230 nm ist in der 1 dargestellt. Bei den in 1 dargestellten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden in der Fraktion I, die zwischen etwa 22,5 und 23,5 in der ACN-Konzentration eluiert wurde, bei der Fraktion II, die zwischen etwa 24 und 25 % eluiert wurde, bei der Fraktion III, die zwischen etwa 28 und 29 % eluiert wurde, und bei der Fraktion IV, die zwischen etwa 34 und 35 eluiert wurde.
    • 3) Das gleiche Verfahren wie in (2) wurde hergestellt unter Verwendung von 2000 mg des Weizengluten-Hydrolysats, wie es im Abschnitt (1) hergestellt worden war, wobei man die aktiven Opioid-Fraktionen I, II, III und IV erhielt. Diese aktiven Fraktionen wurden einer RPC unterworfen unter Verwendung einer Phenyl-Kolonne (Cosmosil 5 Ph, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und mit den Lösungen A und B bei einer Strömungsrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Bei jeder der erhaltenen Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei der Fraktion 1 in der Fraktion I-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 24 bis 25 % eluiert wurde, bei der Fraktion II in der Fraktion II-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 33 bis 34 % eluiert wurde, bei der Fraktion III in der Fraktion III-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 30 bis 31 % eluiert wurde, und bei der Fraktion IV in der Fraktion IV, die bei etwa 36 bis 37 % eluiert wurde.
    • 4) Die im Abschnitt (3) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen in den Fraktionen I-1, II-1, III-1 und IV-1 wurden einer RPC unterworfen unter Verwendung einer Cyanopropyl-Kolonne (Cosmosil 5 CN-R, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (3) eluiert. Jede der Eluatfraktionen wurde gesammelt und es wurde ihre Opioid-Aktivität bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden für die Fraktion I-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-2) in der ACN-Konzentration von etwa 18 bis 19 %, bei der Fraktion II-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion II-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27 %, bei der Fraktion III-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-2) in der ACN-Konzentration von etwa 26 bis 27 %, und bei der Fraktion IV in einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-2) in der ACN-Konzentration von etwa 32 bis 33 %.
    • 5) Die Fraktionen I-2, III-2 und IV-2 der wie oben in (4) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wurden einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR, Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und dann mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) (Lösung C) und ei ner 50 %igen ACN-Lösung, die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) enthielt (Lösung D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Lösung D eluiert. Jede Eluatfraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden für die Fraktion I-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-3) in der ACN-Konzentration von etwa 18 %, für die Fraktion III-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-3) in der ACN-Konzentration von etwa 21 % und für die Fraktion IV-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-3) in der ACN-Konzentration von etwa 28 %.
    • 6) Die Fraktion IV-3 der im obigen Abschnitt (5) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wurde erneut einer RPC unterworfen unter Verwendung der gleichen Kolonne wie im Abschnitt (5) und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (4) eluiert. Jede Eluatfraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-4) in der ACN-Konzentration von etwa 31 %.
    • 7) Die Fraktion IV-4 der wie oben unter (6) hergestellten aktiven Opioid-Fraktion wurde weiter einer Phenethyl-Kolonne (Develosil PhA-T-5, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nomura Chemical Inc.) unterworfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (5) eluiert. Die Bestimmung der Opioid-Aktivität bei jeder Eluatfraktion ergab, daß eine Opioid-Aktivität gefunden wurde bei einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-5) in der ACN-Konzentration von etwa 29 %.
    • 8) Die im Abschnitt (4) erhaltene Fraktion II-2, die im Abschnitt (5) erhaltenen Fraktionen I-3 und III-3 und die im Abschnitt (7) erhaltene Fraktion IV-5 wurden abgetrennt, eingeengt und getrocknet.
  • Die wie oben hergestellten getrockneten Materialien wurden analysiert zur Bestimmung der Aminosäuresequenz unter Verwendung eines 477-A Protein-Sequenzers (Applied Biosystems Inc.). Aus dem getrockneten Material der Fraktion I-3 wurden L-Gly, L-Tyr, L-Tyr, L-Pro und L-Thr nacheinander aus dem N-Terminus freigesetzt, das dann als "Peptid B" identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
  • Aus dem getrockneten Material der Fraktion II-2 wurden L-Gly, L-Tyr, L-Tyr und L-Pro nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid A (SEQ ID NO:1) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
  • Aus dem getrockneten Material der Fraktion III-3 wurden L-Tyr, L-Gly, L-Gly und L-Trp nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid F (SEQ ID NO:6) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
  • Aus dem getrockneten Material der Fraktion IV-5 wurden L-Tyr, L-Gly, L-Gly, L-Trp und L-Leu nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid E (SEQ ID NO:5) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
  • Die Ausbeuten an den Peptiden A, B, E und F wurden bestimmt anhand der Molekulargewichte und des molekularen Extinktionskoeffizienten bei Abs. 280, die Werte von etwa 4 × 10-2 (%) , 4 × 10-3 (%) , 1 × 10-5 (%) bzw. 3 × 10-4 (%) ergaben. Die Rf-Werte der Peptide A, B, E und F wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Platten bestimmt unter Verwendung von Butanol, Essigsäure, Pyridin, Wasser (15/3/10/12) als Entwicklungslösungsmittel, wobei die Werte 0,58, 0,54, 0,77 bzw. 0,61 erhalten wurden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung einer Peptidmischung, welche die Peptide A B E und F enthält, aus Weizengluten-Hydrolysaten
  • Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als saure Protease die gleichen Einheiten einer Asparagin-Protease, die aus Aspergillus niger stammte (erhältlich von der Firma Yakult Co. unter dem Handelsnamen "Protease YP-SS") anstelle von Pepsin verwendet wurde und die Weizengluten-Lösung, die auf pH 3,0 eingestellt worden war, 15 h lang bei 37°C inkubiert wurde. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in der 1 dargestellt, der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhält man somit eine Peptidmischung mit einer Opioid-Aktivität, welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS:1, 2, 5 & 6) enthielt.
  • Beispiel 3
  • Herstellung einer die Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus Weizengluten-Hydrolysaten
  • Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer neutralen Protease, die aus Aspergillus oryzae stammte (erhältlich von der Firma Yamato Chemical Co. unter dem Handelsnamen "Protin FN") anstelle von Thermolysin verwendet wurde. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chroma tographie auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in 1 dargestellt, mit der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. Man erhielt so in diesem Beispiel eine Peptidmischung mit einer Opioid-Aktivität, welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS:1, 2, 5 & 6) enthielt.
  • Beispiel 4
  • Herstellung einer die Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus Weizengluten-Hydrolysaten
  • Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer Cerin-Protease, die aus Bacillus stammte (erhältlich von der Firma Nagase Sangyo Co. unter dem Handelsnamen "Bioprase SP-4") anstelle von Thermolysin verwendet wurden. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in 1 dargestellt, mit der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhielt man somit eine Peptid-Mischung mit Opioid-Aktivität, welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS: 1, 2, 5 & 6) enthielt.
  • Beispiel 5
  • Herstellung des Peptids D aus Weizengluten-Hydrolysaten
    • 1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100 ml einer 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Zu dieser Weizengluten-Lösung wurden 5000 Einheiten Pepsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugegeben und die Lösung wurde 15 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit einer wäßrigen 1 N NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt, es wurden jeweils 5000 Einheiten von Trypsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co.) und Chymotrypsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co.) zugegeben und die Mischung wurde 4 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20 min lang auf 90°C erhitzt, um die Enzyme zu desaktivieren. Das Hydrolysat wurde 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und die resultierende überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,0 g eines Weizengluten-Hydrolysats erhielt.
    • 2) Das in dem Abschnitt (1) hergestellte Weizengluten-Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) unterworfen unter Verwendung einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR; Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und dann mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05 % TFA enthielt (Lösung B), bei einer Strömungsrate von 10 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % der Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 230 nm bei dieser Zeit ist in 2 dargestellt. Bei den in der 2 dargestellten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden bei der Fraktion V, die zwischen etwa 31 und 32 in der ACN-Konzentration eluiert wurde.
    • 3) Das gleiche Verfahren wie im Abschnitt (2) wurde wiederholt unter Verwendung von 2000 mg des im Abschnitt (1) hergestellten Weizengluten-Hydrolysats, wobei man eine aktive Opioid-Fraktion der Fraktion V erhielt. Diese Frak tion wurde einer RPC an einer Phenyl-Kolonne (Cosmosil 5 Ph, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit den Lösungen A und B bei einer Strömungsrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Bei jeder der eluierten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden bei der Fraktion V-1, die in der ACN-Konzentration vone etwa 33 % eluiert wurde.
    • 4) Die aktive Opioid-Fraktion in der Fraktion V-1, wie sie im Abschnitt (3) hergestellt worden war, wurde einer RPC an einer Cyanopropyl-Kolonne (Cosmosil 5 CN-R, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai-Tesque Inc.) unterworfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (3) eluiert. Jede der Eluat-Fraktionen wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden in einer Peak-Fraktion (Fraktion V-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27 bis 28 %.
    • 5) Die wie im obigen Abschnitt (4) hergestellte aktive Opioid-Fraktion der Fraktion V-2 wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR; Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 150 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50 %igen ACN-Lösung, die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) enthielt (Lösung D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Lösung D eluiert. Jede eluierte Fraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wude eine Opioid-Aktivität gefunden in einer hohen Absorptions-Peak-Fraktion (Fraktion V-3) in der ACN-Konzentration von etwa 24 %.
    • 6) Die im Abschnitt (5) hergestellte Fraktion V-3 wurde abgetrennt, eingeengt und getrocknet.
  • Das oben hergestellte getrocknete Material wurde auf seine Aminosäuresequenz untersucht unter Verwendung des gleichen Modell 477-A-Protein-Sequenzers, wie er in Beispiel 1 verwendet worden war. Es wurde gefunden, daß L-Tyr, L-Pro, L-Ile, L-Ser und L-Leu aus dem N-Terminus nacheinander freigesetzt wurden, der als Peptid D (SEQ ID NO:4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu identifiziert wurde, wobei alle sie aufbauenden Aminosäuren L-Aminosäuren waren.
  • Die Ausbeute an Peptid D aus Weizengluten wurde aus den Molekulargewichten und dem Molekularextinktionskoeffizienten bei Abs. 280 bestimmt, wobei ein Wert von etwa 4 × 10-4 (%) erhalten wurde. Der Rf-Wert des Peptids D wurde durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel-Platten auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 bestimmt, wobei ein Wert von 0,73 erhalten wurde.
  • Beispiel 6
  • Herstellung der Peptide A-F durch chemische Synthese
  • 1) Synthese des Peptids A
  • Eine Mischung aus 0,75 g eines handelsüblichen Boc(butoxycarbonyl)-Pro-Harzes (Substitution 0,4 meq/g) und 20 ml Methylenchlorid, enthaltend 45 % Trifluoressigsäure und 2,5 % Anisol, wurde 25 min lang in dem Reaktionsgefäß eines Sam 2-Peptid-Synthesizers (hergestellt von der Firma Biosearch Inc.) bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um eine Boc-Gruppe zu entfernen.
  • Das Pro-Harz mit der entfernten Boc-Gruppe wurde dann mit Methylenchlorid gewaschen, mit Methylenchlorid, das 10 Diisopropylethylamin enthielt, neutralisiert und mit Methylenchlorid weiter gewaschen.
  • Dieses Harz wurde mit 5 ml einer Lösung von 0,4 M Boc-Tyr(Cl2-Bzl) in Dimethylformamid und 5 ml einer Lösung von 0,4 M Diisopropylcarbodiimid in Methylenchlorid gemischt und die Mischung wurde in das Reaktionsgefäß eingeführt und 2 h lang unter Rühren bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
  • Das resultierende Harz wurde nacheinander mit Dimethylformamid, Methylenchlorid, Methylenchlorid, das 10 % Diisopropylethylamin enthielt, Methylenchlorid und Methylenchlorid/Dimethylformamid gewaschen, wobei man ein Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Harz erhielt.
  • Die wiederholte Entfernung einer Boc-Gruppe und das Ankuppeln einer Boc-Aminosäure auf die vorstehend beschriebene Weise ergab ein Produkt, das aus Boc-Gly-Tyr(Cl2-Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Harz bestand.
  • Dieses Harz wurde in 20 ml Fluorwasserstoff, der 10 % Anisol enthielt, eingeführt und 2 h lang bei 0°C gerührt, um aus dem Harz ein Peptid freizusetzen.
  • Anschließend wurde der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 30 %iger Essigsäure extrahiert und lyophilisiert, wobei man 150 mg eines rohes Peptids erhielt. Das rohe Peptid wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) unter Verwendung einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR, Nacalai Tesque Inc.) gereinigt, wobei man 40 mg eines Endprodukts mit der Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) G1y:Tyr:Tyr:Pro = 1:1:1:1 erhielt. Durch Analyse mit dem gleichen Protein-Sequenzer, wie er in Beispiel 1 verwendet worden war, wurde das synthetisierte Peptid als Peptid A (SEQ ID NO:1) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro identifiziert. Der durch Dünnschichtchromatographie (TLC) ermittelte Rf-Wert betrug, wie gefunden wurde, 0,58 wie im Produkt des Beispiels 1.
  • 2) Synthese des Peptids B
  • 30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen Boc(butoxycarbonyl)-Thr(Bzl)-Harzes (Substitution 0,3 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) des Produkts war Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr = 1:1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid B (SEQ ID NO:2) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,54 wie im Produkt des Beispiels 1.
  • 3) Synthese des Peptids C
  • 30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,77 g eines handelsüblichen Boc-Ser(Bzl)-Harzes (Substitution 0,39 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) war die folgende Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr:Ser = 1:1:1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid C (SEQ ID NO:3) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,53.
  • 4) Synthese des Peptids E
  • 40 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g eines handelsüblichen Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A be schrieben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) betrug Tyr:Gly:Gly:Tyr:Leu = 1:1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid E (SEQ ID NO:5) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug, wie gefunden wurde, 0,77 wie beim Produkt des Beispiels 2.
  • 5) Synthese des Peptids F
  • 30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen Boc-Trp-Harzes (Substitution 0,3 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) des Peptids E betrug Tyr:Gly:Gly:Trp = 1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid F (SEQ ID NO:6) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,61 wie beim Produkt des Beispiels 2.
  • 6) Synthese des Peptids D
  • 40 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g eines handelsüblichen Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) war die folgende Tyr:Pro:Ile:Ser:Leu = 1:1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Petid D (SEQ ID NO:4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,73 wie beim Produkt des Beispiels 3.
  • Assay zur Bestimmung der Opioid-Aktivität
  • Zwei aus männlichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht von 30-35 g entnommene Maus-Vas deferens (Samenleiter) wurden mit einem isotonischen Wandler (TB 612-T der Firma Nippon Koden Kogyo Inc., Japan) unter einer Spannung von 0,4 g verbunden. Jedes der Maus-Vas deferens wurde in ein 2 ml-Magnus-Reagensglas, das bei 36°C gehalten wurde, eingetaucht, in das eine Krebs-Lösung eingefüllt wurde, die 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,54 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 1,19 mM KH2PO4 und 11 mM Glucose enthielt, und aus einer Bombe wurde eine O2-Behandlung (Belüftung) (95 % O2, 5 % CO2) durchgeführt. Nach etwa 2-stündiger Stabilisierung auf diese Weise wurde eine elektrische Stimulierung (30 V, 1 msec) an das Maus-Vas deferens angelegt zur Erzielung einer elektrischen Kontraktion. Nachdem die elektrische Kontraktion stabilisiert war, wurden 50 μl eines Inhibitors (enthaltend einen Aminopeptidase-Inhibitor und dgl.) zum Inhalt des Magnus-Reagensröhrchens zugegeben. Dann wurde jede durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie aus Weizengluten-Hydrolysaten abgetrennte Fraktion in das Röhrchen gegeben und die Änderung der elektrischen Kontraktion des Maus-Vas deferens wurde aufgezeichnet. Die Opioid-Aktivität wurde beurteilt anhand der Inhibierung der elektrischen Kontraktion nach der Zugabe jeder Fraktion und die Umkehrung der Inhibierung wurde beurteilt anhand der Zugabe von 20 μl 10-4 M Naloxon. Bei jeder Fraktion wurde die Konzentration (IC50) bestimmt, welche die elektrisch stimulierte Kontraktion des Maus-Vas deferens um 50 % inhibierte.
  • Die IC50-Werte der Peptide A bis D sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
  • Tabelle I
    Peptide IC50 (μM)
    Peptid A 70
    Peptid B 40
    Peptid C 75
    Peptid D 15
  • Sequenz-Liste
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001

Claims (3)

  1. Opioid-Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen Gly-Tyr-Tyr-Pro, Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser oder Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu und deren physiologisch akzeptable Salze.
  2. Verfahren zur Herstellung eines Opioid-Peptids nach Anspruch 1 und der Opioid-Peptide Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu und Tyr-Gly-Gyl-Trp, dadurch gekennzeichnet, dass man Weizenproteine mittels einer sauren Protease hydrolysiert, die Hydrolysate mittels einer neutralen Protease oder einer alkalischen Protease hydrolysiert und das resultierende Peptidgemisch in an sich bekannter Weise fraktioniert, isoliert und reinigt.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Opioid-Peptid nach Anspruch 1 oder ein physiologisch akzeptables Salz desselben in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
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