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Die
Erfindung betrifft Opioid-Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung
und sie aufhaltende pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß den Patentansprüchen. Sie
sind von Weizenproteinen, insbesondere Weizengluten, abgeleitet.
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Es
ist bekannt, daß die
von Lebensmittelproteinen (Casein, Gluten) abgeleiteten Peptide
Opioid-Aktivitäten
aufweisen, wie z.B. Morphin-artige narkotische, analgetische Aktivitäten, und
daß sie
physiologisch wichtig sein können.
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C.
Zioudrou et al haben darüber
berichtet, daß Peptide
mit einer Opioid-Aktivität
in Pepsin-Hydrolysaten von Weizengluten und α-Casein gefunden wurden und
es wurde auch deren Aktivität
nachgewiesen durch Anwendung von Bioassays einschließlich der
Naloxon-reversiblen Inhibierung von Adenylat-Cyclase in Homogenaten
von Neuroplastom-X-Gliom-Hybridzellen
und von elektrisch stimulierten Kontraktionen des Maus-Vas deferens
(Samenleiters der Maus) ("J.
Biol. Chem.", Band
254, Nr. 7, Seiten 2446-2449 (1979)).
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F.R.
Huebner et al haben die Opioid-Aktivitäten in den von der Gliadin-Fraktion
abgeleiteten Fragmenten mittels des Radiorezeptor-Assays erkannt
("Peptides", Band 5, Seiten
1139-1147 (1984)).
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John
E. Morley et al haben darüber
berichtet, daß hydrolysiertes
Gluten die Intestinal-Durchgangszeit verlängert und daß dieser
Effekt umgekehrt wird durch die gleichzeitige Verabreichung von
Naloxon und daß auch
hydrolysiertes Gluten eine Naloxon-reversible Erhöhung der
Somatostatinartigen Aktivität
im Plasma mit sich bringt, die für
die verzögerte
Durchgangszeit verantwortlich sein kann ("Gastroenterology", Band 84, Nr. 6, S. 1517-1523).
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In
diesen Berichten wurde zwar erkannt, daß Opioid-Peptide in Gluten-Hydrolysaten
nachgewiesen wurden, es hat sich bis jetzt aber als nicht möglich erwiesen,
die Struktur und den Charakter dieser Peptide aufzuklären.
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Es
wurde nun gefunden, daß die
aktiven Peptide aus den Pepsinhydrolysaten von Weizengluten nicht isoliert
werden konnten wegen ihrer sehr geringen Aktivität. Die vorliegende Erfindung
ist das Ergebnis fortgesetzter Bemühungen, neue Opioid-Peptide
mit den angegebenen Strukturen aus den Gluten-Hydrolysaten zu isolieren.
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Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Opioid-Peptide mit der angegebenen
Aminosäuresequenz,
die aus den Hydrolysaten von Weizenproteinen isoliert wurden, zur
Verfügung
zu stellen. Ziel der Erfindung ist es ferner, Verfahren zur Herstellung
von Opioid-Peptiden durch enzymatische Hydrolyse anzugeben. Ziel
der Erfindung ist es schließlich,
pharmazeutische Zusammensetzungen zu schaffen, welche die Opioid-Peptide
als aktive Komponente (Wirkstoff) enthalten.
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Die
Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden
Zeichnungen näher
erläutert. Es
zeigen:
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1 die
Trennung von aktiven Opioid-Fraktionen I, II, III und IV in einer
Octadecylsilan (ODS)-Kolonne; und
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2 die
Gewinnung der aktiven Opioid-Fraktion V aus der ODS-Kolonne.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Peptide mit einer Opioid-Aktivität (Opioid-Peptide),
die hergestellt werden durch Hydrolyse von Weizenptroteinen mittels
Proteasen. Gegenstand der Erfindung sind daher Opioid-Peptide mit
den folgenden Aminosäuresequenzen
Gly-Tyr-Tyr-Pro
(SEQ ID NO:1)(1)
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID NO:2)(2)
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser
(SEQ ID NO:3)(3)
Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID NO:4)(4)
und
deren physiologisch akzeptable Salze.
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Die
vier Opioid-Peptide mit den Sequenzen (1), (2), (3) und (4), nämlich (SEQ
ID NO:1), (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3) und (SEQ ID NO:4) sind neu
und werden hier der Einfachheit halber als "Peptid A", "Peptid
B", "Peptid C" bzw. "Peptid D" bezeichnet. Soweit
bekannt, gibt es bisher keinen Bericht über die Herstellung und Isolierung
der vier Peptide aus Weizenproteinen durch enzymatische Hydrolyse
oder chemische Synthese.
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Opioid-Peptide,
welche jeweils die nachfolgende Aminosäuresequenz aufweisen
Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu
(SEQ ID NO:5)(5)
Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID NO:6)(6)
sind
bekannt aus „J.
Med. Chem." 1978,
Band 21, Nr. 11, S. 1110-1115, es gibt jedoch keinen Bericht über die Herstellung
und Isolierung dieser beiden Peptide aus Weizenproteinen durch enzymatische
Hydrolyse. Die beiden Opioid-Peptide
mit den Sequenzen (5) und (6) (SEQ ID NO:5) und (SEQ ID NO:6) werden
hier der Einfachheit halber als "Peptid
E" bzw. "Peptid F" bezeichnet. Die
die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide
aufbauenden Aminosäuren
können
in jeder beliebigen der D-, L- und DL-Konfigurationen vorliegen.
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Die
erfindungsgemäßen Opioid-Peptide
sowie die Opioid-Peptide mit den vorstehenden Sequenzen (5) und
(6) können
hergestellt werden durch ein einen weiteren Gegenstand der Erfindung
bildendes enzymatisches Verfahren, das umfasst die Hydrolyse von
Weizenproteinen mittels einer sauren Protease, die weitere Hydrolyse
der Hydrolysate mittels einer neutralen Protease oder einer alkalischen
Protease und die Fraktionierung, Isolierung und Reinigung des resultierenden
Peptidgemisches auf konventionelle Weise. Die Aminosäuresequenz
der so isolierten Peptide kann beispielsweise durch Verwendung eines
Protein-Sequenzers festgelegt werden.
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Auf
der Basis der festgelegten Aminosäuresequenz können die
erfindungsgemäßen Peptide
auch unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens synthetisiert
werden, beispielsweise durch eine Festphasen-Synthese nach der t-Boc-Strategie.
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Die
Weizenproteine, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können Gluten
allein oder ein Gemisch aus Gluten mit ande ren Proteinen im Weizen,
wie Albumin, Gliadin und Globulin, umfassen.
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Die
sauren Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen
Pepsin und Asparagin-Proteinasen, die aus Pycnoporus coccineus,
Aspergillus und Penicillium stammen. Sie können entweder allein oder in
Kombination untereinander verwendet werden, so lange sie keinen
nachteiligen Einfluß aufeinander
haben. Wenn eine Vielzahl von sauren Proteasen verwendet wird, kann
die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unterschiedlicher
Proteasen oder aufeinanderfolgende Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.
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Die
neutralen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen
Metallproteasen, die aus Mikroorganismen stammen einschließlich der
wärmebeständigen Proteasen
aus Bacillus, wie z.B. Thermolysin, derjenigen, die aus Aspergillus
streptomyces und Rhizopus stammen; derjenigen, die aus Pflanzen,
wie Papain, Bromelain stammen; und derjenigen, die in vivo in Tieren
vorkommen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Thrombin.
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Die
alkalischen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen
Cerin-Proteasen, die aus Bacillus stammen.
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Die
neutralen oder alkalischen Proteasen können allein oder in Kombination
untereinander verwendet werden, so lange sie keinen nachteiligen
Einfluß aufeinander
haben. Wenn eine Vielzahl von neutralen Proteasen verwendet wird,
kann die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unterschiedlicher
Proteasen oder aufeinanderfolgende Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.
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Die
Fraktionierung, Isolierung und Reinigung kann auf bekannte Weise
durchgeführt
werden, beispielsweise durch Membrantrennung und unter Anwendung
eines chromatographischen Verfahrens. In dem erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt ist eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)
einschließlich
der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne,
einer Phenyl-Kolonne,
einer Cyanopropyl-Kolonne und einer Phenethyl-Kolonne.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
weisen Opioid-Aktivitäten
auf, die beteiligt sind an der Analgesie, der Narkose, der Affektion,
der Atmung, dem Pulsschlag, der Körpertemperatur, der Gastrointestinalfunktion,
der Athrocytose, der Immunität,
der Regulierung der Hormonsekretion, wie Insulin und Somatostatin,
der verbesserten Elektrolytabsorption und der regulierten Kontraktion
des Myocards, so daß sie
verwendbar sein können als
Analgetikum und Narkotikum, als Hypnotikum, als Gastrointestinalhormmon-Sekretionsver
besserungsmittel oder als Elektrolyt-Absorptionsverbesserungsmittel.
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Die
vorliegende Erfindung umfaßt
auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil
(Wirkstoff) Opioid-Peptide enthalten, die jeweils die Aminosäuresequenz
der obengenannten Formeln (1) bis (4) aufweisen, oder physiologisch
akzeptable Salze davon in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Die
erfindungsgemäßen Opioid-Peptide
oder ihre Salze können,
da sie ein wasserlösliches
weißes Pulver
darstellen, in der Form, in der sie vorliegen, oder in einer in
Wasser gelösten
Form oral oder parenteral verabreicht werden. Je nach Art der Verabreichung
kann das Opioid-Peptid mit einer großen Vielzahl von physiologisch
akzeptablen Trägern
formuliert sein. Die Dosierungsformen können umfassen Tabletten, Kapseln, Suppositorien,
Pastillen, Sirupe, Granulate, Pulver, injizierbare Lösungen oder
Suspensionen.
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Die
geeignete Dosis kann ausgewählt
werden in Abhängigkeit
von der Dosierungsform, dem Alter und dem Geschlecht der Patienten
oder dem Grad der Symptome.
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Die
erfindungsgemäßen Opioid-Peptide
können
Lebensmitteln und Futtermitteln zugesetzt werden.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen
näher erläutert.
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Hydrolyse
von Weizengluten
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Weizengluten
wird mit Proteasen hydrolysiert zur Herstellung einer wasserlöslichen
Peptidmischung. Anfänglich
wird Weizengluten mit einer Säureprotease
hydrolysiert in der Weise, daß es
in einer Säurelösung, beispielsweise
in verdünnter
Chlorwasserstoffsäure,
dispergiert und gelöst
wird. Danach wird das Hydrolysat neutralisiert oder alkalisch gemacht
und weiter hydrolysiert mit einer neutralen oder alkalischen Protease
zur Herstellung einer Peptidmischung. In diesem Falle kann die Peptidmischung,
welche die Petide A (SEQ ID NO:1), B (SEQ ID NO:2), E (SEQ ID NO:5)
und F (SEQ ID NO:6) enthält,
erhalten werden durch Verwendung von neutraler oder alkalischer
Protease. Die Peptidmischung, die das Peptid D (SEQ ID NO:4) enthält, kann erhalten
werden durch Verwendung von solchen Proteasen als neutraler Protease,
die in vivo in Tieren vorkommen, wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin.
In diesem Falle können
Trypsin und Chymotrypsin gleichzeitig oder nacheinander angewendet
werden.
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Bei
der Herstellung der Peptide wird Pepsin vorzugsweise als saure Protease
verwendet, da das gewünschte
Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.
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Bei
der Herstellung der Peptide A (SEQ ID NO:1), B (SEQ ID NO:2), E
(SEQ ID NO:5) und F (SEQ ID NO:6) werden vorzugs weise Thermolysin,
das aus Bacillus stammt, oder solche, die aus Aspergillus (insbesondere
Aspergillus oryzae) stammen, bevorzugt als neutrale Proteasen verwendet,
da das gewünschte
Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.
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Die
sauren, neutralen und alkalischen Proteasen können in freier Form oder im
immobilisierten Zustand verwendet werden. Die verwendete Menge der
Protease kann in dem Bereich von etwa 5000 bis etwa 100 000 Einheiten
pro 100 g trockenem Gluten liegen. Die Aktivität (Einheit) der verwendeten
Protease wird bestimmt nach dem Casein-Folin-Färbeverfahren A, wie es von
S. Akabori in "Method
of Studying Enzymes", Band
2, S. 238 (1961), beschrieben ist, unter Verwendung einer 1 % Hamerstein-Caseinlösung als
Substrat, die von der Firma American Merk Co. erhältlich ist.
Die Reaktion wird 30 min lang bei 30°C durchgeführt. Die für die Freisetzung von 1 μg Tyrosin
für 1 min
erforderliche Enzymmenge wird als eine Einheit bezeichnet.
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Eine
Proteasebehandlung wird zweckmäßig durchgeführt unter
optimalen Bedingungen des pH-Wertes, der Temperatur, der Menge der
Protease, der Rate und Dauer der Behandlung, die entsprechend den
Situationen, beispielsweise der Arten und der Verwendungsformen
der Protease, ausgewählt
werden. Bei der Durchführung
der Hydrolyse von Gluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin oder
mit Pepsin und danach mit Trypsin-Chymotrypsin wird beispielsweise
eine wäßrige Lösung oder
wäßrige Dispersion
von Gluten auf einen pH-Wert zwischen etwa 1,5 und 5,0 eingestellt
und bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C mit Pepsin hydrolysiert. Anschließend wird
die Lösung
auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0 eingestellt und weiter hydrolysiert
mit Thermolysin oder Trypsin-Chymotrypsin bei einer Temperatur von
etwa 30 bis 50°C,
bis die Löslichkeit
in 0,75 M Trichloressigsäure
in dem Bereich von etwa 40 bis 80 % liegt.
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Zu
dem Zeitpunkt, wenn eine Hydrolyse bis zu dem gewünschten
Grad erreicht ist, werden die Proteasen durch Erhitzen und/oder
Einstellung des pH-Wertes desaktiviert. Das desaktivierte Enzym
und eventuelle unlösliche
feste Materialien, wie z.B. nicht-hydrolysiertes Gluten, werden
abgetrennt und entfernt auf geeignete Weise, beispielsweise durch
Zentrifugieren, wobei man eine Peptidmischung aus der zurückbleibenden
Lösung
durch Trocknen oder erhält.
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Dann
wird die in Wasser gelöste
Peptidmischung einer HPLC, beispielsweise einer HPLC an einer Umkehr-Kolonne,
unterworfen, um das gewünschte
Peptid in reiner Form zu isolieren.
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Die
Isolierung der Opioid-Peptide aus der Petidmischung kann auf die
folgende Weise erfolgen.
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Isolierung der Peptide
A, B, E und F
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- a1) Die durch Hydrolyse
von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin hergestellte
Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne
(wie z.B. Cosmosil 5 C18-AR, Nacalai Tesque
Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A)
und einer Acetonitril (ACN)-Lösung,
die 0,05 % TFA enthält
(Lösung
B) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 40 % der Lösung B eluiert.
Eine Peak-Fraktion
(Fraktion I), die in einer ACN-Konzentration zwischen etwa 22,5
und 23,5 % eluiert wird, eine Peak-Fraktion (Fraktion II), die zwischen
etwa 24 und 25 % eluiert wird, eine Peak-Fraktion (Fraktion III),
die zwischen etwa 28 und 29 % eluiert wird, und eine Peak-Fraktion (Fraktion
IV), die zwischen etwa 34 und 35 % eluiert wird, werden jeweils
fraktioniert und bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
- b1) Die in der Stufe (a1)
hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen
werden einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne
mit anderen Charakteristiken als der in (a1)
verwendeten unterworfen (wie z.B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai Tesque
Inc.) und auf ähnliche
Weise wie in der Stufe (a1) eluiert. Eine
Peak-Fraktion (Fraktion I-1), die in der ACN-Konzentration zwischen
etwa 24 und 25 % eluiert wird, wird von der Fraktion I abgetrennt,
eine Peak-Fraktion (Fraktion II-1), die zwischen etwa 33 und 34
% eluiert wird, wird von der Fraktion II abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion
III-1), die zwischen etwa 30 und 31 % eluiert wird, wird von der
Fraktion III abgetrennt und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-1),
die zwischen etwa 36 und 37 % eluiert wird, wird von der Fraktion
IV abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.
- c1) Die in der Stufe (b1)
hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen
werden der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit
anderen Charakteristiken als der in (b1)
verwendeten unterworfen (wie z.B. Cosmosil 5 CN-R, Nacalai Tesque
Inc.) und auf ähnliche
Weise wie in den Stufen (a1) und (b1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion
I-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 18 und 19 % eluiert
wird, wird von der Fraktion I-1 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion
II-2), die in der ACN-Konzentration von etwa 27 % eluiert wird,
wird von der Fraktion II-1
abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III-2), die zwischen etwa
26 und 27 % eluiert wird, wird von der Fraktion III-1 abgetrennt
und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-2), die zwischen etwa 32 und 33 % eluiert
wird, wird von der Fraktion IV-1 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird
die Opioid-Aktivität
bestimmt.
- (d1) Von den in der Stufe (c1) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen
werden die Fraktionen I-2, III-2 und IV-2 der in (a1)
angewendeten Kolonnenchromatographie unter worfen und dann mit einem
10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH
7) (Lösung
C) und einer 50 %igen ACN-Lösung,
die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH
7) enthält
(Lösung
D) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100 % der Lösung D eluiert.
Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-3), die in der ACN-Konzentration von
etwa 18 % eluiert wird, wird von der Fraktion I-2 abgetrennt, eine
Peak-Fraktion (Fraktion III-3),
die bei etwa 21 % eluiert wird, wird von der Fraktion III-2 abgetrennt,
und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-3), die bei etwa 28 % eluiert
wird, wird von der Fraktion IV-2 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen
wird die Opioid-Aktivität
bestimmt.
- e1) Von den in der Stufe (d1)
hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-3 der
in (a1) angewendeten Kolonnenchromatographie
unterworfen und dann unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in
den Stufen (a1), (b1)
und (c1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion
IV-4), die in der ACN-Konzentration von etwa 31 eluiert wird, wird
von der Fraktion IV-3 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivität bestimmt wird.
- f1) Von den in der Stufe (e1)
hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-4 einer
Umkehrphasen-Chromatographie an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken
als der in den Stufen (a1), (b1)
und (c1) verwendeten unterworfen (z.B. Develosil
PhA-5, Nomura Chemical Inc.) und dann auf ähnliche Weise wie in der Stufe
(d1) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion
IV-5), die in der ACN-Konzentration von etwa 29 % eluiert wird,
wird von der Fraktion IV-4 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivität bestimmt
wird.
- g1) Aus der in der Stufe (c1)
erhaltenen aktiven Opioid-Fraktion
(Fraktion II-2), aus den in der Stufe (d1)
erhaltenen aktiven Opioid-Fraktionen (Fraktion I-3, Fraktion III-3)
und aus der in der Stufe (f) erhaltenen aktiven Opioid-Fraktion
(IV-5) werden zur Gewinnung durch Trocknung die Lösungsmittel
entfernt.
- h1) Die Aminosäuresequenz der in der Stufe
(g1) erhaltenen getrockneten Materialien
wird mittels eines Protein-Sequenzers (wie z.B. 477 A Protein-Sequenzer,
Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die Fraktion I-3 wurde identifiziert
als Peptid B (SEQ ID NO:2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, die Fraktion II-2
wurde identifiziert als Peptid A (SEQ ID NO:1), Gly-Tyr-Tyr-Pro,
die Fraktion III-3 wurde identifiziert als Peptid F (SEQ ID NO:6), Tyr-Gly-Gly-Trp
und die Fraktion IV-5 wurde identifiziert als Peptid E (SEQ ID NO:5),
Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu.
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Isolierung
des Peptids D
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- (a2) Die durch Hydrolyse
von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Trypsin-Chymotrypsin
erhaltene Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan
(ODS)-Kolonne (beispielsweise Cosmosyl 5 C18-AR,
Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A)
und einer Acetonitril (ACN)-Lösung,
die 0,05 % TFA enthält
(Lösung
B) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 40 % der Lösung 8 eluiert.
Eine Peak-Fraktion (Fraktion V), die in der ACN-Konzentration zwischen
etwa 31 und 32 % eluiert wird, wird abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu identifizieren.
- b2) Die in der Stufe (a2)
hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V) wird einer Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (a2) verwendeten (wie z.B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai
Tesque Inc.) unterworfen und auf ähnliche Weise wie in der Stufe
(a2) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion
V-1), die in der ACN-Konzentration von etwa 33 % eluiert wird, wird
abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu ermitteln.
- c2) Die in der Stufe (b2)
hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-1) wird einer Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als die in den
Stufen (a2) und (b2)
verwendeten unterworfen (beispielsweise Cosmosil 5 CN-R, Nacalei
Tesque Inc.) und auf ähnliche
Weise wie in den Stufen (a2) und (b2) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion
V-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 27 und 28 % eluiert
wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.
- d2) Die in der Stufe (c2)
hergestellte aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-2) wird der in der
Stufe (a2) angewendeten Kolonnenchromatographie
unterworfen und dann mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer
(pH 7) (Lösung
C) und einer 50 %igen ACN-Lösung,
die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH
7) enthält
(Lösung D)
mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100 % Lösung D eluiert.
Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-3), die in der ACN-Konzentration
von etwa 24 % eluiert wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.
- e2) Die aktive Opioid-Fraktion (Fraktion
V-3) wird getrocknet zur Entfernung des Lösungsmittels und abgetrennt.
- f2) die Aminosäuresequenz der in der Stufe
(e2) erhaltenen getrockneten Materialien
wird mittels eines Protein-Sequenzers (beispielsweise 477 A Protein-Sequenzer,
Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die Fraktion V-3 wurde identifiziert
als Peptid D (SEQ ID NO:4).
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Alternativ
können
die Peptide A bis F (SEQ ID NOS:1-6) der Erfindung durch chemische
Synthese, beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt
werden.
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Chemische
Synthese von Peptiden
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Das
Peptid wird synthetisiert mittels eines Sam 2-Peptid-Synthesizers (Biosearch
Inc.) entsprechend einem Standard- Protokoll des Synthesizers. Ein Boc(butoxycarbonyl)-Proharz
wird mit einer Deblockierungslösung,
die 45 Trifluoressigsäure
enthält,
behandelt und dann mit Boc-Tyr(Cl2-Bzl) in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid
gekuppelt. Nach dem Deblockieren auf ähnliche Weise wie oben angegeben
wird das Harz nacheinander mit Boc-Tyr (Cl2Bzl)
und Boc-Gly gekuppelt zur Herstellung eines Boc-Gly-Tyr-(Cl2-Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Harzes. Dieses Peptidharz wird
in Fluorwasserstoff, der 10 % Anisol enthält, eingeführt und 1 h lang bei 0°C gerührt. Nachdem
der Fluorwasserstoff abdestilliert worden ist, wird der Rückstand
mit Äther
gewaschen und ein Peptid wird mit 30 %iger Essigsäure extrahiert.
Die Reinigung des rohen Peptids durch HPLC an der ODS-Kolonne ergibt
das Peptid A (SEQ ID NO:1).
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Die
Peptide B-F (SEQ ID NOS:2-6) können
auch nach einem ähnlichen
Verfahren wie oben synthetisiert werden.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
-
Beispiel 1
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Herstellung der Peptide
A, B, E und F aus Weizengluten-Hydrolysaten
-
- 1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100
ml 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein
unlösliches
Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HCl auf
2,0 eingestellt. Zu dieser Glutenlösung wurden 5000 Einheiten
Pepsin (erhältlich
von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugegeben und die Lösung wurde
15 h lang bei 37°C
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit
1 N NaOH auf 7,0 eingestellt, es wurden 5000 Einheiten Thermolysin (erhältlich von
der Firma Peptide Research Institute Inc.) zugegeben und die Mischung
wurde 4 h lang bei 37°C
inku biert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20
min lang auf 90°C
erhitzt, um das Pepsin und das Thermolysin zu desaktivieren. Das
Hydrolysat wurde 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches
Material zu entfernen, und die resultierende überstehende Flüssigkeit
wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,5 g Weizengluten-Hydrolysat
erhielt.
- 2) 80 mg des Weizengluten-Hydrolysats wurden einer Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) an einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR,
Innendurchmesser 20 mm, Länge
250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und dann mit einer wäßrigen 0,05
%igen Trifluoressigsäure
(TFA)-Lösung
(Lösung
A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung,
die 0,05 TFA enthielt (Lösung
B) in einer Strömungsrate
von 10 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % der Lösung B über einen
Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von
230 nm ist in der 1 dargestellt.
Bei den
in 1 dargestellten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt.
Eine Opioid-Aktivität
wurde gefunden in der Fraktion I, die zwischen etwa 22,5 und 23,5
in der ACN-Konzentration eluiert wurde, bei der Fraktion II, die
zwischen etwa 24 und 25 % eluiert wurde, bei der Fraktion III, die
zwischen etwa 28 und 29 % eluiert wurde, und bei der Fraktion IV,
die zwischen etwa 34 und 35 eluiert wurde.
- 3) Das gleiche Verfahren wie in (2) wurde hergestellt unter
Verwendung von 2000 mg des Weizengluten-Hydrolysats, wie es im Abschnitt
(1) hergestellt worden war, wobei man die aktiven Opioid-Fraktionen
I, II, III und IV erhielt. Diese aktiven Fraktionen wurden einer
RPC unterworfen unter Verwendung einer Phenyl-Kolonne (Cosmosil
5 Ph, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge
250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und mit den Lösungen A und B bei einer Strömungsrate
von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % Lösung B über einen
Zeitraum von 40 min eluiert.
Bei jeder der erhaltenen Fraktionen
wurde die Opioid-Aktivität
bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei der Fraktion
1 in der Fraktion I-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 24 bis 25 % eluiert wurde,
bei der Fraktion II in der Fraktion II-1, die in der ACN-Konzentration
von etwa 33 bis 34 % eluiert wurde, bei der Fraktion III in der
Fraktion III-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 30 bis 31
% eluiert wurde, und bei der Fraktion IV in der Fraktion IV, die
bei etwa 36 bis 37 % eluiert wurde.
- 4) Die im Abschnitt (3) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen
in den Fraktionen I-1, II-1, III-1 und IV-1 wurden einer RPC unterworfen
unter Verwendung einer Cyanopropyl-Kolonne (Cosmosil 5 CN-R, Innendurchmesser
4,6 mm, Länge
250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und unter den gleichen Bedingungen
wie im Abschnitt (3) eluiert.
Jede der Eluatfraktionen wurde
gesammelt und es wurde ihre Opioid-Aktivität bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden
für die
Fraktion I-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-2) in der ACN-Konzentration
von etwa 18 bis 19 %, bei der Fraktion II-1 in einer Peak-Fraktion
(Fraktion II-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27 %, bei der
Fraktion III-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-2) in der ACN-Konzentration
von etwa 26 bis 27 %, und bei der Fraktion IV in einer Peak-Fraktion
(Fraktion IV-2) in der ACN-Konzentration von etwa 32 bis 33 %.
- 5) Die Fraktionen I-2, III-2 und IV-2 der wie oben in (4) hergestellten
aktiven Opioid-Fraktionen wurden einer Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) an einer Octadecylsilan-Kolonne
(Cosmosil 5 C18-AR, Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque
Inc.) unterworfen und dann mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer
(pH 7) (Lösung
C) und ei ner 50 %igen ACN-Lösung,
die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH
7) enthielt (Lösung
D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Lösung D eluiert.
Jede Eluatfraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht.
Es wurde eine Opioid-Aktivität
gefunden für
die Fraktion I-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-3) in der ACN-Konzentration
von etwa 18 %, für
die Fraktion III-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-3) in der
ACN-Konzentration von etwa 21 % und für die Fraktion IV-2 in einer
Peak-Fraktion (Fraktion
IV-3) in der ACN-Konzentration von etwa 28 %.
- 6) Die Fraktion IV-3 der im obigen Abschnitt (5) hergestellten
aktiven Opioid-Fraktionen wurde erneut einer RPC unterworfen unter
Verwendung der gleichen Kolonne wie im Abschnitt (5) und unter den
gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (4) eluiert. Jede Eluatfraktion
wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine
Opioid-Aktivität
gefunden bei einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-4) in der ACN-Konzentration
von etwa 31 %.
- 7) Die Fraktion IV-4 der wie oben unter (6) hergestellten aktiven
Opioid-Fraktion wurde weiter einer Phenethyl-Kolonne (Develosil
PhA-T-5, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nomura Chemical
Inc.) unterworfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt
(5) eluiert. Die Bestimmung der Opioid-Aktivität bei jeder Eluatfraktion ergab,
daß eine
Opioid-Aktivität
gefunden wurde bei einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-5) in der ACN-Konzentration
von etwa 29 %.
- 8) Die im Abschnitt (4) erhaltene Fraktion II-2, die im Abschnitt
(5) erhaltenen Fraktionen I-3 und III-3 und die im Abschnitt (7)
erhaltene Fraktion IV-5 wurden abgetrennt, eingeengt und getrocknet.
-
Die
wie oben hergestellten getrockneten Materialien wurden analysiert
zur Bestimmung der Aminosäuresequenz
unter Verwendung eines 477-A Protein-Sequenzers (Applied Biosystems
Inc.). Aus dem getrockneten Material der Fraktion I-3 wurden L-Gly,
L-Tyr, L-Tyr, L-Pro und L-Thr nacheinander aus dem N-Terminus freigesetzt,
das dann als "Peptid
B" identifiziert
wurde mit der Aminosäuresequenz
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, wobei
alle Aminosäure-Bestandteile
L-Aminosäuren
waren.
-
Aus
dem getrockneten Material der Fraktion II-2 wurden L-Gly, L-Tyr, L-Tyr
und L-Pro nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid
A (SEQ ID NO:1) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz
Gly-Tyr-Tyr-Pro, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
-
Aus
dem getrockneten Material der Fraktion III-3 wurden L-Tyr, L-Gly, L-Gly
und L-Trp nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid
F (SEQ ID NO:6) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz
Tyr-Gly-Gly-Trp, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.
-
Aus
dem getrockneten Material der Fraktion IV-5 wurden L-Tyr, L-Gly, L-Gly,
L-Trp und L-Leu nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das
als Peptid E (SEQ ID NO:5) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz
Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu,
wobei alle Aminosäure-Bestandteile
L-Aminosäuren
waren.
-
Die
Ausbeuten an den Peptiden A, B, E und F wurden bestimmt anhand der
Molekulargewichte und des molekularen Extinktionskoeffizienten bei
Abs. 280, die Werte von etwa 4 × 10-2 (%) , 4 × 10-3 (%)
, 1 × 10-5 (%) bzw. 3 × 10-4 (%)
ergaben. Die Rf-Werte der Peptide A, B, E und F wurden durch Dünnschichtchromatographie
auf Silicagel-Platten bestimmt unter Verwendung von Butanol, Essigsäure, Pyridin, Wasser (15/3/10/12)
als Entwicklungslösungsmittel,
wobei die Werte 0,58, 0,54, 0,77 bzw. 0,61 erhalten wurden.
-
Beispiel 2
-
Herstellung einer Peptidmischung,
welche die Peptide A B E und F enthält, aus Weizengluten-Hydrolysaten
-
Die
Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie
in Beispiel 1 durchgeführt, wobei
jedoch als saure Protease die gleichen Einheiten einer Asparagin-Protease,
die aus Aspergillus niger stammte (erhältlich von der Firma Yakult
Co. unter dem Handelsnamen "Protease
YP-SS") anstelle von Pepsin verwendet
wurde und die Weizengluten-Lösung,
die auf pH 3,0 eingestellt worden war, 15 h lang bei 37°C inkubiert
wurde. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie
auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden
bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in der 1 dargestellt,
der gleichen Stärke
wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhält man somit eine Peptidmischung
mit einer Opioid-Aktivität,
welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS:1, 2, 5 & 6) enthielt.
-
Beispiel 3
-
Herstellung
einer die Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus
Weizengluten-Hydrolysaten
-
Die
Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie
in Beispiel 1 durchgeführt, wobei
jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer neutralen
Protease, die aus Aspergillus oryzae stammte (erhältlich von
der Firma Yamato Chemical Co. unter dem Handelsnamen "Protin FN") anstelle von Thermolysin
verwendet wurde. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chroma tographie auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden
bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in 1 dargestellt,
mit der gleichen Stärke
wie in Beispiel 1. Man erhielt so in diesem Beispiel eine Peptidmischung
mit einer Opioid-Aktivität, welche
die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS:1, 2, 5 & 6) enthielt.
-
Beispiel 4
-
Herstellung einer die
Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus Weizengluten-Hydrolysaten
-
Die
Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie
in Beispiel 1 durchgeführt, wobei
jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer Cerin-Protease,
die aus Bacillus stammte (erhältlich
von der Firma Nagase Sangyo Co. unter dem Handelsnamen "Bioprase SP-4") anstelle von Thermolysin
verwendet wurden. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie
auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Eine Opioid-Aktivität wurde
gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in 1 dargestellt,
mit der gleichen Stärke
wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhielt man somit eine Peptid-Mischung
mit Opioid-Aktivität,
welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS: 1, 2, 5 & 6) enthielt.
-
Beispiel 5
-
Herstellung
des Peptids D aus Weizengluten-Hydrolysaten
-
- 1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100
ml einer 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert,
um ein unlösliches
Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2,0
eingestellt. Zu dieser Weizengluten-Lösung wurden 5000 Einheiten
Pepsin (erhältlich
von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugegeben und die Lösung wurde
15 h lang bei 37°C
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit
einer wäßrigen 1
N NaOH-Lösung
auf 7,0 eingestellt, es wurden jeweils 5000 Einheiten von Trypsin
(erhältlich
von der Firma Sigma Chemical Co.) und Chymotrypsin (erhältlich von
der Firma Sigma Chemical Co.) zugegeben und die Mischung wurde 4
h lang bei 37°C
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20
min lang auf 90°C
erhitzt, um die Enzyme zu desaktivieren. Das Hydrolysat wurde 20
min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen,
und die resultierende überstehende
Flüssigkeit
wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,0 g eines Weizengluten-Hydrolysats
erhielt.
- 2) Das in dem Abschnitt (1) hergestellte Weizengluten-Hydrolysat wurde
einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) unterworfen unter Verwendung
einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR; Innendurchmesser
20 mm, Länge
250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und dann mit einer wäßrigen 0,05
%igen Trifluoressigsäure
(TFA)-Lösung
(Lösung
A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung,
die 0,05 % TFA enthielt (Lösung
B), bei einer Strömungsrate
von 10 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % der Lösung B über einen
Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von
230 nm bei dieser Zeit ist in 2 dargestellt.
Bei
den in der 2 dargestellten Fraktionen wurde
die Opioid-Aktivität
bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde
gefunden bei der Fraktion V, die zwischen etwa 31 und 32 in der
ACN-Konzentration eluiert wurde.
- 3) Das gleiche Verfahren wie im Abschnitt (2) wurde wiederholt
unter Verwendung von 2000 mg des im Abschnitt (1) hergestellten
Weizengluten-Hydrolysats, wobei man eine aktive Opioid-Fraktion
der Fraktion V erhielt. Diese Frak tion wurde einer RPC an einer
Phenyl-Kolonne (Cosmosil 5 Ph, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250
mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit den Lösungen A
und B bei einer Strömungsrate
von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40 % Lösung B über einen
Zeitraum von 40 min eluiert.
Bei jeder der eluierten Fraktionen
wurde die Opioid-Aktivität
bestimmt. Eine Opioid-Aktivität
wurde gefunden bei der Fraktion V-1, die in der ACN-Konzentration
vone etwa 33 % eluiert wurde.
- 4) Die aktive Opioid-Fraktion in der Fraktion V-1, wie sie im
Abschnitt (3) hergestellt worden war, wurde einer RPC an einer Cyanopropyl-Kolonne
(Cosmosil 5 CN-R, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai-Tesque
Inc.) unterworfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt
(3) eluiert.
Jede der Eluat-Fraktionen wurde gesammelt und
auf ihre Opioid-Aktivität
untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden in einer Peak-Fraktion
(Fraktion V-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27 bis 28 %.
- 5) Die wie im obigen Abschnitt (4) hergestellte aktive Opioid-Fraktion
der Fraktion V-2 wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan
(ODS)-Kolonne (Cosmosil 5 C18-AR; Innendurchmesser
4,6 mm, Länge
150 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einem 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50 %igen
ACN-Lösung,
die 10 mM KH2PO4-Na2HPO4-Puffer (pH
7) enthielt (Lösung
D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Lösung D eluiert.
Jede eluierte Fraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht.
Es wude eine Opioid-Aktivität
gefunden in einer hohen Absorptions-Peak-Fraktion (Fraktion V-3)
in der ACN-Konzentration von etwa 24 %.
- 6) Die im Abschnitt (5) hergestellte Fraktion V-3 wurde abgetrennt,
eingeengt und getrocknet.
-
Das
oben hergestellte getrocknete Material wurde auf seine Aminosäuresequenz
untersucht unter Verwendung des gleichen Modell 477-A-Protein-Sequenzers,
wie er in Beispiel 1 verwendet worden war. Es wurde gefunden, daß L-Tyr,
L-Pro, L-Ile, L-Ser
und L-Leu aus dem N-Terminus nacheinander freigesetzt wurden, der
als Peptid D (SEQ ID NO:4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu
identifiziert wurde, wobei alle sie aufbauenden Aminosäuren L-Aminosäuren waren.
-
Die
Ausbeute an Peptid D aus Weizengluten wurde aus den Molekulargewichten
und dem Molekularextinktionskoeffizienten bei Abs. 280 bestimmt,
wobei ein Wert von etwa 4 × 10-4 (%) erhalten wurde. Der Rf-Wert des Peptids
D wurde durch Dünnschichtchromatographie
an Silicagel-Platten auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 bestimmt,
wobei ein Wert von 0,73 erhalten wurde.
-
Beispiel 6
-
Herstellung
der Peptide A-F durch chemische Synthese
-
1) Synthese des Peptids
A
-
Eine
Mischung aus 0,75 g eines handelsüblichen Boc(butoxycarbonyl)-Pro-Harzes
(Substitution 0,4 meq/g) und 20 ml Methylenchlorid, enthaltend 45
% Trifluoressigsäure
und 2,5 % Anisol, wurde 25 min lang in dem Reaktionsgefäß eines
Sam 2-Peptid-Synthesizers (hergestellt von der Firma Biosearch Inc.)
bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um eine Boc-Gruppe zu entfernen.
-
Das
Pro-Harz mit der entfernten Boc-Gruppe wurde dann mit Methylenchlorid
gewaschen, mit Methylenchlorid, das 10 Diisopropylethylamin enthielt,
neutralisiert und mit Methylenchlorid weiter gewaschen.
-
Dieses
Harz wurde mit 5 ml einer Lösung
von 0,4 M Boc-Tyr(Cl2-Bzl) in Dimethylformamid und 5 ml einer
Lösung
von 0,4 M Diisopropylcarbodiimid in Methylenchlorid gemischt und
die Mischung wurde in das Reaktionsgefäß eingeführt und 2 h lang unter Rühren bei
Raumtemperatur reagieren gelassen.
-
Das
resultierende Harz wurde nacheinander mit Dimethylformamid, Methylenchlorid,
Methylenchlorid, das 10 % Diisopropylethylamin enthielt, Methylenchlorid
und Methylenchlorid/Dimethylformamid gewaschen, wobei man ein Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Harz
erhielt.
-
Die
wiederholte Entfernung einer Boc-Gruppe und das Ankuppeln einer
Boc-Aminosäure
auf die vorstehend beschriebene Weise ergab ein Produkt, das aus
Boc-Gly-Tyr(Cl2-Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Harz
bestand.
-
Dieses
Harz wurde in 20 ml Fluorwasserstoff, der 10 % Anisol enthielt,
eingeführt
und 2 h lang bei 0°C gerührt, um
aus dem Harz ein Peptid freizusetzen.
-
Anschließend wurde
der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abdestilliert und
der Rückstand wurde
mit 30 %iger Essigsäure
extrahiert und lyophilisiert, wobei man 150 mg eines rohes Peptids
erhielt. Das rohe Peptid wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) unter Verwendung einer Octadecylsilan (ODS)-Kolonne (Cosmosil
5 C18-AR, Nacalai Tesque Inc.) gereinigt,
wobei man 40 mg eines Endprodukts mit der Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) G1y:Tyr:Tyr:Pro
= 1:1:1:1 erhielt. Durch Analyse mit dem gleichen Protein-Sequenzer,
wie er in Beispiel 1 verwendet worden war, wurde das synthetisierte
Peptid als Peptid A (SEQ ID NO:1) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro
identifiziert. Der durch Dünnschichtchromatographie
(TLC) ermittelte Rf-Wert betrug, wie gefunden wurde, 0,58 wie im
Produkt des Beispiels 1.
-
2) Synthese des Peptids
B
-
30
mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen
Boc(butoxycarbonyl)-Thr(Bzl)-Harzes (Substitution 0,3 meq/g) auf
die gleiche Weise wie für
das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) des
Produkts war Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr = 1:1:1:1:1. Durch Analyse mit
dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte
Peptid als Peptid B (SEQ ID NO:2) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr identifiziert.
Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,54 wie im
Produkt des Beispiels 1.
-
3) Synthese des Peptids
C
-
30
mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,77 g eines handelsüblichen
Boc-Ser(Bzl)-Harzes (Substitution 0,39 meq/g) auf die gleiche Weise
wie für
das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) war
die folgende Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr:Ser = 1:1:1:1:1:1. Durch Analyse
mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid
als Peptid C (SEQ ID NO:3) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser identifiziert.
Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,53.
-
4) Synthese des Peptids
E
-
40
mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g eines handelsüblichen
Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie
für das
Peptid A be schrieben. Die Aminosäure-Zusammensetzung
(Molverhältnis)
betrug Tyr:Gly:Gly:Tyr:Leu = 1:1:1:1:1. Durch Analyse mit dem in
Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte
Peptid als Peptid E (SEQ ID NO:5) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu
identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug,
wie gefunden wurde, 0,77 wie beim Produkt des Beispiels 2.
-
5) Synthese des Peptids
F
-
30
mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen
Boc-Trp-Harzes (Substitution 0,3 meq/g) auf die gleiche Weise wie
für das
Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung
(Molverhältnis)
des Peptids E betrug Tyr:Gly:Gly:Trp = 1:1:1:1. Durch Analyse mit
dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte
Peptid als Peptid F (SEQ ID NO:6) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp
identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug
0,61 wie beim Produkt des Beispiels 2.
-
6) Synthese des Peptids
D
-
40
mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g eines handelsüblichen
Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie
für das
Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung
(Molverhältnis)
war die folgende Tyr:Pro:Ile:Ser:Leu = 1:1:1:1:1. Durch Analyse
mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte
Peptid als Petid D (SEQ ID NO:4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu
identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug
0,73 wie beim Produkt des Beispiels 3.
-
Assay zur Bestimmung der
Opioid-Aktivität
-
Zwei
aus männlichen
ICR-Mäusen
mit einem Gewicht von 30-35 g entnommene Maus-Vas deferens (Samenleiter)
wurden mit einem isotonischen Wandler (TB 612-T der Firma Nippon
Koden Kogyo Inc., Japan) unter einer Spannung von 0,4 g verbunden.
Jedes der Maus-Vas deferens wurde in ein 2 ml-Magnus-Reagensglas,
das bei 36°C
gehalten wurde, eingetaucht, in das eine Krebs-Lösung eingefüllt wurde, die 118 mM NaCl, 4,75
mM KCl, 2,54 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 1,19 mM KH2PO4 und 11 mM Glucose enthielt, und aus einer Bombe
wurde eine O2-Behandlung (Belüftung) (95
% O2, 5 % CO2) durchgeführt. Nach
etwa 2-stündiger
Stabilisierung auf diese Weise wurde eine elektrische Stimulierung
(30 V, 1 msec) an das Maus-Vas deferens angelegt zur Erzielung einer
elektrischen Kontraktion. Nachdem die elektrische Kontraktion stabilisiert
war, wurden 50 μl
eines Inhibitors (enthaltend einen Aminopeptidase-Inhibitor und
dgl.) zum Inhalt des Magnus-Reagensröhrchens zugegeben. Dann wurde
jede durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie
aus Weizengluten-Hydrolysaten abgetrennte Fraktion in das Röhrchen gegeben
und die Änderung
der elektrischen Kontraktion des Maus-Vas deferens wurde aufgezeichnet.
Die Opioid-Aktivität
wurde beurteilt anhand der Inhibierung der elektrischen Kontraktion
nach der Zugabe jeder Fraktion und die Umkehrung der Inhibierung
wurde beurteilt anhand der Zugabe von 20 μl 10-4 M
Naloxon. Bei jeder Fraktion wurde die Konzentration (IC50)
bestimmt, welche die elektrisch stimulierte Kontraktion des Maus-Vas
deferens um 50 % inhibierte.
-
Die
IC50-Werte der Peptide A bis D sind in der
folgenden Tabelle I angegeben.
-
Tabelle
I
Peptide | IC50 (μM) |
Peptid
A | 70 |
Peptid
B | 40 |
Peptid
C | 75 |
Peptid
D | 15 |
-
-
-