JPS63219375A

JPS63219375A - コラゲナ−ゼ１及び２の製造法

Info

Publication number: JPS63219375A
Application number: JP62053766A
Authority: JP
Inventors: Akira Endo; 遠藤　章
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1987-03-09
Publication date: 1988-09-13
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPH082299B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はコラゲナーゼの製造法に関し、更に詳細にはス
トレプトミセス属に属するコラゲナーゼ生産菌を利用す
るコラゲナーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

動物の結合組織を構成するコラーゲンは基本単位として
、それぞれ９１％ＯＯＯの分子量をもつ３本の？リペデ
テド鎖から成り、三重らせん構造上とっている。コラー
ゲン特有のこのヘソックス構造は通常のノロテイナーゼ
に対して抵抗性を示し、コラゲナーゼによってのみ作用
を受ける。

コラーゲンを加水分解する動物由来のコラゲナーゼはお
たまじゃくしや哨乳動物の組織培養で認められ、特に後
者の酵素はある種の病変、例えば角膜潰瘍、変形関節炎
、歯根膜炎あるいは腫瘍などと関係づけられ注目されて
いる。その一方で、現在まで４０種類以上の微生物の生
産するコラゲナーゼが発見されているが、精製されたも
のは少ない。嫌気性病原菌のＣｌｏｉｔｒｌｄｌｕｍ　
ｈｌａｔｏｌｙｔｉｅｕｍ　、病原性通性嫌気性好塩菌
のＡｃｈｒｏ＋ｎｏｂａｃｔｅｒ　ｉｏｐｈａｇｕａ（
Ｖｌｂｒｉｏ　ａｒｇｉｎｏｌｙｔｌｃｕｍ　）などか
らコラゲナーゼが単離されている。最近になって。

Ｃ，ｈｉｓｔｏｌｙｔｌｃｕｍコラダナーゼは６種類存
在すると報告された。

コラゲナーゼは動物組織の細胞分散などの生化学試薬と
して利用されてｂるだけでなく、最近では椎間板ヘルニ
アの治療など臨床領域においても、需要性が非常に増大
しつつある。

しかし、入手し得るコラゲナーゼは、Ｃ，ｈｉａｔｏｌｙｔｉｃｕｍや人、　ｉｏｐｈａｇｕ
ｓなどより調興した病原性細菌由来の限られた標品だけ
である。しかし、コラゲナーゼを量産および臨床利用す
るためには好気性、非病原性微生物のコラゲナーゼが必
要である。

先に本発明者は微生物の生産するコラゲナーゼ金臨床応
用するために、土壌より好気的条件下で菌体外にコラゲ
ナーゼ金生産する微生物を検索し、８ｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃ＠ｓ　ｓｐ、　Ｃ−５’３−株（微工研条寄第７１０
号）が強いコラゲナーゼ生産能を有することを見出した
（特開昭６１−１８８０６８号ン。さらにＳｔｒ＊ｐｔ
ｏｍｙｅ＊ｇｍｐ、ｃ−５１株の生産するコラゲナーゼ
は培養上清液よシ限外ｒ過濃縮、硫安塩析ＤＥＡＥ−Ｔ
ＯＹＯＰＥＡＲＬ　、　ＤＥＡＥ−Ｃａｌ　１ｕｌｏｆ
　ｌｎ＊のカラムクロマトグラフィー、電気泳動によυ
精製され、２つの活性画分を得た０これらコラゲナーゼ
は未変性コラーゲンおよび変性コラ−ダンに対して作用
するがカゼインを分解しなかった。

また、反応の至適ｐＨおよび温度ｓ　　ＰＨおよび温度
安定性、アミノ酸組成、各覆阻害剤の影響および抗原特
異性に関して両者に顕著な差は認められなかった０〔発明が解決しようとする問題点〕しかしながら、これらコラゲナーゼは、優れたコラーゲ
ン分解能を有するものの従来の培養法においてはその生
産性が不十分であり、２つの活性画分も各々十分に精製
されたものは得られていない。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者は前記コラゲナーゼの２つの活性画分
（以下コラゲナーゼＩおよびｌと記す）を各々高収率で
製造すべく種々検討したところ、ストレゾトミセス属に
属するコツゲナーゼ生産菌をｍ１、一定の培養条件で培
養すれば目的が達成されることを見い出し、本発明を完
成した。

すなわち本発明は、ストレｆトミセス属に属するコラゲ
ナーゼ生産菌を培養し、その培養物からコラゲナーゼ■
及びＩを採取すること？：特徴とするコラゲナーゼ１及
び１の製造法を提供するものである。

本発明を実施するには、例えばストレゾトミセス属に属
するコラゲナーゼ生産菌を栄養源培地上で好気的に培養
し、培養物中に蓄積したコラゲナーゼ■及び夏を種々の
手段によシ採取することにより行なわれる。好ましい培
地としてはゼラチン添加培地が挙げられる。

以下に本発明の実施態様とともに本発明の詳細な説明す
る。

■　材料および方法１−１　　使用菌株および培養方法菌株は遠藤らによって土壌より分離されたコラゲナーゼ
生産株Ｓｔｒ＠ｐｔｏｍｙｅ＊ｓ　ｓｐ、　Ｃ−５１（
微工研条寄７１０号２％開昭６１−１８８０６６号）を
用いた。

表１に示した組成（１）の培地１００ｄを入れた５００
ｄ容坂ロフラスコにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ　ｓｐ。

Ｃ−５１株を１白金耳植菌し、３０℃で４日間振盪培養
した０これを種培養として表１に示した組成（２）の培
地で各種炭素源・窒素源を加えた培地Ｌｏｏｍ／ｉ入れ
た５００ｄ容坂ロフラスコに５％植菌し、さらに３０℃
、２０時間振盪培養した０ここで使用した炭素源または窒素源は、グリセリン（国
産化学）、カザミノ酸（日永製薬Ｌｚリーｔ：ゾトン（
大豆栄養化学）、ゼラチンの酸加水分解物である水溶性
ゼラチンＵ、Ｈ−タイ７０にツタゼラチン）、ゼラチン
の酵素分解物であるハイマーシュＨ−１０００Ｐ（住友
化学工業）、フラミックスーＥＢ、フラミックス−Ｐ（
日本化薬）、ゼラチン（国産化学）、ハイド、Ｑウダー
（Ｈｌｄｅ　ｐｏｗｄｅｒ　）（都立皮革技術センター
、長南康正氏より恵与）０また表１に示した組成（２）の培地で、炭素源・窒素源
としてグルコース、ゲルコーストセラチン、グリセリン
とゼラチンを各０５％ずつ添加した培地で同様に培養し
た。

同様に種培養として表１に示した組成（３）の培地を用
い、本培養に組成（４）の培地を用いた。

また、この組成（４）を用いた本培養の培養経過中にク
ロラムフェニコール（和光紬薬工業）を添加し、さらに
３０℃でインキュベートした０以下余白ｆ−２酵素活性測定法１−２−１　　コラゲナーゼ活性測定法天然基質として
不溶性コラーゲン、酸可溶性コラ−ダン、ゼラチン、ア
ゾコールを用い、合成基質としてＰＺ−ＰＬＧＰＲ（ｐ
−ｐｈｅｎｙｌａｚｏｂａｎ　−ｚｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ　−Ａ
ｒｇ　）　、　Ｚ−ＧＰＬＧＰ　（ｂ＠ｎ１ｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｇｔｙ−Ｐｒｏ−Ｌ＠ｕ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ　）　、　Ｚ−ＧＰＧＧＰＡ（ｂｅｎｚｙｌｏｚ
ｙｅａｒｂｏｎｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ）を用いて活性測定した。また合成基
質を用いた場合には速度定数も求めた。

（１）不溶性コラーゲン基質として８０メツシユ（０１７７ｍｍ　）以下にそろ
えた不溶性コラーゲン（牛アキレス鍵由来のコラ−ダン
　タイｆｌ、シグマ）を用いてＰ＊ｔ＊ｒｋｏｆｍｋｙ
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｒｍｏｌ、。

８２．４５３−４７１（１９８２））に従ってｐＨ７６
，３７℃で反応させ、遊離した酸可溶性タン、Ｑり質ｆ
：Ｅ、Ｆ、Ｈａｒｔｒｓｅの方法（Ａｎａｌ、Ｂｌｏｃ
ｈｅｍ、。

４８．４２２−４２７（１９７２））またはニンヒドリ
ン法によって定量した。

基質溶液は５０　ｍＷ　Ｔｒｉｍ−塩酸緩衝液ｓ　　Ｐ
Ｈ７６，５ｍＭ塩化カルシウムを用いて不溶性コラーゲ
ンを最終濃度２％になるように調製したＯこの基質溶液１００　Ａｔに酵素溶液１００μｔを加え
て３７℃でインキュベートし、反応停止は０１Ｍ酢酸４
００μを添加することで行なった。反応終了後ｓ　　１
ａＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、、　１５分間の遠心分離を行ない
、上清について牛血清アルブミンを標準としたＥ、Ｐ、
Ｈａｒｔｒ＠ｅの方法またはＬ−ロイシンを標準とした
ニンヒドリン法によりタンノ９り質量を測定した。

酵素単位ハｓ　　ＰＨ７６％　３０℃で１分間に１μｍ
ｏｌの酸可溶性タンノ９り質を遊離する酵素量を１単位
（Ｕ）とした。

（２）　　酸可溶性コラ−ダン基質として酸可溶性牛皮膚コラーグンタイグ■（シグマ
）ヲ用いてＥ、Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｈ，Ｎｏｄａの方法（
Ｂｌｏｃｈｅｍ、旧ｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ　１０１５　
、５６２−５７４（１９６５）〕に従って、ｐＨ７６，
３０℃で反応を行ない遊離したアミノ基末端アミノ酸残
基金ニンヒドリン法によって定量した。

基質溶液は１０　ｍＭ酢酸を用いて酸可溶性コラ−ダン
を最終濃度０１５％になるように調製した。

この基質溶液０３ＷＩＩにＱ　ｌ　５　Ｍ　Ｔｒｉｍ−
塩酸緩衝液ＰＨ７６，１，５Ｍ塩化カルシウムＱ２ｄと
酵素溶液αＩＲ１ｔ−加えて３０℃でインキュベートし
、反応停止はαＩＮ塩酸２　Ｒ１消却することで行なっ
た。反応終了後、遊離したアミノ基末端アミノ酸残基を
同様にニンヒドリン法で定量した。

酵素単位はｐ）１７：６．３０℃で１分間に１μｍｏｌ
のロイシン相当量のアミノ基末端アミノ酸残基金遊離さ
せる酵素量を１単位（Ｕ）とした０（３）　　アゾコール基質としてアゾコール（シグマ）を用いてＰｖｔｅｒｋ
ｏｆｓｋｙの方法に従ってＰＨ７６，３７℃で反応させ
、遊離したアゾ色素を５３０　ｎｍの吸光度で定量した
。

基質溶液は５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液ｐ）Ｉ７
６　ｓ　５　ｍＭ塩化カルシウムを用いてアゾコールを
最終濃度０６％になるように調製した。

この基質溶液２５０　μｍに６２５　ｍＭ　　Ｎ　−エ
チルマレイミド２ｏμｔと酵素溶液２３０μｔｆ加えて
３７℃でインキュベートし、反応停止はｌ　ＯｍＭエチ
レンシアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）５００μを添加するこ
とで行なった。反応終了後１，０ＯＯＸｆ、５分間遠心
分離を行ない、上清について５３０　ｎｍの吸光度を測
定した。

酵素単位はｐＨ７６，３７℃で１分間に１μｍｏｌのア
ゾ色素を遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。

（４）　　ゼラチン基質として牛皮ゼラチンタイ−ｆＷ約６０プルーム（シ
グマ）を用りて、不溶性コラーゲン基質同様に、ｐＨ７
６，３７℃で反応を行ない、遊離したアミノ基末端アミ
ノ酸残基金酸可溶性コラーゲン基質同様に定量した。

（５）　　ＰＺ−ＰＬＧＰＲ合成基質としてＰＺ−ＰＬＧＰＲ（ペーリンガーマンハ
イム）を用い、Ｗ’ｕｎｓｃｈ　、Ｅ、　、Ｈ，Ｇ、Ｈ
ｅ１ｄｒｌｅｈの方法（Ｐｈｙｓｌｏｌ、Ｃｈ＠ｍ、、
　３３３　、１４９−１５１（１９６３））Ｋ従ってＰ
Ｈ８０，３７℃で反応させ遊離したＰＺ−ＰＬ　ｔ−３
２０ｎｍの吸光度より定量した。

基質溶液は５０ｍＭＴｒ１ｇ−塩酸緩衝液ｐＨａｏ、４
ｍＭ塩化カルシウムを用いてＰＺ　−ＰＬＧＰＲを最終
濃度１ｍＭになるように調製した。

この基質溶液１００μｔに酵素溶液１００μｔを加えて
３７℃でインキュベートし反応停止は０５％クエン酸４
００μを添加することで行なった。反応終了後、酢酸エ
チル２　ｘｉ　ｆ加えて抽出し、酢酸エチル層を無水硫
酸ナトリウムで脱水後３２０　ｎｍでの吸光度を測定し
た０酵素量位は１μｍＯ１の基質を１分間に分解する酵
素量を１単位（Ｕ）とした０（６）　　Ｚ　−Ｇ　Ｐ　Ｌ　Ｇ　ＰおよびＺ−ＧＰＧ
ＧＰＡ合成基質とｌ、−１（、Ｚ−ＧＰＩ、ＣＰおよび
Ｚ−ＧＰＧＧＰＡ（ペノテド研究所）を用い、前者はＹ
、Ｎａｇａｌらの方法（Ｂｌｏａｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ、　３７　、５６７（１９ａｏ））に従い
、後者はＧｒａ８ｍａｎｎ、Ｗ、　。

Ｎｏｒｄｖｉｌｒ、Ａ、　、の方法（Ｐ　ｈ　ｙ　ａ　
ｉ　ｏ　ｌ　＊　Ｃｈａｍｔ　ｓ　３２２　＋２６７　
（１９６０））に従って行なった。

基質溶液は２５　ｍＭ　Ｔｒｌｍ−塩酸緩衝液ｓ　　ｐ
）１８０１４ｍＭ塩化カルシウムを用いて調製した。

この基質溶液０．１ｔｒｔｌに酵素溶液α１ｄを加えて
、Ｚ−ＧＰＬＧＰの場合には３７℃％　Ｚ−ＧＰＧＧＰ
Ａの場合には２５℃でインキュベートシ、反応停止はＱ
２Ｎ塩酸０２１１Ｌｌで行なった。反応終了後、遊離し
たアミン基末端アミノ酸残基をＬ−ロイシンを標準とし
たニンヒドリン法によって定量した。

酵素単位はｐＨａｏ、２５℃あるいは３７℃で１分間に
１μｍｏｌのアミノ基末端アミノ酸残基を遊離させる酵
素量を１単位（Ｕ）とした。

１−２−２　　カゼイン分解活性測定法基質としてカゼ
イン（Ｃａ５ｅｌｎ　ｎａｅｈＨＡＭＭＡＲ８ＴｇＮ　
、メルク）を用いてＥ、Ｙｏａｈｉｄａ。

Ｈ，Ｎｏｄａの方法に従って行なった。基質のカゼイン
とｐＨ７８ｓ　３０℃で反応して遊離した酸可溶性チロ
シン残基ｔ”　２７３　ｎｍで定量した。

Ｑ　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｌｍ−塩酸緩衝液、ｐＨ７８で調製し
た０６％カゼイン４ｍと試料溶液α５Ｉｔｌを混合し、
３７℃で反応させた０反応は１０％トリクロロ酢酸で停
止した。反応終了後、−過し、濾過液の２７３　ｎｍの
吸光度を測定した。

１−２−３　　トリデシン様酵素活性測定基質としてＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アルギニα ン　ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−ＢＡＰＮＡ、シグマ）を
用いてＧ、Ｒｅ１ｎｈ＆ｒｄ、Ｆ、Ｈａｎａの方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ、Ａｎａｌ、　（３ｒｄ、Ｗｄ
　）　５．１１９−１２９（１９８４））に従ってトリ
ノシン様アミダーゼ活性を測定した０基質Ｌ−ＢＡＰＮＡ　ｔ−用いてｐＨ７：８．２５℃で
反応させ、遊離したｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｍの
吸光度によ）定量した。

トリエタノールアミン溶液（０，２Ｍ　）リエタノール
アミン、ｐＨ７８，２０ｍＭ　Ｃｍ”）０７５ｍｌと試
料溶液００５−を混合し、５分間放置した０その溶液に
トリエタノールアミン溶液で調製した４　ｍＭ　　Ｌ−
ＢＡＰＮＡ　Ｑ　２０　！１１６を加え、２５℃、１０
分間％４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した０１−３　精製方法１−３−１　　培養１−１の項同様に表１に示した組成（３）の培地を用い
て種培養を行ない表１に示した組成（４）の培地２０１
七入れた３０を容シャーファーメンタ−（ＴＳ−Ｎ型培
養装置、高杉製作所）に植菌し、３０℃、通気量２０　
ｔ　／　ｒｎｉｎ　、攪拌回転数２５０　ｒ、　ｐ、ｍ
、の条件下で２０時間培養を行なった。

１−３−２　　限外ｒ過濃縮３０を容シャーファーメンタ−で２０時間培養して得た
培養液について図１に示したように精製を進めた。操作
は全て４℃で行なった０まず、その培養液をｆ遇して培養上清液を［外濾過（（
Ｊ）’　）　モジ３．−Ａ／ＡＩＬ−１０１０ｓ分画分
子量ＩＱＯＯＯ（旭化成）を用いて限外濾過濃縮した。

１−．３−３　　硫酸アンモニウムによる塩析前項で得
た濃縮液よりコラゲナーゼ活性画分である硫酸アンモニ
ウム３５−７５％飽和沈澱物を得た。

濃縮液に硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように加
え、その沈澱物を遠心分離によって除去した。その上清
液に硫酸アンモニウムを７５％飽和になるように加えた
。その沈澱物を遠心分離によって取り％５ｍＭＴｒｉｇ
−塩酸緩衝液ｓ　　ＰＨ’？：６　ｓ　　１　ｒｎＭ塩
化カルシウムに溶解し、同緩衝液で透析し念。

１−３−４　　　ＤＥＡＥ−トヨ／リール８５０Ｍカラ
ムによる陰イオン交換クロマトグラフイー弱塩基性陰イオン交換体ＤＢＡＥ　−）ヨ／Ｑ−ル６５
０Ｍ（ｃｚ−〕（東洋曹達工業）をカラムサイズ４０Ｘ
１３（Ｘに５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ｐＨ７８
，１ｍＭ塩化カルシウムで充填したＯこれに前項で得た
全量を吸着させ、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液に０
２ｓ　Ｑ　３　、Ｌ　Ｍ塩化ナトリウムを加えた溶液で
段階的に流速３８０Ｒｔ／ｂ　（３０，５屑／／ｈ　−
ｃｌｌ！　）で溶出し、２０　ｍｌ　／　ｔｕｂｅで分
画した０これよシ得たコラゲナーゼ活性の高い画分をダ
イアフローメンブランフィルタ−ＹＭ−１０、分画分子
量ＩＱＯＯＯ（アミコン）によって限外ｒ過濃縮した０ｒ−３−５セルロファインＧＣ−２００−ｍカラムによ
るグルー過分画範囲（分子量）ＩＱｏｏｏ−１２０，０００のセル
ロファインＧＣ−２００−ｍ（生化学工業）をカラムサ
イズＬ９Ｘ９５ＣＩＩに２０　ｍＭＭＯＰＳ−水酸化ナ
トリウム緩衝液、ＰＨ７：６．４　ｍＭ塩化カルシウム
、０２Ｍ塩化ナトリウムで充填した。前項で得た全量に
ついて同緩衝液で流速１　＆７ｔｄ／　ｈ　（４８ゴ／
ｈ−ｃｇＬ”）で溶出し、　　１５ｄ／　ｔｕｂｅで分
画した。これより得たコラゲナーゼ活性の高い両分をダ
イアフローメンブランフィルタ−ＹＭ−１０により限外
−過濃縮し、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ＰＨ
ａＯ，４ｍＭ塩化カルシウムで透析した。

１−３−６　　Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５カラムによる
陰イオン交換クロマトグラフィー前項で得た粗精製物をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ。

Ｐｏ１ｙｐ＠ｐｔｉｄｅ、Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ、ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｌシ
ステムを用いて０強塩基性陰イオン交換体Ｍａｎｅ　Ｑ
　ＨＲ５７５カラム（ファルマシア）に５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｌｓ−塩酸緩衝液、ｐ）ｆ　ａ　０．４　ｍＭ塩化カ
ルシウムで吸着、洗浄した。その後、同緩衝液に３３　
ｍＷ塩化す）　ＩＪクムを加えた溶液によって、流速α
５ａｕ／ｒｈｌｎで溶出し、αｓ　ｗｅ　／　ｔｕｂｅ
で分画した。この操作のみ２０℃で行なった０これより
得九２つの活性画分をそれぞれ４℃でダイアフローメン
ブランフィルタ−ＹＭ−１０で限外濾過濃縮し、１５　
ｍＭ　　ＭＯＰ８−水酸化ナトリウム緩衝液。

ｐＨ７８，１ｍＷ塩化カル７ウムで透析した０１−４　
　タン／耐り質の定量Ｌ　ｏ　ｗｒ　ｙ　Ｔ　Ｏ＊　Ｈ−らの方法に従ってタ
ンＡり質量を測定した。標準タンノ９り質として牛血清
アルブミンを用いた０［−５電気泳動１−５−１　　ｓｅリアクリルアミドダル電電気泳動ク
リアクリルアミドグル電気泳動　ＰＡＧＥ　）はＢ、Ｊ
、Ｄａｖｌｍの方法（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、。

１２１．４０４（１９６４））により行なったＱグルは
２　ｍｆｌｎ厚のスラブダルとし、分離ダルはｐＨ９，
５＊　アクリルアミド濃度７０％に調製した。泳動は４
℃で行なった。ダルの染色はコマシーブリリアントブル
ー１２５０　（牛丼化学薬品）によるタンパク質染色ま
たは過ヨウ素酸−フクシン試薬による糖質染色（ＰＡ８
染色）で行なった０また、ＰＡＧＥを行なった試料のコラゲナーゼ活性およ
びタン、Ｑり質量を定量するためには以下の操作を行な
った。

ＰＡＧＥを行なったゲルを取プ出し、２２−３ｎｔ間隔
で切り出し、５０　ｖＢＭ　Ｔｒｉ−一塩酸緩衝液、　
　ｐＨ７６，４ｍＭ塩化カルシウＡ　４００　ｐＬＫよ
って切り出したゲル切片から抽出し、その抽出液につい
て、合成基質ＰＺ−ＰＬＧＰＲｔ−用いたコラゲナーゼ
活性測定を行なった０また、タン・ｑり質を定量するた
めにコマシーブリリアントブルーによってゲルを染色し
、デンシトメーター、高滓クロマトスキャナＣ５−９３
０（高滓製作所）を用いて染色したダルの５７０　ｎｍ
の吸光度を測定した０１−５−２　５Ｄ８−ぼりアクリ
ルアミド電気泳動５Ｏ８−＆リアクリルアミド電気泳動けＤａｖｉｍの方
法によって行なった。ダルは１ｍｍ厚のスラブダルを用
い、分離グルの？リアクリルアミド濃度はａ５％に調製
し九〇５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定はミオシン（２０５
ＫＤａ　）　、β−ガラクトシダーゼ（１１６ＫＤａ　
）　、ホスホリラーゼＢ　（９７ＫＤａ　）　、牛血清
アルブミン（（３５ＫＤａ　）　ｓオプアルプミン（４
３ＫＤａ　）　、炭酸デヒドロゲナーゼ（２９ＫＤａ　
）　ｔ−含む分子量マーカー（シグマ）の相対的移動度
から計算して行なった。ダルはコマシーブリリアントブ
ルーで染色した。

また、　　５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて試料のゼラチン分
解活性の分析をＣ，Ｈｅｕｓｍｅｎ、Ｅ、Ｂ、Ｄｏｗｄ
ｌｅの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈ＊ｒａ、、　Ｌ　０
２　、１９６−２０２（１９ｓｏ））に従って行なった
。分離ダルは、０１％ゼラチンを含む８５％？リアクリ
ルアミドダルに調製した。４℃で泳動後、取シ出したゲ
ルを室温、１時間２５％トライトンＸ−４００中で振盪
し、　ＳＤＳを除去し、αＩ　Ｍ　Ｔｒｉｍ−塩酸緩衝
液、ｐａ７ｓ、４ｍＭ塩化カルシウム中、３７℃、３〜
４時間インキュベートした０そのゲルをコマシーブリリ
アントブルーで染色した。

１−６　アミノ酸分析アミノ酸分析は、自動アミノ酸分析機（Ｈ％ｔａｅｈｌ　Ｍｏｄ＠ｌ　８３５ａｍｉｎｏ　ａ
ｃｉｄ　ａｎａｌｙｚｅｒ。

８３３Ａ　ｄａｔａ　ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ　）　ｆ用−
て行なった０試料タンノＱり質は真空下で０２％フェノ
ールを含む６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解して
調製した。

この分析方法では、システィン、トリットファンは検出
できず、アスノ９ライン、グルタミンはアスノＱラギン
酸、グルタミン酸として定量した。

１−７　　免疫化学実験部分精製したコラゲナーゼ（セルロファインＧＣ−２０
０−ｍカラムクロマトグラフィーによる活性画分）２０
０μｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　／　Ｉｌｌと同量の（フロイ
ントの完全アジュバント（ディフコ）？：混合し、その
１１Ｌｌ全３ｋｆウサギ（♂）の背部皮下に注射した。

１週問おきに３回注射し、最後の注射後、２週間で血清
を分離し、−２０℃で保存した。

抗原として、Ｓｔｒ＠ｐｔｏｍｙｃｅａ　ａｐ、　Ｃ−
５１株のコラゲナーゼとＣ，ｈｌｓｔｏｌｙｔｌｅｕｍ
　（シグマ）および人、Ｉｏｐｈａｇｕｍ　（ペーリン
ガー　マンハイム）ｔ−用いてオフタロニー法で行なっ
た。

以上の材料および方法を用いることＫよってコラゲナー
ゼ■及び厘ヲ製造することができるが、次に最適培養条
件及び精製方法を検討した。

夏　培養条件の検討従来、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｐ、　Ｃ−５１株
のコラゲナーゼ金生産させる培地として、ゼラチン０３
％、−（ゾトン１．０％、酵母エキス０２％、リン酸水
素二ナトリウム０２％、炭酸ナトリウム０２５％、硫酸
マグネシウム００４％を用いていた。

この従来の生産培地を用いたときよりも、よシ高いコラ
ゲナーゼ活性を得るための条件を検討するため、以下の
実験を行なった。

１−１　　炭素源および窒素源の検討コラゲナーゼ生産に対する炭素源、窒素源の影響を調べ
た。

表ＩＫ示した組成（２）の培地に各種炭素源、窒素源を
０６％添加し、３０℃、２０時間培養したときのコラゲ
ナーゼ生産の変化全表２に示した。この結果のコラゲナ
ーゼ活性は基質としてＰＺ−ＰＬＧＰＲを用いた測定方
法より求めた０以下余白表２　コラゲナーゼ産生に対する培地の影響本基礎培地
：０１％アスノ９ラギン、０．１％に、）ＩＰＯいＱＯ
４％ＭＥＭＯ４・７Ｈ１０、微量無機物、ｐＨ’７２こ
の結果より、炭素源よりも窒素源を添加した場合のほう
がコラゲナーゼ活性が高かった。特にゼラチン、ゼラチ
ン酵素分解物を添加した場合に最もコラゲナーゼ活性が
高く、従来の生産培地を用いた場合よりも５−１０倍の
コラゲナーゼ活性が得られた。

次の炭素源のコラゲナーゼ活性の誘導について検討した
（図２）ｏその結果、グルコースよりもグリセリンを添
加したほうがコラゲナーゼ活性がより高く誘導されたが
、これら炭素源を添加せずにゼラチンのみを培地に添加
したときのほうがコラゲナーゼ活性が高かった（表２）
。

このことから、炭素源、特にグルコースはコラゲナーゼ
生産を抑制し、著しく遅らせることがわかった。

以上より、コラゲナーゼ産生のために使用する培地は、
炭素源を添加せず、ゼラチンまたはフラミックスｐ６添
加した培地が特に好ましい。また炭素源、特にグリセリ
ンを添加した培地ではコラゲナーゼ生産能は低くなるが
菌体量の増加が高かったので、種培養のために使用する
培地は、ゼラチンまたはフラミックスＰとグリセリンを
添加した培地が好ましい。

厘−２ゼラチンまたはゼラチン酵素分解物（フラミック
スＰ）によるコラゲナーゼ誘導培地に添加するゼラチン、フラミックスＰの濃度変化に
よるコラゲナーゼ産生能への影響を検討した（図３（１
）および（２））。ゼラチンまたは７ラミツクスＰを０
３あるいは０５％添加した培地（表１　（４）　）で培
養し、そのときのコラゲナーゼ活性、カゼイン分解活性
、トリプシン様アミダーゼ活性の変化を調べた。

その結果、コラゲナーゼ活性について従来の生産培地を
用いた培養とほとんど変化のない培養２０時間前後に最
大に達し、わずかにゼラチンよりもフラミックスＰを添
加したときのほうが高く誘導されたが、ゼラチンと７ラ
ミツクスＰの添加濃度によるコラゲナーゼ誘導の変化は
ほとんどなかった。それに対し、カゼイン分解活性は、
培養経過とともに増加し、ゼラチンまたはフラミックス
Ｐを０３％より０５％添加した培地のほうが多く生産さ
れた。また、トリグシン様アミダーゼ活性は。

どの場合にでもほとんど生産されなかった。

以上の結果よ＃）％最も好ましい培養条件は非特異的蛋
白分解酵素活性が低く、コラゲナーゼ活性を高く誘導す
る条件は表１に示した組成（４）の培地でゼラチンまた
は７ラミツクスＰ’！ｉ０３％添加した培地で、培養時
間２０時間であることがわかった。

また、このゼラチン、フラミックスＰ’ｉ０３％添加し
た培地で培養し％　　１２，２０．２８時間培養した培
養上清から硫安３５−７５％飽和画分を得て、３０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｍ−塩酸緩衝液ｐｉ（７６、１ｍＭ塩化カル
シウムに溶解、透析後ＰＡＧＥによるタンノ９り質の分
析を行なった（図４）。図４のレーン１〜３はゼラチン
添加培地で１２，２０．２８時間培養した結果でレーン
４〜６はフラミックスＰ添加培地で１２．２０，２８時
間培養した硫安分画物の結果である。

この結果よ＃）％ゼラチン、７ラミツクスＰのどちらを
添加した場合にも培養１２時間ではコラゲナーゼＩが生
産されているが、コラゲナーゼ厘は生産されず、さらに
培養を続けると、コラゲナーゼ■の生産が観察された。

またコラゲナーゼ活性が最大に達する培養２０時間でコ
ラゲナーゼｌおよび１の生産量も最大となっていること
がわかった。これによりコラゲナーゼ！と■は、培養時
間をコントロールすることによシ各々を選択的に採取で
きる。

１−１−３　　クロラムフェニコールのコラゲナーゼ生
産への効果いろいろな培養時期に添加したクロラムフェニコールの
コラゲナーゼ生産に対する影響を調べるために、次の操
作を行なった。

Ｓｔｒ＠ｐｔｏｍｙｅｅｓ　ｓｐ、　Ｃ−５１株を表１
のフラミックスＰ０３％添加した組成（４）の培地で培
養し、培養０，８．１２％　２０時間後にそれぞれクロ
ラムフェニコールを５ｔｒｅｐｔｏｎ＋ｙｃｅｓ　ｍｐ
、　Ｃ−５１株最小致死量（５μｆ／ｌｄ）添加し、さ
らに３０℃でインキュベートを行ない、それらの培養液
について、基質としてＰＺ−ＰＬＧＰＲ’ｉ用込るコラ
ゲナーゼ活性測定を行なった（図５）。

図４よりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｐ、　Ｃ−５１
株のコラゲナーゼはゼラチンやフラミックスＰによって
誘導されることがわかったが、図５の結果よりタン、Ｑ
り質合成阻害剤のクロラムフェニコールの処理によって
ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ＠ｓ　８ｐ。

Ｃ−５１株のコラゲナーゼの生産が止められることがわ
かった。

図５において１２時間培養した培養液と培１１１２時１
１［にクロラムフェニコール５μ？／ｄを添加し、さら
に３０℃、８時間インキュベートした培養液から硫安３
５−７５％飽和画分を得た。その分画物についてｌ−５
−１の項に従込、コラゲナーゼＩおよびＩの活性量、タ
ンノ９り質量の分析を行なった（図６Ａ＊　８８　）。

図４同様に培養１２時間ではコラグナーゼ！は生産され
ているが、コラゲナーゼＩはほとんど生産されていない
ことがわかった（図８Ａ　）ｏこれに比べ、培養１２時
間後にクロラムフェニコール添加して、８時間インキュ
ベートするとコラゲナーゼ■は減少し、コラゲナーゼ璽
は増加することがわかった（図８Ｂ）。

また、ＰＡＧＥによるコラゲナーゼ１の活性量およびタ
ン、ｅり質量の変化を定量した結果クロラムフェニコー
ル添加して８ＲｉＪＨＬ　：Ｆラグナーゼ■はタン、Ｑ
り質量、活性量ともに約２倍に増加していることがわか
った。

従って、クロラムフェニコールを添加して培養を行うこ
とがコラゲナーゼ夏又は璽を選択的に採取するのＩＣ特
に好ましいものである〇！−２精製方法従来のコラゲナーゼの精製方法は従来の生産培地で培養
した培養上清液よシ、限外ｒ過濃縮、硫安塩析、ＤＥＡ
Ｅ−トヨノＱ−ルとＤＥＡＥ−セルロファイン力ラムク
ロマトグラフイーおよび電気泳動によシ行なうものであ
った。

しかし、生産培地の変更など培養条件が変わったことよ
シ従来の方法では精製ができなくなったので、最終的に
電気泳動を用いない精製方法の改良および検討を行なっ
た。

その結果、表１の０３％フラミックスＰ添加した組成（
４）の培地を用いて培養した培養上清液ｓｅｔから図１
の精製方法を用いて最終的に精製度１３８倍、回収率１
８％でコラゲナーゼ■および１が得られた（表３）。

次に各精製過程の結果を示す。

培養上滑液Ｓｅｔを限外濾過濃縮によって６３０１Ｉｊ
にまで濃縮した。これよシ塩析にょシ硫安３５〜７５％
飽和画分を得た。その硫安分画物を透析後＠　ｅｂ　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液ＰＨ７６，Ｌ　ｍＭｔＪｉ化
カルシタカルシウムしたＤＩＡＥ−トヨ／Ｑ−／ｌ／６
５０　Ｍ＋７）　カラム（４０Ｘ１３ｃｍ）に吸着させ
た。そのカラムを同緩衝液で洗浄後、同緩衝液に塩化ナ
トリウムα２、α３、ＩＭ加えた緩衝液で展開し、溶出
液ｔ−２０ｍｌ　／　ｔｕｂｅで分ｉｊｌた（図’ｙ）
ｏこの活性画分（フラクションＮ１２７−３４）１６Ｃ
）＋ｊが得られ、限外濾過濃縮により１１．８ａｔ　Ｋ
　ＩＩ縮した。

この濃縮液を２０　ｍＭ　ＭＯＰＳ−水酸化ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７：６．４　ｍＭ塩化カルシウム、Ｑ２Ｍ
塩化ナトリウムで平衡化したセルロファインＧ　Ｃ−２
００−ｍのカラム（Ｌ９Ｘ９５ｍ）にのせ、同緩衝液で
展開し溶出液を１５ｄ／ｌｕｂ・で分画した（図８）。

この活性画分（フラジ’／　＝ｉ　ｙ　Ｎｕ　２２−４
６　）　３７５１１１　’ｆｔ　ｌ’Ｊｔ外ｒ過外線過
濃縮　ａ　１ｙｄに濃縮しｓ　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−
塩酸緩衝液ｓ　　ＰＨａ　Ｏｓ　４　ｍＭ塩化カルシウ
ムで透析した。

この活性画分を５０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ−塩酸緩衝液
、ＰＨａｏ、　４　ｍＭ塩化カルシウムで洗浄したＭｏ
ｎｏ　Ｑ　１（Ｒ５／　５のカラム（Ｑ５ｘ５ｃｍ）に
吸着させた。そのカラムを同緩衝液で洗浄後、同緩衝液
に３６−塩化ナトリウムを加えた緩衝液で展開し溶出液
ｆ　０．５　ｍｌ　／’　ｔ　ｕｂｅで分画した（図９
）ｏこれより２つの活性画分が得られその活性画分（フ
ラクショ７Ｎｎ２２−２７および３４３４−４４）３０
および６６１１１１７を限外−過濃縮によって、それぞ
れ５ｄに濃縮し１５　ｍＭ　ＭＯＰＳ−水酸化ナトリウ
ム緩衝液ｔｐ）１７：６．１ｍＭ塩化カルシウムで透析
し、−３０℃で保存した。

図１ＯＡは各精製段階で得られた活性画分ｉ　ＰＡＧＥ
によって分析した結果である。レーン１は硫安３５−７
５％分画物、レーン２はＤＥＡＮ−トヨノＱ−ルクロマ
トグラフイー活性画分、レーン３はセルロファイン’Ｇ
Ｃクロマトグラフィー活性画分、レーン４および６はＭ
ｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィー活性画分である。

このように、Ｍａｎｅ　Ｑ　ＨＲ５／　５のカラムクロ
マトグラフィーによって精製された２つの両分は電気泳
動的に単一であったので、その活性画分フラクションＮ
１１２２−２７　’ｉコラゲナーゼ■、フラクションＮ
１３４−４４をコラゲナーゼ厘の最終精製標品として用
いた。

また、セルロファインＧ　Ｃ−２００−ｍのカラムクロ
マトグラフィーによってコラゲナーゼから他のタン、ｅ
り質およびカゼイン分解活性が除去されたことがわかっ
た（図１０人、レーン３、表３）。

精製したコラゲナーゼＩおよびＩｆｔ電気泳動後、過ヨ
ウ素酸−７クシン試薬による楯質染色した結果を図１０
Ｂ（レーンｌおよび２）Ｋ示した。この染色法によって
も最終精製標品が単一であることがわかった。

また、糖染色されたことよシ、コラダナーゼ！および厘
は糖タンノＱり質であると推定された。そこで標品のコ
ラゲナーゼＩおよび璽についてグルコースを標準物質と
してフェノール・硫酸法による糖質定量を行なった。そ
の結果、検出限界（コラゲナーゼ！および罵の１モル当
だシタンノ髪り質量の１／１ｏｏｏ）以下であった。

以下余白斯くシて得られたコラゲナーゼ■および璽の酵素学的諸
性質について以下に示す。

（１）分子量精製標品（Ｉ−２で得たもの、以下同じ）について５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥを行なった結果、コラゲナーゼ１は単一の
鋭いバンドを示した（図１１、レーン２）がコラゲナー
ゼ厘は幅の広いバンドを示した（図１１．レーン４）。

また、試料の調製ｆｔ６％メルカグトエタノール存在下
で行なったときの結果は、非存在下の場合と同じであっ
た（図１１．レーン３．５）。

コラゲナーゼ■および璽の分子量について分子量マーカ
ー（図１１．レーン１）の移動度と比較して計算した結
果、コラゲナーゼ■はｓａ、ｏｏｏ、：ｒラグナーゼＩ
は６９．　ＯＯＯ〜８９．　ＯＯＯの分子量をもっと推
定された。

４７’（、ＳＤＳによって変性を受けていないコラゲナ
ーゼの分子ｔを調べるためにセファデックスＧ　−Ｌ　
１５０　ｓ　セルｏ７アイ／ＧＣ−２００−ｒｎオよび
ＴＳＫ−ダルＧ３０００ＳＷカラムによるダルｆ過を試
みた。しかし、どの場合にもコラゲナーゼ１．１はカラ
ムに吸着し、塩化ナトリウム０〜ＩＭを含む各種緩衝液
を用いてもほとんど溶出されなかった（回収率く１０％
）０このため、グルｒ過によってネイティブなコラゲナ
ーゼの分子量を知ることはできなかった。

８ＤＳ−ＰＡＧＥのメルカプトエタノール処理による分
子量に変化が見られないことよシ、コラゲナーゼＩおよ
び１はジスルフィド結合によるサブユニットを形成しな
いことがわかった。しかし、ネイティブなコラゲナーゼ
の分子量がわからないことからも他の結合によるサブユ
ニット形成については不明である。

（２）　　ｐＨおよび温度の影響精製標品のコラゲナーゼ活性に対する至適ｐＨを調べる
ために基質としてＺ−ＧＰＬＧＰを用いてｐＨ３−Ｌ　
Ｌ％３０℃において活性測定を行なった。

ここで用いた緩衝液は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐ
Ｈａｅｓ　〜ａ５）、Ｔｒｉｍ　−−ｑレイン酸緩衝液
（ｐａａ５〜ａ５）、炭酸−ホウ酸−塩化カリウム緩衝
液（ｐＨ８５〜１１）。

その結果、コラゲナーゼ【％　ＩともｐＨ８〜９の至適
ｐ■を示した（図１２Ａ）０次にコラゲナーゼ活性に対する至適温度を調べた０基質
として未変性コラーゲンを用いると、この基質が４０℃
以上で急激に変性し、測定できなかったので、基質とし
てＺ−ＧＰＬＧＰを用いて２５〜６０’Ｃ（ＰＨ’７５
１でコラゲナーゼ活性測定を行なった。

その結果、コラゲナーゼの至適温度は３５〜４０℃であ
ることがわかった。（図１２Ｂ）。

（３）　　基質特異性天然基質として不溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲン
、ゼラチン、アゾコールヲ用いて、コラゲナーゼＩおよ
びＩによる加水分解を行ない基質特異性を求めた。基質
として不溶性コラーゲン、酸可溶性コラ−ダン、ゼラチ
ンを用いた場合には、μｍ。ｌ　ｐｒ。ｄｕｅｔ　／　
ｍｌｎ／　ｒｌｔｇ　＠　１１１１！Ｖｔｎ１ｌ　ｐｒ
　Ｏｔ＊　１　ｆｌ　％　アゾコールを用いた場合には
ｓ　１１９　ｐ　ｒ　Ｏｄ　ｕ　ｅ　ｉ　／　ｍ　ｌ　
２１　／　！Ｉｔｇ＠　ｎ　Ｚ　７ｍ＠　ｐ　ｒ　ＯＬ
・ｉ＋として表わした。

その結果は、表４に示したが、コラゲナーゼＩはどの基
質を用いた場合にもコラゲナーゼ１よシ高い活性を示し
た。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｌｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ　
コラゲナーゼによって加水分解される合成オリゴペグチ
ドのＰＺ−ＰＬＧＰＲ％Ｚ−ＧＰＬＧＰおよびＺ−ＧＰ
ＧＧＰＡを基質として用いてコラゲナーゼ■と１による
加水分解を行ない、コラゲナーゼ！と１の基質特異性（
μｍｏｌ　ｈｙｄｒｏｌｙｚ＠ｄ　／　ｍＩｎ　／　Ｉ
Ｉｇ・ｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｔａｌｎ　）を求め念。

その結果、コラゲナーゼ！、璽それぞれＰＺ−ＰＩ、Ｇ
ＰＲＫ：　対しテｌ　１７６と１１　ａ　３　ｂＺ−Ｇ
ＰＬＧＰに対して２ａ３と６４７．Ｚ−ＬＧＰＧＧＰＡ
に対して８ａ２と１５３１であった。

また、ラインライ−バーバークの逆数ノロシト法により
、コラゲナーゼＩと厘の合成基質に対するミバエリス定
数Ｋｍおよび触媒定数Ｋｃａｔを求めた（表５）０表４　各檀基質に対するコラゲナーゼ！およびＩの活性（４）酵素阻害剤の効果コラゲナーゼＩとＩＫ対する各種酵素阻害剤の効果につ
いて検討した。この活性測定には基質としてＰＺ−ＰＬ
ＧＰＲあるいはＺ−ＧＰＬＧＰ　’ｉｉ用する方法で行
なった。

酵素阻害剤として金属キレート剤のＥＤＴＡトＯ−７：
ｒ−ナンドロリン、ゾスルフィト結合還元剤のＬ−シス
ティンとメルヵゾトエタノール、チオール酵素阻害剤（
アルキル化斉ｎのヨードアセトアミドとＮ−エチルマレ
イミド、セリンノロテアーゼ阻害剤のゾイソデロビルフ
ルオロリン酸を用いた。

コラゲナーゼＩ、Ｉに対してともにＥＤＴＡとＯ−７エ
ナントロリンは１　ｍＭで１００％の阻害、Ｌ−システ
ィンとメルカゾトエタノ−ルはＬ　ＯｍＭで６０〜７０
％の阻害を示した。

しかし、ヨードアセトアミド（１０ｍＭ）、Ｎ−エチル
マレイミド（５ｍＭ　）％ゾイソグロピルフルオロリン
１１！（１ｍＭ　）は阻害を示さなかった。

また、ＥＤＴム（１ｍＷ　）処理したコラゲナーゼに２
価の金属イオンを添加して活性の回復ｔ−調べたところ
、コラゲナーゼ！、１ともＣ＆２＋、Ｃｏ意＋、　Ｍｇ
”、Ｍｎ”十によって強い活性の回復が観察された。そ
の強く活性を回復させる順序はＣｏｔ＋＞　Ｃａｔ＋＞
Ｍｇ”＞　Ｍｎ”十であり、１０ＭＣ６”＋でコラゲナ
ーゼ夏は１１０％、コラゲナーゼ１では１５５％の活性
の回復を示し、１ｍＭ　Ｃａ”では、コラゲナーゼ■、
夏とも１００％の活性回復を示した。

（５）　　アミノ酸分析コラゲナーゼｌと１のアミノ酸組成は表６に酵素タンノ
９り（分子量８０，０００）１分子当たシの残基数で示
した。

以下余白表６　コラゲナーゼ■および厘のアミノ酸組成本コラダ
ナーゼ■および璽は分子量ｓｏ、ｏｏｏ。

ＴｒｐおよびＣｙｓは検出されなかった〇イイ値は３測
定の平均である。

この結果よシコラダナーゼ！と璽のアミノ酸組成は非常
に似ていることがわかった。

しかし、両コラゲナーゼともＣＦ”　ｒ　”Ｉ’　ｅこ
の方法で測定することはできなかった。

（６）　　免疫化学実験コラゲナーゼ■とＩの抗原特異性とこれらコラゲナーゼ
とＣ，ｈｌ＠ｔｏｌｙｔｌａｕｍおよび人。

１ｏｐｈａｇｕａコラゲナーゼ間の免疫化学的関連性を
調べるためにオフタロニー法による免疫拡散法を行なっ
た。

コラゲナーゼ■と１を含む部分精製物に対するウサギ抗
血清を用いてコラゲナーゼ■、コラゲナーゼ！、コラゲ
ナーゼ夏と１を含む部分精製物Ｃ，ｈｌｓｔｏｌｙｔｌ
ｃｕｍおよびＡ、　ｌｏｐｈａｇｕｓコラゲナーゼにつ
いてオフタロニー法を行なつた結果を図１３に示した。

抗血清（図１３．ウェルＲ）と標品コラゲナーゼ■およ
び厘は単一の沈降線を形成した（図１３．ウェルＡ、Ｂ
）が、Ｃ，ｈ［ｓｔｏｌｙｔｔｃｕｍおよび人、ｉｏｐ
ｈａｇｕｓコラゲナーゼとの間には沈降線を形成しなか
った（図１３．ウェルＣ２ｖ）。

また、抗血清とコラゲナーゼＩと１ヲ含む部分精製物、
標品のコラゲナーゼ■および厘の間に形成された沈降線
は１本でかつ融合した（図１３．ウェルＳ＋　Ａ＋　Ｂ
）。

以上よυコラゲナーゼ夏とＩは抗原特異性が同じであＦ
）　、　Ｃ，ｈｌｍｔｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＡ　、　
ｉ　ｏ　ｐｈａｇｕｓコラダナーゼとは抗原特異性が異
なることがわかった。

■　コラゲナーゼ夏の１への変換アミノ酸組成が近似し、抗原特異性が同じであるが、分
子量や基質特異性などが異なるコラゲナーゼＩとＩの関
連性について検討したＯ図４よシ培養中はじめに、コラゲナーゼＩが生産され、
その後コラゲナーゼＩが生産された結果と図６よりクロ
ラムフェニコールによシタンノＱり合成が停止している
中で、コラゲナーゼ１が生成された結果、また抗原特異
性ならびにアミノ酸組成の結果よりコラゲナーゼ１はコ
ラゲナーゼＩが菌体外に生産されてから分解または修飾
された産物ではな匹かと推定された。

そこで、コラゲナーゼ！と１の関連性を解明する目的で
コラゲナーゼの自己消化、コラゲナーゼ！より曹の生成
について検討した。

厘−１自己消化（１１コラゲナーゼｉの自己消化精製コラゲナーゼＩ　ｆ、ｐＨ３〜１０において３０℃
で２０時間インキュベートした。その試料について３０
　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−塩酸緩衝液、ｐＨ７：６、　１　ｍ
Ｍ塩化カルシウムで透析後、ＰＡＧＥ　’ｉ行なった結
果を図１４に示した０図１４のレーン１および２はコラ
ゲナーゼ■および罵の標品であシ、レーン３〜１０はそ
れぞれｐＨ３，４，５，６，７，８，９，１０において
コラゲナーゼ１をインキュベートした結果であるｏｐＨ
３，４においては、コラゲナーゼが沈澱し、　ＰＡ（Ｊ
による分析ができなかつた。ｐＨ５ではコラゲナーゼ■
がコラゲナーゼ藍および瓢とも異なるタンノＱり質に１
００％変換し、またｐＨ６〜１０におｈてはコラゲナー
ゼ■は自己消化奮起こしているが、その量はわずかであ
った。このことよシ、コラゲナーゼ■の自己消化ではコ
ラゲナーゼ厘は生成されないことがわかった。

同様ＶＣｐＨ３〜１０で３０℃、２０時間インキュベー
トしたコラゲナーゼ１の合成基質ＰＺ−ＰＬＧＰＲに対
する活性とＰＡＧＥ後のデンシトメーターによるコラゲ
ナーゼ夏とＩのタン／Ｑり質量を測定した結果（図１５
）％ＰＨ６〜９．３０℃、２０時間のインキュベートで
。

インキュベート前のコラゲナーゼ！に比べてコラゲナー
ゼ活性が７０−８５％残存することがわかった。またｐ
Ｈ３で処理してコラゲナーゼ蓋から生成されたタン／Ｑ
り質にもインキュベート前のコラゲナーゼ１の約６０％
ｔｌ）−ｙラグナーゼ活性が存在することがわかった。

またｐＨ５でのコラゲナーゼ■からの生成物について５
ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった（図１６人。

レーン４）。図１６人のレーン１ｔｌ）子ｆｆｉマーカ
ー、レーン２および３は標品のコラゲナーゼ■および厘
である。

この結果ｐＨ５処理で生成されたコラゲナーゼ活性をも
つタン／Ｖり質の分子量は７４，０００−９４０００で
あシ、その平均分子量はコラゲナーゼ■の分子量５３ｏ
ｏｏにほぼ一致した０標品のコラゲナーゼ■および璽とコラゲナーゼＩからｐ
Ｈ５で生成されたタンパク質量ついてゼラチン含有５Ｏ
８−ＰＡＧＥを用いた活性染色を行なった結果（図１６
Ｂ、レーン１〜３）によってもコラゲナーゼ■からｐＨ
５で生成された７　４−９４　ＫＤａタン／Ｑり質に活
性があることが示された。

（２）　　コラゲナーゼ履の自己消化精製したコラゲナーゼ１をｐＨ７６，３０”Ｃで８０時
間までインキュベートした。この試料について合成基質
ＰＺ−ＰＬＧＰＲｉ用かたコラゲナーゼ活性を測定しＰ
ＡＧＥにょるタン／Ｖり質量および活性の分析を行なっ
た。

このインキュベートの結果、コラゲナーゼ活性はインキ
ュベート前のコラゲナーゼ１の２０％にまで減少しく図
１７Ｂ）　、新たＶＣ２っのタンパク質が現われた（図
１７Ａ）。

この新たに生成され九タン、Ｖり質にコラゲナーゼ活性
が存在するか調べるために、コラゲナーゼｌ１３０と７
０時間インキュベートした試料について、　ＰＡＧＥに
よる分析を行なった。

この結果を図１８に示したが、インキュベート前のコラ
ゲナーゼ蓋について同様の操作で求めたコラゲナーゼ活
性を１００として、それに対する相対活性で表わし念。

これより新たに生成された２つのタンパク質ともコラゲ
ナーゼ活性をもつことがわかった。

コラゲナーゼ！および璽の自己消化によって生成された
コラゲナーゼ活性を有するタン／Ｑり質は、培養を２８
時間まで行なったときには生産されなかった（図４）ｏ
よってｐＨ７〜８である培養条件において生産されてき
たコラゲナーゼに関して自己消化は生じていないかある
いはほとんど起きていないと考えられる。

＋１−２　　コラゲナーゼ■からコラゲナーゼＩの生成（１）　　硫安分画物のｐＨ７６でのインキュベート１
−２の項と同じ条件で培養を行なうと、はじめにコラゲ
ナーゼｉのみが生産され、その後、コラゲナーゼ蓋が生
産された（図４）。

このコラゲナーゼ１のみが生産された培養上清液の硫安
３５〜７５％飽和塩析物ｆ：５　ｒｎＭＴｒｉｍ−塩酸
緩衝液、ｐＨ７６，１ｍＭ塩化カルシウムで透析し、そ
の硫安分画物’ｉ　３０　’Ｃでインキュベートした０
そのインキュベート時のコラゲナーゼ活性変化を合成基
質ＰＺ＝ＰＬＧＰＲを用いた測定により調べ、またコラ
ゲナーゼ１１１のタンノｑり質量の変化ｆ、ＰＡＧＥに
よる分析で調べた。

この結果、コラゲナーゼＩは減少し、逆にコラゲナーゼ
璽が増加し、生成されたコラゲナーゼＩのタン、Ｖり質
量と活性量はインキュベート１２時間後に最大となった
（図１９）。

このインキュペー）０，１２時間の硫安分画物について
ＰＡＧＥ　Ｋよるコラゲナーゼ■と１のコラゲナーゼ活
性の変化を調べた結果を図２ＯＡおよびＢに示した。

この結果より、コラゲナーゼ■のみ含む硫安分画物のイ
ンキュベートによってコラゲナーゼＩがタン、ｖり質量
だけでなく、活性量としても増加したことがわかった。

（２）　　［安分画物のｐＨ３−９でのインキュベート上記と同じ硫安分画物’ｉ　ｐＨ３−９において３０”
Ｃ１４０時間までインキュベートし、３０ｍＭＴｒｌａ
−塩酸緩衝液、ｐ）ｆ　７６、ｉｎ＋Ｍ塩化カルシウム
で透析した。その試料についてＰＡＧＥを行ない、コラ
ゲナーゼ■のタンパク質量を定量した（図２１）。仁の
結果はインキュベート前の硫安分画物のコラダナーゼＩ
ｔ−同様の方法で定量したときのタン、ｗり質量を１０
０とし、それに対する相対量として表わしたＯｐＨ３および４でインキュベートしたときは、コラゲナ
ーゼが沈澱したので、コラゲナーゼ１の生成を定量する
ことはできなかった。図２１の結果より、　　ｐＨが低
下するほどコラゲナーゼ■の生成量と生成速度が高＜ｂ
ｐＨ５では１０時間でコラゲナーゼ！がなくなり、イン
キュベート前のコラゲナーゼ！のタン／リフ質量と同じ
量のコラゲナーゼＩが生成され、そのコラゲナーゼ１の
生成速度も最大となった。

またｐＨ５で精製したコラゲナーゼｉから生成された７
　４−９４　ＫＤａのタンパク質量図１６）は、この硫
安分画物をインキュベートしたときには観察されなかっ
た０同様にｐＨ５と６において、コラゲナーゼ■のみ含まれ
た硫安分画物ｉ３０’ｃで１００時間までインキュベー
トし、ＰＡＧＥによって。

コラゲナーゼ■の活性量とタン、Ｑり質量を分析した結
果を図２２に示した。この結果はｐＨ５で１００時間イ
ンキュベートしたときく生成されたコラゲナーゼ■のタ
ン、Ｑり質量と活性量ｆ、ｌｏｏとし、それに対する相
対量で表わした。

この結果より、ｐＨ５および６でコラゲナーゼ■のみを
含む硫安分画物（コラゲナーゼＩを含まない）のインキ
ュベートによって、コラゲナーゼＩがコラゲナーゼＩへ
変換することがわかった。また、生成されたコラゲナー
ゼ１の活性量とタンパク質量に相関性が見られた。

以上の結果より、コラゲナーゼ璽は生産菌フリー系にお
いても生成されることが示された０なお、これらの実験でコラゲナーゼ自体の影響を除去す
るために、ＥＤＴＡ　１０　ｍＭ　テコラグナーゼを阻
害してインキュベート’を行なったが、この条件ではコ
ラゲナーゼが沈澱し、分析することができなかった。

（３）　　コラゲナーゼ菖を生成する因子の検討標品の
コラゲナーゼ■の自己消化によってはコラゲナーゼ■の
生成は検出されなかったので、コラゲナーゼＩを生成す
る因子について検討した。また、精製したコラゲナーゼ
■からｐＨ１５で生成された７４−９４ＫＤａのタンパ
ク質ｔ−ｐＨ７％　３０℃で２０時間インキュベートし
てもコラゲナーゼ１の生成は観察されなかった。

各精製過程で得られたコラゲナーゼを含まない画分と標
品のコラゲナーゼＩとｐＨ５またはｐｉ（７６で３０”
Ｃｌ２Ｏ時間インキユヘートした。コラゲナーゼを含ま
ない両分としてＤＥＡＥ　−トヨノリールのカラムクロ
マトグラフィーで得られた、非吸着および０．２．ＩＭ
塩化ナトリウム溶出画分、セルロファインＣＣのカラム
クロマトグラフィーで得られたフラクション階７〜８．
１１〜１２画分を用いた。

ｐＨ’７６　においては、コラゲナーゼ■をコラゲナー
ゼを含まないどの画分とインキュベートしてもコラゲナ
ーゼ璽の生成は観察されなかった。また、インキュベー
ト時間を４０時間に延長してもコラゲナーゼ璽は生成さ
れなかった。

ｐＨ５においてはコラゲナーゼ！（図２３゜レーン１　
）　’ｉ　ＤＩＡＥ　−トヨノリールによル非吸着ＦＩ
Ｊ分（図２３．レーン３）、セルロファインＣＣによる
フラクションＮ１７〜８（図２３゜レーン６）および階
１１〜１２（図２３．レーン９）と３０℃、２０時間イ
ンキュベートした結果、それぞれコラゲナーゼＩ（図２
３、レーン２）の生成が観察され（図２３．レーン５．
８，１１）、コラゲナーゼ■はなくなり、インキュベー
ト前のコラゲナーゼ■のタンノリク質量と同量のコラゲ
ナーゼ厘が生成された。

また、コラゲナーゼ！の生成の見られた、コラゲナーゼ
を含まない画分だけをｐＨ５で同様にインキュベートし
てもコラゲナーゼは生成されてこなかった（図２３．レ
ーン４．７、１０）。

これより％　ｐＨ５においてコラゲナーゼ厘を生成する
因子はＤＩＡＩ　−）ヨ、Ｑ−ルのカラムクロマトグラ
フィーの非吸着画分とセルロファインＧＣのカラムクロ
マトグラフィーの非活性画分に含まれていることがわか
った。

これらコラゲナーゼ蔦ヲ生成させる両分にはカゼイン分
解活性が存在する。ＤＥＡＥ　−トヨ、Ｖ−ルによる非
吸着画分にはα１７μｍｏｌｔｙｒｏｓｉｎｅ　／　Ｒ
９ｐｒｏｔｅｌｎ　（Ｕ　／　１１９　）セルロファイ
ンＧＣによる２つの非活性画分にはそれぞれ０ｏ２６お
よびＱＯ２４Ｕ／■のカゼイン分解活性が含まれていた
。

このことから、ｐＨ５にお込でコラゲナーゼ１ｉ生成す
る因子は、カゼイン分解活性をもつ酵素による作用であ
ると推定された０そとで、１００℃、５分間の処理をし
たＤＥＡＥ　−）ヨパールの非吸着画分と精製したコラ
ゲナーゼ■または精製したコラゲナーゼＩからｐＨ５で
生成されたタン、Ｖり質（以下７４−９４　ＫＤａタン
パク質とした）と３０℃１１０時間インキュベートした
（図２４人）。

図２４人のレーン５はＤＥＡＥ　−）ヨノ髪−ル非吸着
画分２Ｘ１０−”Ｕ（レーン４）と標品のコラゲナーゼ
１２０μｆ（レーン１）を、レーン６は加熱処理した同
非吸着画分と標品のコラゲナーゼｌ　ｋ　ｐＨ５でイン
キュ悦−トシた結果で、レーン７および８はレーン５．
６同様に標品のコラゲナーゼ！の代わりに７４−９４　
ＫＤａタンパク質１ｏｕｒ（レーン３）を用いてｐＨ５
でインヤニベートした結果で、レーン９および１ｏはレ
ーン７．８同様にｐＨ７でインキュベートした結果であ
る。

この結果より、未処理のＤＥＡＥ　−トヨノリール非吸
着画分を用いた場合にはコラゲナーゼ冨（図２４Ａ、レ
ーン２）が生成されたが、加熱処理したＤＥＡＥ　−）
ヨ／リール非吸着画分ではコラゲナーゼ曹が生成されな
かった（図２４人、レーン６．８，１．０）ので、コラ
ゲナーゼ１を生成する因子は酵素による消化作用である
とわかった。またｐＨ７でその因子によシ精製したコラ
ゲナーゼ１からコラゲナーゼ璽が生成されないが、７４
−９４ＫＤａタン７Ｑり質からコラゲナーゼ１が生成さ
れることがわかった０（図２４Ａ、レーン１０）。

次にＭｌｃｒｏｂｌａｌ　ｍ＠ｔａｌｌｏｐｒＯｔ＠Ｉ
ｎａａｅａ（ＥＣ３，４，２４，４）のＳｔｒａｐｔｏ
ｒｎｙｃａｓｇｒ１ｃ＠ｕｓ中性ゾロテイナーゼである
ｏｆプロナーゼ（科研製薬）のコラゲナーゼ■からコラ
ダナーゼ厘ヲ生成する作用について検討した（図２４Ｂ
）０図２４Ｂのレーン５およびレーン６はプロナーゼＥ４ｘ
ｌＯ−”Ｕ　（レーン４）ｅｐＨ５および７で３０℃、
１０時間インキュベートしり結果で、レーン７およびレ
ーン８はプロナーゼＥ４Ｘ１０−”ＩＴと精製したコラ
ゲナーゼ１２０μｔ（レーン１）をｐＨ７および５で、
３０℃、１０時間インキュベートした結果で、レーン９
およびレーン１０はレーン７ｂｓ同様ＶＣｆ　ｏ　ｆ−
セＥ　４　Ｘ　１０−３Ｕと７４−９４ＫＤａタンパク
質１０μｔ（レース２）をインキュベートした結果であ
る。

このように、プロナーゼＥによってもｓ　　ｐＨ５にお
いてのみ、コラゲナーゼ■および７４−９４　ＫＤａタ
ンノリク質からコラゲナーゼＩ（図２４Ｂ、レーン３）
が生成されることがわかった。

〔発明の効果〕

本発明によってコラ−ダンに異常のある疾患に対して有
用なコラゲナーゼｌおよびｌを高収率、高純度で製造す
ることができる。またコラゲナーゼＩ、Ｉは、従来電気
泳動法によらなければ精製できなかったが、本発明によ
シ、電気泳動法を使用せず大量に高純度のものを製造す
ることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明によるコラゲナーゼの精製工程フローチ
ャートを示す図面である。図２はｂｆｆｊｌ々の栄養源
を用すた場合の培養時間とコラゲナーゼ活性の関係を示
す図面である。図３（１）および図３（２）は、ゼラチン又はフラミッ
クスｐ　（Ｆ−Ｐ）ｔ一種々の濃度で添加した場合の培
養時間とコラゲナーゼ活性との関係を示す図面である。図４は、ゼラチン又はフラミックスＰ添加培地で培養し
次場合の硫安分画物の？リアクリルアミドダル電気泳動
図である。図５は、クロラムフェニコール（５μｆ／Ｉ
ＩＬｌ）を添加して培養した場合のインキュベート時間
とコラゲナーゼ活性との関係を示す図面である。図６Ａ
および６Ｂは、クロラムフェニコール（５μ’　／　Ｒ
１）　ｆｉ’　ｓ加して１２時間インキュベートした場
合の電気泳動易動度とコラゲナーゼ活性との関係を示す
図面である。図７は、本発明の精製過程のうちＤＥＡＲ
−）　Ｈ／Ｖ−ルカラムクロマトグラフイーノ結果を示
す説明図であり、図８は同セルロファイ”／ＧＣ−２０
０−ｎａカラムクロマトグラフィーの結果を示す説明図
であり、図９は同Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ６／　５カラムク
ロマトグラフイーの結果を示す説明図である。図１ＯＡ
は本発明の種々の精製過程におけるＰＡＧＥ−電気泳動
図であり、図１０Ｂはその糖質染色図である。図１１は
本発明コラゲナーゼのＳＤＳ　−ＰＡＧＥ電気泳動図で
ある。図１２Ａは本発明コラゲナーゼのＰＨとコラゲナ
ーゼ活性との関係を示し、図１２１は、同温度とコラゲ
ナーゼ活性との関係を示す図面である。図１３は種々の
コラゲナーゼとコラゲナーゼ厘および厘を含む部分精製
物に対する抗血清との間のオフタロニー試験結果を示す
図面である。図１４はコラゲナーゼ１を種々のｐＨでイ
ンキュベートした試料の電気泳動図である。図１５はコ
ラゲナーゼ活性種々のｐＨでインキュベートした場合の
コラゲナーゼ活性の変化を示す図面である。図１６Ａは
、コラゲナーゼ１をｐＨ５で３０℃、２０時間インキュ
ベートした試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す図
面であシ、図１６Ｂはこれを活性染色した状態を示す図
である。図１７Ａはコラゲナーゼ厘をｐＨ７６，３０℃
でインキュベートした試料の電気泳動図を示し、図１７
Ｂは、そのインキュベート時間とコラゲナーゼ活性との
関係を示す図面であ＃）、図１８は同電気泳動易動度と
コラゲナーゼ活性との関係を示す図である。図１９は、コラゲナーゼ精製過程の硫安分画ｆ　ｐＨ７
ｆ３でインキュベートした場合のコラゲナーゼ活性の変
化、コラゲナーゼ■からコラゲナーゼ１への変換を示す
図面であり、図２０＾および２０Ｂは同インキュベート
Ｏ時間後および２０時間後の試料を電気泳動式せた場合
の易動度とコラゲナーゼ活性を示す図面である。図２１
および２２は硫安分画ｔ一種々のｐｇでインキュベート
した場合のインキュベーション時間とコラゲナーゼ■の
生成量を示す図面である。図２３は本発明コラグナーゼ
精裂過程における種々のフラクション中でコラゲナーゼ
ＩをＩＩＨＦＬｏ、３０℃にて２０時間インキュベート
した試料のＰＡＧＥ−電気泳動図である。図２４ＡはＤ
ＥＡＥ　−トミ／Ｑ−ル非吸着画分とコラゲナーゼ１又
は７４−９４ＫＤａ　ｔ−３０Ｔｌ：　、　１−０時間
インキュベートした試料の電気泳動図である。図２４Ｂ
はコラゲナーゼＩ又は７４−９４　ＫＤａ　ｔ−７’ロ
ナーゼＥ処理した試料の電気泳動図である。以上図１培養Ｐ液を限外濾過蓼図２Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（ｈ）図３（１）Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　　ｔｉｍｅ　（ｈ　）図３（
２）Ｃｕｌｊｉｖａｔｌｏｎ　　ｔｉｍｅ　（ｈ　）図面の
浄書図４Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｌ　−＋　−−ＩＩＩＺＩＺ
Ｉ　　ｍａｌＺＱ（ｏｌｌａｃ＋ｅｎａｓｅ　ｌｌ　→
口ＬＺＥｉ２１　　　　口ｅＨＩｍニー　　　＝ゆ圀ご＝　口；；図５ｒｎｃｕｂａｔｉｏｎ　　ｔｉｍｅ　（ｈ）図面の浄書図６人Ｒｅ１ａｔｉｖｅ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ葭１面の浄占図６ＢＲｅｌａｔｉｖｅ　　ｎｏｂｉｌｉｔｙ図８Ｆｒａｃｔｉｏｎ　　　：　　↓５　ｍエフｔｕｂｅ出
ムレ）浄書図１０Ａ　　　　　　　図１０ｆｌＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ５１ＩＷ
Ｊの浄書図１１！９５１−　口＄Ｇ＆−ｍ５ｓ４５電−＝！ｈ−− 図１２ＡＨ図１２Ｂ −フＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　（’Ｃ）図面の浄書図１３（ＲＩ　　Ａｒｔｉｓｅｒｕｍ　　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　
　ａｇａｉｎｓｔ　　ｐａｒｔｉａｌｌｙ　　ｐｕｒｉ
ｆｉｅｄ益二上駁哩！二！ＩＰ、　Ｃ−５１ｃｏｌｌａ
ｇｅｎａｓｅ（八ｌ　　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＣｏＬｌａ
ｇｅｎａｓａ　　工ＩＪ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｃｏｌｌ
ａｇＣｏｌｌａ　Ｘ工１９１　Ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｐ
ｕｒｉｆｉｅｄ　５　ｓｐ、　Ｃ−５１ｃｏｌｌａＣ−
５１ｃｏｌｌａ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｌｕｍ　ｈｉｓｔｏ江ｈｉｃ
ｕｍ　ｃｏｌｌａｇ＠ｎａｓ！ｔｖ）　Ａｃｈｒｏｍｏ
ｂａｃｔｅｒ　７　ｃｏｌｌａｇｓｎａｓ＠図面の浄書図１４＝　　　　　　　　　　　　　　じコ　ぼＳ　心コ　ロ
　９図１５ｔ−ｔへ盾のｒＰ書国璽の浄書Ａ　　　　　　　　　図１７Ａ＝ Φ 石Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　　ｔｉｍｅ　　（ｈ）図１８０　　　　　０．２　　　　　０．４　　　　　０．６
１．０Ｒｅｌａｔｉｖｅ　　ｍｏｂｉｌｉｔｙ図１９Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　　ｔｉｍｅ　（ｈ）図面の浄書
・図２ＱＡ０　　　０．２　　０．４　　０．６　　０．８　　１
．０Ｒｅｌａｔｉｖｅ　　ｍｏｂｉｌｉｊｙ３５−７５
％　（ＮＨｋｋ）２ＳＯ，ｐｐｔ−ｉ＋１ｃｕｂａｔｅ
ｄ　ｆｏｒ　Ｏｂ図面の浄書図２０１１Ｒｅｌａｔｉｖｅ　　ｍｏｂｉｌｉｔｙ：１５−７５％
　　１ＮＨＪｚｓＯｂ　　ｐｐｌ＝、　　１ｎｃｕｂａ
ｔｅｄ　　ｔ’ｏｒ　　２０　　Ｉｔ　　ａヒ　ｐＨ７
，６ａ七　３０１０図２１１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（ｈ）図２２Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　　ｔｉｍｅ　（ｈ）図面のｒｔ
＃書図２３区区田口　蓼Σツｍ　　　　　　ｍｌ　　　　　　　−ロロ　　　　Ｄコ心コ　　　　＝＝　匠コ ζロ＝悶ロ；　Ｅ母印Ｃ公８コ１　α＝口心緊Ｓ −３；−にコ　ロにコ＾ｂＡｊの／７）’ｉ：ｐ図２４Ａ１　　２　　３　４　　５　　６　７　　　ｅ　　　９
　１０ｅ　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　□
　　　　＝２曙ロー　　　　ロー　　　品−″″′こコ０ん渓・パ２）！３’、：）′ 図２４Ｂき萱　　　　　　　　　　　　　　　　ロＣコ＝フ手続補正書（方式）％式％１、　事件の表示昭和６２年特　許　　願第５３７６６号２、発明の名称コラ２ナーゼ■及び■の製造法３、　補正をする者事件との関係　　　出願人住所（名　称ン氏名　遠藤　章４、代理人′ ＆　補正の対象図　　　面７、　補正の内容（１）図４、図６Ａ、図６Ｂ、図１０Ａ１図１０Ｂ１図
１１、図１３、図１４、図１６Ａ１図１６Ｂ１図１７Ａ
１図２ＯＡ１図２０Ｂ１図２３、図２４Ａおよび図２４
Ｂを別紙の通り訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】１、ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ生産菌を
培養し、その培養物からコラゲナーゼ I 及びIIを採取
することを特徴とするコラゲナーゼ I 及びIIの製造法
。２、ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ生産菌を
培養し、その培養物をｐＨ８未満でインキュベートする
ことによりコラゲナーゼ I をコラゲナーゼIIに変換せ
しめることを特徴とするコラゲナーゼIIの製造法。