DE4423724A1

DE4423724A1 - Kinetisch kontrolliertes Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE4423724A1
Application number: DE4423724A
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Prof Dr Jakubke; Herbert Prof Dr Waldmann; Karlheinz Prof Dr Drauz; Andreas Dr Bommarius; Marion Dr Haensler
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1996-01-11
Also published as: JPH10502258A; EP0769066A1; WO1996001906A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden.

Insbesondere richtet sich die Erfindung auf eine kinetisch kontrollierte Peptidsynthese unter Verwendung von Enzymen, bei der vollgeschützte Aminosäuren oder Peptide der Formel I

X-NH-A¹-CO-Y′ (I),

worin X und Y′ jeweils eine Schutzgruppe und A¹ einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten,
mit
Y-geschützten Aminosäuren oder Peptiden der Formel II

H₂N-A²-CO-Y (II),

worin Y eine von Y′ verschiedene Schutzgruppe und A² einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten,
in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Biokatalysators zum vollgeschützten Peptid der Formel III

X-NH-A¹-CO-NH-A²-CO-Y (III),

umgesetzt werden.

In den letzten Jahren erlangten enzymatische Transformationen in der organischen Chemie zunehmendes Interesse, da sie sich vor allem durch milde Reaktionsbedingungen sowie die ausgeprägte stereo-, regio- und chemoselektive Wirkungsweise der Biokatalysatoren auszeichnen. Insbesondere für die Synthese von Peptiden und empfindlichen, komplexen Peptidkonjugaten eröffnen enzymatische Umsetzungen neue vorteilhafte Möglichkeiten (H. Waldmann et al, J. Prakt. Chem. 1993, 335, 109; H. Waldmann et al, Chem. Rev., im Druck; V. Schellenberger et al, Angew. Chem. 1991, 103, 1440; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1437; H.-D. Jakubke in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bd. 9 (Hrsg.: J. Meienhofer), Academic Press, New York, 1987, S. 103). So haben sich z. B. die Ablösung der N-terminalen Phenylacetamido-(PhAc)-Schutzgruppe durch Penicillin G-Acylase (H. Waldmann, Liebigs Ann. Chem. 1988, 1175) und die Abspaltung der C-terminalen Heptyl-(Hep)-ester durch Lipasen (P. Braun et al, Liebigs Ann. Chem. 1991, 165; P. Braun et al, Bioorg. Med. Chem. 1993, 1, 197) als leistungsfähige Verfahren für die Synthese von Peptiden und Glycopeptiden erwiesen und mit der Protease-vermittelten Peptidsynthese in Eis (M. Schuster et al, Tetrahedron 1990, 46, 8093; M. Schuster et al, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 5701) wurde eine neue effiziente Methode für die racemisierungsfreie Verknüpfung von Aminosäuren und Peptiden gefunden.

Die Einsetzbarkeit enzymatischer Umsetzungen in der Peptidchemie wird jedoch oftmals durch die Schwerlöslichkeit der blockierten Peptide unter den verwendeten wäßrigen Reaktionsbedingungen und die dadurch verursachte mangelnde Zugänglichkeit der Substrate für die Biokatalysatoren erschwert oder gar vollständig verhindert. Diese Schwierigkeit kann durch Verwendung löslichkeitsvermittelnder Schutzgruppen überwunden werden (A. Fischer et al, Biomed. Biochim. Acta 1991, 50, 169; H. Kunz et al, Angew. Chem. 1994, 106, 353; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994; 33; H. Meos et al, Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1559). Die Ablösung der hierfür bislang herangezogenen Funktionalitäten erfordert jedoch oft Bedingungen, die deren Anwendung bei der Synthese empfindlicher polyfunktioneller Verbindungen, wie z. B. komplexer Peptidkonjugate, ausschließt. So wurde z. B. das Dipeptid H-Tyr-Arg-OH (Kyotorphin) unter Verwendung der löslichkeitsvermittelnden N-terminalen Maleylamidofunktion durch Chymotrypsin-vermittelte Knüpfung der Peptidbindung mit ca. 50%iger Gesamtausbeute im 12 kg-Maßstab aufgebaut, die abschließende Deblockierung mußte jedoch als Hydrolyse in schwefelsaurer Lösung bei pH 0 durchgeführt werden (A. Fischer et al, Biomed. Biochim. Acta 1991, 50, 169). Durch Chymotrypsin-katalysierte Umsetzung von H-Tyr-OEt mit freiem Arginin bei -18°C in Eis läßt sich die Kyotorphin- Synthese mit einer Ausbeute von über 80% entscheidend vereinfachen (H. Meos et al, Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1559).

Andererseits besteht ein wachsender Bedarf an Schutzgruppen in der Peptidsynthese, die gleichzeitig eine gute Abgangsgruppe für die Knüpfung einer Peptidbindung darstellen und außerdem relativ einfach zu handhaben sind.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von Peptiden in hoher Ausbeute und Selektivität, das die enzymatische Umsetzung einer möglichst hohen Zahl verschiedener Substrate unter katalytischer Einwirkung von einer Vielzahl verschiedener Biokatalysatoren ermöglicht.

Gelöst werden die vorstehenden sowie weitere nicht näher angegebene Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Ansprüchen unter Schutz gestellt.

Dadurch, daß in einem Verfahren der eingangs erwähnten Gattung als Schutzgruppe Y′ Cholin oder eines seiner Salze und als Biokatalysator ein die Spaltung der Cholinesterbindung X-NH-A¹-CO-Y′ und die Übertragung des Acylrestes X-NH-A¹-CO- auf die Verbindung der Formel (II) katalysierendes Enzym verwendet wird, gelingt es vorteilhaft, eine löslichkeitsvermittelnde Eigenschaft der Cholinester bei der enzymatischen Peptidsynthese mit andererseits einer effizienten Acyldonor-Eigenschaft der Cholinester-Verbindungen für die biokatalysierte Knüpfung von Peptidbindungen zu kombinieren.

Cholinester sind weit verbreitete Biomoleküle und an sich bekannt. Darüber hinaus hat es auch schon Untersuchungen zum Einsatz von Cholinester-Verbindungen als Substrat für die Hydrolyse mittels α-Chymotrypsin gegeben (Schellenberger et al, Collection Czechoslovak Chem. Commun., Vol. 53, S. 2884f (1988)), wobei für den Cholinester des Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanins (Z-Phe- OChO) eine hohe kinetische Konstante in der α-Chymotrypsin katalysierten Acyldonor-Reaktion ermittelt wurde, es wurde jedoch nur die Hydrolyse-Reaktion durchgeführt.

Zu den im Rahmen der Erfindung vollgeschützten nützlichen Verbindungen der Formel (I) gehören alle Cholinester mit X-geschützten Aminosäuren oder Peptiden oder deren Salze. In Frage kommen u. a. Cholinesterchlorid, -bromid, -hydrogentartrat, -hydrogencitrat, -ascorbat, -hydrogenbromid; besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß das Cholinesterhydrogenbromid.

Die Verbindungen der Formel (I) sind nach dem Fachmann geläufigen Verfahren erhältlich. Beispielhafte Synthesen werden bei H. Kunz und M. Buchholz, Chem. Ber., 1979, 112, 2145, wiedergegeben. Zum Schutz des N-terminalen Endes wurden bekannte Schutzgruppen X verwendet. Hierzu gehören die Z-Gruppe (Benzyloxycarbonyl), die Boc-Gruppe (t-Butyloxycarbonyl) und verschiedene andere Acyl-Gruppen (Acetyl, Phenacetyl, Formyl).

Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannte Y-geschützte Aminosäuren oder Peptide. Als beispielhafte Y-Schutzgruppen seien in nicht vollständiger Aufzählung z. B. Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Nitrobenzyl- , tert.-Butyl, Amid u. a. genannt. Bevorzugt sind für die Erfindung der Ethyl oder Benzylrest oder die Amidgruppe.

Auch die Verbindungen der Formel (II) sind nach literaturbekannten Verfahren erhältlich. Hilfreiche Hinweise kann man dem Organikum, VEB-Verlag, 8. Aufl., 1968, entnehmen.

Zu den mit Vorteil im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Biokatalysatoren gehören eine große Vielzahl unterschiedlicher Esterasen oder auch Serin- oder Thiol-Proteasen.

U.a. sind in diesem Zusammenhang Cholin-Esterasen und Proteasen, wie z. B. Chymotrypsin, Papain, Trypsin, Subtilopeptidase A, Nagarse und Proteinase K erfindungsgemäß von hohem Interesse. Ganz besonders bevorzugte Biokatalysatoren sind α-Chymotrypsin und/oder Trypsin.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Peptidherstellung läßt sich äußerst vorteilhaft im wäßrigen Medium durchführen. Hierunter ist entweder im wesentlichen reines Wasser zu verstehen oder Wasser, das ggf. Zusätze von weniger polaren Lösungsmitteln, wie C₁-C₄-Alkoholen in Mengen bis zu 50 Gew.-%, aufweisen kann.

In besonders bevorzugter Ausführungsform kennzeichnet sich das Verfahren der Erfindung dadurch, daß eine auf Temperaturen 10°C, bevorzugt etwa 0°C, vorgekühlte wäßrige Lösung der Verbindung der Formel (I) (Acyldonor) zu einer, die Verbindung der Formel (II) (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthaltenden wäßrigen Lösung, die bevorzugt ebenfalls auf etwa 0°C vorgekühlt ist, so zugegeben wird, daß über den Zugabezeitraum ständig ein Überschuß an Verbindung der Formel (II) gewährleistet ist.

Hierdurch gelingt es besonders vorteilhaft, eine möglicherweise zu beobachtende, jedoch unerwünschte, konkurrierende Hydrolyse des Cholinesters zurückzudrängen.

Bevorzugt wird dabei so vorgegangen, daß eine auf 0°C vorgekühlte Lösung des Acyldonors langsam zu einer ebenfalls eisgekühlten Lösung (pH 7.8), die den Acylakzeptor und den Biokatalysator enthält, zugetropft wird, so daß ein Überschuß an Nucleophil gewährleistet wird.

Die Knüpfung der Peptidbindung durch die Protease erfolgt im allgemeinen sehr rasch, bereits nach etwa 30 min können u. U. die ausgefallenen Peptide in analytisch reiner Form mit Ausbeuten von 60-82% isoliert werden.

Üblicherweise werden die Cholinester getrennt von der enzymatischen Reaktion synthetisiert und dann als Ausgangsverbindung der Formel I im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Sie können jedoch auch zusammen mit der Peptidsynthese aus entsprechenden Vorstufen hergestellt werden.

Daher kennzeichnet sich das Verfahren der Erfindung in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform dadurch, daß die Verbindung der Formel I in situ aus einer Verbindung der Formel IV

X-NH-A¹-CO-OEt-Hal (IV),

worin X und A¹ die bei Formel I angegebene Bedeutung besitzen und OEt-Hal für die Chlor-, Brom- oder Jodethylestergruppe steht, besonders bevorzugt aber für die Bromethylestergruppe, und Trimethylamin hergestellt wird, wobei bevorzugt das Trimethylamin zu einer wäßrigen Lösung, die die Verbindung der Formel IV, den Biokatalysator sowie die Verbindung der Formel II enthält, zugegeben wird.

Dadurch, daß zu einer wäßrigen Lösung, welche den der Verbindung der Formel I (Acyldonor) entsprechenden Halogenethylester, besonders bevorzugt Bromethylester, die Verbindung der Formel II (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthält, eine bevorzugt gekühlte wäßrige Trimethylamin-Lösung so zugegeben wird, daß die Menge an Trimethylamin gerade zur in-situ-Bildung des dem Halogenethylester entsprechenden Cholinesters ausreicht, der dann enzymatisch zum geschützten Dipeptid reagiert, also durch die "in-situ-Bildung" des Cholinesters, wird die getrennte Synthese des Cholinesters vor der enzymatischen Reaktion überflüssig, die gute Reaktivität des Cholinesters als Verbindung der Formel I (Acyldonor) aber ausgenutzt.

Zusammenfassend hat die Erfindung damit eine praktikable Methode zur Nutzung der Cholinester-Gruppe zum C-Schutz für die enzymatische Peptidsynthese zur Verfügung gestellt.

Weiter wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele erläutert.

Beispiele

Zur Untersuchung der Substrateigenschaften der Cholinester, die durch die ermittelte P₁-Spezifität des Chymotrypsins für positiv geladene Reste und durch den Coulomb-Effekt der positiven Ladung, der eine erhöhte Reaktivität der Cholinesterbindung bedingt, verursacht werden, werden Cholinester als Carboxylkomponenten für kinetisch kontrollierte Peptidsynthesen eingesetzt. Als Substrate werden Z-Phe-OCh⁺Br^- und Z-Leu-Gly-OCh⁺Br^- (Z = Benzyloxycarbonyl, Ch = Cholin) eingesetzt, die aufgrund der unterschiedlichen Primärspezifität enzymatische Kupplungen mit verschiedenen Proteasen ermöglichen.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der enzymkatalysierten Synthese von Z-Phe-Leu-NH₂ ausgehend vom entsprechenden Cholinester und Leucinamid (NH₂-Leu-CO-NH₂, Y = NH₂) als Nucleophil. Sowohl mit α-Chyrnotrypsin als auch mit Trypsin konnten unter präparativen Reaktionsbedingungen ohne weitgehend Optimierung gute Peptidausbeuten erzielt werden.

Insbesondere im Fall von Chymotrypsin war es vorteilhaft, durch Vorkühlung und insbesondere durch die tropfenweise Esterzugabe aufgrund des dadurch manipulierten sehr hohen Nucleophilüberschusses eine mögliche, unerwünschte Esterhydrolyse zurückzudrängen. Durch die Produktausfällung ist die Aufarbeitung sehr einfach. Wie auch anderweitig nachgewiesen, akzeptiert Trypsin aromatisch Aminosäurereste in P₁-Position.

Sehr überraschend ist ohne Zweifel der Befund, daß auch Butyrylcholinesterase in der Lage ist, die Knüpfung von Peptidbindungen zu katalysieren. Im gefrorenen wäßrigen System konnten signifikante Produktbildungsraten in Abhängigkeit von der eingesetzten Enzymkonzentration erzielt werden. Offenbar wird ein aromatischer Rest in P₁ weniger gut akzeptiert, da bei der Umsetzung von Z-Leu-Gly- OCh⁺Br^- eine Ausbeuteverdoppelung resultiert. Der sehr hohe Anteil des nicht umgesetzten Esters nach relativ langen Reaktionszeiten belegt, daß bei -15°C die Umsetzung recht langsam verläuft.

Tabelle 1

Proteasekatalysierte Synthesen unter Einsatz von Z-Phe-OCh⁺Br^- als Carboxylkomponente und NH₂-Leu-CO-NH₂ als Aminokomponente

Die Chymotrypsin-katalysierte Synthese von Z-Phe-Arg-NH₂ verlief aufgrund der P₁-Spezifität sehr gut. Interessanterweise konnte der Cholinester auch in guten Ausbeuten mit Aminosäurebenzylestern verknüpft werden, so daß auf diese Weise Dipeptidderivate resultieren, die beispielsweise für weiterführende papainkatalysierte Segmentverknüpfungen Bedeutung haben. Die sehr gute Akzeptanz von Z-Leu-Gly-OCh⁺Br^- für Papain wird durch eine Produktausbeute von 90% bei der Umsetzung mit Leucinamid unterstrichen.

Die durchgeführten Untersuchungen belegen, daß Cholinester für kinetisch kontrollierte Peptidsynthesen gut geeignete Carboxykomponenten sind. Die solubilisierende Wirkung der Abgangsgruppe ermöglicht Reaktionsführungen im wäßrigen Reaktionsmedium mit dem Vorteil der Produktpräzipitation bei entsprechender Reaktantenwahl.

Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind kommerzielle Enzympräparationen, bei deren erster Nennung jeweils die Bezugquelle angegeben ist.

Beispiel 1 Synthese von Z-Phe-Leu-NH₂ a) mit α-Chymotrypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)

0.26 g (2 mmol) H-Leu-NH₂ (= NH₂-Leu-CO-NH₂) werden in 5.5 ml Wasser gelöst und im Eisbad vorgekühlt. Nach Zugabe einer vorgekühlten Lösung von 7.5 mg α-Chymotrypsin in 2 ml Wasser wird die Lösung gerührt und innerhalb von etwa 3 min tropfenweise mit einer auf 0°C vorgekühlten Lösung von 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh⁺Br^- versetzt. Das ausgefallene Produkt wird 30 min nach Beendigung der Esterzugabe abgesaugt, dreimal mit Wasser auf der Fritte gewaschen und i. Vak. getrocknet. Das Rohprodukt wird aus Methanol/Wasser umgefällt.
Ausb.: 0.336 g (81.6% d. Th.)
Fp. 189-193°C; MS(FAB) 412(M+1)
HPLC-einheitlich (Acetonitril/Wasser (40/60, v/v, 0.1% TFA)).

b) mit Trypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)

Wie im Beispiel 1a, jedoch mit 7.5 mg Trypsin.
Ausb. 0.298 g (72.2% d. Th.) umgefällt aus Methanol/Wasser
Fp. 193-195°C
HPCL-einheitlich (vgl. 1a).

c) mit Butyrylcholinesterase (Handelsprodukt der Firma Sigma)

1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM Z-Phe-OCh⁺Br^-, 50 mM H-Leu-NH₂ und 4 µm Butyrylcholinesterase ergeben bei -15°C im gefrorenen wäßrigen System nach einer Reaktionszeit von 216 h bei nicht umgesetzten Esteranteil von 43.3% eine Ausbeute an Produkt von 9.5% d. Th.

Mit 20 µM Bytyrylcholinesterase wurden nach 120 h 17.2% Z-Phe-Leu-NH₂ erhalten (Ester: 13.8%, ZPhe-OH: 68.9).

d) mit Subtilopeptidase A (Handelsprodukt der Firma Boehringer)

1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM Z-Phe-OCh⁺Br^-, 50 mM H-Leu-NH₂ und 0.03 µM Subtilopeptidase A ergeben bei -15°C im gefrorenen wäßrigen System nach einer Reaktionszeit von 30 h und vollständigem Esterverbrauch eine Peptidausbeute von 29% (bei Raumtemperatur betrug nach 1 h und bei vollständigem Esterverbrauch die Peptidausbeute 3.5%).

e) mit Nagarse (Handelsprodukt der Firma Sigma)

Unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen wie im Beispiel 1d) betrug die Peptidausbeute nach 30 h bei einer Enzymkonzentration im Reaktionsansatz von 0.03 µM 29.5% d.Th. (Ester: 14.7%), während bei Raumtemperatur nach 1 h und vollständigem Esterverbrauch die Peptidausbeute nur 5.3% betrug.

f) mit Proteinase K (Handelsprodukt der Firma Boehringer)

Unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen wie im Beispiel 1d) betrug die Peptidausbeute nach 30 h bei einer Enzymkonzentration von 0.06 µM im Reaktionsansatz und vollständigem Esterverbrauch 31.1% d. Th., während bei Raumtemperatur nach 4 h die Peptidausbeute nur 5.1% betrug.

Beispiel 2 a) mit Papain (Handelsprodukt der Firma Merck) Synthese von Z-Leu-Gly-Leu-NH₂

Zu 600 µl einer Lösung von 54.2 mg H-Leu-NH₂ in 5 ml Wasser (mit 1/10 M HCl auf pH 7.8 gebracht) werden 200 µl einer Lösung von 5.25 mg Papain in 50 ml 5 mM Dithiothreitol gegeben. Nach Zugabe von 200 µl einer Lösung von 9.76 mg Z-Leu-Gly-OCh⁺Br^- in 2 ml Wasser wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1 h wird die Reaktionslösung mit 3 ml 2.5 proz. Trifluoressigsäure/Acetonitril (1 : 1, v/v) versetzt. Die Ausbeute wird HPLC-analytisch bestimmt und beträgt 90% d. Th.

b) mit Butyrylcholinesterase

1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM Z-Leu-Gly-OCh⁺Br^-, 50 mM H-Leu-NH₂ und 20 µM Butyrylcholinesterase ergeben im gefrorenen wäßrigen System bei -15°C eine Peptidproduktausbeute von 36.4% d. Th. (Ester: 47.7%, Z-Leu-Gly-OH: 15.9%).

Mit 4 µM Enzym wurden unter den gleichen Bedingungen nach 72 h nur 23.2% Peptid erhalten (Ester: 70.3%; Z-Leu-Gly- OH: 6.5%).

Beispiel 3 Synthese von Z-Phe-Arg-NH₂

Zu 600 µl einer Lösung von 18.5 mg H-Arg-NH₂ in 5 ml Wasser (mit 1/10 M HCl auf pH 7.8 gebracht) werden 200 µl einer Lösung von 5 mg α-Chymotrypsin in 1 l Wasser gegeben. Nach Zugabe von 200 µl einer Lösung von 23.25 mg Z-Phe-OCh⁺Br^- in 5 ml Wasser wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 30 min wird die Reaktionslösung mit 3 ml 2.5 proz. TFA/AcN (1 : 1,v/v) versetzt. Die Ausbeute wird HPLC-analytisch bestimmt und beträgt 86% d. Th.

Beispiel 4 Synthese von Z-Phe-Ala-OBzl

0.703 g (2 mmol) H-Ala-OBzl_*p-Tos werden in wenig Wasser gelöst, mit 2 M NaOH wird der pH auf 7.5 gebracht und danach auf 5 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 5 mg α-Chymotrypsin, gelöst in 1 ml Wasser, werden 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh⁺Br^-, gelöst in 4 ml Wasser, langsam zugetropft. Das während der Reaktion ausfallende Peptidderivat wird nach 30 min abgetrennt, auf der Fritte 1× mit Wasser, dreimal mit ges. NaHCO₃-Lösung und 1× mit Wasser gewaschen und i. Vak. getrocknet.
Ausb. 0.277 g (60% d. Th)
Fp. 130-132°C
MS(FAB) 461 (M+1)
HPLC-einheitlich in Acetonitril/Wasser/TFA (60 : 40 : 0.1).

Beispiel 5 Synthese von Z-Phe-Gly-OBzl

Wie im Beispiel 4 werden 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh⁺Br^- und 0.675 g (2 mmol) H-Gly-OBzl_*p-Tos bei pH 7.5 mit 5 mg α-Chymotrypsin umgesetzt.
Ausb. 0.71 g (60.7% d. Th.)
Fp. 127-129°C
HPLC-einheitlich (vgl. Beispiel 4).

Beispiel 6 In-situ Darstellung von Z-Phe-Leu-NH₂ mit α-Chymotrypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)

0.26 g (2 mmol) H-Leu-NH₂ und 0.390 g (1 mmol) Z-Phe-OEtBr werden in 5.5 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe einer Lösung von 7.5 mg α-Chymotrypsin in 2 ml Wasser wird die Lösung gerührt und innerhalb von etwa 10 min mit einer gekühlten wäßrigen Lösung von 1 mmol Trimethylamin versetzt. Das ausgefallene Produkt wird 30 min nach Beendigung der Trimethylamin-Zugabe abgesaugt, dreimal mit Wasser auf der Fritte gewaschen und i. Vak. getrocknet. Das Rohprodukt wird aus Methanol/Wasser umgefällt.
Ausb.: 0.305 g (74.1% d. Th.)
Fp. 189-192°C; MS (FAB) 412 (M+1)
HPLC einheitlich (Acetonitril/Wasser (40/60, v/v 0.1% TFA)).

Weitere Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Patentansprüchen.

Claims

1. Kinetisch kontrolliertes Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Peptiden, bei dem vollgeschützte Aminosäuren oder Peptide der Formel I X-NH-A¹-CO-Y′ (I),worin X und Y′ jeweils eine Schutzgruppe und A¹ einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten, mit Y-geschützten Aminosäuren oder Peptiden der Formel IIH₂N-A²-CO-Y (II),worin Y eine von Y′ verschiedene Schutzgruppe und A² einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten,
in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Biokatalysators X zum vollgeschützten Peptid der Formel IIIX-NH-A¹-CO-NH-A²-CO-Y (III),umgesetzt werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Schutzgruppe Y′ Cholin oder eines seiner Salze und als Biokatalysator ein die Spaltung der Cholinesterbindung X-NH-A¹-CO-Y′ und die Übertragung des Acylrest X-NH-A¹-CO- auf die Verbindung der Formel (II) katalysierendes Enzym verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung im wäßrigen Medium durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine auf Temperaturen 10°C, bevorzugt etwa 0°C, vorgekühlte wäßrige Lösung der Verbindung der Formel (I) (Acyldonor) zu einer, die Verbindung der Formel (II) (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthaltenden wäßrigen Lösung, die bevorzugt ebenfalls auf etwa 0°C vorgekühlt ist, so zugegeben wird, daß während der gesamten Zugabedauer ein Überschuß an Verbindung der Formel (II) gewährleistet ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I in situ aus einer Verbindung der Formel IV X-NH-A¹-CO-OEt-Hal (IV),worin X und A¹ die bei Formel I angegebene Bedeutung besitzen und OEt-Hal für die Chlor-, Brom- oder Jodethylestergruppe steht, besonders bevorzugt für die Bromethylestergruppe, und Trimethylamin hergestellt wird, wobei das Trimethylamin, bevorzugt in wäßriger gekühlter Lösung, zu einer, bevorzugt gekühlten wäßrigen Lösung, welche die Verbindungen der Formel II und IV und den Biokatalysator enthält, zugegeben wird.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysator eine Protease verwendet wird, welche die selektive Übertragung des Acylrests von Aminosäurecholinestern auf N-Nucleophile der Formel (II) gestattet und keine störende Proteaseaktivität zeigt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysator α-Chymotrypsin, Trypsin, Subtilopeptidase A, Nagarase, Proteinase K, Papain und/oder Butyrylcholin-Esterase verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysator α-Chymotrypsin und/oder Trypsin verwendet werden.