WO1996001906A1 - Kinetisch kontrolliertes verfahren zur enzymatischen herstellung von peptiden - Google Patents

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WO1996001906A1
WO1996001906A1 PCT/EP1995/002655 EP9502655W WO9601906A1 WO 1996001906 A1 WO1996001906 A1 WO 1996001906A1 EP 9502655 W EP9502655 W EP 9502655W WO 9601906 A1 WO9601906 A1 WO 9601906A1
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biocatalyst
choline
compound
peptides
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PCT/EP1995/002655
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Hans-Dieter Jakubke
Marion HÄNSLER
Herbert Waldmann
Karlheinz Drauz
Andreas Bommarius
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Degussa Aktiengesellschaft
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/062—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha- or omega-carboxy functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing peptides.
  • the invention is directed to a kinetically controlled peptide synthesis using enzymes, in which fully protected amino acids or peptides of the formula I
  • Y is a protecting group other than Y 'and A 2 is a
  • the object of the invention is therefore to provide a further process for the preparation of peptides in high yield and selectivity, which enables the enzymatic conversion of as many different substrates as possible under the catalytic action of a large number of different biocatalysts.
  • Choline esters are widespread biomolecules and are known per se. In addition, there have also been investigations into the use of choline ester compounds as substrates for the hydrolysis using ⁇ -chymotrypsin
  • Useful compounds of the formula (I) which are fully protected in the context of the invention include all choline esters with X-protected amino acids or peptides or their salts. Possible u. a. Choline ester chloride, bromide, hydrogen tartra, hydrogen citra, ascorbate, hydrogen bromide; Choline ester hydrogen bromide is particularly preferred according to the invention.
  • the compounds of the formula (I) can be obtained by processes familiar to the person skilled in the art. Exemplary syntheses are in H. Kunz and M. Buchholz, Chem. Ber. , 1979, 112, 2145.
  • Known protecting groups X were used to protect the N-terminal end. These include the Z group (benzyloxycarbonyl), the Boc group (t-butyloxycarbonyl) and various other acyl groups (acetyl, phenacetyl, formyl).
  • the compounds of formula (II) are known Y-protected amino acids or peptides.
  • Exemplary Y-protecting groups are in a non-exhaustive list e.g. B. methyl, ethyl, benzyl, nitrobenzyl, tert-butyl, amide and others called.
  • the ethyl or benzyl radical or the amide group are preferred for the invention.
  • the compounds of the formula (II) can also be obtained by processes known from the literature. Helpful hints can be found in the Organikum, VEB-Verlag, 8th ed., 1968.
  • biocatalysts which can advantageously be used in the process according to the invention include a large number of different esterases or else serine or thiol proteases.
  • choline esterases and proteases such as. B. chymotrypsin, papain, trypsin, subtilopeptidase A, Nagarse and proteinase K according to the invention of great interest.
  • biocatalysts are ⁇ -chymotrypsin and / or trypsin.
  • the process according to the invention for peptide production can be carried out extremely advantageously in an aqueous medium.
  • aqueous medium This is to be understood as either essentially pure water or water, which may have additions of less polar solvents, such as C1-C4 alcohols, in amounts of up to 50% by weight.
  • the process of the invention is characterized in that an aqueous solution of the compound of the formula (I) (acyl donor) precooled to temperatures ⁇ 10 ° C., preferably about 0 ° C., to give the compound of the formula (II) (Acyl acceptor) and the biocatalyst-containing aqueous solution, which is preferably likewise pre-cooled to about 0 ° C., is added in such a way that an excess of the compound of the formula (II) is constantly guaranteed over the addition period.
  • the procedure is preferably such that a solution of the acyl donor precooled to 0 ° C. is slowly added dropwise to a likewise ice-cooled solution (pH 7.8) which contains the acyl acceptor and the biocatalyst, so that an excess of nucleophile is ensured.
  • the peptide bond is usually linked very quickly by the protease.
  • U. the precipitated peptides can be isolated in analytically pure form with yields of 60-82%.
  • the choline esters are usually synthesized separately from the enzymatic reaction and then used as the starting compound of the formula I in the process according to the invention. However, they can also be prepared together with the peptide synthesis from corresponding precursors.
  • X and A 1 have the meaning given for formula I and OEt-Hal stands for the chlorine, bromine or iodoethyl ester group, but particularly preferably for the bromoethyl ester group, and trimethylamine is prepared, preferably the trimethylamine to an aqueous solution which Compound of formula IV containing the biocatalyst and the compound of formula II is added.
  • Compound of formula I (acyl donor) corresponding halogen ethyl ester, particularly preferably bromoethyl ester, the compound of formula II (acyl acceptor) and Biocatalyst contains, preferably a cooled aqueous trimethylamine solution is added so that the amount of trimethylamine is just sufficient for the in-situ formation of the choline ester corresponding to the haloethyl ester, which then reacts enzymatically to the protected dipeptide, that is, by the "in-situ formation "of the choline ester, the separate synthesis of the choline ester before the enzymatic reaction is superfluous, but the good reactivity of the choline ester as a compound of the formula I (acyl donor) is exploited.
  • choline esters are used as carboxyl components for kinetically controlled peptide synthesis.
  • choline esters are well suited carboxy components for kinetically controlled peptide synthesis.
  • the solubilizing effect of the leaving group enables reactions to be carried out in the aqueous reaction medium with the advantage of product precipitation with a corresponding choice of reactants.
  • the enzymes used in the examples below are commercial enzyme preparations, the first time in which the reference source is given.
  • trypsin commercial product from Serva
  • subtilopeptidase A commercial product from Boehringer
  • Z-Phe-OCh + Br " , 50 mM H-Leu-NH2 and 0.03 ⁇ M subtilopeptidase A give a peptide yield of 29% at -15 ° C in a frozen aqueous system after a reaction time of 30 h and complete ester consumption (at room temperature after 1 h and with complete ester consumption the peptide yield was 3.5%).
  • the peptide yield after 30 h at an enzyme concentration of 0.06 ⁇ M in the reaction mixture and complete ester consumption was 31.1% of theory. Th., While at room temperature after 4 h the peptide yield was only 5.1%.
  • Example 4 As in Example 4, 0.465 g (1 mmol) of Z-Phe-OCh + Br " and 0.675 g (2 mmol) of H-Gly-OBzl * p-Tos are reacted at pH 7.5 with 5 mg of ⁇ -chymotrypsin.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein kinetish kontrolliertes, Verfahren enzymatischen Herstellung von vollgeschützten Peptiden der Formel (III): NH-A1-CO-NH-A2-CO-Y, wobei vollgestüzte Aminosäurenester der der Formel (I): X-NH-A1-CO-Y' als Acyldonor, worin X und Y' Schutzgruppe und A1 einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten, mit Y-geschützten Aminosäuren oder Peptiden der Formel (II): NH¿2-A?2CO-Y (als Nukleophile), worin Y' verschiedene Schutzgruppe und A2 einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten, in Gegenwart eines Biokatalysators (z. B. Protease, bevorzugt Chymotrypsin oder Trypsin oder (Cholin)-Esterase) Y, umgesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, dass Y' Cholin oder eines seiner Salze bedeutet und dass der Biokatalysator ein die Spaltung der Cholin-esterbindung und die Übertragung des Acylrests X-NH-A1-CO auf die Verbindung der Formel (II) katalysierendes Enzym ist. Der Cholinester vermitteln löslichkeitseigenschaften und effizienten Acyldonoreigenschaftem für die biokatalysierte Knüpfung von Peptidbindungen.

Description

Kinetisch kontrolliertes Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Peptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden.
Insbesondere richtet sich die Erfindung auf eine kinetisch kontrollierte Peptidsynthese unter Verwendung von Enzymen, bei der vollgeschützte Aminosäuren oder Peptide der Formel I
X—NH—A3 CO—'Y' (I) ,
worin X und Y' jeweils eine Schutzgruppe und A1 einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten, mit
Y-geschützten Aminosäuren oder Peptiden der Formel II
H2N—A2—CO—Y (II),
worin Y eine von Y' verschiedene Schutzgruppe und A2 einen
Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten,
in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Biokatalysators zum vollgeschützten Peptid der Formel III
X—NH—A3 CO—NH-—A2—CO—Y (III),
umgesetzt werden.
In den letzten Jahren erlangten enzymatische Transformationen in der organischen Chemie zunehmendes
Interesse, da sie sich vor allem durch milde Reaktionsbedingungen sowie die ausgeprägte Stereo-, regio- und che oselektive Wirkungsweise der Biokatalysatoren auszeichnen. Insbesondere für die Synthese von Peptiden und empfindlichen, komplexen Peptidkonjugaten eröffnen
ERSATZBLÄF (REGEL 26) enzymatische Umsetzungen neue vorteilhafte Möglichkeiten (H. Waldmann et al. , J. Prakt. Chem. 1993, 335, 109; H. Waldmann et al. , Chem. Rev. , im Druck; V. Schellenberger et al . , Angew. Chem. 1991, 103 , 1440; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 31, 1437; H.-D. Jakubke in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" , Bd. 9 (Hrsg.: J. Meienhofer) , Academic Press, New York, 1987, S. 103) . So haben sich z. B. die Ablösung der N-terminalen Phenylacetamido- (PhAc) -Schutzgruppe durch Penicillin G-Acylase (H. Waldmann, Liebigs Ann. Chem. 1988, 1175) und die Abspaltung der C-terminalen Heptyl- (Hep) -ester durch Lipasen (P. Braun et al . , Liebigs Ann. Chem. 1991, 165; P. Braun et al. , Bioorg. Med. Chem. 1993, X, 197) als leistungsfähige Verfahren für die Synthese von Peptiden und Glycopeptiden erwiesen und mit der Protease-vermittelten Peptidsynthese in Eis (M. Schuster et al. , Tetrahedron 1990, _6_, 8093; M. Schuster et al . , Tetrahedron Lett. 1993, 34. 5701) wurde eine neue effiziente Methode für die racemisierungsfreie Verknüpfung von Aminosäuren und Peptiden gefunden.
Die Einsetzbarkeit enzymatischer Umsetzungen in der Peptidchemie wird jedoch oftmals durch die Schwerlöslichkeit der blockierten Peptide unter den verwendeten wäßrigen Reaktionsbedingungen und die dadurch verursachte mangelnde Zugänglichkeit der Substrate für die Biokatalysatoren erschwert oder gar vollständig verhindert . Diese Schwierigkeit kann durch Verwendung löslichkeitsvermittelnder Schutzgruppen überwunden werden (A. Fischer et al. , Biomed. Biochim. Acta 1991, 5_0_, 169; H. Kunz et al. , Angew. Chem. 1994, 106. 353; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994; 3_3_; H. Meos et al . , Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4_, 1559) . Die Ablösung der hierfür bislang herangezogenen Funktionalitäten erfordert jedoch oft Bedingungen, die deren Anwendung bei der Synthese empfindlicher polyfunktioneller Verbindungen, wie z. B. komplexer Peptidkonjugate, ausschließt. So wurde z. B. das Dipeptid H-Tyr-Arg-OH (Kyotorphin) unter Verwendung der löslichkeitsvermittelnden N-terminalen Maleylamidofunktion durch Chymotrypsin-vermittelte Knüpfung der Peptidbindung mit ca. 50 %iger Gesamtausbeute im 12 kg-Maßstab aufgebaut, die abschließende Deblockierung mußte jedoch als Hydrolyse in schwefelsaurer Lösung bei pH 0 durchgeführt werden
(A. Fischer et al. , Biomed. Biochim. Acta 1991, 5_£, 169) . Durch Chy otrypsin-katalysierte Umsetzung von H-Tyr-OEt mit freiem Arginin bei -18 °C in Eis läßt sich die Kyotorphin- Synthese mit einer Ausbeute von über 80 % entscheidend vereinfachen (H. Meos et al. , Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1559) .
Andererseits besteht ein wachsender Bedarf an Schutzgruppen in der Peptidsynthese, die gleichzeitig eine gute Abgangsgruppe für die Knüpfung einer Peptidbindung darstellen und außerdem relativ einfach zu handhaben sind.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von Peptiden in hoher Ausbeute und Selektivität, das die enzymatische Umsetzung einer möglichst hohen Zahl verschiedener Substrate unter katalytischer Einwirkung von einer Vielzahl verschiedener Biokatalysatoren ermöglicht.
Gelöst werden die vorstehenden sowie weitere nicht näher angegebene Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Ansprüchen unter Schutz gestellt.
Dadurch, daß in einem Verfahren der eingangs erwähnten Gattung als Schutzgruppe Y' Cholin oder eines seiner Salze und als Biokatalysator ein die Spaltung der Cholinesterbindung X—NH—A3—CO—Y' und die Übertragung des Acylrestes X—NH— Α?—CO— auf die Verbindung der Formel (II) katalysierendes Enzym verwendet wird, gelingt es vorteilhaft, eine löslichkeitsvermittelnde Eigenschaft der Cholinester bei der enzymatischen Peptidsynthese mit andererseits einer effizienten Acyldonor-Eigenschaft der Cholinester-Verbindungen für die biokatalysierte Knüpfung von Peptidbindungen zu kombinieren.
Cholinester sind weit verbreitete Biomoleküle und an sich bekannt. Darüber hinaus hat es auch schon Untersuchungen zum Einsatz von Cholinester-Verbindungen als Substrat für die Hydrolyse mittels α-Chymotrypsin gegeben
(Schellenberger et al. , Collection Czechoslovak Chem. Commun., Vol. 53, S. 2884f (1988)), wobei für den Cholinester des Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanins (Z-Phe- OChO) eine hohe kinetische Konstante in der α-Chymotrypsin katalysierten Acyldonor-Reaktion ermittelt wurde, es wurde jedoch nur die Hydrolyse-Reaktion durchgeführt.
Zu den im Rahmen der Erfindung vollgeschützten nützlichen Verbindungen der Formel (I) gehören alle Cholinester mit X-geschützten Aminosäuren oder Peptiden oder deren Salze. In Frage kommen u. a. Cholinesterchlorid, -bromid, -hydrogentartra , -hydrogencitra , -ascorbat, -hydrogenbromid; besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß das Cholinesterhydrogenbromid. Die Verbindungen der Formel (I) sind nach dem Fachmann geläufigen Verfahren erhältlich. Beispielhafte Synthesen werden bei H. Kunz und M. Buchholz, Chem. Ber. , 1979, 112, 2145, wiedergegeben. Zum Schutz des N-terminalen Endes wurden bekannte Schutzgruppen X verwendet. Hierzu gehören die Z-Gruppe (Benzyloxycarbonyl) , die Boc-Gruppe (t-Butyloxycarbonyl) und verschiedene andere Acyl-Gruppen (Acetyl, Phenacetyl, Formyl) .
Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannte Y-geschützte Aminosäuren oder Peptide. Als beispielhafte Y-Schutzgruppen seien in nicht vollständiger Aufzählung z. B. Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Nitrobenzyl- , tert.-Butyl, Amid u. a. genannt. Bevorzugt sind für die Erfindung der Ethyl oder Benzylrest oder die Amidgruppe.
Auch die Verbindungen der Formel (II) sind nach literaturbekannten Verfahren erhältlich. Hilfreiche Hinweise kann man dem Organikum, VEB-Verlag, 8. Aufl., 1968, entnehmen.
Zu den mit Vorteil im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Biokatalysatoren gehören eine große Vielzahl unterschiedlicher Esterasen oder auch Serin- oder Thiol-Proteasen.
U. a. sind in diesem Zusammenhang Cholin-Esterasen und Proteasen, wie z. B. Chymotrypsin, Papain, Trypsin, Subtilopeptidase A, Nagarse und Proteinase K erfindungsgemäß von hohem Interesse. Ganz besonders bevorzugte Biokatalysatoren sind α-Chymotrypsin und/oder Trypsin.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Peptidherstellung läßt sich äußerst vorteilhaft im wässrigen Medium durchführen. Hierunter ist entweder im wesentlichen reines Wasser zu verstehen oder Wasser, das ggf. Zusätze von weniger polaren Lösungsmitteln, wie C1-C4-Alkoholen in Mengen bis zu 50 Gew.-%, aufweisen kann.
In besonders bevorzugter Ausführungsform kennzeichnet sich das Verfahren der Erfindung dadurch, daß eine auf Temperaturen < 10 °C, bevorzugt etwa 0 °C, vorgekühlte wässrige Lösung der Verbindung der Formel (I) (Acyldonor) zu einer, die Verbindung der Formel (II) (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthaltenden wässrigen Lösung, die bevorzugt ebenfalls auf etwa 0 °C vorgekühlt ist, so zugegeben wird, daß über den Zugabezeitraum ständig ein Überschuß an Verbindung der Formel (II) gewährleistet ist.
Hierdurch gelingt es besonders vorteilhaft, eine möglicherweise zu beobachtende, jedoch unerwünschte, konkurrierende Hydrolyse des Cholinesters zurückzudrängen. Bevorzugt wird dabei so vorgegangen, daß eine auf 0 °C vorgekühlte Lösung des Acyldonors langsam zu einer ebenfalls eisgekühlten Lösung (pH 7.8) , die den Acylakzeptor und den Biokatalysator enthält, zugetropft wird, so daß ein Überschuß an Nucleophil gewährleistet wird.
Die Knüpfung der Peptidbindung durch die Protease erfolgt im allgemeinen sehr rasch, bereits nach etwa 30 min können u. U. die ausgefallenen Peptide in analytisch reiner Form mit Ausbeuten von 60 - 82 % isoliert werden.
Üblicherweise werden die Cholinester getrennt von der enzymatischen Reaktion synthetisiert und dann als Ausgangsverbindung der Formel I im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Sie können jedoch auch zusammen mit der Peptidsynthese aus entsprechenden Vorstufen hergestellt werden.
Daher kennzeichnet sich das Verfahren der Erfindung in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform dadurch, daß die Verbindung der Formel I in situ aus einer Verbindung der Formel IV
X—NH—A3 CO—OEt—Hai (IV) ,
worin X und A1 die bei Formel I angegebene Bedeutung besitzen und OEt-Hal für die Chlor-, Brom- oder Jodethylestergruppe steht, besonders bevorzugt aber für die Bromethylestergruppe, und Trimethylamin hergestellt wird, wobei bevorzugt das Trimethylamin zu einer wässrigen Lösung, die die Verbindung der Formel IV, den Biokatalysator sowie die Verbindung der Formel II enthält, zugegeben wird.
Dadurch, daß zu einer wässrigen Lösung, welche den der
Verbindung der Formel I (Acyldonor) entsprechenden Halogenethylester, besonders bevorzugt Bromethylester, die Verbindung der Formel II (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthält, eine bevorzugt gekühlte wässrige Trimethylamin-Lösung so zugegeben wird, daß die Menge an Trimethylamin gerade zur in-situ-Bildung des dem Halogenethylester entsprechenden Cholinesters ausreicht, der dann enzymatisch zum geschützten Dipeptid reagiert, also durch die "in-situ-Bildung" des Cholinesters, wird die getrennte Synthese des Cholinesters vor der enzymatischen Reaktion überflüssig, die gute Reaktivität des Cholinesters als Verbindung der Formel I (Acyldonor) aber ausgenutzt.
Zusammenfassend hat die Erfindung damit eine praktikable
Methode zur Nutzung der Cholinester-Gruppe zum C-Schutz für die enzymatische Peptidsynthese zur Verfügung gestellt.
Weiter wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele erläutert.
Beispiele
Zur Untersuchung der Substrateigenschaften der Cholinester, die durch die ermittelte P^-Spezifität des Chymotrypsins für positiv geladene Reste und durch den Coulomb-Effekt der positiven Ladung, der eine erhöhte Reaktivität der
Cholinesterbindung bedingt, verursacht werden, werden Cholinester als Carboxylkomponenten für kinetisch kontrollierte Peptidsynthesen eingesetzt. Als Substrate werden Z-Phe-OCh+Br" und Z-Leu-Gly-OCh+Br" (Z = Benzyloxycarbonyl, Ch = Cholin) eingesetzt, die aufgrund der unterschiedlichen Primärspezifität enzymatische Kupplungen mit verschiedenen Proteasen ermöglichen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der enzymkatalysierten Synthese von Z-Phe-Leu-NH2 ausgehend vom entsprechenden Cholinester und Leucinamid (NH2~Leu-CO-NH2, Y = NH2) als Nucleophil. Sowohl mit α-Chymotrypsin als auch mit Trypsin konnten unter präparativen Reaktionsbedingungen ohne weitgehend Optimierung gute Peptidausbeuten erzielt werden. Insbesondere im Fall von Chymotrypsin war es vorteilhaft, durch Vorkühlung und insbesondere durch die tropfenweise Esterzugabe aufgrund des dadurch manipulierten sehr hohen Nucleophilüberschusses eine mögliche, unerwünschte Esterhydrolyse zurückzudrängen. Durch die Produktausfällung ist die Aufarbeitung sehr einfach. Wie auch anderweitig nachgewiesen, akzeptiert Trypsin aromatisch Aminosäurereste in P1-Position. Sehr überraschend ist ohne Zweifel der Befund, daß auch Butyrylcholinesterase in der Lage ist, die Knüpfung von Peptidbindungen zu katalysieren. Im gefrorenen wäßrigen System konnten signifikante Produktbildungsraten in Abhängigkeit von der eingesetzten Enzymkonzentration erzielt werden. Offenbar wird ein aromatischer Rest in P^ weniger gut akzeptiert, da bei der Umsetzung von Z-Leu-Gly- OCh+Br~ eine Ausbeuteverdoppelung resultiert. Der sehr hohe Anteil des nicht umgesetzten Esters nach relativ langen Reaktionszeiten belegt, daß bei -15 °C die Umsetzung recht langsam verläuft.
Tab.l Proteasekatalysierte Synthesen unter Einsatz von Z-Phe-OCh+Br" als Carboxylkomponente und NH2-Leu-CO-NH2 als Aminokomponente
Enzym T C/N Rk. -Zeit Ausb. Bemerkungen [E]**
(°c) (%) α-Chymotrypsin RT* 1:2 30 min 82 präparativ 0.2 μM
Trypsin RT* 1:2 30 min 72 präparativ 0.2 μM
Butyrylcholin¬ -15 1:25 120 h 17 analy . ; 20 μM esterase
Subtilo- -15 1:25 30 h 29 analyt. ; 0.03 μM peptidase A
Nargase -15 1:25 30 h 29.5 analyt. ; 0.03 μM
Proteinase K -15 1:25 30 h 31 analyt. ; 0.06 μM 96/01906
*) Vorkühlung der Lösung und tropfenweise Esterzugabe zwecks Verminderung der ansonsten sehr schnellen Cholinester-Hydrolyse
**) bezogen auf die Einwaage der kommerziellen Enzymcharge
Die Chymotrypsin-katalysierte Synthese von Z-Phe-Arg-NH2 verlief aufgrund der P^-Spezifität sehr gut. Interessanterweise konnte der Cholinester auch in guten Ausbeuten mit Aminosäurebenzylestern verknüpft werden, so daß auf diese Weise Dipeptidderivate resultieren, die beispielsweise für weiterführende papainkatalysierte Segmentverknüpfungen Bedeutung haben. Die sehr gute Akzeptanz von Z-Leu-Gly-OCh+Br" für Papain wird durch eine Produktausbeute von 90 % bei der Umsetzung mit Leucinamid unterstrichen.
Die durchgeführten Untersuchungen belegen, daß Cholinester für kinetisch kontrollierte Peptidsynthesen gut geeignete Carboxykomponenten sind. Die solubilisierende Wirkung der Abgangsgruppe ermöglicht Reaktionsführungen im wäßrigen Reaktionsmedium mit dem Vorteil der Produktpräzipitation bei entsprechender Reaktantenwahl.
Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind kommerzielle Enzympräparationen, bei deren erster Nennung jeweils die Bezugquelle angegeben ist.
Beispiel 1
Synthese von Z-Phe-Leu-NH2
a) mit α-Chymotrypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)
0.26 g (2 mmol) H-Leu-NH2 (= NH2-Leu-CO-NH ) werden in 5.5 ml Wasser gelöst und im Eisbad vorgekühlt. Nach Zugabe einer vorgekühlten Lösung von 7.5 mg α-Chymotrypsin in 2 ml Wasser wird die Lösung gerührt und innerhalb von etwa 3 min tropfenweise mit einer auf 0 °C vorgekühlten Lösung von 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh+Br~ versetzt. Das ausgefallene Produkt wird 30 min nach Beendigung der Esterzugabe abgesaugt, dreimal mit Wasser auf der Fritte gewaschen und i. Vak. getrocknet. Das Rohprodukt wird aus Methanol/Wasser umgefällt .
Ausb.: 0.336 g (81.6 % d. Th.)
Fp. 189 - 193 °C; MS (FAB) 412 (M+l)
HPLC einheitlich (Acetonitril/Wasser (40/60,v/v, 0.1 % TFA) )
b) mit Trypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)
Wie im Beispiel la, jedoch mit 7.5 mg Trypsin.
Ausb. 0.298 g (72.2 % d. Th.) umgefällt aus Methanol/Wasser Fp. 193 - 195 °C HPLC-einheitlich (vgl. la)
c) mit Butyrylcholinesterase (Handelsprodukt der Firma Sigma)
1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM Z-Phe-OCh+Br", 50 mM H-Leu-NH2 und 4 μM
Butyrylcholinesterase ergeben bei -15 °C im gefrorenen wäßrigen System nach einer Reaktionszeit von 216 h bei nicht umgesetzten Esteranteil von 43.3 % eine Ausbeute an Produkt von 9.5 % d. Th.
Mit 20 μM Butyrylcholinesterase wurden nach 120 h 17.2 % Z-Phe-Leu-NH2 erhalten (Ester: 13.8 %, Z-Phe-OH: 68.9) .
d) mit Subtilopeptidase A (Handelsprodukt der Firma Boehringer)
1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM
Z-Phe-OCh+Br", 50 mM H-Leu-NH2 und 0.03 μM Subtilopeptidase A ergeben bei -15 °C im gefrorenen wäßrigen System nach einer Reakionszeit von 30 h und vollständigem Esterverbrauch eine Peptidausbeute von 29 % (bei Raumtemperatur betrug nach 1 h und bei vollständigem Esterverbrauch die Peptidausbeute 3.5 %) .
e) mit Nagarse (Handelsprodukt der Firma Sigma)
Unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen wie im Beispiel ld) betrug die Peptidausbeute nach 30 h bei einer Enzymkonzentration im Reaktionsansatz von 0.03 μM 29.5 % d. Th. (Ester: 14.7 %) , während bei Raumtemperatur nach 1 h und vollständigem Esterverbrauch die Peptidausbeute nur 5.3 % betrug.
f) mit Proteinase K (Handelsprodukt der Firma Boehringer)
Unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen wie im Beispiel ld) betrug die Peptidausbeute nach 30 h bei einer Enzymkonzentration von 0.06 μM im Reaktionsansatz und vollständigem Esterverbrauch 31.1 % d. Th. , während bei Raumtemperatur nach 4 h die Peptidausbeute nur 5.1 % betrug.
Beispiel 2
a) mit Papain (Handelsprodukt der Firma Merck)
Synthese von Z-Leu-Glv-Leu-NH2
Zu 600 μl einer Lösung von 54.2 mg H-Leu-NH2 in 5 ml Wasser (mit 1/10 M HC1 auf pH 7.8 gebracht) werden 200 μl einer Lösung von 5.25 mg Papain in 50 ml 5 mM Dithiothreitol gegeben. Nach Zugabe von 200 μl einer Lösung von 9.76 mg Z-Leu-Gly-OCh+Br" in 2 ml Wasser wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1 h wird die Reaktionslösung mit 3 ml 2.5 proz. Trifluoressigsäure/Acetonitril (1:1, v/v) versetzt. Die Ausbeute wird HPLC-analytisch bestimmt und beträgt 90 % d. Th.
b) mit Butyrylcholinesterase
1 ml wäßrige Reaktionslösung, pH 7.8, enthaltend 2 mM Z-Leu-Gly-OCh+Br", 50 mM H-Leu-NH2 und 20 μM Butyrylcholinesterase ergeben im gefrorenen wäßrigen System bei -15 °C eine Peptidproduktausbeute von 36.4 % d. Th. (Ester: 47.7 %, Z-Leu-Gly-OH: 15.9 %) .
Mit 4 μM Enzym wurden unter den gleichen Bedingungen nach 72 h nur 23.2 % Peptid erhalten (Ester: 70.3 %; Z-Leu-Gly- OH: 6.5 %) .
Beispiel 3
Synthese von Z-Phe-Arσ-NH2
Zu 600 μl einer Lösung von 18.5 mg H-Arg-NH2 in 5 ml Wasser (mit 1/10 M HC1 auf pH 7.8 gebracht) werden 200 μl einer Lösung von 5 mg α-Chymotrypsin in 1 1 Wasser gegeben. Nach Zugabe von 200 μl einer Lösung von 23.25 mg Z-Phe-OCh+Br~ in 5 ml Wasser wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 30 min wird die Reaktionslösung mit 3 ml 2.5 proz. TFA/AcN (1:1,v/v) versetzt. Die Ausbeute wird HPLC-analytisch bestimmt und beträgt 86 % d. Th.
Beispiel 4
Synthese von Z-Phe-Ala-OBzl
0.703 g (2 mmol) H-Ala-OBzl*p-Tos werden in wenig Wasser gelöst, mit 2 M NaOH wird der pH auf 7.5 gebracht und danach auf 5 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 5 mg α-Chymotrypsin, gelöst in 1 ml Wasser, werden 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh+Br~, gelöst in 4 ml Wasser, langsam zugetropft. Das während der Reaktion ausfallende Peptidderivat wird nach 30 min abgetrennt, auf der Fritte lx mit Wasser, dreimal mit ges. NaHCθ3-Lösung und lx mit Wasser gewaschen und i. Vak. getrocknet.
Ausb. 0.277 g (60 % d. Th) Fp. 130 - 132 °C MS(FAB) 461 (M+l)
HPLC-einheitlich in Acetonitril/Wasser/TFA (60:40:0.1)
Beispiel 5
Synthese von Z-Phe-Gly-QBzl
Wie im Beispiel 4 werden 0.465 g (1 mmol) Z-Phe-OCh+Br" und 0.675 g (2 mmol) H-Gly-OBzl*p-Tos bei pH 7.5 mit 5 mg α-Chymotrypsin umgesetzt.
Ausb. 0.71 g (60.7 % d. Th.)
Fp. 127 - 129 °C
HPLC-einheitlich (vgl. Beispiel 4)
Beispiel 6
In-situ Darstellung von Z-Phe-Leu-NH2 mit α-Chymotrypsin (Handelsprodukt der Firma Serva)
0.26 g (2 mmol) H-Leu-NH2 und 0.390 g (1 mmol) Z-Phe-OEtBr werden in 5.5 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe einer Lösung von 7.5 mg α-Chymotrypsin in 2 ml Wasser wird die Lösung gerührt und innerhalb von etwa 10 min mit einer gekühlten wäßrigen Lösung von 1 mmol Trimethylamin versetzt. Das ausgefallene Produkt wird 30 min nach Beendigung der Trimethylamin-Zugabe abgesaugt, dreimal mit Wasser auf der Fritte gewaschen und i. Vak. getrocknet. Das Rohprodukt wird aus Methanol/Wasser umgefällt. Ausb.: 0.305 g (74.1 % d. Th. )
Fp. 189 - 192 °C; MS (FAB) 412 (M+l)
HPLC einheitlich (Acetonitril/Wasser (40/60, v/v 0.1 % TFA) )
Weitere Vorteile und Ausfuhrungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Patentansprüchen.

Claims

Patentansprüche
1. Kinetisch kontrolliertes Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Peptiden, bei dem vollgeschützte Aminosäuren oder Peptide der Formel I
X—-NH—A3—CO—-Y' (I) ,
worin X und Y' jeweils eine Schutzgruppe und A3- einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten, mit Y-geschützten Aminosäuren oder Peptiden der Formel II
H2N—A2—CO—Y (II),
worin Y eine von Y' verschiedene Schutzgruppe und A2 einen Aminosäure- oder Peptidrest bedeuten,
in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Biokatalysators X zum vollgeschützten Peptid der
Formel III
X—NH—A3 CO—- H—A2—CO—Y (III),
umgesetzt werden, dadurch gekennzeichnet , daß als Schutzgruppe Y1 Cholin oder eines seiner Salze und als Biokatalysator ein die Spaltung der Cholinesterbindung X— H—A3—CO—Y1 und die Übertragung des Acylrest X—NH—A3—CO— auf die Verbindung der Formel (II) katalysierendes Enzym verwendet wird.
2 . Verfahren nach Anspruch 1 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Umsetzung im wässrigen Medium durchgeführt wird .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß eine auf Temperaturen < 10 °C, bevorzugt etwa 0 °C, vorgekühlte wässrige Lösung der Verbindung der Formel (I) (Acyldonor) zu einer, die Verbindung der Formel (II) (Acylakzeptor) und den Biokatalysator enthaltenden wässrigen Lösung, die bevorzugt ebenfalls auf etwa 0 °C vorgekühlt ist, so zugegeben wird, daß während der gesamten Zugabedauer ein Überschuß an Verbindung der Formel (II) gewährleistet ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der Formel I in situ aus einer Verbindung der Formel IV
X—NH—A3 CO—OEt—Hai (IV) ,
worin X und A3- die bei Formel I angegebene Bedeutung besitzen und OEt-Hal für die Chlor-, Brom- oder
Jodethylestergruppe steht, besonders bevorzugt für die Bromethylestergruppe, und Trimethylamin hergestellt wird, wobei das Trimethylamin, bevorzugt in wässriger gekühlter Lösung, zu einer, bevorzugt gekühlten wässrigen Lösung, welche die Verbindungen der Formel II und IV und den Biokatalysator enthält, zugegeben wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als Biokatalysator eine Protease verwendet wird, welche die selektive Übertragung des Acylrests von Aminosäurecholinestern auf N-Nucleophile der Formel (II) gestattet und keine störende Proteaseaktivität zeigt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch ge ennzeichnet , daß als Biokatalysator α-Chymotrypsin, Trypsin, Subtilopeptidase A, Nagarase, Proteinase K, Papain und/oder Butyrylcholin-Esterase verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet , daß als Biokatalysator α-Chymotrypsin und/oder Trypsin verwendet werden.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0278787A1 (de) * 1987-02-13 1988-08-17 Carlbiotech Ltd. A/S Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dipeptiden
DE4101895C1 (de) * 1991-01-23 1991-12-05 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
WO1991019811A1 (de) * 1990-06-13 1991-12-26 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von peptiden

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0278787A1 (de) * 1987-02-13 1988-08-17 Carlbiotech Ltd. A/S Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dipeptiden
WO1991019811A1 (de) * 1990-06-13 1991-12-26 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von peptiden
DE4101895C1 (de) * 1991-01-23 1991-12-05 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUNZ ET AL.: "Das System 2-Halogenethylester / Cholinester als zweistufen-Schutzgruppe für die Carboxylfunktion von Aminosäuren und Peptiden", CHEM. BER., vol. 112, no. 6, pages 2145 - 2157 *
SCHELLENBERGER ET AL.: "Specific water-soluble substrates for chymotrypsin : attemps for compensating diminished P1-S1 interactions", COLL. CZECHOSLOVAK CHEM. COMMUN., vol. 53, no. 11b, pages 2884 - 2889 *

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