JPH05292992A - ペプチドレニン阻害剤を合成する方法 - Google Patents
ペプチドレニン阻害剤を合成する方法Info
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- JPH05292992A JPH05292992A JP4215212A JP21521292A JPH05292992A JP H05292992 A JPH05292992 A JP H05292992A JP 4215212 A JP4215212 A JP 4215212A JP 21521292 A JP21521292 A JP 21521292A JP H05292992 A JPH05292992 A JP H05292992A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ペプチドレニン阻害剤を合成する方法に関す
る。 【構成】 特定構造のペプチドアシル供与体を、特定構
造の求核試薬と反応させることによって、ペプチドレニ
ン阻害剤を合成するものでプロテアーゼ調製物の存在下
にこの反応を実施することを特徴とし、ここでペプチド
アシル供与体Ac−Phe−Ala −OMe （Ｎ−アセチル−Ｌ
−フェニルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエステル）及
び求核試薬Norst − OPri （(3S, 2R)−シクロヘキシル
ノルスタチン イソプロピルエステル）の双方を100 〜
500mM 含む25°〜60℃の水飽和酢酸エチル溶液中でpH6.
5 〜7.5 で４〜20重量％の水を含有する担持触媒の形で
プロテアーゼ調製物を得る。
る。 【構成】 特定構造のペプチドアシル供与体を、特定構
造の求核試薬と反応させることによって、ペプチドレニ
ン阻害剤を合成するものでプロテアーゼ調製物の存在下
にこの反応を実施することを特徴とし、ここでペプチド
アシル供与体Ac−Phe−Ala −OMe （Ｎ−アセチル−Ｌ
−フェニルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエステル）及
び求核試薬Norst − OPri （(3S, 2R)−シクロヘキシル
ノルスタチン イソプロピルエステル）の双方を100 〜
500mM 含む25°〜60℃の水飽和酢酸エチル溶液中でpH6.
5 〜7.5 で４〜20重量％の水を含有する担持触媒の形で
プロテアーゼ調製物を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチドレニン阻害剤
を合成する方法に関するものである。
を合成する方法に関するものである。
【０００２】
【化７】 の構造を有するレニン阻害剤は、心臓血管薬としての興
味が増大している主題である血圧降下剤のうち既知の種
類のものである。グリーンリー(Greenlee)の「レニン阻
害剤(Renin Inhibitors)」４「Pharm. Res. 」364 (198
7)参照。このため、レニン阻害特性を示す特定種のペプ
チド、更にはその中間体を合成するための有用な方法を
開発することが、大きな興味の対象であった。
味が増大している主題である血圧降下剤のうち既知の種
類のものである。グリーンリー(Greenlee)の「レニン阻
害剤(Renin Inhibitors)」４「Pharm. Res. 」364 (198
7)参照。このため、レニン阻害特性を示す特定種のペプ
チド、更にはその中間体を合成するための有用な方法を
開発することが、大きな興味の対象であった。
【０００３】こうした上記の一般構造式を有する試薬を
調製するには、従来は、一般構造式Ｉ（ここでＲは水素
である）のアミノ酸又はペプチド誘導体（ペプチドアシ
ル供与体）を、一般構造式IIのβ−ヒドロキシアミン誘
導体（求核試薬）と、化学結合剤の存在下に下記の反応
スキームに従って反応させ、ペプチド結合を形成するこ
とによっている。
調製するには、従来は、一般構造式Ｉ（ここでＲは水素
である）のアミノ酸又はペプチド誘導体（ペプチドアシ
ル供与体）を、一般構造式IIのβ−ヒドロキシアミン誘
導体（求核試薬）と、化学結合剤の存在下に下記の反応
スキームに従って反応させ、ペプチド結合を形成するこ
とによっている。
【０００４】
【化８】
【０００５】例えば、欧州特許出願EP312157A2, EP3098
41A2、及びEP310070A2を参照。しかし、こうした化学的
方法によると、望ましくない二次的反応やラセミ化の生
ずるおそれがあり、従ってこの化学反応を注意深く制御
することでこれらの問題を最小限にし、又は除去するこ
とが必要になる。特に望ましくない二次的反応は、不所
望なＤ−アミノ酸を含有するペプチドアシル供与体が含
まれることであり、これはジアステレオマー性の不純物
をもたらし、このレニン阻害剤の製品が、意図された目
的には役に立たないものになる。更に、この方法の反応
速度と収率とはしばしば低く、かつ二次的反応によっ
て、純粋な製品を得るために煩雑な精製プロセスが必要
になる。そのうえ、この化学的方法ではしばしば毒性の
溶媒を使用するので、廃棄物処理問題を生ずる。こうし
た化学合成の抱える問題や、化学結合剤のコストが高い
ことから、このレニン阻害剤を製造することは比較的高
価につく。
41A2、及びEP310070A2を参照。しかし、こうした化学的
方法によると、望ましくない二次的反応やラセミ化の生
ずるおそれがあり、従ってこの化学反応を注意深く制御
することでこれらの問題を最小限にし、又は除去するこ
とが必要になる。特に望ましくない二次的反応は、不所
望なＤ−アミノ酸を含有するペプチドアシル供与体が含
まれることであり、これはジアステレオマー性の不純物
をもたらし、このレニン阻害剤の製品が、意図された目
的には役に立たないものになる。更に、この方法の反応
速度と収率とはしばしば低く、かつ二次的反応によっ
て、純粋な製品を得るために煩雑な精製プロセスが必要
になる。そのうえ、この化学的方法ではしばしば毒性の
溶媒を使用するので、廃棄物処理問題を生ずる。こうし
た化学合成の抱える問題や、化学結合剤のコストが高い
ことから、このレニン阻害剤を製造することは比較的高
価につく。
【０００６】酵素類は、室温で水溶液で働く高度に特異
的な触媒であることが知られている。プロテアーゼ酵素
がペプチドの加水分解を触媒することが知られているこ
とから、この加水分解反応を逆転させることの実際的な
可否を検討すること、即ち、プロテアーゼをペプチドの
合成を触媒するために用いることに、多大の努力が払わ
れてきた。α−アミノ酸又はα−アミノ酸誘導体を、他
のα−アミノ酸又はα−アミノ酸誘導体と結合させるた
めにプロテアーゼ酵素触媒を用いることは、本技術分野
で良く知られている。例えば、米国特許第4,806,473 号
参照。
的な触媒であることが知られている。プロテアーゼ酵素
がペプチドの加水分解を触媒することが知られているこ
とから、この加水分解反応を逆転させることの実際的な
可否を検討すること、即ち、プロテアーゼをペプチドの
合成を触媒するために用いることに、多大の努力が払わ
れてきた。α−アミノ酸又はα−アミノ酸誘導体を、他
のα−アミノ酸又はα−アミノ酸誘導体と結合させるた
めにプロテアーゼ酵素触媒を用いることは、本技術分野
で良く知られている。例えば、米国特許第4,806,473 号
参照。
【０００７】α−アミノ酸又はα−アミノ酸誘導体を、
非α−アミノ酸アミン又はアミン誘導体と結合させるた
めにプロテアーゼ酵素触媒を用いることは、あまり知ら
れていない。酵素によって触媒された結合は、速度論的
方法（酵素中間体の分離を結合の方へと方向づけること
を必要とする非平衡論的アプローチ）又は熱力学的方法
（平衡の位置を移動させることを必要とする平衡論的ア
プローチ）によって実現することができる。カルマン(K
ullman) の「酵素的ペプチド合成(Enzymatic Peptide S
ynthesis) 」(CRC プレス 1987)参照。
非α−アミノ酸アミン又はアミン誘導体と結合させるた
めにプロテアーゼ酵素触媒を用いることは、あまり知ら
れていない。酵素によって触媒された結合は、速度論的
方法（酵素中間体の分離を結合の方へと方向づけること
を必要とする非平衡論的アプローチ）又は熱力学的方法
（平衡の位置を移動させることを必要とする平衡論的ア
プローチ）によって実現することができる。カルマン(K
ullman) の「酵素的ペプチド合成(Enzymatic Peptide S
ynthesis) 」(CRC プレス 1987)参照。
【０００８】α−アミノ酸又はαーアミノ酸誘導体（ア
シル供与体）とアミン（合成非α−アミノ酸求核試薬）
との間にペプチド結合を生じさせる速度論的及び熱力学
的合成法のためのプロテアーゼ酵素を含む方法が、四つ
の文献に記載されている。
シル供与体）とアミン（合成非α−アミノ酸求核試薬）
との間にペプチド結合を生じさせる速度論的及び熱力学
的合成法のためのプロテアーゼ酵素を含む方法が、四つ
の文献に記載されている。
【０００９】こうした文献の一つは、フィッシャー等
(Fischer et al)の「極小水分量の有機溶媒系における
パパイン触媒ペプチド合成 (Papain−catalyzed Peptid
e Synthess in Organic Solvent Systems with Extreme
Low Water Content) 」「ペプチド化学(Peptide Chemi
stry) 」413 (1987)である。これは、Boc −Tyr −Gly
−OCH2CONH2 （アシル供与体）をペンチルアミン（合成
非α−アミノ酸求核試薬）に対してパパインを用いて結
合させてBoc −Tyr −Gly −NH−ペンチル基を生成させ
る速度論的方法を開示している。この方法では、パパイ
ンを用いても、パパインを用いない同種の反応にくらべ
て収率が僅かに13％しか向上していないことから、本当
に酵素触媒反応であるとは思えない。
(Fischer et al)の「極小水分量の有機溶媒系における
パパイン触媒ペプチド合成 (Papain−catalyzed Peptid
e Synthess in Organic Solvent Systems with Extreme
Low Water Content) 」「ペプチド化学(Peptide Chemi
stry) 」413 (1987)である。これは、Boc −Tyr −Gly
−OCH2CONH2 （アシル供与体）をペンチルアミン（合成
非α−アミノ酸求核試薬）に対してパパインを用いて結
合させてBoc −Tyr −Gly −NH−ペンチル基を生成させ
る速度論的方法を開示している。この方法では、パパイ
ンを用いても、パパインを用いない同種の反応にくらべ
て収率が僅かに13％しか向上していないことから、本当
に酵素触媒反応であるとは思えない。
【００１０】バルバス等（Barbas et al) は、「J. Che
m. Soc. Chem. Comm. 」533 (1987)で、Ｚ−Gly −OEt
（アシル供与体）をε−アミノカプロン酸メチルエステ
ル（合成非α−アミノ酸求核試薬）にパパイン触媒下に
結合させてＺ−Gly −ε−ACA −OMe を調製する、他の
速度論的方法を記載している。この反応では、高価な求
核試薬が大過剰(100％) に必要であり、求核試薬の量に
対して僅か31％の収率でしか結合後の製品が得られない
ことから、この方法は非実際的である。こうした速度論
的方法の他の欠点は、フィッシャー等及びバルバス等の
報告から明白であるが、高いpHを採用しなければならな
いことであり、これはしばしばペプチドのラセミ化をも
たらし、このため製品がその意図された目的からみて役
に立たないものとなることである。
m. Soc. Chem. Comm. 」533 (1987)で、Ｚ−Gly −OEt
（アシル供与体）をε−アミノカプロン酸メチルエステ
ル（合成非α−アミノ酸求核試薬）にパパイン触媒下に
結合させてＺ−Gly −ε−ACA −OMe を調製する、他の
速度論的方法を記載している。この反応では、高価な求
核試薬が大過剰(100％) に必要であり、求核試薬の量に
対して僅か31％の収率でしか結合後の製品が得られない
ことから、この方法は非実際的である。こうした速度論
的方法の他の欠点は、フィッシャー等及びバルバス等の
報告から明白であるが、高いpHを採用しなければならな
いことであり、これはしばしばペプチドのラセミ化をも
たらし、このため製品がその意図された目的からみて役
に立たないものとなることである。
【００１１】セロフスキー等(Cerovsky et al)が52「Co
ll. Czech. Chem. Comm.」2309 (1987) で報告した研究
では、パパインによって触媒した熱力学的方法を用いる
ことで」Ｚ−Cys （Ｓベンジル）（アシル供与体）を、
異なった塩基強度を持つ一連の非α−アミノ酸求核試薬
へと結合させている。この著者は、弱塩基性のアミンに
ついては良好な収率を報告しているけれども、（例え
ば、フェニルヒドラジンには、収率90％、pKB ＝8.79；
アニリンには、収率77％、pKb ＝9.37) 、強塩基性アミ
ン求核試薬を用いると収率が極端に低くなった（例え
ば、ベンジルアミンについては、収率19％、pKB ＝4.6
7；シクロヘキシルアミンについては、収率０％、pKB
＝3.34) 。彼らの結論によれば、「このアミノ結合が生
成するためには、芳香環系が、所与のアミンのアミノ基
と結合することが必要である」。一般構造式IIの求核試
薬は芳香環系に結合しておらず、強塩基性（pKB ＝３−
４）のアミンなので、上記の結果の示唆するところで
は、本出願では役に立たない。
ll. Czech. Chem. Comm.」2309 (1987) で報告した研究
では、パパインによって触媒した熱力学的方法を用いる
ことで」Ｚ−Cys （Ｓベンジル）（アシル供与体）を、
異なった塩基強度を持つ一連の非α−アミノ酸求核試薬
へと結合させている。この著者は、弱塩基性のアミンに
ついては良好な収率を報告しているけれども、（例え
ば、フェニルヒドラジンには、収率90％、pKB ＝8.79；
アニリンには、収率77％、pKb ＝9.37) 、強塩基性アミ
ン求核試薬を用いると収率が極端に低くなった（例え
ば、ベンジルアミンについては、収率19％、pKB ＝4.6
7；シクロヘキシルアミンについては、収率０％、pKB
＝3.34) 。彼らの結論によれば、「このアミノ結合が生
成するためには、芳香環系が、所与のアミンのアミノ基
と結合することが必要である」。一般構造式IIの求核試
薬は芳香環系に結合しておらず、強塩基性（pKB ＝３−
４）のアミンなので、上記の結果の示唆するところで
は、本出願では役に立たない。
【００１２】セロフスキー等（Cerovsky et al) は、49
「Col. Czech. Chem. Comm. 」2557(1984)において更
に、Ｎ−置換アミノ酸を、化学量論的な量のアニリン又
はフェニルヒドラジン求核試薬と、パパイン触媒下に結
合させる熱力学的方法を開示している。この方法による
収率は低く（平均56％±23％) 、長い反応時間が必要で
あり(24 時間) 、容量的な生産性が非常に低い。
「Col. Czech. Chem. Comm. 」2557(1984)において更
に、Ｎ−置換アミノ酸を、化学量論的な量のアニリン又
はフェニルヒドラジン求核試薬と、パパイン触媒下に結
合させる熱力学的方法を開示している。この方法による
収率は低く（平均56％±23％) 、長い反応時間が必要で
あり(24 時間) 、容量的な生産性が非常に低い。
【００１３】米国特許第4,889,869 号には、上記した型
のレニン阻害剤中にペプチド結合を生成させる広範な種
類の方法が開示されており、おそらくはプロテアーゼサ
ーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ、キモトリプシ
ン、トリプシン、ペプシン及びパパインを用いた酵素合
成が含まれている。しかし、こうした合成は実際には実
施されなかったことは明白である。指名されたプロテア
ーゼは、パパインを例外として、問題のペプチド結合を
形成する酵素的合成反応では実際には作用しないからで
ある。
のレニン阻害剤中にペプチド結合を生成させる広範な種
類の方法が開示されており、おそらくはプロテアーゼサ
ーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ、キモトリプシ
ン、トリプシン、ペプシン及びパパインを用いた酵素合
成が含まれている。しかし、こうした合成は実際には実
施されなかったことは明白である。指名されたプロテア
ーゼは、パパインを例外として、問題のペプチド結合を
形成する酵素的合成反応では実際には作用しないからで
ある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、レニン阻害
剤を合成する上記の従来技術の方法における欠点を克服
し、二次的反応なしに、かつラセミ化なしに定量的に近
い収率を与える、迅速で経済的な方法を提供するもので
ある。
剤を合成する上記の従来技術の方法における欠点を克服
し、二次的反応なしに、かつラセミ化なしに定量的に近
い収率を与える、迅速で経済的な方法を提供するもので
ある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の最も広い態様に
おいては、上記した構造式III のペプチドレニン阻害剤
を、プロテアーゼ類の存在下に、構造式Ｉのペプチドア
シル供与体成分を構造式IIの求核試薬成分と結合させる
ことによって、簡単かつ低コストで合成することができ
ることを発見した。ここでこのプロテアーゼの調製物
は、ペプチドアシル供与体のＮ−アセチル−Ｌーフェニ
ルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエステル（Ac−Phe −
Ala −OMe)及び求核試薬の（3S, 2R) −シクロヘキシル
ノルスタチン（cyclohexylnorstatine) イソプロピル
エステル (Norst − OPri ) の双方を100 〜500mM 含む
25℃〜60℃の水飽和酢酸エチル溶液中でpH6.5 〜7.5 で
４〜20重量％の水を含有する担持触媒の形で存在してお
り、このプロテアーゼ調製物が、前記ペプチドアシル供
与体のカルボキシル末端と前記求核試薬のアミノ基との
結合を、 (a) 溶液１リットル当り、１時間当り、酵素の重量パー
セント当り、結合ペプチド1.0 ミリモル以上の標準化初
期反応速度； (b) 20以上：１のフェニルアラニルアラニンペプチド結
合の開裂に対する結合の位置選択性；及び (c) 20以上：１の、Ac−L −Phe −L −Ala −Norst −
OPri の生成のAc−Ｌ−Phe −Ｄ−Ala −Norst − OPr
i の生成に対するジアステレオ選択性 をもって触媒する。「標準化初期反応速度」「位置選択
性」及び「ジアステレオ選択性」という用語は、続く本
発明の詳細な説明中で定義する。
おいては、上記した構造式III のペプチドレニン阻害剤
を、プロテアーゼ類の存在下に、構造式Ｉのペプチドア
シル供与体成分を構造式IIの求核試薬成分と結合させる
ことによって、簡単かつ低コストで合成することができ
ることを発見した。ここでこのプロテアーゼの調製物
は、ペプチドアシル供与体のＮ−アセチル−Ｌーフェニ
ルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエステル（Ac−Phe −
Ala −OMe)及び求核試薬の（3S, 2R) −シクロヘキシル
ノルスタチン（cyclohexylnorstatine) イソプロピル
エステル (Norst − OPri ) の双方を100 〜500mM 含む
25℃〜60℃の水飽和酢酸エチル溶液中でpH6.5 〜7.5 で
４〜20重量％の水を含有する担持触媒の形で存在してお
り、このプロテアーゼ調製物が、前記ペプチドアシル供
与体のカルボキシル末端と前記求核試薬のアミノ基との
結合を、 (a) 溶液１リットル当り、１時間当り、酵素の重量パー
セント当り、結合ペプチド1.0 ミリモル以上の標準化初
期反応速度； (b) 20以上：１のフェニルアラニルアラニンペプチド結
合の開裂に対する結合の位置選択性；及び (c) 20以上：１の、Ac−L −Phe −L −Ala −Norst −
OPri の生成のAc−Ｌ−Phe −Ｄ−Ala −Norst − OPr
i の生成に対するジアステレオ選択性 をもって触媒する。「標準化初期反応速度」「位置選択
性」及び「ジアステレオ選択性」という用語は、続く本
発明の詳細な説明中で定義する。
【００１６】ここで表１〜表４を参照する。表１，２
は、記載したすべての化合物の主リストであり、本発明
の「従来の技術」の項で記載したものと同じローマ数字
を用いており、即ち、アシル供与体に対して「Ｉ」を、
求核試薬に対して「II」を、トリペプチドレニン阻害剤
に対して「III 」を用いてある。表３，４は、各例で使
用した結合性成分及び各例で合成したレニン阻害剤の構
造を示す要約である。すべての配置は、(R) と断らない
限りは(S) である。本発明に従い、プロテアーゼの調製
物の存在下に構造式Ｉのペプチドアシル供与体を構造式
IIの求核試薬と反応させることによって、上記の一般構
造式III のペプチドレニン阻害剤を酵素的に合成する方
法を提供する。この結合反応において、プロテアーゼ調
製物は、「課題を解決するための手段」の項目に記載し
た結合反応速度、位置選択性及びジアステレオ選択性を
示す。ここで置換基は、次のように定義される：
は、記載したすべての化合物の主リストであり、本発明
の「従来の技術」の項で記載したものと同じローマ数字
を用いており、即ち、アシル供与体に対して「Ｉ」を、
求核試薬に対して「II」を、トリペプチドレニン阻害剤
に対して「III 」を用いてある。表３，４は、各例で使
用した結合性成分及び各例で合成したレニン阻害剤の構
造を示す要約である。すべての配置は、(R) と断らない
限りは(S) である。本発明に従い、プロテアーゼの調製
物の存在下に構造式Ｉのペプチドアシル供与体を構造式
IIの求核試薬と反応させることによって、上記の一般構
造式III のペプチドレニン阻害剤を酵素的に合成する方
法を提供する。この結合反応において、プロテアーゼ調
製物は、「課題を解決するための手段」の項目に記載し
た結合反応速度、位置選択性及びジアステレオ選択性を
示す。ここで置換基は、次のように定義される：
【００１７】Ｒは、水素、アルキル基、シクロアルキル
基、アリル基又はアラルキル基である。R1は、ROCONH
−, ROCOO −, ROCOCH2 −, RNHCONH −, RNHCOO−, RN
HCOCH2−, RSO2NH−, 又はRSO2CH2 −である。R2, R4及
びR6は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキ
ル基、アリル基又はアラルキル基である。
基、アリル基又はアラルキル基である。R1は、ROCONH
−, ROCOO −, ROCOCH2 −, RNHCONH −, RNHCOO−, RN
HCOCH2−, RSO2NH−, 又はRSO2CH2 −である。R2, R4及
びR6は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキ
ル基、アリル基又はアラルキル基である。
【００１８】R3は、水素、アルキル基、シクロアルキル
基、４−イミダゾイル基、−OH, −SR, −(CH2) n −S
R, 又は−(CH2) n −NH2 であり、ここでｎは１〜６の
整数である。R5は、-COOR6, −CHOHR6，−CH2CONHCH
2R6, 又は−CH2CHRCONHR6である。
基、４−イミダゾイル基、−OH, −SR, −(CH2) n −S
R, 又は−(CH2) n −NH2 であり、ここでｎは１〜６の
整数である。R5は、-COOR6, −CHOHR6，−CH2CONHCH
2R6, 又は−CH2CHRCONHR6である。
【００１９】「アルキル基」は、１〜20個の炭素原子を
有する、置換又は非置換の直鎖又は分枝鎖の炭素基であ
り、ヘテロ原子を含んでいてもよい。「シクロアルキル
基」は、３〜７個の炭素原子を有する環状構造であり、
この環中に架橋構造又はヘテロ原子を含んでいてもよ
く、ここでこのヘテロ原子は、Ｏ，Ｎ及びＳから選択さ
れる。または「シクロアルキル基」は、少なくとも一つ
の置換基を有する置換シクロアルキル基であってよく、
この置換基に、窒素、ハロゲン、炭素、酸素、リン及び
硫黄から選ばれた原子が含まれていてよい。
有する、置換又は非置換の直鎖又は分枝鎖の炭素基であ
り、ヘテロ原子を含んでいてもよい。「シクロアルキル
基」は、３〜７個の炭素原子を有する環状構造であり、
この環中に架橋構造又はヘテロ原子を含んでいてもよ
く、ここでこのヘテロ原子は、Ｏ，Ｎ及びＳから選択さ
れる。または「シクロアルキル基」は、少なくとも一つ
の置換基を有する置換シクロアルキル基であってよく、
この置換基に、窒素、ハロゲン、炭素、酸素、リン及び
硫黄から選ばれた原子が含まれていてよい。
【００２０】「アリル基」は、６〜10個の炭素原子を有
する単環状、二環状又はヘテロ環状の芳香族基であり、
ここでこのヘテロ原子は、酸素、窒素及び硫黄の中から
選択されており、又は、少なくとも一つの置換基を有す
る置換アリル基であり、この置換基に、窒素、ハロゲ
ン、炭素、酸素、リン及び硫黄から選択された原子が含
まれている。また、「アラルキル基」は、アリル基に結
合されたアルキル基である。
する単環状、二環状又はヘテロ環状の芳香族基であり、
ここでこのヘテロ原子は、酸素、窒素及び硫黄の中から
選択されており、又は、少なくとも一つの置換基を有す
る置換アリル基であり、この置換基に、窒素、ハロゲ
ン、炭素、酸素、リン及び硫黄から選択された原子が含
まれている。また、「アラルキル基」は、アリル基に結
合されたアルキル基である。
【００２１】ここで参照する結合反応は、標準的条件下
に、等モル量のジペプチドエステルアシル供与体成分と
求核試薬とを酸素的に結合させることからなる。更に特
定的には、水飽和酢酸エチル溶液中の250mM のペプチド
アシル供与体Ac−Phe −Ala−OMe （下記表１の構造Iv)
を、これと同じ量(250mM) の求核試薬Norst −OPr
i （下記表１中の構造IIa)と、前記プロテアーゼ調製物
を含む５重量％の担持触媒の存在下に５０℃で反応させ
る。この担持触媒を調製するには、1.6 重量％のプロテ
アーゼ調製物及び0.6 重量％のシステイン（アジュバン
トとして）を含有する0.1MのpH7.0 の水溶性リン酸緩衝
液３重量部を、１重量部の多孔質焼きケイソウ土と混合
し、次いで水分量が７重量％となるまで水を蒸発させ
る。
に、等モル量のジペプチドエステルアシル供与体成分と
求核試薬とを酸素的に結合させることからなる。更に特
定的には、水飽和酢酸エチル溶液中の250mM のペプチド
アシル供与体Ac−Phe −Ala−OMe （下記表１の構造Iv)
を、これと同じ量(250mM) の求核試薬Norst −OPr
i （下記表１中の構造IIa)と、前記プロテアーゼ調製物
を含む５重量％の担持触媒の存在下に５０℃で反応させ
る。この担持触媒を調製するには、1.6 重量％のプロテ
アーゼ調製物及び0.6 重量％のシステイン（アジュバン
トとして）を含有する0.1MのpH7.0 の水溶性リン酸緩衝
液３重量部を、１重量部の多孔質焼きケイソウ土と混合
し、次いで水分量が７重量％となるまで水を蒸発させ
る。
【００２２】本発明で有用な、好適なプロテアーゼ調製
物は、三つの主な特徴を有する。 (1) こうしたプロテアーゼ調製物は、アシル供与体酸と
アミノ供与体との結合を、充分に早い速度で触媒する。
この特徴は、結合の標準化初期反応速度に反映されてお
り、標準化初期反応速度は、溶液1 リットル当り、1 時
間当り、酵素の重量％当りに生産される結合製品のミリ
モル数として定義される。上記したように、有用な参照
反応は、Ac−Phe −Ala −OMe (Iv)とNorst − OPri (I
Ia) との結合によるＮ−アセチル−Ｌ−フェニル アラ
ニル−Ｌ−アラニル−（３Ｓ，２Ｒ）−シクロヘキシル
ノルスタチン イソプロピルエステル（Ac−Phe −Ala
−Norst − OPri )(IIIv) の生成反応である。溶液１リ
ットル当り、１時間当り、重量％の酵素当りに生産され
る結合製品の量が１ミリモルより少ないという参照反応
速度を、プロテアーゼ調製物が有している場合には、本
発明で有用であるとは見なされない。
物は、三つの主な特徴を有する。 (1) こうしたプロテアーゼ調製物は、アシル供与体酸と
アミノ供与体との結合を、充分に早い速度で触媒する。
この特徴は、結合の標準化初期反応速度に反映されてお
り、標準化初期反応速度は、溶液1 リットル当り、1 時
間当り、酵素の重量％当りに生産される結合製品のミリ
モル数として定義される。上記したように、有用な参照
反応は、Ac−Phe −Ala −OMe (Iv)とNorst − OPri (I
Ia) との結合によるＮ−アセチル−Ｌ−フェニル アラ
ニル−Ｌ−アラニル−（３Ｓ，２Ｒ）−シクロヘキシル
ノルスタチン イソプロピルエステル（Ac−Phe −Ala
−Norst − OPri )(IIIv) の生成反応である。溶液１リ
ットル当り、１時間当り、重量％の酵素当りに生産され
る結合製品の量が１ミリモルより少ないという参照反応
速度を、プロテアーゼ調製物が有している場合には、本
発明で有用であるとは見なされない。
【００２３】(2) こうしたプロテアーゼ調製物は、アシ
ル供与体とアミノ供与体との結合を、充分な位置選択性
をもって触媒する。この「位置選択性」は、内部のアミ
ド結合開裂の反応速度に対する結合の反応速度の比率に
反映され、かつこの比率として定義されるものである。
上記したように、有用な参照は、酸形のＮ−アセチル−
Ｌ−フェニルアラニンの生成をもたらす開裂反応と、結
合反応との標準化初期反応速度の比率であ。これらの二
つの参照反応の上記比率が少なくとも100 ：１であるプ
ロテアーゼ調製物が好ましい。これらにより、化学的純
度が少なくとも99％のレニン阻害剤結合製品の生成がも
たらされるからであり、この純度が、通常、薬学用途に
おいて、許容可能であると見なされている。しかしなが
ら、上記比率が少なくとも20：１であるプロテアーゼ調
製物も、本発明では有用と見なされる。これらによっ
て、99％の化学的純度にまで精製が可能なレニン阻害剤
の生成がもたらされるからである。
ル供与体とアミノ供与体との結合を、充分な位置選択性
をもって触媒する。この「位置選択性」は、内部のアミ
ド結合開裂の反応速度に対する結合の反応速度の比率に
反映され、かつこの比率として定義されるものである。
上記したように、有用な参照は、酸形のＮ−アセチル−
Ｌ−フェニルアラニンの生成をもたらす開裂反応と、結
合反応との標準化初期反応速度の比率であ。これらの二
つの参照反応の上記比率が少なくとも100 ：１であるプ
ロテアーゼ調製物が好ましい。これらにより、化学的純
度が少なくとも99％のレニン阻害剤結合製品の生成がも
たらされるからであり、この純度が、通常、薬学用途に
おいて、許容可能であると見なされている。しかしなが
ら、上記比率が少なくとも20：１であるプロテアーゼ調
製物も、本発明では有用と見なされる。これらによっ
て、99％の化学的純度にまで精製が可能なレニン阻害剤
の生成がもたらされるからである。
【００２４】(3) こうしたプロテアーゼ調製物は、アシ
ル供与体のアミノ供与体との結合を、充分なジアステレ
オ選択性をもって触媒する。「ジアステレオ選択性」
は、アシル供与体との結合において、Ｄ異性体に対して
Ｌ異性体が生成する標準化初期反応速度の比率に反映さ
れ、この比率として定義される。ここで、上記の構造式
Ｉのアシル供与体中のR3保持部位はエピマー化を受け
る。上記と同じ参照反応において、競合しあう反応は、
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン及
びそのエピマーであるＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラ
ニル−Ｄ−アラニンと、（３Ｓ，２Ｒ）−シクロヘキシ
ルノルスタチン イソプロピルエステルとの結合であ
る。このＬ−Ｄ異性体の結合反応速度に対する上記Ｌ−
Ｌ異性体の結合反応速度の比率が少なくとも100 ：１で
あるプロテアーゼ調製物が好ましいが、この比率が少な
くとも20：１であるプロテアーゼ調製物は、第(2) 項で
上記したものと同じ理由から有用とみなされる。
ル供与体のアミノ供与体との結合を、充分なジアステレ
オ選択性をもって触媒する。「ジアステレオ選択性」
は、アシル供与体との結合において、Ｄ異性体に対して
Ｌ異性体が生成する標準化初期反応速度の比率に反映さ
れ、この比率として定義される。ここで、上記の構造式
Ｉのアシル供与体中のR3保持部位はエピマー化を受け
る。上記と同じ参照反応において、競合しあう反応は、
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン及
びそのエピマーであるＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラ
ニル−Ｄ−アラニンと、（３Ｓ，２Ｒ）−シクロヘキシ
ルノルスタチン イソプロピルエステルとの結合であ
る。このＬ−Ｄ異性体の結合反応速度に対する上記Ｌ−
Ｌ異性体の結合反応速度の比率が少なくとも100 ：１で
あるプロテアーゼ調製物が好ましいが、この比率が少な
くとも20：１であるプロテアーゼ調製物は、第(2) 項で
上記したものと同じ理由から有用とみなされる。
【００２５】上記の機能的パラメーターの中に入る好適
なプロテアーゼ調製物の多くは、スルフヒドリル プロ
テアーゼの調製物である。本発明で有用とみられる特定
のプロテアーゼ調製物の例には、パパイン、キモパパイ
ン、フィシン及びブロメラインが含まれる。このプロテ
アーゼ調製物の使用可能な形態には、粉末、溶液、担体
上の固定化物、酵素を含有する細胞性抽出物及び酵素含
有細胞が含まれる。これらの形態のすべては、水、有機
溶媒又はこれら二つの混合物中に溶解又は懸濁すること
ができる。酵素を含有する細胞の形態においては、細胞
は全細胞であってよく、又は断片化されていてもよい。
なプロテアーゼ調製物の多くは、スルフヒドリル プロ
テアーゼの調製物である。本発明で有用とみられる特定
のプロテアーゼ調製物の例には、パパイン、キモパパイ
ン、フィシン及びブロメラインが含まれる。このプロテ
アーゼ調製物の使用可能な形態には、粉末、溶液、担体
上の固定化物、酵素を含有する細胞性抽出物及び酵素含
有細胞が含まれる。これらの形態のすべては、水、有機
溶媒又はこれら二つの混合物中に溶解又は懸濁すること
ができる。酵素を含有する細胞の形態においては、細胞
は全細胞であってよく、又は断片化されていてもよい。
【００２６】本発明の結合方法を実施するのに際して
は、漂白された又は漂白されていない又は仮焼されたケ
イソウ土、ポリデキストラン、ポリアクリルアミド、ポ
リスチレン、ポリアクリル酸エステル、シリカゲル又は
多孔質ガラスビーズのような不活性担体上にプロテアー
ゼ調製物を固定化することも有利である。好適で、商業
的に入手可能な形態の焼きケイソウ土が、コロラド州デ
ンバー市のジョーンズマンヴィル（Johns Manville) に
よって、「セライト(Ceite) 」シリーズの名称の下に製
造、販売されている。好適な、商業的に入手可能な形態
のポリアクリル酸エステルが、ペンシルバニア州 フィ
ラデルフィア市のローム アンド ハース(Rohm and Ha
as) によって、「XAD −７」及び「XAD −８」の名称の
下に製造、販売されている。好適で、商業的に入手可能
な形態のポリデキストランが、スウェーデンの会社であ
る「ファルマシア（pharmacia)」社によって「セファデ
ックス(Sephadex)」の名称の下に製造、販売されてい
る。好適で、商業的に入手可能な形態のポリアクリルア
ミドが、カリフォルニア州リッチモンド市のバイオーラ
ド ラボラトリーズ社(Bio−Rad Laboratories) によっ
て「バイオゲル Ｐ（Baiogel Ｐ）」シリーズの名称に
よって製造、販売されている。
は、漂白された又は漂白されていない又は仮焼されたケ
イソウ土、ポリデキストラン、ポリアクリルアミド、ポ
リスチレン、ポリアクリル酸エステル、シリカゲル又は
多孔質ガラスビーズのような不活性担体上にプロテアー
ゼ調製物を固定化することも有利である。好適で、商業
的に入手可能な形態の焼きケイソウ土が、コロラド州デ
ンバー市のジョーンズマンヴィル（Johns Manville) に
よって、「セライト(Ceite) 」シリーズの名称の下に製
造、販売されている。好適な、商業的に入手可能な形態
のポリアクリル酸エステルが、ペンシルバニア州 フィ
ラデルフィア市のローム アンド ハース(Rohm and Ha
as) によって、「XAD −７」及び「XAD −８」の名称の
下に製造、販売されている。好適で、商業的に入手可能
な形態のポリデキストランが、スウェーデンの会社であ
る「ファルマシア（pharmacia)」社によって「セファデ
ックス(Sephadex)」の名称の下に製造、販売されてい
る。好適で、商業的に入手可能な形態のポリアクリルア
ミドが、カリフォルニア州リッチモンド市のバイオーラ
ド ラボラトリーズ社(Bio−Rad Laboratories) によっ
て「バイオゲル Ｐ（Baiogel Ｐ）」シリーズの名称に
よって製造、販売されている。
【００２７】これらの固定化酵素触媒の水分量は、0.5
〜10.0重量％でなければならず、7.0 重量％が好まし
い。酵素の担持量は、この担体の重量に基づいて、2.0
〜20重量％でなければならず、5.0 重量％が好ましい。
シスタミン、システイン、ベーターメルカプトエタノー
ル、硫化水素及びジチオトレイトールのようなアジュバ
ントを添加することによって、反応時間及び収率を向上
させることができる。これらのアジュバントは、この固
定化酵素又は溶液又は懸濁液の酵素へと、1.0 〜5.0 重
量％の量で、好ましくは2.0 重量％の量で添加すること
ができる。一般的に言うと、本発明の結合反応において
反応体の濃度が上昇すると、レニン阻害剤ペプチドの生
産の速度も上昇する。
〜10.0重量％でなければならず、7.0 重量％が好まし
い。酵素の担持量は、この担体の重量に基づいて、2.0
〜20重量％でなければならず、5.0 重量％が好ましい。
シスタミン、システイン、ベーターメルカプトエタノー
ル、硫化水素及びジチオトレイトールのようなアジュバ
ントを添加することによって、反応時間及び収率を向上
させることができる。これらのアジュバントは、この固
定化酵素又は溶液又は懸濁液の酵素へと、1.0 〜5.0 重
量％の量で、好ましくは2.0 重量％の量で添加すること
ができる。一般的に言うと、本発明の結合反応において
反応体の濃度が上昇すると、レニン阻害剤ペプチドの生
産の速度も上昇する。
【００２８】温度が上昇すると (20℃〜60℃) 、また触
媒の触媒濃度や比活性が上昇すると、反応速度もまた上
昇する。触媒の比活性は、グラム当りの活性単位数の単
位によっで特定される。触媒の比活性の好適な範囲は、
グラム当り75〜500 単位であり、この一方触媒濃度の好
適な範囲は100 〜500mg/mlである。水中に５容量％のア
セトニトリルを含有するpH6.5 の反応溶液中で25℃で１
分間当り、溶液１リットル当り、１マイクロモルのメチ
ルエステルを加水分解するのに等しい速度で、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエス
テル基質のカルボキシル末端を加水分解するのに必要な
酵素調製物の量として、活性単位を定義する。本発明の
プロテアーゼ触媒は、最小でも５回まで再使用可能であ
るようだ。
媒の触媒濃度や比活性が上昇すると、反応速度もまた上
昇する。触媒の比活性は、グラム当りの活性単位数の単
位によっで特定される。触媒の比活性の好適な範囲は、
グラム当り75〜500 単位であり、この一方触媒濃度の好
適な範囲は100 〜500mg/mlである。水中に５容量％のア
セトニトリルを含有するpH6.5 の反応溶液中で25℃で１
分間当り、溶液１リットル当り、１マイクロモルのメチ
ルエステルを加水分解するのに等しい速度で、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニンメチルエス
テル基質のカルボキシル末端を加水分解するのに必要な
酵素調製物の量として、活性単位を定義する。本発明の
プロテアーゼ触媒は、最小でも５回まで再使用可能であ
るようだ。
【００２９】この反応溶液のpHは、約6.5 〜7.5 であっ
てよく、ほぼ中性であることが好ましい。特に好適な例
においては、この結合反応に参加するペプチドアシル供
与体酸が、実施例の項で例示するように、このアシル供
与体のエステル系で開始することによって、インシテュ
で形成される。
てよく、ほぼ中性であることが好ましい。特に好適な例
においては、この結合反応に参加するペプチドアシル供
与体酸が、実施例の項で例示するように、このアシル供
与体のエステル系で開始することによって、インシテュ
で形成される。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】この実施例は、エステル形態のアシル供与
体を用いる参照結合反応に関する本発明の方法を例示し
ている。酵素触媒は、パパイン調製物250mg を、100mg
のＬ−システインと共に、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)16m
l に溶解することで調製し、プロテアーゼ調製物1.6 重
量％およびアジュバントであるＬ−システイン0.6 重量
％を含む触媒溶液を作成した。このpHを0.1M NaOH で7.
0 に再調整した。この溶液３重量部を、多孔質焼成ケイ
ソウ土（Porous calcined diatomaceous earth) 〔セラ
イト（Celite) 649 〕の１重量部（５ｇ）と混合してス
ラリーを形成し、これを時計皿に移した。この調製物中
の水を一晩蒸発させ、５重量％を担持した (loaded) 酵
素触媒を作成した。乾燥したケーキを緩やかに破壊し、
自由に流動する顆粒状調製物を得た。減圧下に150 ℃に
加熱しながら既知量の調製物の重量損失を測定すること
によって残存水を７重量％に調製した。250mM のペプチ
ドアシル供与体Mor −Phe −(SMe)Cys−OMe （構造Inを
有す) および250mM の求核試薬（３Ｓ，２Ｒ）−シクロ
ヘキシルノルスタチン（cyclohexylnorstatine)イソプ
ロピル エステル（構造IIa を有す) を含む酢酸エチル
(EtOAc)飽和水溶液の５mlを触媒1.25g に添加し（最終
触媒濃度を250mg/mlとし）、この混合物を50℃で攪拌
し、96mM/hr/WT％酵素の標準化 (normalized) 初期反応
速度を発生させ、この反応が７時間でトリペプチド レ
ニン阻害剤IIInの100 ％添加にまで進行したことが、HP
LC分析によって示された。
体を用いる参照結合反応に関する本発明の方法を例示し
ている。酵素触媒は、パパイン調製物250mg を、100mg
のＬ−システインと共に、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)16m
l に溶解することで調製し、プロテアーゼ調製物1.6 重
量％およびアジュバントであるＬ−システイン0.6 重量
％を含む触媒溶液を作成した。このpHを0.1M NaOH で7.
0 に再調整した。この溶液３重量部を、多孔質焼成ケイ
ソウ土（Porous calcined diatomaceous earth) 〔セラ
イト（Celite) 649 〕の１重量部（５ｇ）と混合してス
ラリーを形成し、これを時計皿に移した。この調製物中
の水を一晩蒸発させ、５重量％を担持した (loaded) 酵
素触媒を作成した。乾燥したケーキを緩やかに破壊し、
自由に流動する顆粒状調製物を得た。減圧下に150 ℃に
加熱しながら既知量の調製物の重量損失を測定すること
によって残存水を７重量％に調製した。250mM のペプチ
ドアシル供与体Mor −Phe −(SMe)Cys−OMe （構造Inを
有す) および250mM の求核試薬（３Ｓ，２Ｒ）−シクロ
ヘキシルノルスタチン（cyclohexylnorstatine)イソプ
ロピル エステル（構造IIa を有す) を含む酢酸エチル
(EtOAc)飽和水溶液の５mlを触媒1.25g に添加し（最終
触媒濃度を250mg/mlとし）、この混合物を50℃で攪拌
し、96mM/hr/WT％酵素の標準化 (normalized) 初期反応
速度を発生させ、この反応が７時間でトリペプチド レ
ニン阻害剤IIInの100 ％添加にまで進行したことが、HP
LC分析によって示された。
【００３５】（実施例２〜７）上記触媒を種々の不活性
担体上に固定したことを除いて、実施例１を反覆した。
試験した担体は、「セライト577 」（未漂白 ケイソウ
土）；「セライト503」( 漂白ケイソウ土) ；「セライ
ト649 」（焼成セイソウ土、50／100 メッシュ）；「セ
ライト６４８」( 焼成ケイソウ土、30／50メッシュ）、
「XAD −８」（ポリアクリル酸エステル）、およびシリ
カゲルであった。50％添加のための標準化初期反応速度
および時間を表３に示す。
担体上に固定したことを除いて、実施例１を反覆した。
試験した担体は、「セライト577 」（未漂白 ケイソウ
土）；「セライト503」( 漂白ケイソウ土) ；「セライ
ト649 」（焼成セイソウ土、50／100 メッシュ）；「セ
ライト６４８」( 焼成ケイソウ土、30／50メッシュ）、
「XAD −８」（ポリアクリル酸エステル）、およびシリ
カゲルであった。50％添加のための標準化初期反応速度
および時間を表３に示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】（実施例８〜11）触媒の担体量を変化させ
たことを除き、実施例１を反復した。結果を表４に示
す。
たことを除き、実施例１を反復した。結果を表４に示
す。
【００３８】
【表６】
【００３９】最適担持量は５重量％と測定され、10％で
はこれとほぼ同じ活性が得られ、20％ではわずかに低い
活性が示された。これは５％担持量で酵素の単層が担体
を被覆できることを示しており、より多く担持させても
有効な酵素の量は増加しないと考えられる。
はこれとほぼ同じ活性が得られ、20％ではわずかに低い
活性が示された。これは５％担持量で酵素の単層が担体
を被覆できることを示しており、より多く担持させても
有効な酵素の量は増加しないと考えられる。
【００４０】（実施例12〜14）パパイン触媒を、酵素の
担持量を５および10重量％とし、反応溶液中にアジュバ
ントのシステインを添加してまたは添加しないで調製し
たことを除き、実施例１を反覆した。触媒濃度を500mg/
mlとし、この反応を50℃で実施した。これらの結果は表
５に示すが、両方の酵素担持量において、システインを
溶液中に存在させると触媒活性が高まることが解る。
担持量を５および10重量％とし、反応溶液中にアジュバ
ントのシステインを添加してまたは添加しないで調製し
たことを除き、実施例１を反覆した。触媒濃度を500mg/
mlとし、この反応を50℃で実施した。これらの結果は表
５に示すが、両方の酵素担持量において、システインを
溶液中に存在させると触媒活性が高まることが解る。
【００４１】
【表７】
【００４２】（実施例15）加熱されたカラム反応器中で
反応を実施し、この際37g の酵素触媒を充填したカラム
を通して前記反応体を再循環させたことを除き、実施例
１を反覆した。上記したものとほぼ同一の結果が得られ
た。
反応を実施し、この際37g の酵素触媒を充填したカラム
を通して前記反応体を再循環させたことを除き、実施例
１を反覆した。上記したものとほぼ同一の結果が得られ
た。
【００４３】（実施例16〜19）種々の酵素調製触媒を用
いて実質上実施例１を反覆した。これらの結果を表６に
示す。
いて実質上実施例１を反覆した。これらの結果を表６に
示す。
【００４４】
【表８】
【００４５】（実施例20〜35）これらの実施例は、広範
囲のトリペプチド レニン阻害剤構造が、本発明の方法
による合成に適合することを示す。実施例１と同じ溶媒
及び触媒系中に、一般構造式Ｉのジペプチドメチルエス
テルの形態のアシル供与体及び一般構造式IIの求核試薬
（各々250mm)を含む溶液を，50℃で攪拌した。これらの
結果を表７に要約する。
囲のトリペプチド レニン阻害剤構造が、本発明の方法
による合成に適合することを示す。実施例１と同じ溶媒
及び触媒系中に、一般構造式Ｉのジペプチドメチルエス
テルの形態のアシル供与体及び一般構造式IIの求核試薬
（各々250mm)を含む溶液を，50℃で攪拌した。これらの
結果を表７に要約する。
【００４６】
【表９】
【００４７】（実施例36）アシル供与体酸のインシテュ
生成によって予想外に迅速な結合がもたらされることを
示すために、アシル供与体出発原料としてメチルエステ
ル形（Ｒ＝−CH3)および酸形（Ｒ＝−Ｈ）の双方におけ
る化合物Inを使用し、かつ求核試薬として構造IIa を使
用して、化合物IIInの合成を実施した。両反応は、EtOA
c 中に250mM の出発原料を含み250mg/mlの固定化パパイ
ンを含んでいた。出発原料としてエステルを使用した場
合に、100mM/hrの初期速度が達成でき、この速度は、反
応の完了に必要な約４時間継続した。対照的に、酸形態
のトリペプチド合成の初期速度は28mM/hr であり、その
速度も、ほぼ４時間継続した。
生成によって予想外に迅速な結合がもたらされることを
示すために、アシル供与体出発原料としてメチルエステ
ル形（Ｒ＝−CH3)および酸形（Ｒ＝−Ｈ）の双方におけ
る化合物Inを使用し、かつ求核試薬として構造IIa を使
用して、化合物IIInの合成を実施した。両反応は、EtOA
c 中に250mM の出発原料を含み250mg/mlの固定化パパイ
ンを含んでいた。出発原料としてエステルを使用した場
合に、100mM/hrの初期速度が達成でき、この速度は、反
応の完了に必要な約４時間継続した。対照的に、酸形態
のトリペプチド合成の初期速度は28mM/hr であり、その
速度も、ほぼ４時間継続した。
【００４８】（実施例37〜59）これらの実施例が示すと
ころでは、ジペプチドエステルのカルボキシル末端と求
核試薬のアミノ基との間の結合に対して、本発明の方法
によって高度の選択性がもたらされる。この結合反応の
間に競合しあう反応は、構造Ｉのアシル供与体のペプチ
ド結合の開裂である。位置選択性は、Ac−Phe − Ala−
OMe とNorst −OPri との参照結合反応において、開裂
生成物の生成により証明できる、フェニルアラニル−ア
ラニン ペプチド結合の開裂の標準化初期速度に対す
る、トリペプチド合成（または結合）の標準化初期速度
の比率として定義した。開裂生成物が検出できない場合
には、0.8 μM/hr/wt ％酵素の速度を、計算のための上
限として使用した。位置選択性を示すために、実施例１
に示したのとほぼ同様の方法で同一の反応物を用いて種
々のトリペプチドを合成し、この種の内部開裂の指標と
して、置換基R1およびR2を有するカルボン酸の存在を分
析した。対照実験の示すところでは、0.8 μM/hr/wt ％
酵素のような遅い速度が、24時間後に検出された。これ
らの合成反応を、24時間後に開裂生成物の存在について
試験した。これらの分析の結果を表８に示す。測定され
た位置選択性のうち最も低いのは4000であり、これは化
学的純度99.97 ％の結合生成物の生成に対応している。
20のような低い位置選択性は、化学的純度95％の結合生
成物の生成に対応しているが、これも本発明において有
用である。それはかかる混合物が通常の方法によって、
一般にヒト用の医薬品に要求される99.90 ％の化学的純
度にまで精製できるからである。
ころでは、ジペプチドエステルのカルボキシル末端と求
核試薬のアミノ基との間の結合に対して、本発明の方法
によって高度の選択性がもたらされる。この結合反応の
間に競合しあう反応は、構造Ｉのアシル供与体のペプチ
ド結合の開裂である。位置選択性は、Ac−Phe − Ala−
OMe とNorst −OPri との参照結合反応において、開裂
生成物の生成により証明できる、フェニルアラニル−ア
ラニン ペプチド結合の開裂の標準化初期速度に対す
る、トリペプチド合成（または結合）の標準化初期速度
の比率として定義した。開裂生成物が検出できない場合
には、0.8 μM/hr/wt ％酵素の速度を、計算のための上
限として使用した。位置選択性を示すために、実施例１
に示したのとほぼ同様の方法で同一の反応物を用いて種
々のトリペプチドを合成し、この種の内部開裂の指標と
して、置換基R1およびR2を有するカルボン酸の存在を分
析した。対照実験の示すところでは、0.8 μM/hr/wt ％
酵素のような遅い速度が、24時間後に検出された。これ
らの合成反応を、24時間後に開裂生成物の存在について
試験した。これらの分析の結果を表８に示す。測定され
た位置選択性のうち最も低いのは4000であり、これは化
学的純度99.97 ％の結合生成物の生成に対応している。
20のような低い位置選択性は、化学的純度95％の結合生
成物の生成に対応しているが、これも本発明において有
用である。それはかかる混合物が通常の方法によって、
一般にヒト用の医薬品に要求される99.90 ％の化学的純
度にまで精製できるからである。
【００４９】
【表１０】
【００５０】（実施例60〜67）これらの実施例が示すと
ころでは、本発明の方法はジアステレオ選択的であり、
即ちR3置換基結合位置で（Ｌ）配置の方が遙かに優先し
ながらトリペプチドの生成が起こっている。ジアステレ
オ選択性は、（Ｌ，Ｄ）−異性体の合成の標準化初期速
度に対する（Ｌ，Ｌ）−異性体の合成の標準化初期速度
の比率として定義した。合成が検出できない場合は、0.
8 μM/hr/wt ％酵素の限界値を使用した。反応物および
反応条件は、実施例１とほぼ同様にした。この結合方法
のジアステレオ選択性を、４種のトリペプチドのエピマ
ー：IIIaおよびIIIh ; IIIi およびIIIr ; IIIi および
IIIj ; ならびにIIIkおよびIIIlのパパイン−触媒合成
に示した。全ての場合において、R3置換基結合アミノ酸
位置のＤ−アミノ酸（Ｒ−配置）により、結合（ならび
にジペプチドエステルの加水分解）が妨げられた。R1置
換基結合アミノ酸位置のＤ−アミノ酸残基（Ｒ−配置）
は、結合を遅くさせるが、妨げはしなかった。これらの
結果を表９に示す。
ころでは、本発明の方法はジアステレオ選択的であり、
即ちR3置換基結合位置で（Ｌ）配置の方が遙かに優先し
ながらトリペプチドの生成が起こっている。ジアステレ
オ選択性は、（Ｌ，Ｄ）−異性体の合成の標準化初期速
度に対する（Ｌ，Ｌ）−異性体の合成の標準化初期速度
の比率として定義した。合成が検出できない場合は、0.
8 μM/hr/wt ％酵素の限界値を使用した。反応物および
反応条件は、実施例１とほぼ同様にした。この結合方法
のジアステレオ選択性を、４種のトリペプチドのエピマ
ー：IIIaおよびIIIh ; IIIi およびIIIr ; IIIi および
IIIj ; ならびにIIIkおよびIIIlのパパイン−触媒合成
に示した。全ての場合において、R3置換基結合アミノ酸
位置のＤ−アミノ酸（Ｒ−配置）により、結合（ならび
にジペプチドエステルの加水分解）が妨げられた。R1置
換基結合アミノ酸位置のＤ−アミノ酸残基（Ｒ−配置）
は、結合を遅くさせるが、妨げはしなかった。これらの
結果を表９に示す。
【００５１】
【表１１】
【００５２】これまで明細書中で使用してきた用語と表
現とは、明細書中で説明のために使用したものであっ
て、制限のために使用したものではない。これらの用語
及び表現を使用するのに際しては、提示しかつ記載した
特徴やそれらの一部分の均等物を排除する意図はない。
本発明の範囲は、続く請求の範囲によってのみ定義さ
れ、制限されることを認識されたい。
現とは、明細書中で説明のために使用したものであっ
て、制限のために使用したものではない。これらの用語
及び表現を使用するのに際しては、提示しかつ記載した
特徴やそれらの一部分の均等物を排除する意図はない。
本発明の範囲は、続く請求の範囲によってのみ定義さ
れ、制限されることを認識されたい。
Claims (12)
- 【請求項１】 【化１】 の構造を有するペプチドアシル供与体を、 【化２】 の構造を有する求核試薬と反応させることで、 【化３】 の構造のペプチドレニン阻害剤を合成する方法であっ
て、 プロテアーゼ調製物の存在下にこの反応を実施すること
を特徴とし、ここで上記ペプチドアシル供与体Ac−Phe
−Ala −OMe 及び上記求核試薬Norst − OPriの双方を1
00 〜500mM 含む25°〜60℃の水飽和酢酸エチル溶液中
でpH6.5 〜7.5で４〜20重量％の水を含有する担持触媒
の形でプロテアーゼ調製物が存在し、プロテアーゼ調製
物が、前記ペプチドアシル供与体のカルボキシル末端と
前記求核試薬のアミノ基との結合を、 (a) 溶液１リットル当り、１時間当り、酵素調製物の重
量パーセント当り、結合ジペプチド1.0 ミリモル以上の
初期反応速度； (b) 20以上：１のフェニルアラニルアラニンペプチド結
合の開裂に対する結合の位置選択性；及び (c) 20以上：１の、Ac−L −Phe −L −Ala −Norst −
OPri の生成へのジアステレオ選択性をもって触媒し、 ここで、Ｒは、水素、アルキル基、シクロアルキル基、
アリル基又はアラルキル基であり；R1は、ROCONH−，RO
COO −，ROCOCH2 −，RNHCONH −，RNHCOO−，RNHCOCH2
−，RSO2NH−，又はRSO2CH2 −であり、 R2, R4及びR6は、それぞれ独立してアルキル基、シクロ
アルキル基、アリル基又はアラルキル基であり；R3は、
水素、アルキル基、シクロアルキル基、４−イミダゾイ
ル基、−OH, −SR, −(CH2) n −SR, 又は−(CH2) n −
NH2 であり、ここでｎは１〜６の整数であり；R5は、−
COOR6, −CHOHR6, −CH2CONHCH2R6, 又は−CH2CHRCONH
R6であり；アルキル基は、１〜20個の炭素原子を有す
る、置換又は非置換又はヘテロ原子含有の直鎖又は分技
鎖炭素基であり；シクロアルキル基は、３〜７個の炭素
原子を有する環状構造であり、ここでこの環中に架橋構
造又はヘテロ原子を含んでいてよく、又は置換シクロア
ルキル基であり；アリル基は、６〜10個の炭素原子を有
する単環性、二環性又はヘテロ環性の芳香族基、又は置
換アリル基であり；及びアラルキル基は、アリル基に結
合されたアルキル基である；ヘプチドレニン阻害剤を合
成する方法。 - 【請求項２】 前記プロテアーゼ調製物がスルフヒドリ
ルプロテアーゼである、請求項１記載のペプチドレニン
阻害剤を合成する方法。 - 【請求項３】 前記プロテアーゼ調製物が、パパイン、
キモパパイン、フィシン及びブロメラインから選択され
ている、請求項１記載のペプチドレニン阻害剤を合成す
る方法。 - 【請求項４】 【化４】 の構造を有するペプチドアシル供与体を、 【化５】 の構造を有する求核試薬と、 パパイン、キモパパイン、フィシン及びブロメラインか
ら実質的になる群のうちの少なくとも１種からなるプロ
テアーゼ調製物の存在下に反応させることで、 【化６】 の構造のペプチドレニン阻害剤を合成する方法であっ
て、ここで、 Ｒは、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アリル基
又はアラルキル基であり；R1は、ROCONH−，ROCOO −，
ROCOCH2 −，RNHCONH −，RNHCOO−，RNHCOCH2−，RSO2
NH−，RSO2O −，又はRSO2CH2 −であり、 R2, R4及びR6は、それぞれ独立してアルキル基、シクロ
アルキル基、アリル基又はアラルキル基であり；R3は、
水素、アルキル基、シクロアルキル基、４−イミダゾイ
ル基、−OH, −SR, −(CH2) n −SR, 又は−(CH2) n −
NH2 であり、ここでｎは１〜６の整数であり、 R5は、−COOR6, −CHOHR6, −CH2CONHCH2R6, 又は−CH
2CHRCONHR6であり；アルキル基は、１〜20個の炭素原子
を有する、置換又は非置換又はヘテロ原子含有の直鎖又
は分技鎖炭素基であり；シクロアルキル基は、３〜７個
の炭素原子を有する環状構造であり、ここでこの環中に
架橋構造又はヘテロ原子を含んでいてよく、又は置換シ
クロアルキル基であり；アリル基は、６〜10個の炭素原
子を有する単環性、二環性又はヘテロ環性の芳香族基、
又は置換アリル基であり；及びアラルキル基は、アリル
基に結合されたアルキル基である；ヘプチドレニン阻害
剤を合成する方法。 - 【請求項５】 前記プロテアーゼ調製物が、粉末、溶
液、担体上の固定化物、酵素を合有する細胞性抽出物及
び酵素含有細胞から選択された形態である、請求項１又
は４記載のヘプチドレニン阻害剤を合成する方法。 - 【請求項６】前記プロテアーゼ調製物が、実質的に多孔
質焼きケイソウ土からなる担体上に固定化されている、
請求項５記載のペプチドレニン阻害剤を合成する方法。 - 【請求項７】 前記の固定化プロテアーゼ調製物が、担
体の重量に対して、２〜20重量％の量で存在している、
請求項６記載のペプチドレニン阻害剤を合成する方法。 - 【請求項８】 前記の固定化プロテアーゼ調製物が0.5
〜10重量％の水を含有する、請求項６記載のペプチドレ
ニン阻害剤を合成する方法。 - 【請求項９】 前記の固定化プロテアーゼ調製物が、実
質的にシステイン、シスタミン、ベーターメルカプトエ
タノール、硫化水素及びジチオトレイトールからなる群
より選ばれたアジュバントを含有している、請求項６記
載のペプチドレニン阻害剤を合成する方法。 - 【請求項１０】 前記プロテアーゼ調製物の前記溶液用
の溶媒が、水、有機溶剤、及び水と有機溶媒との混合物
から選択されている。請求項５記載のペプチドレニン阻
害剤を合成する方法。 - 【請求項１１】 前記の酵素を含有する細胞が全細胞で
ある、請求項５記載のペプチドレニン阻害剤を合成する
方法。 - 【請求項１２】 前記の酵素を含有する細胞が部分細胞
である、請求項５記載のペプチドレニン阻害剤を合成す
る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74407791A | 1991-08-12 | 1991-08-12 | |
| US07/744077 | 1991-08-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292992A true JPH05292992A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=24991337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4215212A Pending JPH05292992A (ja) | 1991-08-12 | 1992-08-12 | ペプチドレニン阻害剤を合成する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0528629A2 (ja) |
| JP (1) | JPH05292992A (ja) |
| KR (1) | KR930004474A (ja) |
| CA (1) | CA2075771A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR950702188A (ko) * | 1992-07-02 | 1995-06-19 | 후지야마 로오 | 아미노산 유도체 생산 및 합성의 신규 중간체 |
| US6017887A (en) * | 1995-01-06 | 2000-01-25 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide, peptide analog and amino acid analog protease inhibitors |
| US5804560A (en) * | 1995-01-06 | 1998-09-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide and peptide analog protease inhibitors |
-
1992
- 1992-08-11 CA CA002075771A patent/CA2075771A1/en not_active Abandoned
- 1992-08-12 JP JP4215212A patent/JPH05292992A/ja active Pending
- 1992-08-12 KR KR1019920014520A patent/KR930004474A/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-08-12 EP EP92307368A patent/EP0528629A2/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0528629A3 (ja) | 1994-05-04 |
| EP0528629A2 (en) | 1993-02-24 |
| KR930004474A (ko) | 1993-03-22 |
| CA2075771A1 (en) | 1993-02-13 |
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