KR0172590B1

KR0172590B1 - 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 항비루스 활성 및 그것의 분해방법

Info

Publication number: KR0172590B1
Application number: KR1019930702516A
Authority: KR
Inventors: 데니스 씨. 리오타; 레이몬드 에프. 쉬나지; 최우백
Original assignee: 빈센트 라테르자; 에모리 유니버시티
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1999-02-01
Also published as: DK1439177T3; RO122814B1; EP0575482A1; BR9205661A; AU665187B2; DE69233379T2; CA2104399A1; DE69233786D1; PT100151B; CA2104399C; HU211344A9; IL100965A0; JP3292830B2; AU8077398A; FI20030932A; AU1561792A; EP1439177A1; CN1127301A; NO932980L; JP2901160B2

Abstract

본 발명은 약학적 허용 담체중의 유효량의 2-히드록시메틸-5-(-5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 5' 또는 N⁴알킬화 또는 아실화 유도체를 비롯한 그것의 약학적 허용 유도체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 인체의 HIV 또는 HBV 감염을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 거울상 이성질체중 하나의 반응만을 차별적으로 촉매하는 효소로 라세미 혼합물을 처리하는 단계를 포함하는, 누클레오시드 거울상 이성질체를 분해하는 방법도 개시되어 있다.

Description

[발명의 명칭]

2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 항비루스 활성 및 그것의 분해방법

[발명의 배경]

본 발명은 생물학적 활성 누클레오시드 분야에 해당하는 것으로써, 구체적으로 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥타시올란(FTC)을 비롯한 항비루스 조성물, 그것의 생리학적 허용유도체, 또는 생리학적 허용염과, FTC의 (-)-β-L 및 (+)-β-D 거울상 이성질체의 분해방법 및 사용방법에 관한 것이다.

1981년에는, 후천성 면역 결핍증(ADIS)이 인체면역 시스템을 매우 손상시키면서 거의 사망하는 질병으로 판명되었다. 1983년에는, ADIS의 병인학적 원인이 인체 면역결핍 비루스(HIV)로 판명되었다. 1990년 12월까지, 세계 보건기구에서 산출한 바로는 전세계 8백만 내지 천만명이 HIV에 감염되었으며, 미국에서만 1,000,000 내지 1,400,000인 것으로 확인되었다.

1985년에는, 합성 누클레오시스 3'-아자이도-3'-데옥시티미딘(AZT)이 인체 면역결핍 비루스의 복재를 방해하는 것으로 밝혀졌다. 이후로, 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시시티딘(DDC), 3'-플루오로-3'-데옥시티미딘(FLT), 및 2',3'-디데옥시-2',3-디데히드로티미딘(D4T)를 비롯한 다른 많은 합성누클레오시드가 HIV에 효과적인 것으로 판명되었다. 기타 많은 2',3'-디데옥시누클레오시드는 생체외 많은 비루스의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 합성 누클레오시드는, 세포 키나아제에 의해 5'-트리포스페이트에 세포 인상화반응이 이루어진후 비루스 DNA의 성장균주에 합성되어, 3'-히드록시기의 부재로 인한 결합의 종결을 유발시킨다.

다양한 2',3'-디데옥시누클레오시드가 생체내 또는 생체외에서 HIV의 복제를 방해할 수 있음이 밝혀진 후로, 누클레오시드의 3'-위치의 탄소원자가 이종원자로 치환된 누클레오시드를 많은 연구원들이 계획하고 테스트하였다. 노벡외 다수의 문헌에는, (±)-1-[(2β, 4β)-2-(히드록시메틸)-4-디옥솔라닐]티민(일명, (±)-디옥솔란-T)이 HIV에 대해 적당한 활성을 지니며(ATH 8 세포에 대한 ES₅₀=20㎛), 200㎛의 농도에서는 비감염된 대조 세포에 독성을 띠지 않음이 개시되어 있다[Tetrahedron Letters 30(46), 6246, (1989)]. IAF Biochem International, Inc.에 양도된, 유럽특허출원 공고 제 0 337 713호 및 미합중국 특허 제 5,041,449호에는 항비루스 활성을 지닌 2-치환-4-1,3-디옥솔란이 개시되어 있다.

IAF Bioehem International, Inc.에 양도된, 미합중국 특허 제 5,047,407호 및 유럽특허 출원 공고 제 0 382 526호에는 항비루스 활성을 지닌 많은 2-치환-5-치환-1,3-옥사티올란 누클레오시드가 개시되어 있으며, 구체적으로 2-히드록시메틸-5-(시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 C1'-β 이성질체의 라세미혼합물(거의 C4'-위치)(이하부터는 (±)-BCH-189로 칭함)이 HIV에 대해 AZT와 거의 동일한 활성을 지니며, 테스트량으로는 세포독성을 띠지 않는 것으로 보고되었다. (±)-BCH-189는 또한 36주 이상동안 AZT로 치료받은 환자의 생체외 AZT-내성 HIV 분리체의 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌다.

인체 건강상의 심각한 문제점을 유발시키는 또다른 비루스는 B형 간염 비루스(이하에서는 HBV로 칭함)이다. HBV는 담배를 제외한다면 인체암을 유발시키는 원인중 최우선이다. HBV가 암을 유발시키는 매카니즘은 알려져 있지 않으나, 종양발생을 직접적으로 유인하거나, 만성염증, 경변증, 및 감염과 관련된 세포재생을 통해 종양발생을 간접적으로 유발시킬 수 있는 것으로 가정된다.

숙주가 감염사실을 깨닫지 못하는 2~6개월의 잠복기간 이후에는, HBV감염은 급성간염 및 간손상을 일으킬 수 있으며, 이로써 복부통증, 황달, 및 특정 효소의 혈액내 수치 상승을 유발시킨다. HBV는 넓은 부위의 간이 파괴되는, 급진행성의, 종종 치명적 형태의 질병인, 돌발성 간염을 유발시킬 수 있다.

급성 간염은 통상적으로 치료된다. 그러나, 일부 환자는 연장된 또는 무제한적인 기간동안 혈액내에 고수치의 비루스 항원이 존재함으로써, 만성감염이 유발된다. 만성감염은 만성 지속성 간염을 유발시킬 수 있다. 만성지속성 HBV에 감염된 환자는 개발도상국에 가장 많다. 1991년 중반까지, HBV만성질환자는 아시아에만 약 2억 2천 5백만이 있었으며, 세계적으로는 거의 3억에 달했다. 만성 존속 감염은 피로, 간경변, 및 간세포 종양, 1차 간암을 유발시킬 수 있다.

서양의 산업화 국가에서는, HBV 보균자 또는 그들의 혈액샘플과 접하는 집단을 HBV 감염의 위험이 높은 집단으로 정하고 있다. HBV의 유행병학은 AIDS와 매우 유사한데, 이는 HBV 감염이 AIDS 또는 AIDS 관련 합병증의 환자사이에 많다는 점에 대한 설명이 된다. 그러나, HBV는 HIV보다 전염성이 강하다.

인체 혈청에서 수득된 백신은 환자를 HBV에 대해 면역시키기 위해 개발된 것이다. 그 효과는 밝혀졌으나, 만성 보균자의 인체 혈청의 공급이 제한적이고 정제과정이 길고 비용이 비싸기 때문에 백신의 제조에 어려움이 있다. 또한, 다른 혈청으로 제조된 각 배치의 백신은 안전성을 위해 침팬지에 테스트하여야 한다. 백신은 또한 면역공학을 통해 제조되기도 했다. 면역학적으로 제조된 단백질인 α-인터페론으로 매일 치료할 경우 희망적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 최근까지는 비루스의 복제를 효과적으로 억제하는 공지된 약학체제가 없다.

약학적 용도로서 누클레오시드를 시판하기 위해서는 독성이 낮으면서 효과적이어야 하며, 또한 제조비용이 저렴해야 한다. 다량의 누클레오시드를 저렴한 비용으로 제조하기 위한 새로운 제조방법에 대한 많은 연구 및 개발이 수행되고 있다. 현재에는 하기 2대의 경로를 통해 2',3'-디데옥시누클레오시드를 제조하고 있다: 원상태의 누클레오시드의 유도화 반응 또는 헤테로고리염기를 지닌 유도화된 당 부분의 축합반응. 원상태의 누클레오시드를 변성시킴으로써 새로운 누클레오시드를 제조하는 경우에는 많은 불잇점이 있으나, 이 접근방식의 주요 잇점은 거의 절대 입체 화학이 이미 설정되어 있다는 점이다. 그러나, 이 접근방식은 비자연적 발생염기 또는 비자연적 발생 탄수화물 부(이것들은 본래 그대로의 누클레오시드로부터 제조된 것이 아님)를 포함하는 누클레오시드, 예를들면 1,3-옥사티올란 누클레오시드 및 1,3-디옥솔란 누클레오시드의 제조에는 사용될 수 없다.

헤테로 고리염기를 지닌 탄수화물 또는 탄수화물-유사부위를 축합하여 합성 누클레오시드를 형성하는 경우에는, 2개의 비대칭 중심(C1' 및 C4'-위치)를 지닌 누클레오시드가 형성됨에 따라, 부분입체 이성질체 쌍으로서 존재하게 된다. 각 부분입체 이성질체는 한쌍의 거울상 이성질체로써 존재한다. 따라서, 생성물은 4개 거울상 이성질체의 혼합물이다.

종종 C1' 또는 C4'-위치에 비자연발생적 입체이성질체를 지닌 누클레오시드가 입체이성질체를 지닌 원상태와 동일한 누클레오시드 보다 활성이 적은 것으로 종종 밝혀졌다. 예를들어, 카터외 다수의, 「Antimicrobial Agents and Chemotherapy」, 34:6, 1297-1300(1990, 6)에는, 역 전사효소 활성을 50% 저하시키는데 필요한 세포 배양체중의 카보버(2',3'-디데히드로-2',3'-디데옥시구아노신)의 (-)-거울상 이성질체의 농도(EC₅₀)가 0.8μM인 반면, 카보버의 (+)-거울상 이성질체이 EC₅₀은 60μM 이상인 것으로 보고되었다.

PCT 국제 공고 제 WO 91/11186호에는, 축합 반응에 사용된 루이스산을 주의깊게 선택함으로써, 높은 부분입체 이성질체 선택성을 지닌 1,3-옥사티올란 누클레오시드(C1'-탄소로부터 헤테로고리염기의 까지 결합이 β형태인 높은 퍼센테이지의 누클레오시드)를 제조할 수 있음이 개시되어 있다. 염화 제2주석이 축합촉매로 사용되는 경우에는, 거의 완전한 β-입체 특이성의 존재하에 염기와 1,3-옥사티올란 누클레오시드의 축합이 일어남이 밝혀졌다. 다른 루이스산은 낮은 C1'-β선택도를 제공하거나 또는 제공하지 않으면서 반응에 단순히 촉매작용을 하지 못한다.

후천성 면역 결핍증(AIDS), AIDS관련 합병증, 및 B형 간염이 전세계적으로 유행병 수준에 이르렀고, 감염된 환자에 비극적인 결과를 낸다는 사실에 비추어보면, 숙주에 대한 독성이 낮으면서 이들 질병을 치료할 수 있는 신규의 효과적인 약학 제제가 강력히 요구된다.

또한 약학적으로 중요한 누클레오시드를 제조하기 위한, 구체적으로는 탄수화물-유사부위와 염기를 축합시켜 제조한 합성 누클레오시드의 C4'-위치에 β-입체특이성을 부여하기 위한, 비용면에서 저렴하고 상업적으로 시행가능한 방법을 제공할 필요성이 있으며, 따라서, 본 발명의 목적은 HIV에 감염된 환자의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HBV에 감염된 환자 또는 다른 숙주동물의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 거울상 이성질체적으로 집중된 1,3-옥사티올란 누클레오시드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 1,3-옥사티올란 누클레오티드의 C4'-거울상 이성질체를 분해하는 방법을 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

약학적 허용담체중의 유효량의 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 5' 또는 N⁴알킬화 또는 아실화 유도체를 비롯한 이들의 약학적 허용유도체, 또는 이들의 약학적 허용염을 투여하는 것을 비롯한, 인체 및 다른숙주 동물의 HIV 및 HBV감염을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다.

2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC)는 숙주세포에 대한 독성이 매우 낮고, 인체 면역결핍 비루스에 대해 상당히 높은 활성을 지니는 것을 밝혀졌다. 또한 FTC는 HBV에 상당한 활성을 지니므로, HBV감염과 관련된 많은 질병의 환자를 치료하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다.

독성 및 약력학 연구를 통해, 약학적 투여를 위한 항비루스 제제로서의 FTC의 유용성을 확인하였다. FTC 및 그것의 거울상 이성질체는 50μM 이하의 농도에서는 주변 인체 골수세포에 비독성을 지니며, 200μM 이하에서는 다른 세포계에 비독성을 지닌다. FTC-TP는 PBMC 및 HepG 2 세포의 주요 세포내 신진대사물이다. FTC-TP는 폴리(Ⅰ)올리고(dC) 주형-프라이머를 사용하여 K₁이 0.2μM인 HIV-1 역 전사효소(RT)를 경쟁적으로 억제한다. 서열분석을 통해, HIV-RT가 사용되는 경우 FTC-TP는 잠재성 DNA결합 종결자인 것으로 밝혀질 수 있다(C-종결 형태).

FTC로의 만성치료는 설치류에는 독성을 지니지 않는데, 심지어 2달이상동안 하루에 85㎎/㎏씩 경구 투여하는 경우에도 비독성을 띤다. 리서스 원숭이에서의 FTC의 약력학을 통해, 경우 생효율성이 높으며(약 73±6%) 플라스마의 최종 반감기가 약 1.34±0.18(경구투여시와 정맥내 투여시의 평균)임을 알 수 있다.

거울상 이성질체중 하나의 반응만을 차별적으로 촉매하는 효소로써 라세미 혼합물을 처리하는 단계가 포함된, FTC의 라세미 혼합물을 비롯한 누클레오시드 거울상이성질체의 라세미 혼합물을 분해하는 방법도 또한 개시되어 있다. 상기 방법은 탄수화물부 또는 염기부에 임의 치환된 피리미딘 및 퓨린 누클레오시드를 비롯한 광범위한 누클레오시드를 분해하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 탄수화물부중의 부가의 헤테로원자를 포함하는 누클레오시드 유도체, 예를들면 (±)-FTC 및 (±)-BCH-189를 분해하는데 사용될 수 있다. 누클레오시드의 분해는 적당한 비용선에서 다량으로 수행할 수 있다.

본문중에 기재된 방법을 사용하여, FTC를 그것의 (+)-β-D와 (-)-β-L 거울상 이성질체로 분해하였다. (-)-β-L거울상 이성질체는 (+)-β-D-거울상 이성질체 보다 HIV, HBV, 및 SIV에 대해 효과가 큰 것으로 나타났다. FTC의 (+)-거울상 이성질체 또한 HIV, HBV, 및 SIV에 활성을 지닌다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC)의 화학구조를 나타낸 것이다.

제2도는 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 제조방법을 나타낸 것이다.

제3도는 FTC의 (+)와 (-)거울상 이성질체에 대한 알칼리성 포스파타아제 및 뱀의 독액중 포스포디에스테라아제의 특이성을 나타낸 흐름도이다.

제4도는 효소 Amano PS-800(-□-) 및 PLE(-⊙-)를 사용했을 경우 일정시간에 걸쳐 FTC의 5'-부티릴 에스테르의 리파아제-촉매 가수분해가 진행되는 것을 나타낸 그래프이다.

제5도는(실시예 4의 방법을 통해 제조된) 라세미 및 거울상 이성질체적으로 집중된 FTC의 농도(μM)의 효과에 대한 HIV-1 감염된 인체 PBM 세포의 억제율(%)을 나타낸 그래프이다 [(-●-, (±)-FTC), (-○-, (-)-FTC), (-■-, (+)-FTC)].

제6도는 HIV-1 감염된 PBM세포의 억제율(%)에 미치는 라세미 및 거울상 이성질체적으로 집중된 FTC(실시예 3의 방법을 통해 제조)의 농도(μM)의 영향을 나타낸 그래프이다 [(-●-, (±)-FTC), (-○-, (-)-FTC), (-■-, (+)-FTC)].

제7도는 일정시간(시간)내에 인체 PBM 세포의 삼중수소화1된 (±)-FTC의 흡수율에 대한 pmol/10⁶세포를 나타낸 그래프이다.

제8도는 인체의 PBM 세포로부터 방사선 표시된 (±)-FTC의 배출도를 나타낸 그래프이다(pmol/10⁶세포에 대한 시간단위로 측정).

제9도는 [³H]-(±)-FTC 및 그것의 포스포릴레이트 유도체가 10μM의 [³H]-(±)-FTC를 포함한 배지중에 배양한 인체 HepG-2-세포(2개 측정치의 평균)에 존재하는지의 여부를 나타낸 것이다(지정시간에 걸쳐 pmol/10⁶세포로 측정).

제10도는 24시간동안 10μM의 [³H]-(±)-FTC(700 DPM/pmole)로 세포를 처리하고, 이어서 제거한지 24시간후에 화합물의 농도를 측정한 후 일정시간에 걸쳐 pmol/10⁶세포로 인해 HepG2의 [³H]-(±)-FTC와 그것의 포스포릴레이트 유도체의 일정시간에 걸친 방출도를 나타낸 것이다.

제11도는 24시간동안 10μM의 [³H]-(±)-FTC(700 DPM/pmole)과 함께 배양한 후 인체 HepG2의 [³H]-(±)-FTC 및 그것의 포스포릴레이트 유도체의 합성농도가 저하됨을 나타낸 것이다(일정시간에 걸쳐 pmol/10⁶세포).

제12도는 농도(μM)에 대한 생존율로 측정된, 과립구-대식세포의 선구세포의 콜로니 형성에 미치는 FTC의 효과를 나타낸 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본문에 사용된 용어 거울상 이성질체적 집중된 누클레오시드는 누클레오시드의 한 거울상이성질체가 95% 이상을 차지하는 누클레오시드 조성물을 칭하는 것이다.

본문에 사용된 용어 FTC는 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(라세미형태 또는 거울상 이성질체)를 칭하는 것이며, 또한 2'-데옥시-플루오로-3'-티아시티딘으로 칭하기도 한다.

본문에 사용된 용어 (±)-FTC는 (±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 칭하는 것이다.

본문에 사용된 용어 (-)-FTC는 (-)-β-L-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 칭하는 것이다.

본문에 사용된 용어 FTC-MP, FTC-DP, 및 FTC-TP는 각각 FTC의 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트를 칭하는 것이다.

본문에 사용된 용어 BCH-189는 2-히드록시메틸-5-(시토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 칭하는 것이다.

본문에 사용된 용어 차별적 효소 촉매반응은 다른것에 비해 한 기질을 선호하는 효소에 의한 촉매반응을 칭하는 것이다.

본문에 사용된 이탈기는 작용기기 결합된 분자로부터 작용기가 분리되는 경우 초기 탄화반응을 수행하는 작용기를 의미한다.

본문에 개시된 발명은 약학적 허용담체중의 유효량의 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로 시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 (±)-β-D,L, (-)-β-L 또는 (+)-β-D 거울상 이성질체, 5' 또는 N⁴알킬화 또는 아실화 유도체를 비롯한 약학적(생리학적) 허용 유도체, 또는 그것의 약학적(생리학적) 허용염을 투여하는 것을 포함하는, HIV 및 HBV 감염, 및 유사방식으로 복제하는 다른 비루스를 치료하기 위한 방법과 조성물에 관한 것이다. 하기에 제시된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 자체적으로 항-HIV-1, 항-HIV-2 및 항-시미안 면역결핍 비루스(항-SIV)활성과 같은 항레트로비루스 활성을 지니거나 또는 항 레트로비루스 활성을 지닌 화합물로 대사된다.

FTC 및 이것의 약학적 허용 유도체 또는 이들 화합물을 함유한 약학적 허용 제제는 HIV 감염 및 AIDS 관련 합병증(ARC), 지속성 전신화 림프절질환(PGL), AIDS-관련 신경학적 상태, 항-HIV 항체 양성 및 HIV-양성 상태, 카포시 육종, 혈소판 감소증 푸르푸레아 및 기회 감염증상과 같은 다른 관련 상태에 유용하다. 또한, 이들 화합물 또는 제제는 항-HIV 항체를 지니거나 또는 HIV-항원에 양성반응을 보이는 환자 또는 HIV에 노출된 환자의 임상질병의 진행을 지연하거나 예방하기 위해 예방학적으로 사용될 수 있다.

FTC 및 이것의 약학적 허용유도체 또는 염 또는 이들 화합물을 함유한 약학적 허용 제제는 HBV 감염 및 항-HBV항체에 양성상태 및 HBV-양성상태, HBV에 의한 만성간염, 경변증, 급성 간염, 돌발성 간염, 만성 존속 간염, 및 피로와 같은 다른 관련상태를 예방 및 치료하는데 유용하다. 이들 화합물 또는 제제는 또한 항-HBV 항체 또는 HBV-항원 양성의 환자 또는 HBV에 노출된 환자의 임상학적 질병을 지연시키거나 예방하는데 예방학적으로 사용될 수 있다.

요약해보면, 본 발명은 하기 (a)~(f)를 특징으로 한다:

(a)(±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란 및 이것의 약학적 허용 유도체 및 염 ;

(b)(-)-β-L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란 및 이것의 약학적 허용 유도체 및 염 ;

(c)(±)-β-D-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란 및 이것의 약학적 허용 유도체 및 염 ;

(d)의학적 치료, 예를들어 HIV 또는 HBV 감염의 예방 또는 치료에 유용한 (±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 이것의 (-) 및 (+) 거울상 이성질체, 및 이들의 약학적 허용 유도체와 염 ;

(e)(±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 이것의 (-) 및 (+) 거울상 이성질체와, 이들의 약학적 허용 유도체 및 염을 HIV 또는 HBV 감염의 치료를 위한 의약품 제조시 사용하는 방법 ;

(f)(±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 이것의 (-) 또는 (+) 거울상 이성질체, 또는 이들의 약학적 허용 유도체 또는 염을 약학적 허용담체와 함께 함유하는 약학 제제 ;

(g)(i) 하기 일반식(A)의 1,3-옥사티올란과 임의보호된 5-플루오로시토신을 반응시키고; 임의로 임의의 히드록실 보호기를 제거하는 단계;

(ii) 시토신 고리의 5-위치내에 불소원자를 도임시키기 위한 플루오르화제와 하기 일반식(B)의 화합물을 반응시키는 단계; 또는

(iii) 우라실고리의 4-위치내 옥소기를 아미노기로 전환시키기 위한 제제와 하기 일반식(C)의 화합물을 반응시키고; 의의 잔류 보호기를 제거함으로써 바람직한 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는, 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 제조하는 방법 ;

(상기식중, R_1a는 수소 또는 아실기를 비롯한 보호기이고, R_1b는 아미노 보호기이고, L은 이탈기이다) ;

(f) (-) 거울상 이성질체와 (+) 거울상 이성질체의 혼합물 형태의 상기 화합물 또는 이것의 유도체(예, 5'-에스테르)를 조건에 적용시키거나 거울상 이성질체를 분해시키기 위한 시약과 반응시키는 단계 및 필요에 따라 생성된 유도체를 전구 화합물로 전환시키는 단계를 포함하는, 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 (-) 또는 (+) 거울상 이성질체를 제조하는 방법.

방법 (e)의 (i)단계에서, 히드록시 보호기로는 아실(예, 아세틸), 아릴아실(예, 벤조일 또는 치환된 벤조일), 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 벤질 또는 치환된 벤질, 트리알킬 실릴(예, 디메틸-t-부틸실릴) 또는 디페닐메틸실릴을 비롯한 삼중치환된 실릴과 같은 보호기가 있다. 5-플루오로시토신 화합물은 삼중치환된 실릴기로 임의 보호될 수 있다. 보호기는 종래의 방식으로 제거될 수 있다. 이탈기 L은 누클레오시드 화학분야에 공지된 통상적인 이탈기, 예를들면 염소 또는 브롬과 같은 할로겐, 메톡시 또는 에톡시와 같은 알콕시, 또는 아세틸 또는 벤조일과 같은 아실이다.

방법(e) 중 (i)단계의 반응은 루이스산, 바람직하게는 염화 제2주석, 또는 트리메틸실릴 트리플레이트의 존재하에 유기용매(예, 1,2-티클로로에탄 또는 아세토니트릴)중에서 수행할 수 있다.

일반식 A의 화합물(식중, L은 아실기, 예를들면, 아세틸기임)은 하기 일반식(D)의 화합물과 환원제(예, 수소화 리튬 알루미늄)를 반응시킨후, 바람직한 중간체에 적당한 종래의 시약, 예를들면 아실화를 위한 무수카르복실산(아세트산), 할로겐화를 위한 염소화 또는 브롬화 시약, 또는 알킬화 시약으로 처리함으로써 수득할 수 있다:

상기식중, R_1a는 상기 정의한 바와 같다.

상기 일반식(D)의 화합물은 고온하에서 하기 일반식(E)의 화합물과 HSCH₂CO₂H를 반응시킴으로써 제조할 수 있다:

상기식중, R_1a는 상기 정의한 바와 같다.

상기 일반식(E)의 화합물은 일반식 CH₂=CH-OR의 알릴 에테르 또는 에스테르 또는 일반식 ROCH₂-CH=CH-CH₂OR(식중, R은 알킬, 실릴, 또는 아실기와 같은 보호기임)의 2-부텐-1,3-디올의 디에테르 또는 디에스테르를 오존분해함으로써 제조할 수 있다.

방법(e)의 (ii)단계에서, 5-플루오로 치환제는 당해 기술분야, 즉 M.J. Robins 외 다수의 「Nucleic Acid Chemistry」 (Part 2, L.B. Townsend and R.S. Tipson, J. Wiley and Sons, 편찬, 뉴욕 895-900(19/8)) 및 그중의 참고문헌 ; R. Duschinsky의 「Nucleic Acid Chemistry」 (Part 1, L.B. Townsend and R.S. Tipson, J. Wiley and Sons 뉴욕, 43-46(1987)) 및 그중의 참고문헌에 공지된 방법을 통해 도입될 수 있다. 플루오르화제는, 예를들어 플루오로트리클로로메탄중의 트리메틸하이포아플루오르산염일 수 있다.

방법(e)의 (iii)단계에서, 일반식(c)의 화합물은 4-클로로페닐 디클로로포스페이트와 함께 1,2,4-트리아졸로 처리함으로써 해당 4-(1,2,4-트리아조일릴)화합물을 형성하는데, 이것은 이어서, 예를들어 메탄올과의 반응을 통해 바람직한 4-아미노(시티딘)화합물로 전환된다.

일반식(B) 및 (C)의 출발물질은, 예를들어 방법(e)의 (i)단계에 기재된 것과 유사한 방식으로 일반식(A)의 화합물과 적당한(임의로 보호된) 염기를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 5-플루오로우라실 및 5-플루오로시토신은 알드리히 케미칼 컴페니(밀워키, WI 53233, 미합중국)에서 시판된다.

(±)-거울상 이성질체는 하기 Ⅲ 부분에 상세히 구체화된 바와 같이 분해할 수 있다.

FTC는 적당한 에스테르화제, 예를들어 산 할라이드 또는 무수산과의 반응을 통해 약학적 허용 에스테르로 전환될 수 있다. FTC 또는 이것의 약학적 허용 유도체는 종래방식, 예를들어 적당한 염기로의 처리를 통해 그것의 약학적 허용염으로 전환될 수 있다. FTC의 에스테르 또는 염은, 예를들어 가수분해를 통해 FTC로 전환될 수 있다.

Ⅰ. 활성화합물, 및 이것의 생리학적 허용유도체와 염.

본문에 개시된 항비루스성 활성 화합물은 라세미 형태 또는 분해된 거울상 이성질체로서의 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란(제1도 참조)이다.

활성 화합물은, 수용자에게 투여시 전구 FTC화합물을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있거나, 자체적으로 활성을 지닌 임의의 유도체로서 투여할 수 있다. 비제한적인 예는 약학적 허용염(선택적으로 생리학적 허용염으로도 칭함), 및 활성화합물의 5' 및 N⁴아실화 또는 알킬화 유도체(선택적으로 생리학적 또는 약학적 활성 유도체로 칭함)이다. 한 실시태양중, 아실기는 에스테르기의 비-카르보닐부가 직쇄, 분지, 또는 고리형 알킬, 메톡시알킬을 비롯한 알콕시알킬, 벤질을 비롯한 아르알킬, 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬, 할로겐, C₁내지 C₄의 알킬 또는 C₁내지 C₄의 알콕시로 임의 치환된 페닐을 비롯한 아릴, 메탄설포닐을 비롯한 알킬 또는 아르알킬 설포닐과 같은 설포네이트 에스테르, 모노, 디 또는 트리포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬 실릴(예, 디메틸-t-부틸실릴) 또는 디페닐메틸실릴 중에서 선택된 카르복실산 에스테르이다. 에스테르의 아릴기는 임의로 페닐기를 포함한다. 알킬기는 직쇄, 분지, 또는 고리형이며, 임의로 C₁-C₁₈의 기이다.

FTC의 약학적 허용유도체의 구체적인 예로는 하기 일반식의 화합물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다:

상기식중, R₁및 R₂는 각각 알킬 및 아실, 구체적으로 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, 이소부틸, 2차-부틸, t-부틸, 이소펜틸, 아밀, t-팬틸, 3-메틸부티릴, 수소 숙시네이트, 3-클로로벤조에이트, 시클로펜틸, 시클로헥실, 벤조일, 아세틸, 피발로일, 메실레이트, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 카프로일, 카프릴, 카프릭, 라우릭, 미리스틱, 팔미틱, 스테아릭, 올레익, 아미노산, 예를들면 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 프롤리닐, 페닐아라니닐, 트립토파닐, 메티오닐, 글리시닐, 세리닐, 트레오니닐, 시스테이닐, 티로시닐, 아스파라지닐, 글루타미닐, 아스파토일, 글루타오일, 리시닐, 아르지니닐, 및 히스티디닐로 이루어진 군중에서 선택되는데, 이들 예에 국한되는 것은 아니며, 상기 R₁및 R₂중 하나는 수소일 수 있다.

FTC 또는 그것의 유도체는 약학적 허용염의 형태로 제공될 수 있다. 본문에 사용된 약학적 허용염 또는 착물은 친 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하고, 존재하는 경우 최소한의 비바람직한 독성학적 효과를 지닌 FTC의 염 또는 착물을 칭하는 것이다. 그러한 염의 비제한적인 예는

(a) 무기산(예, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등)으로 형성된 산부가염 및 아세트산, 옥살산, 주석산, 숙신산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팜산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌디술폰산, 및 폴리갈락투론산과 같은 유기산으로써 형성된 염;

(b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 나트륨, 칼륨 등과 같은 다원자가의 금속 양이온으로써 형성된 염, 또는 N,N-디벤질에틸렌-디아민, 암모늄, 또는 에틸렌디아민으로 형성된 유기 양이온으로써 형성된 염; 또는

(c) (a)와 (b)의 조합물, 예를들면 아연 탄닌산염 등.

활성 화합물의 변성, 구체적으로 N⁴및 5'-0 위치에서의 변성은 활성류의 대사율 및 생체내 이용율에 영향을 미치며, 이로써 활성류의 전달에 제어를 가한다. 또한, 상기와 같은 변성을 통해 화합물의 항비루스 활성에 영향을 미칠수 있으며, 일부 경우 활성을 친 화합물보다 높게 증가시킨다. 이는 본문중에 기재된 방법, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 따라 유도체를 제조한후, 그것의 항비루스 활성을 테스트함으로써 쉽게 알 수 있다.

Ⅱ. 활성 화합물의 제조

FTC의 라세미 혼합물은 PCT 국제 공고 제 WO 91/11186호(1991년 8월 공개, 출원인-에모리 유니버시티)에 상세히 개시된 방법, 또는 실시예 1에 개시된 방법을 통해 제조할 수 있다. 통상적으로, 상기 방법에는 일반식 CH₂=CH-CH₂-OR의 알킬 에테르 또는 에스테르 또는 일반식 ROCH₂-CH=CH-CH₂OR의 2-부텐-1,3-디올의 디에테르 또는 디에스테르(식중, R은 알킬, 실릴, 또는 아실기와 같은 보호기임)를 오존화 함으로써 일반식 OHC-CH₂-OR의 글리콜알데히드를 형성하는 단계; 상기 글리콜알데히드에 티오글리콜산을 첨가함으로써 일반식 2-(R-옥시)-메틸-5-옥소-1,3-옥사티올란의 란톤을 형성하는 단계; 락톤을 옥사티올란 고리의 5-위치에 이탈기를 포함한 다양한 화합물로 환원시키는 단계; 이들 화합물을 SnCl₄의 존재하에 실릴화된 5-플루오로시토신과 결합시킴으로써 FTC의 β-이성질체를 형성하는 단계; 및 보호기를 임으로 제거하는 단계를 포함한다.

[실시예 1]

[(±)-β-D,L-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 제조 방법]

FTC의 라세미혼합물의 제조 방법은 제2도에 예시되어 있으며, 하기에서 자세하게 설명하였다.

[2-부텐-1,4-디올의 보호 반응]

불활성 기체하의, 건조된 2L의 3목 플라스크안에 100g(93.5ml=1.135mol= 1.00당량)의 2-부텐-1,4-디올과 15g(약 0.1당량)의 DMAP(4-디메틸아미노피리딘)를 800ml의 건조 피리딘에 용해시킨 후 0℃로 냉각하면서 교반하였다. 이어서 염화부티릴(260ml=2.2당량)을 천천히 첨가하여 과열을 방지하고 1시간동안 교반하였다. 상기 반응물을 소량의 얼음물로 급냉시켰다. 상기 용액을 염으로부터 따라내 진공상태에서 증발시켰다. 남은 염을 물에 용해시킨 후, 그 수용액은 에틸에테르로 두 번 추출했다. 합성된 다른 층들은 포화 CuSO₄로 1회, Norit(상표명)를 함유한 포화 NaHCO₃로 2회 세척한 후, Celite(상표명) 플러그를 통해 진공 여과하였다.

농축된 반응 혼합물을 에테르에 용해시킨 후 염용액에 대해 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 세척하였다. 합성 유기층들을 회전식으로 증발시킴으로써 농축시킨 후, 진공하에 방치했다. 상기 반응은 통상적으로 거의 정량에 가깝다. 반응량은 필요에 따라 쉽게 증가시킬 수 있다. 생성물인 1,4-디부티릴-2-부텐-1,4-디올은 엶은 황색의 맑은 용액 이었다.

[보호된 디올의 오존 분해 반응]

큰 건조관과 가스 주입을 위한 개방관이 구비된 건조된 5L의 3목 플라스크내에서 4L의 건조 CH₂Cl₂에 1,4-디부티릴-2-부텐-1,4-디올(1.365mol)을 용해시켰다. 상기관은 농축된 용액에 노출되는 것을 막을 수 있는, 기체 버블링 유리관이 아닌 것이 적합하다. 불활성 기체에 의해 상기용액에 기포를 발생시키면서, 상기 용액을 교반하고-78℃까지 냉각시켰다. 용액이 충분히 냉각되었으면 기체 입구를 밀봉하고, 플라스크와 교반기를 오존 발생기로 옮겼다. 얼음 배스에 유지시키면서 20분 이상 동안 교반 용액에 산소로써 기포를 형성시켰다. 이러한 긴 반응동안 저온으로 유지시키는데에는 크리오쿨(Cryocool)이 적당하다. 이어서 오존을 8 내지 8.5 psi에서 주입하였다. 반응 완료시에는, 오존의 공급을 중지하고 약 30분동안 산소로써 용액에 기포를 형성시킨후 3당량의 Me₂S를 첨가하였다. 플라스크를 냉각 배스로부터 꺼내어 후드로 옮긴 후 약 2일 동안 교반함으로써 환원 반응을 완료하였다. 상기 용액을 증발시킨 후 수시간 동안 진공하에 방치하였다.

상기 반응을 통해 통상적으로 황색의 맑은용액인 보호알데히드(2-부티릴옥시아세트알데히드)를 약 95% 수득하였다.

[머캡토아세트산을 사용한 알데히드의 고리화 반응]

상기 알데히드(1.0당량)를 딘 스타크(Dean Stark)형의 트랩이 설치된 플라스크내에서 톨루엔 용액에 용해시킴으로써 0.80 내지 0.85M의 용액을 수득하였다. 티오글리콜산(1.1당량)을 첨가하고 그 혼합물을 환류하에 가열하였다. 트랩을 통해 물을 등비 제거하였다. 상기 반응을 3시간내에 완결한 후, 실온으로 냉각시켰다. 유기 용액은 동량의 포화 중조수로 2회, 물로 한번 세척한 후, MgSO₄및 Norit(상표명)상에서 건조시킨후, Celite(상표명)를 통해 진공상태에서 여과하였다. 1차 NaHCO₃세척시에는 에테르로 한차례 역추출하였다. 상기 에테르는 한번 수세하고, MgSO₄와 Norit(상표명)상에서 건조시키고, Celite(상표명)을 통해 진공여과한 후, 다른 유기물과 함께 톨루엔 용액으로부터 증발시켰다. 상기 합성 물질은 진공하에서 하룻밤 동안 방치했다.

상기 반응은 통상적으로 90% 수율의 2-(부티릴옥시)-메틸-5-옥소-1,3-옥사티올란을 제공한다.

[락톤의 환원 반응과 아세테이트의 전환 반응]

기계식 교반기가 설치되어 있고 불활성 대기하에 유지된, 건조된 3목 플라스크내에서 2-부티릴옥시-메틸-5-옥소-1,3-옥사티올란(1.00당량)을 건조 THF에 용해 시킴으로써 0.23M의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 교반하여 0℃로 냉각시킨 후 THF중의 1.1당량의 1.0M Li(t-BuO)₃AIH를 캐뉼러를 통해 첨가하였다. 약 3시간이내에 환원 반응이 완결되었는데, 이는 에테르/헥산 용매계(2:1)와 아니스알데히드계 색소를 사용하여 TLC를 통해 알 수 있었다.

이어서 약 10당량의 새로 증류한 Ac₂O를 첨가하고, 2일동안 교반함으로서 아세틸화된 생성물을 수득하였다. 포화된 NaHCO₃를 첨가하여 반응물을 급냉시킨후, 하룻밤 동안 교반했다. 이어서 상기 용액을 증발시키고 부가의 NaHCO₃용액과 함께 하룻밤 동안 교반하였다. 이것을 에테르로 추출한 후 포화 NaHCO₃로 조심스럽게 2회 세척하고, 1회 수세한 후, MgSO₄와 Norit(상표명)상에서 건조시키고, Celite(상표명)를 통해 진공여과하여 증발시켰다. 생성물은 담황색의 맑은액이었다. 가스 크로마토그래피(처음온도=80℃; 처음 시간=5분; 진행속도=10℃/분; 최종 온도=240℃)결과, 순도는 통상적으로 약 70%였다.

[5-플루오로시토신의 실릴화 반응]

상기 용액이 투명해진후 2시간동안 5-플루오로시토신(GC순도 지시법을 사용하여 이전단계에서 수득된 아세틸화 락톨의 양을 기준으로 1.05당량)을 촉매량의 순수한 황산 암모늄(0.05 내지 0.10당량)을 함유한 10당량이상의 헥사메틸디실라진에서 2시간 동안 환류함으로써 실릴화하였다. 이어서 플라스크를 단단히 밀봉하고 보조 트랩이 설치된 진공 펌프를 사용하여 용매를 제거했다. 이어지는 결합 반응에 사용할 수 있게 될 때까지 백색 고형물의 생성물을 하룻밤동안 진공하에 방치하였다.

[아세틸화 락톨과 실릴화 5-플루오로시토신의 결합 반응]

질소 대기하에서 건조 디클로로메탄(350ml)중의 실릴화 5-플루오로시토신(33.86gm 0.124mol)에 SnCl₄용액(135.6ml, CH₂Cl₂중의 1몰 용액)을 첨가했다. 상기용액을 실온에서 15분동안 교반했다. 상기 용액을 질소대기하에서 30분 동안 디클로로메탄(400ml)중의 락톨 아세테이트(38gm, 0.113몰)용액에 첨가했다.

TLC에 의해 반응의 완료가 지시된 지점에서, 상기 반응 용액을 2시간동안 교반했다. 이어서 상기 반응용액을 디클로로메탄(500ml)으로 희석하고 수산화 암모늄 용액으로 급냉했다. 반응온도는 30℃이하로 유지하면서, 수산화 암모늄 용액(100ml)을 서서히 첨가함에 따라 백색 침전이 형성되었다.

상기 혼합물을 또 다시 30분간 교반한 뒤, 실리카겔 마개 컬럼(직경 7인치, 높이 5인치)에 통과시켰다. 이어서 디클로로메탄(2L), 에틸 아세테이트(2L) 및 에틸 아세테이트:에탄올(9:1)(4L)로 연속적으로 용출시켰다. 에틸 아세테이트와 에틸 아세테이트:에탄올 용출제에는 필요한 생성물이 함유되어 있었다. 이들 용액을 합성하여 감압하에서 증발시켰다. 이어서 남은 점착성 고형물을 건조에테르(200ml)로 세척함으로써 백색 고형물(25.35gm; 71%)의 FTC-5'-부티레이트를 수득하였다.

FTC-5'-부티레이트(8.74gm; 0.026mol)울 250ml의 메탄올에 용해시켰다. 실온에서 나트륨 메톡사이드(2.85gm; 0.052gm)를 첨가했다. 이어서 1시간 동안 반응물을 교반하였으며, 반응 완결지점은 TLC로 확인했다. NH₄Cl용액(10ml)을 첨가하여 반응물을 급냉시킨 후, 감압하에 용매를 제거했다. 상기 잔류물을 실리카겔(5gm)상에 흡착시킨 후 용출제로서 에틸 아세테이트:에탄올(9:1)을 사용하여 작은 컬럼에 통과시켰다. 생성물-함유 분획을 합성하여 증발시킴으로써 점착성 고형물을 수득한 후, 이것을 건조 에테르로 세척하여 백색 고형물 FTC(6.00gm, 88%)를 수득하였다.

Ⅲ. 누클레오시드 거울상 이성질체의 분해 반응

누클레오시드 거울상 이성질체-이것에는 FTC의 (+) 및 (-) 거울상 이성질체가 있으나 이에 국한되지 않음- 라세미 혼합물을 분해하는 방법이 이하 제시되어 있다. 상기 방법은 또한 1,3-옥사티올란 및 1,3-디옥솔란의 유도체와 같은 탄수화물 또는 탄수화물-유사 부분들의 라세미 혼합물을 분해하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 라세미 혼합물중 한 거울상 이성질체의 반응만을 차별적으로 촉매하는 효소의 사용을 특징으로 한다. 물리적 구조의 새로운 차이점을 기초로 하여 미반응된 거울상 이성질체로부터 반응된 거울상 이성질체를 분해하였다. 하기에 거론된 효소중 하나를 선택하거나 또는 공지된 효소를 체계적으로 분석함으로써, 당업자들은 해당 누클레오시드 광학 이성질체에 선택적인(또는 불필요한 거울상 이성질체를 제거하는 방법에서는, 불필요한 거울상 이성질체에 선택성을 띠는)효소를 선택할 수 있다. 필요시 기질을 번성시켜 바람직하게 분해할 수 있는 방법도 또한 당업자는 알고 있을 것이다. 비대칭 NMR 이동 시약, 편광측정법, 또는 비대칭성 HPLC를 사용으로써, 회수된 에스테르가 광학적으로 집중되어 있음을 판정할 수 있다.

하기 실시예에서는 거울상 이성질체의 라세미 혼합물을 분해하기 위한 효소의 사용방법을 부가로 설명하고자 한다. 라세미 혼합물을 분해하는 다른 공지된 방법은 본문에 개시된 분해방법과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 모든 변성 방법은 본 발명의 범위내에 포함된다.

[C5'-누클레오시드 에스테르의 가수분해를 기초로 한 분해방법]

한 실시태양의 제조방법은, 누클레오시드 주석산염 혼합물의 C5'-히드록실기와 아실 화합물을 반응시킴으로써 누클레오시드가 에스테르의 카르비놀말단부에 존재하는 C5'-에스테르를 형성하는 방법이다. 이어서 누클레오시드 C5'-에스테르의 라세미 혼합물을, 주어진 시간동안 거울상 이성체중 하나를 차별적으로 분열 또는 가수분해하는 효소로 처리했다.

상기 방법의 잇점은 탄수화물 부분 또는 염기부분에 임의로 치환된 피리미딘과 퓨린 누클레오시드를 비롯한, 다수의 누클레오시드를 분해하는데 사용할 수 있다는 점이다. 상기 방법은 또한 탄수화물 부분에 부가의 헤테로원자를 포함하는 누클레오시드 유도체, 예를들면, FTC 및 BCH-189를 분해하는데 사용할 수 있다. 상기 방법의 광범위한 응용 가능성은, 에스테르의 카르비놀부가 거울상 이성질체를 구별하는 효소의 기능을 수행하나, 이들 효소의 주요한 인식부위는 에스테르의 카르복실산 부분에 존재한다는 사실에 부분적으로 기인하다. 또한, 하나의 효소/기질의 연구 결과를 외관상 다른 또다른 시스템에 성공적으로 삽입시킬 수 있는데, 단 두 기질의 카르복실 부분은 갈거나 또는 거의 유사하어야 한다.

상기 방법의 또 다른 장점은 영역 선택성을 띤다는 점이다. 에스테르를 가수분해하는 효소는 통상적으로 분자의 다른 위치에서의 외부 반응에 대해서는 촉매 기능을 수행하지 않는다. 예를들어, 효소 리파아제는 락톤 내부는 가수분해하지 않으면서 2-히드록시메틸-5-옥소-1,3-옥사티올란의 에스테르의 가수분해 반응만을 촉매한다. 이는 에스테르 가수분해 반응에 대한 화학적 접근과 상당히 대조를 이룬다.

상기 방법의 또다른 장점은, 반응 혼합물로부터 가수분해되지 않은 거울상 이성질체와 가수분해된 거울상 이성질체를 분해하는 것이 매우 간단하다는 점이다. 가수분해 되지 않은 거울상 이성질체는, 가수분해된 광학 이성질체보다 지방친화력이 더 크기 때문에 헥산 및 헥산/에테르를 비롯한 광범위한 비극성 유기 용매중 하나 또는 용매 혼합물로 단순 추출함으로써 효과적으로 수득할 수 있다. 이어서 극성이 큰 유기용매, 예를들어 에틸 아세테이트로 추출하거나, 또는 동결건조한 후, 에탄올 또는 메탄올로 추출함으로써, 지방 친화력이 적고, 극성이 큰 가수분해된 거울상 이성질체를 수득할 수 있다. 알콜은 특정 조건하에서 효소를 변성시키므로 가수분해 중에는 사용을 피해야 한다.

[효소와 기질]

효소와 기질이 적절하게 조화된 상태에서는, 모든 누클레오시드 거울상 이성질체를 분해할 수 있는 조건이 설정된다. 필요한 거울상 이성질체를 가수분해하는 효소로 라세미 혼합물을 처리함으로써(이어서 극성 용매로 극성 가수분해물을 추출함으로써)또는 불필요한 거울상 이성질체를 가수분해하는 효소로 처리함으로써(이어서 비극성 용매로 불필요한 거울상 이성질체를 제거함으로써)필요한 거울상 이성질체를 분리할 수 있다.

에스테르 가수분해 반응을 촉매하는 효소에는 에스테라아제, 예를들면 돼지간의 에스테라아제, 돼지의 췌장 리파아제와 Amano PS-800(상표명) 리파아제를 비롯한 리파아제, 섭스틸리신, 및 α-키모트립신이 있다.

제3도는 FTC의 (+)와 (-)광학 이성질체에 대한 알카리성 포스파타아제와 뱀독 성분중의 포스포디에스테라아제의 특이성을 나타낸 흐름도이다. 제시된 바와 같이, 알카리성 포스파타아제는 모든 FTC 거울상 이성질체의 삼인산염을 가수분해하기 때문에, 분해 수단으로서 효과적이지 못하다. 포스포디에스테라아제 Ⅰ는 FTC의 (+)-이성질체 또는 그것의 모노에스테르를 차별적으로 가수분해 하는데, 이것을 이어서 5'-누클레오티다아제로 처리함으로써 (+)-FTC를 수득할 수 있다.

많은 동족체를 분석한 실험결과에 구애되지 않고, 선택된 효소 시스템을 사용하여 누클레오시드의 5'-위치를 에스테르화 하는데 사용될 수 있는 것으로는 아실기가 가장 효과적인 것으로 결정할 수 있다. 예를들어, 1,3-옥사티올란 누클레오시드가 부티르산으로 에스테르화되는 경우에는, 높은 거울상 선택성(94-100%의 거울상 이성질체 초과율) 및 반대 선택성하에서 돼지간의 에스테라아제와 아마노 PS-800(상표명)에 의한 분해가 진행된다. 돼지간의 에스테라아제는 FTC의 (+)-거울상 이성질체만을 차별적으로 기수분해하며, Amano PS-800(상표명)은 FTC의 (-)-거울상 이성질체만을 차별적으로 가수분해한다. 표 1에 기록된 거울상 이성질체의 초과율은 효소 처리된 혼합물에 남아 있는 정제된 부티레이트 에스테르(즉, PLE의 경우에는 (-)-FTC의 부티레이트 에스테르이고 Amano PS-800(상표명)의 경우에는 (+)-FTC의 부티레이트 에스테르임)의 양이다.

각 누클레오시드 거울상 이성질체 혼합물 및 효소와 함께 사용할 수 있는 아실기의 비제한적인 예로는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 및 펜탄산올 비롯한 알킬 카르복실산 및 치환된 알킬 카르복실산이 있다. 특정 효소를 사용하는 경우, 상당한 전자-인출성을 띠는 아실 화합물을 사용함으로써 에스테르 결합을 약화시켜 가수 분해시키는 것이 바람직하다. 전자-인출성 아실기의 예로는 2-클로로프로피온산, 2-클로로부티르산, 및 2-클로로펜탄산과 같은 α-할로에스테르가 있다. α-할로에스테르는 리파아제에 대하 우수한 기질이다.

[분해 조건]

효소에 의한 가수 분해 반응은, 통상적으로 pH가 해당 효소의 적정 pH에 가까운 완충 수용액중의 촉매량의 효소로써 이루어진다. 상기 반응이 진행됨에 따라, 카르복실산이 유리됨으로써 pH가 저하된다. pH를 효소의 pH최적치 부근으로 유지하기 위해 수성 염기를 첨가해야 한다. pH의 변화 및 pH를 유지하는데 필요한 염기의 양을 조사함으로써 반응의 진행도를 쉽게 알 수 있다. 적절하게 선택된 유기 용매를 사용하여 소수성 에스테르(비가수분해된 거울상 이성질체)와 극성이 보다 큰 알콜(가수 분해된 거울상 이성질체)를 용액으로부터 연속적, 선택적으로 추출할 수 있다. 선택적으로, 고체 지지체상에 효소가 고정되어 있는 컬럼에 상기 물질을 통과시킴으로써 분해할 수 있다.

효소에 의핸 가수분해가 각기 다른 조건하에서 수행되는 경우에는 재생성이 열등해질 수 있다. 따라서, 균일한 조건하에서 가수 분해를 수행하는 것이 바람직하다. 알콜 용매는 효소를 변성시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. Triton X-100(상표명)같은 비이온성 계면활성제를 사용함으로써 균일화시킬 수 있다. 그러나, 이들 계면 활성제를 첨가할 경우에는, 출발 물질의 용해를 지지할 뿐만 아니라, 생성물의 물에 대한 용해도를 향상시킨다. 따라서, 효소 반응은 비균일-조건하에서 비이온 계면 활성제의 첨가시 보다 효과적으로 진행될 수 있으나, 회수된 출발 물질과 생성물의 분해가 더욱 어려워질 수 있다. 상기 생성물은 적당한 크로마토그래피 방법 및 화학적(예를들면, 선택적 염 형성)방법을 통해 분해할 수 있다. 디아실화 누클레오시드를 사용할 수 있으나, 종종 상당한 친지성을 지니며 사용된 매질중에 잘 용해되지 않는다.

[실시예 2]

[거울상 선택적으로 리파아제에 의해 촉매된 FTC 에스테르의 가수 분해 반응]

(±)-FTC의 N-염산염을 선택적으로 0-아실화 함으로써(표 1 및 제4도 참조) 많은 FTC의 5'-0-아실 유도체를 제조하였다. 리파아제에 의한 상기 유도체의 가수 분해 효율을 조사하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 돼지간의 에스테라아제(PLE)는 FTC의 (+)-거울상 이성질체의 에스테르의 가수 분해반응에 높은 선택성을 보이므로, HPLC로 분석된 혼합물중에는 (-)-FTC의 부티레이트가 우세하게 많은 양이 남아있었다. 이와 반대로, PS-800은 FTC의 (-)-광학이성질체의 에스테르를 차별적으로 가수분해하여, HPLC로 분석된 혼합물중에는 (+)-FTC의 부티레이트가 우세하게 많은 양이 남아 있었다. 또한 가수 분해율이 아실기의 성질에 좌우된다는 사실이 밝혀졌으며; 아세틸 유도체는 부티릴 유도체보다 가수 분해율이상당히 느렸다. FTC의 프로피온산 에스테르의 가수 분해율이 부티레이트 유도체에서의 경우보다 훨씬 빠르다는 점은 이미 밝혀진 사실이다. 회수율(%)과 거울상 이성질체의 초과율(%)은 모두 HPLC를 사용하여 측정했다. PLE를 사용할 경우에는 거울상 선택성은 우수하지만(통상적으로 97%(오차무시) 또는 그 이상), PLE-촉매적 가수분해에 의한 거울 이성질체적으로 집중된 부티레이트가 PS-800에 의해 효소 가수분해되는 연속적 효소 가수 분해 반응을 통해 부가적으로 집중될 수 있다.

[실시예 3]

[거울성 선택적, 리파아제-촉매에 의해 FTC 부티레이트를 가수분해함으로써 (+)-와 (-)-FTC를 제조하는 방법]

(±)-FTC의 5'-0-부티레이트(0.47mmol, 149mg)를 pH 8 의 완충제 : CHCN(4:1)의 용액 16ml에 용해시켰다. 맑은 용액을 교반한 후 26mg의 돼지 간 에스테라아제(PLE-A)로 처리하였다. HPLC로써 반응의 진행도를 측정하였다(제4도). 20시간후(52% 전환), 반응 혼합물을 2×80ml의 CHCL및 80ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층 추출물을 합성하여, 무수 MgSO상에서 건조시키고, 여과한 후, 회전 증발시킴으로써 농축시켰다. 생성된 잔류물을 용출제로서 에틸 아세테이트를 사용하여 2×1000m의 pPLC 판 상에서 용출시킴으로써(이중용출), 분해후 53mg(출발 물질을 기준으로 36%)의 FTC 부티레이트를 수득하였는데, 이것은 HPLC 분석 결과 거울상 이성질체 초과율(e.e.)이 98%인 것으로 판정되었다. 이어서 거울상 이성질체적으로 집중된 부티레이트를 1.6mL의 메탄올로 처리한 후 0.38mmol(20mg)의 나트륨 메톡사이드로 처리했다. 생성된 혼합물을 실온에서 교반하고, 반응의 진행도는 HPLC로 관측하였다. 상기 반응은 30분 이내에 완결되었다. 회전식 증발을 통해 용매를 제거함으로써, 에틸 아세테이트:에탄올(5:1)을 용출제로 사용하여 1000m의 pTLC상에서 용출시킨 미정제 백색 고형물(76 mg)을 수득하였다. (-)-FTC는 백색 고형물로 분리하였다(33mg; 수율 82%). FTC를 그것의 5'-0-아세테이트 유도체로 HPLC 분석한 결과 e.e.는 97%였다; [α](,)-120.5°(c=0.88; 무수 에탄올).

반응의 종료시 반응 혼합물에 HCCl를 첨가하고(이는 또한 효소를 변성시킬 수 있다), 진공하에 용매를 제거한 후, HCCl로 추출함으로써 반응 진행 단계에서의 에멀젼화를 방지할 수 있다.

이와 유사하게, 1.2mmol(375 mg)의 (±)-FTC의 5'-0-부티레이트를 pH 8의 완충제-CHCN(4:1) 40mL에 용해시켰다. 맑은 용액을 교반한 후 58mg의 돼지간 에스테라아제(PLE-A)로 처리했다. 반응의 진행도는 HPLC로 측정하였다. 90분후(38% 전환), 반응 혼합물을 150mL의 CHCl에 첨가했다. 이어서 층을 분리한 후 수성층을 동결 건조함으로써 용매를 제거했다. 동결 건조를 통한 백색 잔류물은 3×10mL의 무수 알코올로 추출하였다. 추출물을 여과하여, 합성하고, 진공하에서 농축시킴으로써 179mg의 미정제 오일을 수득했다. 이어서 용출제로서 3×75mL의 에틸 아세테이트와 에틸아세테이트-에탄올(5:1)을 순차적으로 사용하여 40×30mm의 실리카카겔 컬럼상에서 상기 미정제 물질을 용출했다. (+)-FTC는 백색 고형물(109mg; 처음 부티레이트를 기준으로 37%)로서 분해하였다. (+)-FTC를 그것의 5'-0-아세테이트 유도체로서 HPLC 분석한 결과, e.e.는 97.4%였다; [α]0(,)+113.4°(c=2.53; 무수 에탄올).

pH 8의 완충제: CHCN(4:1) 4.0mL 중의 7mg의 PS-800 및 0.12 mmol(37 mg)의 FTC의 5'-0-부티레이트를 사용하여 유사한 반응을 수행했다. 반응은 PLE-A를 사용했을 때 보다 훨씬 느렸는데, 59%를 전환시키는데 74시간이 소요됐다. 회수된 부티레이트(11.4mg; 처음양의 31%)를 HPLC로 분석한 결과 e.e.는 94%이었다.

[시티딘-데옥시시티딘 탈아미노 효소를 사용한 누클레오시드 거울상 이성질체의 분해 반응]

선택적인 실시 태양에서는 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로-시토신-1-일)-1,3-옥사티올란을 비롯한 2-히드록시메틸-5-(시토신-1-일)-1,3-옥사티올란 및 그것의 유도체의 라세미 혼합물을 분해하는데 시티딘-데옥시티딘 탈아미노 효소를 사용하였다. 상기 효소는, 시토신 부분의 우라실로의 탈아미노 반응을 촉매한다. 1,3-옥사티올란 누클레오시드의 거울상 이성질체중 하나가 시티딘-데옥시티딘 탈아미노 효소의 바람직한 기질이라는 점이 밝혀졌다. 우라실 유도체로 전환되지 않는(따라서, 염기성을 띠는) 거울상 이성질체는 산성 용액을 사용하여 용액으로부터 추출했다. 강산성 용액(pH가 3.0 이하)이 되지않도록 주의해야 하는데, 강산성 용액은 옥사티올란 고리를 분해시킬 수 있다.

시티딘-데옥시시티딘 탈아미노 효소는 쥐의 간 또는 인체간으로부터 분리되거나, 또는 이.콜리와 같은 원핵 계통의 재조합 서열로 형질 발현될 수 있다.

시티딘-데옥시시티딘 탈아미노 효소를 사용하여 시티딘 누클레오시드 거울상 이성질체를 분해하는 방법은 분해 방법만을 단독으로 사용하거나, 또는 상기된 바와 같이 5'-0-뉴클레오시드 에스테르의 효소 가수분해에 의한핸 분해 방법을 비롯한 다른 분해 방법과 함께 사용할 수도 있다.

[통상적인 분해 방법과 효소에 의한 분해 방법의 조합]

상기 거론된 누클레오시드 거울상 이성질체의 라세미 혼합물의 분해 방법을 다른 통상적인 거울상 이성질체의 분해 방법과 함께 사용함으로써 최종 생성물의 광학적 순도를 향상시킬 수 있다.

통상적인 분해 방법에는 많은 물리적 방법 및 화학적 방법이 있다. 주석산염이 종종 대응하는 각각의 광학 이성질체보다 잘 용해된다는 이론을 기초로 했을 때, 가장 간단하고 가장 효율적인 방법은 재결정화 방법이다. 아실화 화합물 또는 최종 거울상 이성질체 생성물에 대한 재결졍화 반응은 임의의 단계에서 수행할 수 있다. 이러한 간단한 방법이 성공적인 경우에는, 적당한 방법이 될 수 있다.

재결정화 방법을 통해 허용적인 광학적 순도의 물질이 제공되지 않는 경우에는, 다른 방법을 검토해 볼 수 있다. 누클레오시드가 염기성인 경우에는(예를들어, 시티딘), 상당히 다른 용해도 특성을 지닐 수 있는 부분 입체 이성질체 혼합물을 형성하는 비대칭 산을 사용할 수 있다. 비대칭산의 비제한적인 예로는 말산, 만델산, 디벤조일 주석산, 3-브로모캄포-8-술폰산, 10-캄포술폰산, 및 디-p-톨루오일주석산이 있다. 이와 유사하게, 비대칭산 유도체로 유리 히드록실기를 아실화함으로써, 분해가 가능할 정도로 물리적 특성이 충분히 다를 수 있는 부분 입체 이성질체 혼합물이 형성된다.

시클로텍스트린 결합 컬럼(라이닌 코오포레이션에서 시판)을 비롯한, 비대칭 분리를 위한 HPLC컬럼에 라세미 혼합물을 통과 시킴으로써, 거울상 이성질체적으로 집중된 누클레오시드를 소량 수득하거나 정제할 수 있다.

[실시예 4]

[HPLC에 의한 누클레오시드의 라세미 혼합물의 분해 반응]

라이닌 코오포레이션(Woburn, MA)에서 입수한 비대칭 시클로 덱스트린 결합(시클로본드 AC-Ⅰ)컬럼을 사용하여 (±)- FTC의 C4'-거울상 이성질체를 분해하였다. 이때 조건은 다음과 같다: 물중의 0.5% 메탄올(이소크래틱); 유속 1ml/분, 262nm에서의 UV검출, HPLC등급 메탄올은 J.T. 베이커(필립스 버그, 뉴저어지)제품이다. 라세미 혼합물을 주입한 후 분획들을 수집하였다. 각각의 거울상 이성질체가 포함된 분획을 침지하여, 냉각시킨후, 동결 건조하였다. 상기 화합물을 UV 스펙트로스코피와 HPLC에서의 체류 시간에 의해 특징지었다. 통상적으로, (-)-광학 이성질체는 (+)-광학 이성질체에 비해 체류 시간이 짧다(문헌 「J. Liquid Chromatography」 7:353-376, (1984) 참고). 상기 화합물의 농도는, 생물학적 평가를 위해 물중에 제조된 공지된 농도(15 μM)의 원액을 사용하여 UV 스펙트로스코피를 통해 측정하였다. 분리된 거울상 이성질체의 체류 시간은 표 2에 제시되어 있다.

[실시예 5]

[대칭성 컬럼을 사용하여 FTC 거울상 이성질체를 분리하는 대안적 방법]

시클로본드 Ⅰ-Ac 컬럼(5μm, 25cm×4.6mm, 라이닌 코오포레이션, Woburn, MA, 카탈로그 번호 AST-41049)을 사용하고, 물중의 0.5%의 이소크래틱 메탄올(피셔 사이언티픽, 인코오포레이티드, HPLC 등급, 카탈로그 번호 A-452-4)의 유속은 0.6ml/분으로 하고 UV 검출을 262nm하에서 수행한 결과, FTC 거울상 이성질체의 체류 시간은 각각 12.68 분 ((-)-FTC)과 13.20 분 ((+)-FTC)이었다.

키랄팩 AS 컬럼(10μm, 25cm×4.6mm, J.T. 베이커 인코오포레이티드, 필립스버그, 뉴저어지, 카탈로그 번호 7406-00, 일련번호 09-29-10320)을 사용하고 이소프로필 알코올(HPLC등급, 피셔 사이언티픽 인코오포레이티드, 카탈로그 번호 A-451-4)의 유속은 0.8ml/분으로 하여 262nm에서 UV 검출한 결과, FTC 거울상 이성질체의 체류 시간은 각각 5.9 분 ((-)-FTC), 및 9.8 분 ((+)-FTC)였다.

Ⅳ. 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-올사티올란(FTC)의 HIV의 복제 억제 능력

거울상 이성질체적으로 집중된 성분을 부가로 분리하는 지의 여부와 항비루스 활성도를 부가로 판정하기 위해, 예비 단계로서 수많은 누클레오시드의 라세미 혼합물을 검색할 필요가 있다. HIV를 억제하는 누클레오시드의 능력은 다양한 실험 방법에 의해 측정할 수 있다. 본문 중에 사용되었으며 하기에 상세히 기술된 방법을 통해, HIV-1(LAV 균주)에 감염된, 피토헤마글루티닌(PHA)에 의해 자극된 인체 주변 혈액 단핵(PBM) 세포에서 비루스 복제의 억제율을 측정하였다. 생성된 비루스의 양은 비루스-암호화된 역전사효소를 측정함으로써 측정하였다. 생성된 효소의 양은 생성된 비루스의 양에 비례한다. 표 3에는 다수의 (±)-1,3-옥사티올란과 누클레오시드의 EC값(PBM 세포중에서 비루스의 복제를 50% 억제하는 누클레오시드의 농도, 오차 인자 약 10%)과 IC값(유사 분열 물질로 자극된 감염되지 않은 인체 PBM 세포의 성장률 50% 억제하는 누클레오시드의 농도)이 제시되어 있다.

[실시예 6]

[(±)-1,3-옥사티올란 누클레오시드의 항-HIV 활성]

A. B형 간염 보균자와 HIV-1에 혈청 음성 반응을 보이는 건강한 공급자로부터 추출된, 식물성 혈구 응집소로 자극되고 생성후 3일된 PBM 세포(10세포/ml)를 ml당 50%의 조직 배양 감염 투여량(TICD 50)의 약 100배에 해당하는 농도의 HIV-1(LAV 균주)로 감염시킨 후 항비루스 화합물의 농도를 다양하게 하면서, 그리고 부재하에서 배양하였다.

B. 감염 처리로부터 약 한 시간후, 테스트된 화합물(배지중 최종 농도의 2배)을 포함한 배지, 또는 화합물이 포함되지 않은 배지를 플라스크(5ml; 최종 부피 10ml)에 첨가했다. AZT는 양성 대조체로 사용하였다.

C. 세포를 비루스(약 2×10dpm/ml, 역전사 효소 분석율 통해 측정)로 처리한 후 CO배양기내에 넣었다. HIV-I(LAV 균주)는 조지아주 아틀란타에 있는 질병 관리 센타에서 입수하였다. PBM 세포를 배양하고, 비루스를 회수하여 역 전사 효소 활성을 측정하는데에 사용된 방법들은, 친균류 영역이 배지에 포함되지 않는 것을 제외하고는, 맥도갈 외 다수의 「J. Immun. Meth.」(76, 171-183, 1985) 및 스피라외 다수의 「J. Clin. Meth.」 (25, 97-99, 1987)에 기재된 것들이다(스키나지외 다수의, 「Antimicrob. Agents Chemother.」, 32, 1784-1787(1988); Id., 34; 1061-1067(1990) 참조).

D. 6일째에, 세포와 상청액을 15ml 튜브에 옮기고 10분간 약 900g을 원심 분리했다. 5ml의 상청액을 제거한 후 30분간 40,000 rpm으로 원심 분리함으로써(베크만 70.1 Ti 회전기) 비루스를 농축시켰다. 역전사 효소의 수치를 측정하기 위해 용해된 비루스 펠릿을 가공 처리하였다. 결과는 표본 상청액의 dpm/ml로 표시된다. 보다 소량의 상청액 (1ml)으로부터 수득된 비루스는, 원심 분리한후 용해시켜 역전사 효소 수치를 측정함으로써 농축될 수 있다.

50% 효과 농도(EC)는 중간 효과 방법을 통해 판정하였다(「Antimicrob. Agents Chemother.」 30, 491-498(1986) 참조), 간략화하면, 역 전사 효소의 측정을 통해 판정된 비루스 억제율(%)은 화합물의 마이크로 몰농도에 대해 도표로 기재된다. EC은 비루스 성장이 50% 억제되는 지점의 화합물의 농도이다.

E. 상기 언급된 항비루스 검정시와 유사한 조건하에 약물이 존재하는 상태와 부재하에서, 유사 분열 물질 자극된 비감염 인체 PBM 세포(3.8×10세포/ml)를 배양하였다. 6일 후에, 스키나지외 다수의, 「Antimicrobial Agents and Chemotherapy」(22(3), 499(1982))에 기재된 혈구 계수기와 트립판 청배제 방법을 사용하여 상기 세포를 계측하였다. IC은 정상 세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도이다.

또는

표 3에 제시된 바와 같이, 통상적으로, 치환된 시토신 1,3-옥사티올란 누클레오시드는 대응하는 우라실 누클레오시드 보다 활성이 높다. EC₅₀과 IC₅₀측정치에서의 오차는 ±10%이다.

(±)-FTC의 한 화합물(DLS-022, 화합물 8로 칭함)은 특별한 활성(PBM 세포의 경우, 약 10μM)을 지니며, 또한 매우 낮은 독성(PBM, Vero 및 CEM 세포의 경우, 100μM 이상)을 지닌다.

(±)-FTC의 IC₅₀은 100μM이상인데, 이로써, 상기 화합물이 100㎛이하의 미감염된 PBM 세포에서는 독성을 띠지 않음을 알 수 있다.

[실시예 7]

[HPLC에 의해 분해된 FTC 거울상 이성질체의 항비루스 활성]

실시예 4의 방법을 통해 FTC 거울상 이성질체를 분리한 후, 실시예 6의 방법에 의해 항비루스 활성을 평가하였다. 상기 결과는 표 4 및 제5도에 재시되어 있다.

표 4에 제시된 바와 같이, 본 실험에서 FTC의 (-)-거울상 이성질체는 (+)-FTC광학 이성질체에 비해 효능이 거의 한 등급 위이며, 라세미 혼합물과 거의 동일한 항-HIV활성을 지닌다. 인체 PBM 세포에서 트리판 청 배제법을 통해 측정한 바에 따르면 거울상 이성질체 또는 라세미 혼합물의 독성은 100μM이하였다.

[실시예 8]

[실시예 3의 방법으로 분해된 FTC 거울상 이성질체의 항비루스 활성]

역시 실시예 3의 방법을 통해 (±)-FTC의 거울상 이성질체를 분해한 후, 실시예 6의 방법으로 항비루스 활성을 측정하였다. 그 결과는 제 6도에 제시되어 있다. 제6도에 제시된 바와 같이, FTC의 라세미 혼합물의 EC은 0.017μM이고 (-)-FTC의 EC은 0.0077μM이며, (+)-FTC의 EC은 0.84μ였다.

[실시예 9]

[인체 PBM 세포내로의 (±)-FTC의 흡수력]

본 연구는, 세포내에서 검출된 대사 산물과 약물 성분의 세포내에서의 특성을 추적하기 위해 방사선 표시된 FTC를 사용하여 수행하였다. 모든 연구는 두 번씩 수행하였다. 인체 주변 혈액 단핵세포(PBM 세포)를, 태아상태의 송아지 혈청 10%와 항생 물질(2×10세포/ml, 각 시간당 10ml)을 함유한 RPMI 1640 배지에 현탁시킨 후 10μM FTC(특이 활성도가 약 700 dpm/pmol)를 첨가하여 배양하였다. 세포는 각각 2, 6, 12 및 24시간 동안 약물로 처리하였다. 상기 각 시점에서, 배지를 제거한 후 차가운 항크스 균형 염용액으로 세포를 2회 세척하였다. 0.2ml의 60% 차가운 메탄올/물을 첨가하여 추출한 후, -70℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 다음날 아침, 상기 현탁액을 원심 분리하고 -70℃에서 30분 동안 두 번 반복하여 추출했다. 총 상청액(0.6 ml)을 건조 상태까지 동결 건조시켰다. 상기 잔류물을 250μ1의 물로 재현탁시키고 50 내지 100μ1의 분취량을 HPLC로써 분석했다. HPLC를 통해 세포내 약물 성분과 대사 산물 유도체를 측량하였다. 일부 화합물이 잠재적으로 산에 불안정성을 지니기 때문에, 생리학적 pH에 가까운 완충시스템을 사용하여 대사 산물을 분리하였다.

제7도는 pmol/10세포에 대한 시간(시)에서, 인체 PBM세포에서의 삼중 수소화된 (±)-FTC의 존재 여부(흡수도)(2회 측정치의 평균)를 나타낸 그래프이다. 상기 흡수도의 연구를 통해 방사선 표시된 FTC가 인체 임파구에 쉽게 흡수되고, 매우 많은 양의 FTC의 5'-트리포스페이트 유도체가 생성됨을 알 수 있었다.

[실시예 10]

[다양한 세포계에서 FTC의 항 레트로비루스 활성]

실시예 6에 제시된 방법과 유사한 방법을 사용하여 많은 세포계내에서의 FTC의 항 레트로비루스 활성을 측정하였다. 세포계들은 기증자, AIDS 연구 및 참고 시약 프로그램, NIH(록빌레, 매릴랜드), ATCC, 또는 적십자로부터 입수하였다. CEM 티미딘 키나아제 결핍 세포들은, 5-브로모-2'-데옥시유리딘의 존재하에서 CEM 세포를 연속헤서 통과시킴으로써 제조하였다. 그 결과는 표 5에 제시되어 있다.

[실시예 11]

[인체 PBM 세포로부터 (±)-FTC의 방출]

24시간 동안 약물성분과 함께 배지내에서 배양하고 이어서 약물을 제거한 후 세포내에서 검출된 대사산물과 약물성분의 세포내 특성을 추적하기 위해 방사선 표시된 FTC를 사용하여 연구를 수행하였다. 본 연구에서는 삼인산염의 세포내 양이 감소하는데 필요한 시간을 측정하였다. 연구는 2회 수행했다. 미감염된 세포(2×10ml)를 혈청 (각 시간당 10ml)이 강하된 적당한 배지에 현탁시킨 후 5%의 CO배양기내에서 37℃하에 배양시켰다. 방사선 표시된 FTC농도는 10μM이었다. 세포에 표시된 화합물로써 세포를 24시간 동안 처리한 후, 상기 세포를 완전히 세척하고, 이어서 항비루스 약물이 함유되지 않은 새로운 배지를 즉시 공급했다. 0, 2, 4, 6, 12, 24 및 48 시간(2차 배양시간)에, 세포를 제거하고, 즉시 60%의 차가운 메탄올/물로 추출했다. 원심 분리한 후 세포 펠릿을 제거함으로써 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 동결 건조한 후, -70℃에서 저장하였다. 분석하기 이전에, 상기 물질을 250μL의 HPLC완충액으로 재현탁시킨 후 즉시 분석했다. 세포내 약물 성분과 대사 유도체는, 음이온 교환 파티실 10 SAX 컬럼이 구비된 휴렛-팩커드 모델 1040 PHLC시스템(와트만, 인코오포레이티드) 또는 마이크로 메리틱스를 사용하여 1ml/분의 유속, 1 Kpsi의 압력, 262nm에서의 UV 검출 조건하에 HPLC로써 측량하였다. 이동상은 탈이온수(A), 2mA의 NaHPO/16mM NaOAC(pH=6.6)(B), 15mM의 NaHPO/120.2mM NaOAC (pH=6.6)(C), 및 100mM의 NaHPO/800mA NaOAc(pH=6.6)(D)로 이루어져 있다.

분해방법 : A로써 5분간 이소크래틱 처리하고, 100%의 B로 15분간 선gud 구배하고, 20분간 100℃까지 100% C로 선행 구배한 후, 100%의 D까지 10분간 선형 구배하고, 이어서, 100% D로써 처리하였다.

[인체 세포내의 체류 시간(분)]

제8도는 농도(pmol/10⁶세포)에 대해 약물 제거후의 경과 시간으로 측정된, 인체 PBM 세포로부터 방사선 표시된 (±)-FTC의 방출도를 나타낸 그래프이다. 도면에 나타난 바와 같이, FTC-삼dls산염은 세포내 반감기가 약 12시간이며 세포의 약물이 제거된 후 48시간 이내에는 세포내에서 1 내지 5μM의 농도(화합물의 EC₅₀값 이상치)로 쉽게 검출될 수 있다. 또한, HIV RT를 사용한 경우 (±)-FTC삼인산염의 친화도(KI)는 0.2μM로서, 48시간 이내의 농도 보다 낮다.

[실시예 12]

[(±)-FTC의 약학적 허용 유도체의 항-HIV활성]

a. 5'와 N⁴위치를 유도하여 제조된 많은 (±)-FTC의 약학적 허용 유도체를, 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 PBM세포 내에서의 항-HIV활성을 측정하였다. 그 결과는 다음과 같다. (±)-FTC의 5'-0-부티레이트 에스테르의 EC₅₀은 0.0017이었다. (±)-FTC의 N⁴-아세틸유도체의 EC₅₀은 0.0028이었다. (±)-FTC의 5'-0-부티레이트, (±)-FTC의 N⁴-에스테르의 EC₅₀는 0.0058이었다.

b. MT4 시스템에서 (±)-FTC의 5'-0-부티레이스 에스테르의 항-HIV활성(EC₅₀)은 0.04μM이었다. 동일한 분석에서, 아실화되지 않은 (±)-FTC의 IC₅₀은 0.52μM이었다. 상기 시스템에서 AZT의 IC₅₀는 0.09μM이었다.

Ⅴ. HBV의 복제를 억제하는 FTC의 효능

[실시예 13]

[2.2.15 세포 배양체 중에서 FTC의 (+)와 (-)-거울상 이성질체 활성의 평가]

2.2.15 세포 배양체(간염 비리온에 의해 전형된 HePG2 세포)에서 비루스의 성장을 억제하는 FTC의 거울상 이성질체의 효능은 하기에 자세히 기술되어 있다.

본 배양은 시스템에서의 항 비루성 효능에 대한 분석 및 HVB DNA에 대한 분석의 요약과 설명은 코바와 밀만의, 「Antiviral Res.(15:217, 1991)에 기재되어 있다. 항비루스성에 대해서는, 두 개의 독립된 경로를 통해 세포들을 분석했다. 모든 평판에 있는 모든 웰(well)에는, 같은 시간에 같은 밀도로 시드(seed) 하였다.

[분석 파라미터]

세포내 와 세포외 모두의 HBV DNA수준은 자체적인 변동이 있으므로 미처리된 세포에서는 이들 HBV DNA형태의 평균 수준보다 3.5배(HBV 비리온 DNA의 경우) 또는 3.0배(HBV DNA복제 중간 생성물의 경우) 이상 감소시키는 것이 통계학상 유효성이 있는 것으로 간주된다[P0.05]. 각 세포 DNA의 제조시 합성된 HBV DNA의 양(본 실험의 기초가 되는 세포에 대하여 일정하게 유지)을 사용하여 세포내 HBV DNA 형태의 양을 계산하고, 이로써 각 샘플들은 동량의 DNA로 비교하였다.

미처리 세포에서 세포외 HBV 비리온 DNA의 통상적인 값은 50 내지 150pg/ml(배양배지) 이내이다(평균 약 76 pg/ml). 미처리 세포의 세포내 HBV DNA 복제 중간 생성물은 50 내지 100pg/㎍의 세포 DNA값을 지닌다(평균 약 74pg/㎍의 세포 DNA). 통상적으로, 항 비루성 화합물로 처리함으로 인한 세포내 HBV DNA수준의 저하는, HBV 비리온 DNA 수준의 감소보다 더 느리게 일어나며 명백하지 않다(코바와 밀만의, 「Antiviral Res.」, 15 : 217,1991 참조).

이같은 실험에 혼성분석 방식을 수행한 결과, 세포당 2 내지 3의 게놈 복제물에는 약 1.0pg의 세포내 HBV DNA가 대응하고 3×10⁵비루스 입자/ml에는 1.0pg/ml의 세포외 HBV DNA가 대응하는 것으로 나타났다.

[독성 분석]

독성 분석은, 임의의 관찰된 항 비루스 효과가 세포 생존 능력에 대한 통상적인 영향에 좌우되는지의 여부를 평가하기 위하여 수행하였다. 본문중에 사용된 방법은 중성 적 염료의 흡수도 측정 방법으로서, HSV와 HIV를 비롯한 다수의 비루스-숙주 시스템에서의 세포의 생존 능력을 분석하는데 널리 사용하는 표준 방법이다. 독성 분석은 96개의 웰이 있는 평바닥의 조직 배양 평판에서 수행하였다. 독성 분석을 위한 세포를 배양하고 항 비루스성 평가에 대해 하기 언급된 바와 같은 방식으로 시험 화합물로 처리하였다. 각 화합물은 4μM의 농도에서 검사하였고, 각각 3개씩 배양했다(웰 A, B, 및 C). 중석 적 염료의 흡수력으로써 상대적인 독성수준을 결정하였다. 510nm(Asin)에서 내화된 염료의 흡수도는 정량 분석에 사용하였다. 측정값들은 테스트 화합물과 동일한 96개 웰의 평판상에 놓여진 9개의 독립적 미처리 세포들의 Asin 평균값이 퍼센테이지로 나타내었다.

5번째 평판상의 9개의 대조 배양체의 염료 흡수도는 91.6% 내지 110.4%이었고, 6번째에서는 96.6% 내지 109%이었다. 그 결과는 표 6에 제시되어 있다.

[독성 평가]

표 6에 제시된 것처럼, 항비루스성 평가에 사용되는 농도의 테스트 화합물에서는 독성이 거의 없었다(미처리 세포에서 관찰된 염료 흡수도가 50%이상 저하되었음). 테스트 화합물, (-)-FTC와 (+)-FTC은 모두 독성 테스트에 사용된 가장 높은 농도(330μM)에서 독성을 띤다는 것이 나타났다.

[항 비루스성에 대한 평가]

[대조군]

정규 변동내에서, HBV 비리온 DNA와 세포내 HBV 복제 중간 생성물[HBV RI]수준은 처리 기간에 걸쳐서 미처리 세포내에서 일정하게 유지되었다. 1%농도의 DMSO는 2.2.15 세포 배양체중의 HBV복제에 영향을 미치지 못했다.

[테스트 화합물]

표 7에 제시된 것처럼, (-)-FTC와 (+)-FTC는 모두 테스트 수준에서 HBV의 복제를 상당하게 억제하였다. 표 8에서 제시된 바와같이, (-)-FTC는 농도 4,1, 및 0.25μM의 농도에서 HBV 비리온 DNA와 세포내 HBV DNA의 합성을 상당히 억제하였다.

[실시예 14]

[인체 간세포 내로의 (±)-FTC의 흡수도; FTC의 HVB의 활성]

인체 간세포(HepG2 세포, ATCC에서 입수)에 실시예 9의 방법은 반복 수행하여 상기 세포내의 FTC의 대사와 흡수도를 판정하였다. 제9도에 제시된 바와 같이, (±)-FTC는 HepG2에 다량 흡수된다. 상기 인체 간 세포는 (±)-FTC를 (±)-FTC삼인산염으로 대사시키는 비율이 높다.

본문에서 제시된 다른 데이터와 상기 데이터를 통해, (±)-FTC뿐만아니라 그들의 (-) 및 (+) 거울상 이성질체가 간세포에서 포스포아릴화됨을 알 수 있다. 상기 세포는 B형 간염 비루스로 전형될 수 있다.

[실시예 15]

[인체 HepG2 세포에서 FTC의 방출]

제10도는 10μM의 [H]-(±)-FTC(700 DPM/pmol)로 24시간 동안 세포를 처리하고, 이어서 제거하고 24시간동안 화합물의 농도를 측정한 후 인체 HepG2 세포에서 [H]-(±)-FTC와 그것의 포스포릴화 유도체의 방출도를 pmol/10세포 단위로 시간에 대해서 나타낸 것이다.

제11도는 10μM의 [H]-(±)-FTC(700 DPM/pmol)로 24시간 동안 배양한 후 인체 GepG2 세포로부터 [H]-(±)-FTC와 그것의 포스포릴화 유도체의 결합농도 감소도를 pmol/10세포 단위로 시간에 대해 나타낸 것이다.

도면에 제시된 바와 같이, 48시간에서도 1μM이상(상기 화합물의 EC보다 훨씬 높은 값)의 활성 화합물이 세포내에서 여전히 존재하였다.

Ⅴ. 과립구-대식구 선구 세포의 독성

[실시예 16]

[과립구-대식구 선구세포의 군체 형성에 미치는 FTC의 효과]

제12도는 과립구-대식구 선구세포의 콜로니 형성에 대한 FTC의 (-)와 (+) 거울상 이성질체의 영향을 농도(μM)에 대한 생존율(%)로 측정한 그래프이다 ((-)-FTC, -○-; (+)-FTC, -●-; AZT, -■-). 제시된 바와 같이, FTC의 (-)-거울상 이성질체는 독성이 적은데, 즉 상기 세포계에서 (+)-거울상 이성질체 또는 AZT보다 높은 IC을 지닌다.

Ⅵ. FTC의 약력학

[실시예 17]

[쥐에 투여한 FTC의 대사]

(±)-FTC의 투여량을 10, 50 및 100㎎/㎏으로 하여 쥐의 정맥내에 투여하였고, 시간에 대한 혈장 약물 농도아래의 면적(AUC), 총 정화치(CLT), 정상 상태의 분포량(Vss), 평균 체류시간(MRT) 및 반감기(t)을 계산하였다. 그 결과는 표 9에 제시되어 있다.

[실시예 18]

[FTC의 정맥내 및 경구 투여 후 FTC에 대한 약력학 파라미터]

리서스(rhesus) 원숭이에게 33.3㎎/㎏의 (+)-FTC를 투여(정맥내 및 경구)함으로써 (+)-FTC의 모델에 구애되지 않은 약력학 파라미터를 산출했다. 그 결과는 표 10에 제시되어 있다. 중요한 것은, 원숭이에게 상기 화합물의 생물학적 효력이 73%(+6%)이라는 점이다.

[실시예 19]

[리서스 원숭이에서 FTC 및 그것의 대사산물의 CSF/혈청 비율]

리서스 원숭이에게 33.3㎎/㎏의 활성화합물을 투여하고, 투여 한시간후 뇌 척수액(CSF) 및 혈청중의 (+)-FTC의 양을 측정함으로써 혈액-뇌 관문을 가로지르는 (+)-FTC의 능력을 평가하였다. 그 결과는 표 11에 제시되어 있다. 상기 데이터를 통해, 상당량의 활성화합물이 이 포유동물에서 혈액-뇌 관문을 통과함을 알 수 있다.

Ⅲ. 약학 조성물의 조제

HIV 또는 HBV에 감염되어 질병을 앓고 있는 사람에게, 약학적 허용 담체 또는 희석제중의 유효량의 (+)-FTC, 또는 그것의 (-) 또는 (+) 거울상이성질체 또는 약학적 허용 유도체 또는 그들의 염을 환자에게 투여함으로써 질병을 치료할 수 있다. 상기 활성물질은 임의의 적당한 경로, 예를들면, 경구, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 또는 국소적으로 액체 또는 고체 형태로 투여할 수 있다.

상기 활성 화합물은, 치료하는 환자에 심각한 독성의 영향을 미치지 않으면서 생체내 비루스 복제, 특히 HIV 및 HBV 복제를 억제할 수 있는 치료 유효량의 화합물을 전달하는데 충분한 양의 약학적 허용담체 또는 희석제중에 포함된다. 억제량은, 예를들면 본문중에 기술된 것과 분석평가 방식을 통해 측정된 것으로서 억제효과를 충분히 발휘할 수 있는 활성성분의 양을 의미한다.

위에서 언급된 모든 조건에서 (-), (+) 또는 (+)-FTC의 바람직한 투여량은 하루에 체중을 기준으로 약 1 내지 50㎎/㎏ 이내이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 20㎎/㎏ 이며, 보다 통상적으로는 하루에 치료받는 사람의 체중당 0.1 내지 약 100㎎이다. 약학적 허용 유도체의 효과적인 투여량의 범위는 전달되어질 뉴클레오시드 모체의 중량을 기준으로하여 계산될 수 있다. 만일 유도체가 자체적으로 활성을 지니는 경우에도, 유도체의 중량을 사용하여 상기와 같은 방법, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술 방법으로 효과적인 투여량을 계산할 수 있다.

상기 화합물은 단위투여 형태당 7 내지 3000㎎, 바람직하게는 70 내지 1400㎎의 활성성분이 함유된 임의의 적당한 투여형태로 투여하는 것이 용이하다. 상기 양에 국한되는 것은 아니다. 경구 투여시에는 통상적으로 50-1000㎎이 적당하다.

활성성분은 투여되어 활성 화합물의 혈장내 최고 농도가 0.2 내지 70μM, 바람직하게는 약 1.0 내지 10μM인 정도가 바람직하다. 이것은, 예를들어 임의의 염수중의, 0.1 내지 5%의 활성 성분 용액을 정맥내에 주사하거나, 또는 활성성분 알약으로 투여함으로써 가능하다.

약제 조성물중의 활성성분의 농도는 상기 약제의 흡수도, 불활성화도, 및 배출율과 당업자에게 공지된 다른 요인들에 좌우된다. 투여량은 또한 병세의 심각도에 따라 변화함을 주목해야 한다. 임의의 특정 실험 대상자의 경우, 구체적 투여처방은 각 개인의 필요도와 조성물의 투여를 주재하거나 투여하는 전문의의 판단에 따라 조정되어야 하고, 이하 설명하는 농도범위는 단지 예에 불과하며, 범위 또는 청구된 조성물의 범위 또는 실행을 한정하려는 의도는 아니다.

활성화합물의 바람직한 투여 형식은 경구투여이다. 경구 조성물은 통상적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 것이다. 그들은 젤라틴 캡슐내에 봉입되거나 정제형태로 압축될 것이다. 경구 치료제로의 투여하기 위해서는, 활성화합물은 부형제와 함께 섞거나 정제, 알약, 또는 캡슐 형태로 사용할 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제, 및/또는 보조제는 상기 조성물의 일부 성분으로서 함유될 수 있다.

정제, 환제, 캡슐, 알약등은 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물중 임의의 것을 함유할 수 있다: 미정질 셀룰로스, 트라가칸트 고무 또는 젤라틴과 같은 결합제; 녹말 또는 락토오스 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분 같은 분해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes(상표명)같은 윤활제; 실리콘 디옥사이드 콜로이드 같은 미끄럼제; 설탕 또는 사카린 같은 감미제; 또는 박하, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향 같은 방향제. 투여단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 유형의 물질이외에도 지방성 오일 같은 액체담체를 함유할 수 있다. 또한, 투여단위 형태에는 그것의 물리적 형태를 변화시키는 다양한 다른 물질, 예를들면, 설탕코팅, 셀락, 또는 다른 장용제가 함유될 수 있다.

(+)-FTC, 또는 그것의 (-) 또는 (+)-거울상이성질체 또는 그것의 약학적 허용 유도체 또는 그것의 염은 엘릭서, 현탁액, 시럽, 와퍼, 츄잉껌 등의 성분으로 투여할 수 있다. 시럽은 화합물이외에도 감미제인 설탕과 특정 방부제, 염료 및 착색제와 향료를 함유할 수 있다.

(±)-FTC, 또는 그것의 (-) 또는 (+)-거울상이성질체, 또는 약학적 허용 유도체 또는 그들의 염은 바람직한 작용을 손상하지 않는 다른 활성물질과 혼합하거나, 누클레오시드 항-HIV 화합물을 비롯한, 항균성, 항진균성, 소염성, 또는 항비루스성 같은 바람직한 작용을 강화하는 다른 물질과 함께 혼합될 수 있다.

비경구, 피내, 피하, 또는 국소적 용도로 사용된 용액 또는 현탁액은 다음과 같은 성분, 즉 주사수, 염수, 불휘발성유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 무균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염 같은 완충제와 염화나트륨 또는 덱스트로오즈 같은 강장 조절제를 함유할 수 있다. 비경구용 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 다양한 투여 용기에 내장될 수 있다.

만일 정맥내에 투여되는 경우, 바람직한 담체는 식염수 또는 인산염 완충염(PBS)이다.

바람직한 실시양태에서, 활성 화합물은 이식제와 미량캡슐화 전달 시스템을 비롯한, 조절 방출제와 같이 화합물이 체내로부터 빠르게 배출되지 않도록 하는 담체와 함께 조제된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오토에스테르, 및 폴리젖산 같은 생분해성, 생체 적합성 중합체를 사용할 수 있다. 그러한 제제의 조제방법은 당업자라면 명백히 알 것이다. 상기 물질은 또한 알자 코오포레이션과 노바 파마슈티칼스, 인코포레이티드에서 입수할 수 있다.

리포좀 현탁액(비루스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 목표로 하는 리포좀 포함)은 약학적 허용 담체로서도 바람직하다. 이들은 예를들어, 미합중국 특허 제 4,522,811호(그것의 전 내용은 본문에 참고 인용됨)에 개재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 조제할 수 있다. 예를들면, 리포좀 제제는, 무기용매에 적당한 지지(들)(예, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 용해시킨후, 상기 무기 용매를 증발시킴으로써 제조하는데 용기내의 표면에는 건조된 지질의 얇은 막이 잔존하게 된다. 이어서 활성 화합물 또는 그것의 일인산염, 이인산염, 및/또는 삼인산염 유도체의 수용액을 용기내에 넣었다. 이어서 상기 용기를 손으로 흔들어 용기의 측면으로부터 지질 물질을 유리시키고 지질 응집물을 분산시킴으로써, 리포좀 현탁액을 형성하였다.

Ⅳ. FTC인산염 유도체의 조제

FTC의 일인산염, 이인산염, 및 삼인산염 유도체는 아래 언급한 것과 같이 조제할 수 있다.

일인산염은 이마이외 다수의, 문헌 「J. Org. Chem.」, 34(6), 1547-1550 (1969, 6)]의 방법에 따라 조제할 수 있다. 예를 들면, 약 100㎎의 FTC와 약 280μl의 포스포릴 클로라이드를 약 0℃에서 약 4시간 동안 교반하면서 8ml의 건조 에틸 아세테이트와 반응시켰다. 상기 반응은 얼음으로 급냉시켰다. 상기 수상을 에탄올과 물의 혼합물(1;1)에서 5% 수산화암모늄으로 용출함으로써, 활성탄 컬럼에서 정제하였다. 용출제를 증발시켜 암모늄 FTC-5'-일인삼염을 수득하였다.

이인산염은 데이비슨외 다수의 문헌 「J. Org. Chem.」(52(9), 1794-1801(1987))의 방법에 따라 조제할 수 있다. FTC 이인산염은 대응하는 토실레이트로부터 조제할 수 있는데, 예를들면 뉴클레오시드와 토실클로라이드를 피리딘하의 실온에서 약 24시간동안 반응시키고, 일반적인 방법(즉, 그것을 세정, 건조, 및 결정화하는 방법)으로 생성물을 수득하였다.

삼인산염은 호드외 다수의 문헌 「J. Am. Chem. Soc.」(87(8), 1785-1788 (1965))의 방법에 따라 조제할 수 있다. FTC가 활성화되는 경우(당업자에게 공지된 방법에 따라 이미다졸리드를 제조함으로써) DMF 중의 트리부틸 암모늄 피로포스페이트로 처리했다. 상기 반응을 통해 누클레오시드의 삼인산염을 다량 수득하였고, 약간의 미반응된 일인산염 및 약간의 이인산염도 수득하였다. DEAE컬럼의 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한 후 삼인산염을 즉, 테트라소듐염으로 분리했다.

본 발명은 그것의 바람직한 실시태양을 참고로 기재했다. 본 발명은 전술한 본 발명의 상세한 설명에 대한 조절 및 변형이 가능하다. 이러한 변형 및 조절은 첨부된 특허청구 범위내에서 이루어진다.

Claims

분리된 거울상 이성질체로서의 (-)-β-L-2-히드록시메틸-5-(-5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 그의 포스페이트, 알킬 에스테르, 아실 에스테르 또는 생리학적 허용염.
제1항에 있어서, 다음 일반식을 갖는 화합물:

(식중, R₁및 R₂는 각각 C_1-6알킬; 에스테르기의 비-카르보닐부가 직쇄 C_1-6알킬, 분지 C_1-6알킬, 또는 고리형 C_1-6알킬로 이루어진 군중에서 선택된 카르복실산 에스테르; C_1-6알콕시알킬; C_7-14아르알킬; C_7-14아릴옥시알킬; 할로겐, C_1-4알킬 또는 C_1-4알콕시로 임의 치환된 페닐을 비롯한 C_7-14아릴; 설포네이트 에스테르; C_1-6알킬 또는 C_7-14아르알킬 설포닐; 모노-, 디- 또는 트리포스페이트이고, R₁또는 R₂중 하나가 수소일 수 있다).
제2항에 있어서, R₁및 R₂가 각각 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, 이소부틸, 2차-부틸, t-부틸, 이소펜틸, 아밀, t-펜틸, 3-메틸부티릴, 수소 숙시네이트, 3-클로로벤조에이트, 시클로펜틸, 시클로헥실, 벤조일, 아세틸, 피발로일, 메실레이트, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 카프로익, 카프릴릭, 카프릭, 라우릭, 미리스틱, 팔미틱, 스테아릭, 및 올레익으로 이루어진 군 중에서 선택되며, R₁및 R₂중 하나는 수소일 수 있는 화합물.
제3항에 있어서, 상기 R₁이 n-부틸이고, R₂는 수소인 화합물.
인체의 HIV감염을 치료하기 위한 유효량의 분리된 거울상 이성질체로서의 (-)-β-L-2-히드록시메틸-5-(-5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 또는 그것의 생리학적 허용염을 약학적 담체중에 함유하는 약학조성물.
제5항에 있어서, 담체가 경구 투여에 적합한 것인 약학 조성물.
제5항에 있어서, 담체가 캡슐로 된 것이 특징인 약학 조성물.
제5항에 있어서, 담체가 정제 형태인 것이 특징인 약학 조성물.
거울상 이성질체적으로 집중된 형태의 (-)-β-L-2-히드록시메틸-5-(-5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란.
인체의 HIV감염을 치료하기 위한 유효량의 거울상 이성질체적으로 집중된 형태의 (-)-β-L-2-히드록시메틸-5-(-5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 또는 그것의 생릭학적 허용염을 약학적 담체중에 함유하는 약학 조성물.
인체의 HIV 감염을 치료하기 위한 유효량의 제2항의 화합물, 또는 그것의 생리학적 허용염을 약학적 담체중에 함유하는 약학조성물.