FI114915B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten beta-2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-1-yyli)-1,3-oksatiolaanin enantiomeerien valmistamiseksi - Google Patents

Description

114915

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten β-2-hydroksi-metyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin enan-tiomeerien valmistamiseksi 5 Keksinnön tausta Tämä keksintö on biologisesti aktiivisten nuk-leosidien alueelta ja erityisesti käsittää virusvastaisia koostumuksia, jotka sisältävät 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaania ("FTC"), sen fy-10 siologisesti hyväksyttävää johdannaista tai fysiologisesti hyväksyttävää suolaa, ja menetelmän FTC:n (-)-p-L- ja ( + )-β-D-enantiomeerien erottamiseksi ja niiden käytön.

Vuonna 1981 identifioitiin hankittu immuunipuu-tosoireyhtymä (AIDS) sairautena, joka vakavasti vaarantaa 15 ihmisen immuunijärjestelmän ja joka melkein poikkeuksetta johtaa kuolemaan. Vuonna 1983 AIDS:in etiologisen aiheuttajan määritettiin olevan ihmisen immuunipuutosvirus (HIV). Joulukuussa 1990 Maailman terveysjärjestö arvioi, että koko maailmassa 8-10 miljoonaa ihmistä oli saanut 20 HIV-tartunnan ja tästä lukumäärästä 1 000 000 - 1 400 000 oli USA:ssa.

, i1 Vuonna 1985 selostettiin, että synteettinen nuk- ,·’ leosidi 3'-atsido-3'-deoksitymidiini (AZT) estää ihmisen immuunipuutosviruksen replikaatiota. Sen jälkeen monien ·’; 25 muiden synteettisten nukleosidien mukaan lukien 2', 3 1 — .·. dideoksi-inosiini (DDI), 2', 3'-dideoksisytidiini (DDC), » :·. 3'-fluori-3'-deoksitymidiini (FLT) ja 2' , 3'-dideoksi- 2 ', 3'-didehydrotymidiini (D4T) on osoitettu olevan tehok-. kaita HIVrtä vastaan. Monien muiden 2', 3'-dideoksinuk- ; 30 leosidien on osoitettu estävän monien erilaisten virusten kasvua in vitro. Näyttää siltä, että sen jälkeen kun nämä '! “! synteettiset nukleosidit on solussa fosforyloitu 5'- ·····' trifosfaatiksi solun kinaasien vaikutuksesta, ne liitetään kasvavaan virus-DNA-säikeeseen, mikä aiheuttaa ketjun • · [ 35 päättymisen 3'-hydroksyyliryhmän puuttumisen johdosta.

Ml'· 114915 2

Erilaisten 2',3'-dideoksinukleosidien menestys HIV:n replikaation estämisessä in vivo tai in vitro on saanut monet tutkijat suunnittelemaan ja testaamaan nuk-leosideja, joissa on korvattu heteroatomilla hiiliatomi 5 nukleosidin 3’-asemassa. Norbeck et ai. esittävät, että (± )-l- [ (2β, 4β) -2- (hydroksimetyyli) -4-dioksolanyyli] tyrniini (josta käytetään nimitystä (±)-dioksolaani-T) osoittaa kohtuullista aktiivisuutta HIV:tä vastaan (EC50 20 pm ATH8-soluissa) eikä ole myrkyllinen infektoimattomille kontrol-10 lisoluille pitoisuutena 200 μΜ. Tetrahedron Letters 30 (46) (1989) 6246. EP-hakemusjulkaisu 0 337 713 ja US-pa-tenttijulkaisu 5 041 449, jotka on merkitty kuuluviksi toiminimelle IAF BioChem International, Inc., esittelevät 2-substituoituja-4-substituoituja-l,3-dioksolaaneja,jotka 15 osoittavat virusvastaista aktiivisuutta.

US-patenttijulkaisu 5 047 407 ja EP-hakemusjulkaisu 0 382 526, jotka on myös merkitty kuuluviksi toiminimelle IAF Biochem International, Inc., esittelevät monia 2-sub-sti tuoi tu j a- 5 - substi tuoi tu j a-1,3 -oksat iolaaninukleoside j a, 20 joilla on virusvastaista aktiivisuutta, ja selostavat erityisesti, että 2-hydroksimetyyli-5-(sytosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaanin Cl'-β-isomeerin raseemisella seoksella (C4'~ :Y: aseman suhteen) (josta jäljempänä käytetään nimitystä (±)- : :BCH-189) on suunnilleen sama aktiivisuus HIV:tä vastaan 25 kuin AZTtllä eikä se ole myrkyllinen soluille testattuina määrinä. (±)-BCH-189:n on myös todettu estävän sellaisilta

Ypotilailta, joita on hoidettu AZT:llä kauemmin kuin 36 • » » viikkoa, peräisin olevien AZT-resistenttien HIV-isolaat- , tien replikaatiota in vitro.

• * > 30 Toinen virus, joka aiheuttaa vakavan ihmisten ter- ’···’ veyttä koskevan ongelman, on hepatiitti B -virus (josta i alempana käytetään nimitystä "HBV" ). HBV jää jälkeen ai- noastaan tupakasta ihmisen syövän aiheuttajana. Mekanismi, , ·. jolla HBV aiheuttaa syöpää, on tuntematon, vaikka on ole- » · · ·;· ; 35 tettu, että se voi suoraan panna alulle kasvaimen kehitty- 3 114915 misen tai epäsuorasti panna alulle kasvaimen kehittymisen infektioon liittyvän kroonisen tulehduksen, kirroosin ja solujen regeneraation kautta.

Kahdesta kuuteen kuukautta kestävän inkubaatioajan 5 jälkeen, jonka kestäessä isäntä on tietämätön infektiosta, HBV-infektio voi johtaa äkilliseen hepatiittiin ja maksavaurioon, joka aiheuttaa vatsakipua, keltaisuutta ja eräiden entsyymien kohonneita tasoja veressä. HBV voi aiheuttaa nopean hepatiitin, nopeasti etenevän, usein kohtalok-10 kaan taudin muodon, jossa massiivisia osia maksasta tuhoutuu.

Potilaat tyypillisesti toipuvat äkillisestä hepatiitista. Joillakin potilailla kuitenkin suuria määriä virusantigeeniä säilyy itsepintaisesti veressä pitkän tai 15 epämääräisen ajan aiheuttaen kroonisen infektion. Krooniset infektiot voivat johtaa krooniseen pysyvään hepatiittiin. Kroonisella pysyvällä HBV:11a infektoituneet potilaat ovat erittäin tavallisia kehitysmaissa. Vuoden 1991 keskipaikkeilla oli yksistään Aasiassa likimääräisesti 225 20 miljoonaa kroonista HBV:n kantajaa ja koko maailmassa melkein 300 miljoonaa kantajaa. Krooninen pysyvä hepatiitti • voi aiheuttaa väsymystä, maksakirroosia ja maksasolusyö- : pää, joka on primaarinen maksasyöpä.

; Läntisissä teollisuusmaissa HBV-infektiolle riski- 25 alttiita ryhmiä ovat sellaiset, jotka ovat kosketuksissa :, HBV:n kantaj ien tai heidän verinäytteidensä kanssa. HBV:n ’.. epidemiologia on hyvin samanlainen kuin hankitun immuuni- ’ puutosoireyhtymän, mikä selittää miksi HBV-infektio on tavallinen AIDS:in tai AIDS:iin liittyvän kompleksin omaa-·' ' 30 villa potilailla. HBV on kuitenkin helpommin tarttuva kuin HIV.

; On kehitetty ihmisen seerumista peräisin oleva ro- .··, kote potilaiden immunoimiseksi HBV:tä vastaan. Vaikka se on todettu tehokkaaksi, rokotteen tuottaminen on hankalaa, :·: 1 35 koska kroonisilta kantajilta peräisin olevan ihmisen see- * » 4 114915 rumin tarjonta on rajoitettua ja puhdistusmenetelmä on pitkä ja kallis. Lisäksi kukin eri seerumista valmistettu rokote-erä täytyy testata simpansseissa turvallisuuden varmistamiseksi. Rokotteita on myös tuotettu geeniteknolo-5 gian avulla. Päivittäinen hoito α-interferonilla, geeniteknologian avulla valmistetulla proteiinilla, on myös ollut lupaavaa. Kuitenkaan nykyään ei tunneta farmaseuttista vaikuttaja-ainetta, joka tehokkaasti estää viruksen replikaatiota.

10 Nukleosidin markkinoimiseksi farmaseuttisia tarkoi tuksia varten sen ei ainoastaan pidä olla tehokas ja sen myrkyllisyyden vähäinen, vaan sen valmistuksen täytyy myös olla kannattavaa. Laaja määrä tutkimus- ja kehitystyötä on suunnattu uusiin, kustannuksiltaan alhaisiin menetelmiin 15 nukleosidien tuottamiseksi suuressa mittakaavassa. 2',3'-Dideoksinukleosideja valmistetaan nykyään käyttäen jompaakumpaa kahdesta reitistä: johdannaisen tekeminen ehyestä nukleosidista tai johdannaiseksi tehdyn sokeriosan konden-saatio heterosyklisen emäksen kanssa. Vaikka monia hait-20 to ja liittyy uusien nukleosidianalogien hankkimiseen muuntamalla ehyitä nukleosideja, on tämän lähestymistavan tär-•· keä etu, että luonto on jo aikaansaanut sopivan absoluut- tisen stereokemian. Kuitenkaan tätä lähestymistapaa ei . .·. voida käyttää sellaisten nukleosidien tuottamisessa, jotka 25 sisältävät joko luonnossa esiintymättömiä emäksiä tai !. ! luonnossa esiintymättömiä hiilihydraattiosia (ja joita sen vuoksi ei valmisteta ehyistä nukleosideista), kuten 1,3-’·’ oksatiolaaninukleosidit ja 1,3-dioksolaaninukleosidit.

Kondensoitaessa hiilihydraatti tai hiilihydraatin : 30 kaltainen osa heterosyklisen emäksen kanssa synteettisen nukleosidin muodostamiseksi, tuotetaan nukleosidi, jossa . ,·. on kaksi kiraalikeskusta (Cl'- ja C4'-asemassa) ja joka ,···, siten esiintyy diastereomeeriparina. Kumpikin diasteromee- ri esiintyy enantiomeerien yhdistelmänä. Sen vuoksi tuote : 35 on neljän enantiomeerin seos.

5 114915

Todetaan usein, että nukleosidit, joilla on luonnossa esiintymätön stereokemia joko Cl'- tai C4'-asemassa, ovat vähemmän aktiivisia kuin sama nukleosidi, jolla on luonnossa aikaansaadun mukainen stereokemia. Esimerkiksi 5 Carter et ai. ovat selostaneet, että karboviirin (2',3'-didehydro-2',3’-dideoksiguanosiini) (-)-enantiomeerin se pitoisuus soluviljelmässä, joka vaaditaan vähentämään käänteiskopioijaentsyymin aktiivisuutta 50 %:n verran (EC50), on 0,8 μΜ, kun taas karboviirin (+)-enantiomeerillä 10 EC50 on suurempi kuin 60 μΜ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34:6 (kesäkuu 1990) 1297 - 1300.

PCT-kansainvälinen julkaisu WO 91/11186 esittää, että 1,3-oksatiolaaninukleosideja voidaan valmistaa suurella diastereoselektiivisyydellä (suuri prosenttimäärä 15 nukleosidia, jolla on Cl'-hiilestä heterosykliseen emäkseen menevän sidoksen β-konfiguraatio) valitsemalla huolellisesti Lewis-happo, jota käytetään kondensaatiomene-telmässä. Havaittiin, että 1,3-oksatiolaaninukleosidin kondensaatio emäksen kanssa tapahtuu melkein täydellisellä 20 β-stereospesifisyydellä, kun tina(4)kloridia käytetään kondensaatiokatalyyttinä. Toiset Lewis-hapot aikaansaavat · vähäistä (tai ei ollenkaan) Cl'-β-selektiivisyyttä tai eivät yksinkertaisesti katalysoi reaktioita.

. Ottaen huomioon, että hankittu immuunipuutosoireyh- 25 tymä, AIDS:iin liittyvä kompleksi ja hepatiitti B -virus !. ! ovat saavuttaneet epidemiatasoja maailmanlaajuisesti ja niillä on traagisia vaikutuksia tartunnan saaneeseen poti-'·* * laaseen, on jäljellä voimakas tarve aikaansaada sellaisia uusia tehokkaita farmaseuttisia vaikuttaja-aineita näiden * 9 * : 30 sairauksien hoitamiseksi, joiden myrkyllisyys isännälle on ·φ>>ί vähäinen.

. On myös olemassa tarve aikaansaada kannattava, kau- pallisesti toteuttamiskelpoinen menetelmä farmaseuttisesti tärkeiden nukleosidien tuottamiseksi ja erityisesti β-ste- i.i : 35 reospesifisyyden saavuttamiseksi sellaisten synteettisten » 1 > t · 6 114915 nukleosidien C4'-asemassa, jotka on valmistettu konden-soimalla hiilihydraatin kaltainen osa emäksen kanssa.

Sen vuoksi tämän keksinnön eräänä tarkoituksena on tarjota menetelmä ja koostumus HIV-tartunnan saaneiden ihmispoti-5 laiden hoitamiseksi.

Toinen tämän keksinnön tarkoitus on tarjota menetelmä ja koostumus HBV-tartunnan saaneiden ihmispotilaiden tai muiden isäntäeläinten hoitamiseksi.

Vielä eräs tämän keksinnön tarkoitus on tarjota 10 enantiomeerin suhteen rikastettuja 1,3-oksatiolaaninukleo-sideja.

Vielä eräs tämän keksinnön tarkoitus on tarjota menetelmä 1,3-oksatiolaaninukleosidien C4'-enantiomeerien erottelua varten.

15 Keksinnön yhteenveto

Esitellään menetelmä ja koostumus HIV- ja HBV-in-fektioiden hoitamiseksi ihmisillä ja muilla isäntäeläimil-lä, jossa annetaan tehokas määrä 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaania, sen farmaseutti-20 sesti hyväksyttävää johdannaista, mukaan lukien 5'- tai N4-alkyloitu tai -asyloitu johdannainen, tai sen farmaseut-• tisesti hyväksyttävää suolaa farmaseuttisesti hyväksyttä vässä kantaja-aineessa.

On havaittu, että 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisy-25 tosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaani ( "FTC” ) osoittaa yllättävän suurta aktiivisuutta ihmisen immuunipuutosvirusta vastaan ; ja on hyvin vähän myrkyllinen isännän soluille. On myös • ‘ havaittu, että FTC osoittaa hyvin merkittävää aktiivisuut ta HBV:tä vastaan ja sitä voidaan sen vuoksi käyttää monia : *,· 30 erilaisia HBV-tartuntaan liittyviä sairauksia omaavien potilaiden hoitoon.

. Myrkyllisyys- ja farmakokineettiset tutkimukset vahvistavat FTC:n hyödyllisyyden virusvastaisena aineena lääkkeenä annettavaksi. FTC ja sen enantiomeerit eivät ole !,: i 35 myrkyllisiä periferisille ihmisen luuytimen soluille pi- 7 114915 toisuuksina, jotka ovat enintään 50 μΜ, eivätkä muille solulinjoille pitoisuuksina, jotka ovat enintään 200 μΜ. FTC-TP on tärkeä solunsisäinen aineenvaihduntatuote PBMC-ja HepG2-soluissa. FTC-TP estää kilpailevasta HIV-1-kään-5 teiskopioija (RT) -entsyymiä omaten Kj-arvon 0,2 μΜ käytettäessä poly(I)oligo(dC)-templaattialuketta. Käyttäen sek-venssointianalyysiä FTC-TP:n voidaan osoittaa olevan tehokas DNA-ketjun terminaattori, kun käytetään HIV-RT (C-lopetukset ).

10 Krooninen hoito FTC:llä ei ole myrkyllistä jyr sijöille edes käytettäessä oraalisia annoksia, jotka ovat 85 mg/kg päivää kohti, vähintään kahden kuukauden ajan.

FTC:n farmakokinetiikka reesusapinoissa osoittaa sen oraalisen biologisen hyötyosuuden olevan suuren (noin 73 ± 15 6 %) ja rajapuoliintumisajan plasmassa olevan noin 1,34 ± 0,18 (oraalisen ja laskimoon antamisen keskiarvo).

Esitellään myös menetelmä nukleosidienantiomeerien raseemisen seoksen, mukaan lukien FTC:n raseeminen seos, erottelemiseksi, joka menetelmä sisältää vaiheen, jossa 20 raseeminen seos saatetaan sellaisen entsyymin vaikutuksen alaiseksi, joka valikoivasti katalysoi reaktiota yhdessä • · enantiomeereistä. Menetelmää voidaan käyttää laajan vali- , koiman nukleosideja mukaan lukien pyrimidiini- ja puriini- . .·, nukleosideja, jotka ovat valinnaisesti substituoituja hii- • * » 25 lihydraattiosassa tai emäsosassa, erotteluun. Menetelmää

• I

!. ! voidaan myös käyttää sellaisten nukleosidijohdannaisten erottelemiseksi, jotka sisältävät lisäheteroatomeja hiili-

• * I

*·' ‘ hydraattiosassa, esimerkiksi (±)-FTC ja (±)-BCH-189. Nuk- leosidien erottelu voidaan suorittaa suuressa mittakaavas- ; 30 sa kohtuullisin kustannuksin.

Käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä FTC jaettiin , ,·, sen (+ ) -p-D- ja (-)-p-L-enantiomeereiksi. (-)-p-L-enantio- meeri näyttää olevan tehokkaampi kuin (+ )-p-D-enantiomeeri HIV:tä, HBV:tä ja SIV:tä vastaan. FTC:n (+)-enantiomeeri

• I

I 35 on myös aktiivinen HIV:tä, HBV:tä ja SIVrtä vastaan.

8 114915

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli )-l, 3-oksatiolaanin ("FTC") kemiallisen rakenteen kuva.

5 Kuvio 2 kuvaa menetelmää 2-hydroksimetyyli-5-(5- fluorisytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin valmistamiseksi.

Kuvio 3 on juoksukaavio alkalisen fosfataasin ja käärmeenmyrkyn fosfodiesteraasin spesifisyydestä FTC:n (+)- ja (-)-enantiomeerien suhteen.

10 Kuvio 4 on graafinen esitys, joka osoittaa FTC:n 5'-butyryyliesterin lipaasin katalysoiman hydrolyysin edistymisen ajan mukana käytettäessä entsyymejä Amano PS-800r (- avoin neliö -) ja PLE (- avoin ympyrä, jossa on piste -).

15 Kuvio 5 on graafinen esitys raseemisen ja enan- tiomeerin suhteen rikastetun FTC:n (valmistettu esimerkin 4 menetelmän avulla) pitoisuuden (μΜ) vaikutuksesta HIV-l:llä infektoitujen ihmisen PBM-solujen prosenttiseen estämiseen. [(- tummennettu ympyrä - (±)-FTC), (- avoin ym- 20 pyrä - (-)-FTC), (- tummennettu neliö - (+)-FTC)].

Kuvio 6 on graafinen esitys raseemisen ja enantio-meerin suhteen rikastetun FTC:n (valmistettu esimerkin 3 menetelmän avulla) pitoisuuden (μΜ) vaikutuksesta HIV- • * · l:llä infektoitujen ihmisen PBM-solujen prosenttiseen es- • * · 25 tämiseen. [(- tummennettu ympyrä - (±)-FTC), (- avoin ym- : * pyrä - (-)-FTC), (- tummennettu neliö - (+)-FTC)].

• » 1 : .* Kuvio 7 on graafinen esitys tritiumilla merkityn v : (±)-FTC:n otosta ihmisen PBM-soluihin (kahden määrityksen keskiarvo) esitettynä aika (tunteja) pikomooleja/106 solua 30 vastaan.

; Kuvio 8 on graafinen esitys radioaktiivisuudella merkityn (±)-FTC:n poistumisesta ihmisen PBM-soluista, mitattuna tunteina pikomooleja/106 solua vastaan.

Kuvio 9 kuvaa [3H]-(±)-FTC:n ja sen fosforyloitujen ; 35 johdannaisten läsnäoloa ihmisen HepG-2-soluissa (kahden 9 114915 määrityksen keskiarvo), joita on inkuboitu 10 μΜ [3H]-(±)~ FTC:a sisältävissä elatusaineissa, mitattuna pikomoolei-na/106 solua aikaa vastaan.

Kuvio 10 kuvaa [3H]-(±)-FTC:n ja sen fosforyloitujen 5 johdannaisten poistumista ihmisen HepG2-soluista esitettynä pikomooleina/106 solua aikaa vastaan sen jälkeen kun soluja on käsitelty 10 μΜ [3H]-(±)-FTC:llä (700 hajoamista minuutissa/pikomooli) 24 tunnin ajan ja yhdisteen pitoisuutta on arvioitu 24 tuntia poistamisen jälkeen.

10 Kuvio 11 esittää [3H]-(±)-FTC:n ja sen fosforyloitu jen johdannaisten yhdistetyn pitoisuuden vähenemistä ihmisen HepG2-soluista sen jälkeen kun on inkuboitu 10 μΜ [3H]-(±)-FTC:n kanssa (700 hajoamista minuutissa/pikomooli) 24 tunnin ajan, esitettynä pikomooleina/106 solua aikaa 15 vastaan.

Kuvio 12 on graafinen esitys FTC:n enantiomeerien vaikutuksesta granulosyyttimakrofaagiedeltäjäsolujen pesäkkeiden muodostukseen, mitattuna prosenttisena eloonjäämisenä μΜ pitoisuutta vastaan [(-)-FTC avoin ympyrä; 20 (+)-FTC tummennettu ympyrä; AZT tummennettu neliö].

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä käytettynä ilmaus "enantiomeerin suhteen ri- T kastettu nukleosidi" viittaa nukleosidikoostumukseen, joka • « ' sisältää tuon nukleosidin yhtä ainoaa enantiomeeriä vähin- • 1 25 tään 95 %.

( » • » ’ Tässä käytettynä termi FTC viittaa 2-hydroksimetyy- « 1 * 1 · ; ' li-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaaniin(raseemi- v ’ nen muoto tai enantiomeerejä), josta myös käytetään nimi tystä 2'-deoksi-5-fluori-3'-tiasytidiini.

30 Tässä käytettynä termi (±)-FTC viittaa (±)-β-Ρ,L- 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-1-yyli)-1,3-oksatio-laaniin.

Tässä käytettynä termi (-)-FTC viittaa (-)-p-L-2-hydroksimetyyli-5-( 5-fluorisytosin-l-yyli )-l, 3-oksatiolaa-35 niin.

10 114915 Tässä käytettynä termi (+)-FTC viittaa (+)-β-ϋ-2-hydroksimetyyli-5-( 5-fluorisytosin-l-yyli )-l, 3-oksatiolaa-niin.

Tässä käytettynä termit FTC-MP, FTC-DP ja FTC-TP 5 viittaavat vastaavasti FTC:n monofosfaattiin, difosfaat-tiin ja trifosfaattiin.

Tässä käytettynä termi BCH-189 viittaa 2-hydroksi-metyyli-5-(sytosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaaniin.

Tässä käytettynä ilmaus "valikoiva entsyymikatalyy-10 si" viittaa sellaisen entsyymin suorittamaan katalyysiin, joka antaa etusijan yhdelle substraatille toiseen verrattuna.

Tässä käytettynä poistuva ryhmä tarkoittaa funktionaalista ryhmää, joka muodostaa alkavan karbonoinnin, kun 15 se eroaa molekyylistä, johon se on kiinnittynyt.

Tässä esitelty keksintö on menetelmä ja koostumus HIV- ja HBV-infektioiden ja muiden samankaltaisella tavalla replikoituvien virusten hoitamiseksi ihmisillä tai muilla isäntäeläimillä, jossa annetaan tehokas määrä 20 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-1-yyli)-l,3-oksatio- laanin (± )-β-Ρ, L-, (-)-β-ΐι- tai (+ )^-D-enantiomeeriä, sen farmaseuttisesti ("fysiologisesti") hyväksyttävää johdan- t · · naista, mukaan lukien 5'- tai N4-alkyloitu tai -asyloitu • · • · · ·.*.* johdannainen, tai farmaseuttisesti ("fysiologisesti") hy- 25 väksyttävää suolaa farmaseuttisesti hyväksyttävässä kan- • \> taja-aineessa. Kuten alla on esitetty, tämän keksinnön • ·’; mukaisilla yhdisteillä joko on retroviruksen vastainen :*:’: aktiivisuus kuten Hiv-l:n, HIV-2:n ja apinan immuunipuu- tosviruksen vastainen (SIV:in vastainen) aktiivisuus it-30 sellään tai ne muutetaan aineenvaihdunnassa yhdisteeksi, joka osoittaa retroviruksen vastaista aktiivisuutta.

FTC ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset tai näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävät valmisteet ovat hyödyllisiä HIV-infektioiden : . , 35 ja muiden vastaavien tilojen kuten AIDS:iin liittyvän I t » 11 114915 kompleksin (ARC), jatkuvan yleistyneen lymfadenopatian (PGL), AIDS:iin liittyvien neurologisten tilojen, anti-HIV-vasta-aineen suhteen positiivisten ja HIV:n suhteen positiivisten tilojen, Kaposin sarkooman, trombosytopeeni-5 sen purppuran ja opportunististen infektioiden ehkäisyssä ja hoidossa. Lisäksi näitä yhdisteitä tai valmisteita voidaan käyttää ennaltaehkäisevästi kliinisen sairauden ehkäisemiseksi tai sen etenemisen hidastamiseksi henkilöillä, jotka ovat anti-HIV-vasta-aineen suhteen tai HIV-anti-10 geenin suhteen positiivisia tai jotka ovat olleet alttiina HIV:lie.

FTC ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset tai suolat tai näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävät valmisteet ovat myös hyödyllisiä 15 HBV-infektioiden ja muiden niihin liittyvien tilojen kuten anti-HBV-vasta-aineen suhteen positiivisten ja HBV:n suhteen positiivisten tilojen, HBV:n aiheuttaman kroonisen maksatulehduksen, kirroosin, äkillisen hepatiitin, nopeasti kehittyvän hepatiitin, kroonisen pysyvän hepatiitin ja 20 uupumuksen ehkäisyssä ja hoidossa. Näitä yhdisteitä tai valmisteita voidaan myös käyttää ennaltaehkäisevästi eh-käisemään kliinistä sairautta tai hidastamaan sen etene-'! mistä henkilöillä, jotka ovat anti-HBV-vasta-aineen suh- ; teen tai HBV-antigeenin suhteen positiivisia tai jotka • » ··’ 25 ovat olleet alttiina HBV:lle.

Lyhyesti sanottuna tämä keksintö käsittää seuraavat ’.· puolet: : : a)(±)-β—D,L-2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)- 1,3-oksatiolaanin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä 30 johdannaisia ja suoloja; b) (- )-^-L-2-hydroksimetyyli-5-( 5-f luorisytosin-l-yyli )-·, 1,3-oksatiolaanin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia ja suoloja; 12 114915 c) (+)-p-D-2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)- 1,3-oksatiolaanin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia ja suoloja; d) (i)-β-Ρ,L-2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)- 5 1,3-oksatiolaanin, sen (-)- ja (+)-enantiomeerit ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia ja suoloja käytettäväksi lääkehoidossa esimerkiksi HIV- tai HBV-infektion hoitamiseksi tai ennalta ehkäisemiseksi; e) (±)-β-Ρ,L-2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)- 10 1,3-oksatiolaanin, sen (-)- ja (+)-enantiomeerien ja nii den faramseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten ja suolojen käytön lääkkeen valmistuksessa HIV- tai HBV-infek-tion hoitoa varten; f) farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät (±)-β-15 D, L-2-hydroksimetyyli-5-( 5-f luorisytosin-l-yyli )-l,3-oksa- tiolaania, sen (-)- tai (+)-enantiomeeriä tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista tai suolaa yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa; 20 g) menetelmän 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli )-l, 3-oksatiolaanin valmistamiseksi, jossa: i) annetaan valinnaisesti suojatun 5-fluorisytosiinin rea-goida kaavan A mukaisen 1,3-oksatiolaanin kanssa • · · : 25 (A> * · > jossa Rla on vety tai hydroksyylin suojaryhmä mukaan lukien ... 30 asyyliryhmä ja L on poistuva ryhmä; ja valinnaisesti pois- tetaan mahdollinen hydroksyylin suojaryhmä.

» * 13 114915 ii) annetaan kaavan B mukaisen yhdisteen NHR1b £ (B) 10 (jossa Rla on yllä määritellyn mukainen ja Rlb on aminon suojaryhmä) reagoida fluoraavan aineen kanssa, jota käytetään fluoriatomin lisäämiseksi sytosiinirenkaan 5-asemaan; tai 15 iii) annetaan kaavan C mukaisen yhdisteen A' (C) *.· (jossa Rla on yllä määritellyn mukainen) reagoida sellaisen :.· 25 aineen kanssa, joka muuttaa oksoryhmän urasiilirenkaan 4-asemassa aminoryhmäksi; ja kaikki jäljellä olevat suoja-•: ryhmät poistetaan, jolloin aikaansaadaan haluttu tuote.

·*; f) menetelmän 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yy- li)-l,3-oksatiolaanin (-)- tai (+)-enantiomeerin valmis-30 tamiseksi, jossa yhdiste tai sen johdannainen (esim.

5'-esteri) saatetaan (-)- ja (+)-enantiomeerien seoksen 1’ muodossa sellaisiin olosuhteisiin tai annetaan sen reagoi da sellaisten reagenssien kanssa, joiden avulla erotetaan enantiomeerit, ja mikäli tarpeellista muutetaan tulokseksi 35 saatu johdannainen alkuperäiseksi yhdisteeksi.

14 114915

Menetelmän e) 1) yhteydessä hydroksin suojaryhmä käsittää alla yksityiskohtaisesti kuvattuja suojaryhmiä mukaan lukien asyyli (esim. asetyyli), aryyliasyyli (esim. bentsoyyli tai substituoitu bentsoyyli), trityyli tai mo-5 nometoksitrityyli, bentsyyli tai substituoitu bentsyyli, trisubstituoitu silyyli mukaan lukien trialkyylisilyyli (esim. dimetyyli-t-butyylisilyyli) tai difenyylimetyylisi-lyyli. 5-Fluorisytosiiniyhdiste voi valinnaisesti olla suojattu trisubstituoiduilla silyyliryhmillä. Suojaryhmät 10 voidaan poistaa tavanomaisesti. Poistuva ryhmä L on tyypillinen nukleosidikemian alalla tunnettu poistuva ryhmä, esim. halogeeni kuten kloori tai bromi, alkoksi kuten metoksi tai etoksi tai asyyli kuten asetyyli tai bentsoyy li.

15 Reaktio menetelmässä e) i) voidaan suorittaa orgaa nisessa liuottimessa (esim. 1,2-dikloorietaani tai aseto-nitriili) Lewis-hapon, edullisesti tina(4)kloridin tai trimetyylisilyylitriflaatin läsnä ollessa.

Kaavan A (jossa L edustaa asyyliryhmää, esim. ase-20 tyyliryhmää) mukaisia yhdisteitä voidaan saada antamalla kaavan D mukaisen yhdisteen R1aO—\ o V y° ; 25 XS_J (D) (jossa Rla on yllä määritellyn mukainen) reagoida pelkis-timen, esim. litiumalumiinihydridin, kanssa, mitä seuraa käsittely sopivalla tavanomaisella reagenssilla haluttua . 30 välituotetta varten, esimerkiksi karboksyylihappoanhydri- ·_; dillä, esim. etikkahappoanhydridillä, asyloimiseksi, kloo- "···’ raus- tai bromausreagensseilla halogenoimiseksi tai alky- : loivilla reagensseilla.

Kaavan D mukainen yhdiste voidaan valmistaa an-35 tamalla kaavan E mukaisen yhdisteen 15 114915

H

"„°N^k0 (E) 5 reagoida yhdisteen HSCH2C02H kanssa kohotetussa lämpötilassa.

Kaavan E mukainen yhdiste voidaan valmistaa sellaisen allyylieetterin tai -esterin, jolla on kaava CH2=CH-CH2-OR, tai 2-buteeni-l,3-diolin dieetterin tai diesterin, 10 jolla on kaava ROCH2-CH=CH-CH2OR, jossa R on suojaryhmä kuten alkyyli-, silyyli- tai asyyliryhmä, otsonolyysin avulla.

Menetelmän e) ii) yhteydessä 5-fluorisubstituentti voidaan lisätä alalla tunnettujen menetelmien aulla [M.J.

15 Robins et ai., teoksessa Nucleic Acid Chemistry, osa 2, L.B. Townsend ja R.S. Tipson, toimittajat, J. Wiley and Sons, New York, 895 - 900 (19/8) ja siinä olevat viitteet; R. Duschinsky teoksessa Nucleic Acid Chemistry, osa 1, L.B. Townsend ja R.S. Tipson, toimittajat, J. Wiley and 20 Sons, New York 43 - 46 (1978) ja siinä olevat viitteet]. Fluorausaine voi olla esimerkiksi trimetyylihypofluoriitti fluoritrikloorimetaanissa.

Mitä tulee menetelmään e) iii), kaavan C mukaista v yhdistettä voidaan käsitellä 1,2,4-triatsolilla, yhdessä 25 4-kloorifenyylidikloorifosfaatin kanssa, vastaavan 4- ( 1,2,4-triatsoylyyli )yhdisteen muodostamiseksi, joka ·*; muutetaan sitten halutuksi 4-amino( sytidiini) -yhdisteek- si suorittamalla reaktio esimerkiksi metanolin kanssa.

• ·

Kaavojen B ja C mukaiset lähtöaineet voidaan val-30 mistaa esimerkiksi antamalla sopivan (valinnaisesti suojatun) emäksen reagoida kaavan A mukaisen yhdisteen kanssa vastaavalla tavalla kuin on kuvattu menetelmässä e) i).

5- fluoriurasiili ja 5-fluorisytosiini ovat kaupallisesti saatavissa toiminimeltä Aldrich Chemical Co., Milwaukee, 35 WI 53233, USA.

16 114915 (±)-enantiomeerien erottelu voidaan suorittaa kuten on esitetty yksityiskohtaisesti osassa III jäljempänä.

FTC voidaan muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi esteriksi suorittamalla reaktio sopivan esteröivän aineen, 5 esimerkiksi happohalogenidin tai -anhydridin kanssa. FTC tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä johdannainen voidaan muuttaa sen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tavanomaisesti, esimerkiksi käsittelemällä sopivalla emäksellä. FTC:n esteri tai suola voidaan muuttaa FTCrksi esi-10 merkiksi hydrolyysin avulla.

I. Aktiivinen yhdiste ja sen fysiologisesti hyväksyttäviä johdannaisia ja suoloja Tässä esitelty virusvastaisena aktiivinen yhdiste on 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-l,3-oksa-15 tiolaani (katso kuvio 1), raseemisessa muodossa tai eristettynä enantiomeerinä.

Aktiivinen yhdiste voidaan antaa minä tahansa johdannaisena, joka saajalle antamisen jälkeen kykenee tarjoamaan suoraan tai epäsuorasti alkuperäisen FTC-yhdisteen 20 tai joka osoittaa itse aktiivisuutta. Ei-rajoittavia esimerkkejä ovat aktiivisen yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat (joita vaihtoehtoisesti nimitetään "fysio-mm\\’ logisesti hyväksyttäviksi suoloiksi") ja 5'- ja N4-asyloi- dut tai -alkyloidut johdannaiset (joita vaihtoehtoisesti : 25 nimitetään "fysiologisesti tai farmaseuttisesti aktiivi- siksi johdannaisiksi"). Yhdessä suoritusmuodossa asyyli- • · ryhmä on karboksyylihapon esteri, jossa esteriryhmän ei- • · *«;·, karbonyyliosa on valittu joukosta suoraketjuinen, haarau- I * * tunut tai syklinen alkyyli, alkoksialkyyli mukaan lukien ,,, 30 metoksimetyyli, aralkyyli mukaan lukien bentsyyli, arylok- • (i; sialkyyli kuten fenoksimetyyli, aryyli mukaan lukien fe- '··** nyyli, joka on valinnaisesti substituoitu halogeenillä, ; C1_4-alkyylillä tai C1.4-alkoksilla, sulfonaattiesterit kuten alkyyli- tai aralkyylisulfonyyli mukaan lukien metaanisul-,35 fonyyli, mono-, di- tai trifosfaattiesteri, trityyli tai

t I

’ « j · 11491 5 17 monometoksitrityyli, substituoitu bentsyyll, trialkyyli-silyyll (esim. dimetyyli-t-butyylisilyyli) tai difenyyli-metyylisilyyli. Estereissä olevat aryyliryhmät käsittävät optimaalisesti fenyyliryhmän. Alkyyliryhmä voi olla suora-5 ketjuinen, haarautunut tai syklinen ja on edullisesti ryhmä.

Erityisiä esimerkkejä FTC:n farmaseuttisesti hyväksyttävistä johdannaisista ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta: NHR

JV- N ^

<KJ

15 zs/v

MJ

s-J

jossa Rx ja R2 on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, 20 jonka muodostavat alkyyli ja asyyli erityisesti mukaan lukien, mutta mainittuihin rajoittumatta, metyyli, etyyli, propyyli, butyyli, pentyyli, heksyyli, isopropyyli, isobu-tyyli, sek-butyyli, t-butyyli, isopentyyli, amyyli, t-pen-tyyli, 3-metyylibutyryyli, vetysukkinaati, 3-klooribentso- • ·/· 25 aatti, syklopentyyli, sykloheksyyli, bentsoyyli, asetyyli, • *: pivaloyyli, mesylaatti, propionyyli, butyryyli, valeryyli, ·*: kaproni-, kapryyli-, kapriini-, lauriini-, myristiini-, ·'; palmitiini-, steariini-, öljyhappo, aminohapot mukaan lu kien mutta mainittuhin rajoittumatta alanyyli, valinyyli, 30 leusinyyli, isoleusinyyli, prolinyyli, fenyylialaninyyli, ,! tryptofanyyli, metioninyyli, glysinyyli, serinyyli, treo- ;* ninyyli, kysteinyyli, tyrosinyyli, asparaginyyli, glutami- nyyli, aspartoyyli, glutaoyyli, lysinyyli, argininyyli ja histidinyyli, ja jossa toinen ryhmistä Rx ja R2 voi olla H.

18 114915 FTC tai sen johdannaiset voidaan tarjota farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodossa. Tässä käytettynä ilmaus farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat tai kompleksit viittaa FTC:n suoloihin tai komplekseihin, joilla on 5 jäljellä alkuperäisen yhdisteen haluttu biologinen aktiivisuus ja jotka osoittavat minimaalisia, mikäli ollenkaan, epäsuotavia toksikologisia vaikutuksia. Ei-rajoittavia esimerkkejä sellaisista suoloista ovat a) happoadditiosuo-lat, jotka on muodostettu epäorgaanisten happojen (esimer-10 kiksi kloorivetyhapon, bromibetyhapon, rikkihapon, fos- forihapon, typpihapon ja vastaavien) kanssa, ja suolat, jotka on muodostettu orgaanisten happojen kuten etikka-hapon, oksaalihapon, viinihapon, meripihkahapon, omenaha-pon, askorbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamoiini-15 hapon, algiinihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenisul- fonihappojen, naftaleenidisulfonihappojen ja polygalaktu-ronihapon kanssa; b) emäsadditiosuolat, jotka on muodostettu moniarvoisten metallikationien kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, 20 koboltin, nikkelin, kadmiumin, natriumin, kaliumin ja vastaavien kanssa tai orgaanisen kationin, joka on muodos-·· tunut N,N-dibentsyylieteenidiamiinista, ammoniumista tai • · I · eteenidiamiinista, kanssa; tai c) a):n ja b):n yhdis-. ,*. telmät; esim. sinkkitannaattisuola tai vastaavat.

25 Aktiivisen yhdisteen muunnokset, erityisesti N4- ja !. ! 5'-O-asemissa, voivat vaikuttaa aktiivisen yhdisteen bio- ,,! logiseen hyötyosuuteen ja sen aineenvaihdunnan nopeuteen, *· ' kontrolloiden siten aktiivisen yhdisteen toimitusta. Li säksi muunnokset voivat vaikuttaa yhdisteen virusvastai-: 30 seen aktiivisuuteen, joissakin tapauksissa suurentaen ak- tiivisuutta alkuperäiseen yhdisteeseen verrattuna. Tämä . ·. voidaan helposti tukia valmistamalla johdannainen ja tes- , ··. taamalla sen virusvastainen aktiivisuus tässä kuvattujen menetelmien tai alan ammatti-ihmisten tunteman muun mene- : 35 telmän mukaan.

* * I · > » 19 114915 II. Aktiivisten yhdisteiden valmistus FTC:n raseeminen seos voidaan valmistaa käyttäen menetelmää, joka on esitelty yksityiskohtaisesti PCT- kansainvälisessä julkaisussa W0 91/11186, joka on julkaistu 5 8. elokuuta 1991 ja jonka on jättänyt Emory University, tai sen menetelmän avulla, joka on esitelty esimerkissä 1. Yleensä menetelmässä otsonoidaan joko allyylieetteri tai -esteri, jolla on kaava CH2=CH-CH2-OR, tai 2-buteeni-l,3-diolin dieetteri tai diesteri, jolla on kaava ROCH2-CH=CH-10 CH20R, jossa R on suojaryhmä kuten alkyyli-, silyyli- tai asyyliryhmä, kaavan 0HC-CH2-0R mukaisen glykoaldehydin muodostamiseksi; lisätään tioglykolihappoa glykoaldehydiin kaavan 2-(R-oksi)metyyli-5-okso-l,3-oksatiolaani mukaisen laktonin muodostamiseksi; pelkistetään laktoni erilaisiksi 15 yhdisteiksi, jotka sisältävät poistuvan ryhmän oksatiolaa-nirenkaan 5-asemassa; kytketään nämä yhdisteet silyoidun 5-fluorisytosiinin kanssa yhdisteen SnCl4 läsnä ollessa FTC:n β-isomeerin muodostamiseksi ja valinnaisesti poistetaan suojaryhmät.

20 Esimerkki 1 (±) -β-Ρ, L-2-Hydroksimetyyli-5- (5-fluorisytosin-l- yyli)-1,3-oksatiolaanin valmistus : Menetelmä FTC:n raseemisen seoksen valmistamiseksi : on esitetty kuviossa 2 ja kuvattu yksityiskohtaisesti al- ; v. 25 la.

2-Buteeni-l,4-diolin suojaus

Kuivassa 2 litran kolmikaulakolvissa inertissä ilmakehässä 100 grammaa (93,5 ml = 1,135 moolia = 1,00 ekvi-, , valenttia) 2-buteeni-l,4-diolia ja 15 grammaa (noin 30 0,1 ekv.) DMAP (4-dimetyyliaminopyridiini) liuotettiin ’··' 800 mitään kuivaa pyridiiniä ja sekoitettiin jäähdyttäen • 0 °C;seen. Butyryylikloridia (260 ml = 2,2 ekv.) lisättiin sitten hitaasti ylikuumenemisen estämiseksi ja sekoitet-, \ tiin yhden tunnin ajan. Reaktio tukahdutettiin pienellä ; 35 määrällä jäävettä. Neste dekantoitiin suolan joukosta ja 20 114915 haihdutettiin tyhjössä. Jäljelle jäänyt suola liuotettiin veteen ja vesiliuosta uutettiin kaksi kertaa etyylieette-rillä. Yhdistetyt eetterikerrokset pestiin kerran kyllästetyllä CuS04-liuoksella, kaksi kertaa kyllästetyllä 5 NaHC03-liuoksella, joka sisälsi Norit , ja tyhjösuodatet-tiin sitten seliitti -kerroksen läpi.

Konsentroitu reaktioseos liuotettiin eetteriin ja pestiin noudattaen samaa menetelmää kuin yllä suolaliuoksen tapauksessa. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset konsen-10 troitiin kiertohaihduttimen avulla ja pantiin sitten tyhjöön. Tämä reaktio on tyypillisesti hyvin lähellä kvantitatiivista. Mittakaavaa voidaan helposti suurentaa tarpeen mukaan. Tuote l,4-dibutyryyli-2-buteeni-l,4-dioli on värittömästä lievästi keltaiseen oleva kirkas neste.

15 Suojatun diolin otsonolyysi l,4-Dibutyryyli-2-buteeni-l,4-diolia (1,365 moolia) liuotettiin 4 litraan kuivaa CH2C12 kuivassa 5 litran kol-mikaulakolvissa, joka oli varustettu suurella kuivausput-kella ja avoimella putkella kaasun sisäänvientiä varten.

20 Optimaalisesti putki ei ole huokoslasikaasunpulputusputki, joka tukkeutuu joutuessaan väkevän liuoksen vaikutuksen ·;· alaiseksi. Liuosta sekoitettiin ja jäähdytettiin :Y: -78 °C:seen samalla kun inerttiä kaasua pulputettiin • liuoksen läpi. Kaasun sisäänvientiaukko tukittiin, kun 25 liuos oli jäähtynyt riittävästi, ja kolvi ja sekoituslaite

• I

:-i t siirrettiin otsonigeneraattoriin. Happea pulputettiin se- koitetun liuoksen läpi vähintään 20 minuutin ajan pitäen ‘ samalla jäähaudetta. Cryocool-laite on ihanteellinen al haisen lämpötilan ylläpitämiseksi tätä pitkällistä reak-·’ 30 tiota varten. Otsonia lisättiin sitten käyttäen painetta 8-8,5 psi. Loppuun saattamisen jälkeen otsoni virta py-; säytettiin ja happea pulputettiin liuoksen läpi noin puo- ,···. Ien tunnin ajan ennen kuin lisättiin 3 ekvivalenttia Me2S.

Kolvi poistettiin jäähdytyshauteesta ja siirrettiin vetoni : 35 kaappiin, jossa sitä sekoitettiin noin 2 päivän ajan täy- 21 114915 dellisen pelkistymisen aikaansaamiseksi. Liuos haihdutettiin ja pantiin tyhjöön useiden tuntien ajaksi.

Tämä reaktio tuottaa tyypillisesti noin 95 % määrän suojattua aldehydiä (2-butyryloksiasetaldehydiä), värittö-5 mästä keltaiseen olevaa kirkasta nestettä.

Renkaanmuodostus aldehydistä merkaptoetikkahapon avulla

Aldehydi (1,0 ekvivalenttia) liuotettiin tolueeniin niin että aikaansaatiin 0,80 - 0,85 M liuos kolviin, joka 10 oli varustettu Dean Stark -tyyppisellä loukulla. Tioglyko-lihappoa (1,1 ekv.) lisättiin ja seosta kuumennettiin palautus jäähdyttäen. Vesi poistettiin atseotrooppisesti loukun avulla. Reaktio saatettiin loppuun 3 tunnissa ja reak-tioseoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan. Orgaa-15 ninen liuos pestiin kaksi kertaa yhtä suurilla tilavuuksilla kyllästettyä NaHC03-vesiliuosta ja kerran vedellä, kuivattiin käyttäen MgS04 ja Noritia ja tyhjösuodatettiin seliitin läpi ennen kuin se haihdutettiin tyhjössä. Ensimmäistä NaHC03-pesuliuosta takaisinuutettiin kerran eet-20 terillä; eetteri pestiin kerran vedellä, kuivattiin käyttäen MgS04 ja NoritiaR, tyhjösuodatettiin seliitinR läpi ja ..]·* haihdutettiin yhdessä muun orgaanisen aineen kanssa tolu- eeniliuoksesta. Yhdistetty aine pantiin tyhjöön yön ajak-: si.

25 Reaktio tarjoaa tyypillisesti 90 % saannon 2-(bu- tyryloksi )metyyli-5-okso-l, 3-oksatiolaania.

Laktonin pelkistys ja muuttaminen asetaatiksi 2-Butyryloksimetyyli-5-okso-1,3-oksatiolaani (1,00 ekvivalenttia) liuotettiin kuivaan THFiiin niin että 30 saatiin 0,23 M liuos kuivaan kolmikaulakolviin, joka oli varustettu koneellisella sekoituslaitteella ja pidettiin inertissä ilmakehässä. Liuosta sekoitettiin ja se jäähdy-tettiin 0 °C;seen enen kuin 1,1 ekvivalenttia 1,0 M Li(t-BuO)3A1H THFrssa lisättiin johtoputken avulla. Pelkistys • 35 tapahtui loppuun noin kolmessa tunnissa, minkä osoitti 22 114915 ohutkerroskromatografia (TLC) käyttäen suhteen 2 : 1 omaavaa eetteri/heksaaniliuotinjärjestelmää ja anisaldehydi-värjäystä.

Sitten lisättiin noin 10 ekvivalenttia juuri tis-5 lattua Ac20 ja sekoitettiin 2 päivän ajan asetyloidun tuotteen aikaansaamiseksi. Reaktio tukahdutettiin lisäämällä kyllästettyä NaHC03/ jota sekoitettiin yön ajan. Liuos haihdutettiin sitten ja sekoitettiin lisämäärän NaHC03-liuosta kanssa yön ajan. Tätä uutettiin eetterillä, joka 10 pestiin (huolellisesti) kaksi kertaa kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kerran vedellä, kuivattiin käyttäen MgS04 ja NoritiaR, tyhjösuodatettiin seliitinR läpi ja haihdutettiin. Tuote on tumman keltainen, kirkas neste. Kaasukromatografia (alku-T = 80 °C; alkuaika = 5 min; edistymis-15 nopeus = 10 °C/min; loppu-T = 240 °C) osoittaa tyypillisesti puhtaudeksi noin 70 %.

5-Fluorisytosiinin silylointi 5-Fluorisytosiini (1,05 ekvivalenttia sen asetyloidun laktolin määrän perusteella, joka oli saatu edellises-20 sä vaiheessa osoittaen puhtaus kaasukromatografian avulla) silyloitiin kuumentaen palautusjäähdyttäen vähintään 10 ekvivalentissa heksametyylidisilatsaania, joka sisälsi katalyyttisen määrän puhdasta ammoniumsulfaattia (0,05 -0,10 ekv.), kahden tunnin ajan sen jälkeen kun liuos oli 25 kirkastunut. Kolvi suljettiin sitten tiiviisti ja liuotin .poistettiin käyttäen tyhjöpumppua ja apuloukkua. Tuote, valkea kiinteä aine, jätettiin tyhjöön yön ajaksi, kunnes * * * se oli valmis käytettäväksi seuraavassa paritusreaktiossa.

,. . Silyloidun 5-fluorisytosiinin liittäminen asetyloi- 30 tuun laktoliin

Silyloitu 5-fluorisytosiini (33,86 g, 0,124 moo-: lia), joka oli kuivassa dikloorimetaanissa (350 ml), li- sättiin SnCl4-liuokseen (135,6 ml, 1-molaarinen liuos . CH2Cl2:ssa) typpi-ilmakehässä. Liuosta sekoitettiin 15 mi- ; 35 nuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tämä liuos siirrettiin 23 114915 johtoputken avulla liuokseen, jossa oli laktoliasetaattia (38 g, 0,113 moolia) dikloorimetaanissa (400 ml) typpi-ilmakehässä, 30 minuutin aikana.

Reaktioliuosta sekoitettiin 2 tunnin ajan, jonka jälkeen 5 TLC osoitti reaktion tapahtuneen loppuun. Reaktioliuos laimennettiin sitten dikloorimetaanilla (500 ml) ja sammutettiin ammoniumhydroksidiliuoksella. Ammoniumhydroksi-diliuos (100 ml) lisättiin hitaasti pitäen reaktion lämpötila 30 °C:een alapuolella, mikä johti valkean saostuman 10 muodostumiseen.

Seosta sekoitettiin vielä 30 minuutin ajan ja sen annettiin sitten kulkea silikageelipylvään (läpimitta 17,8 cm, korkeus 12,7 cm) läpi. Se eluoitiin peräkkäisessä järjestyksessä dikloorimetaanilla (2 1), etyyliasetaatilla 15 (2 1) ja etyyliasetaatti : etanolilla (9 : 1) (4 1). Etyy liasetaatti- ja etyyliasetaatti : etanolieluentti sisälsivät halutun tuotteen. Nämä liuokset yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Jäljelle jäänyt tahmea kiinteä aine pestiin sitten kuivalla eetterillä (200 ml), 20 jolloin saatiin valkea kiinteä aine (25,35 g; 71 %) FTC-5'-butyraatti.

FTC-5'-butyraatti (8,74 g; 0,026 moolia) liuotet-tiin 250 ml:aan metanolia. Natriummetoksidia (2,85 g; : 0,052 g) lisättiin huoneenlämpötilassa. Reaktioseosta βει v. 25 koitettiin 1 tunnin ajan, jonka jälkeen TLC varmisti reak- • ·. tion tapahtuneen loppuun. NH4Cl-liuosta (10 ml) lisättiin reaktion tukahduttamiseksi ja sitten liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännös absorboitiin silikageeliin (5 g) ja johdettiin pienen pylvään läpi käyttäen etyyli-*’ 30 asetaatti : etanolia eluenttina (9 : 1). Tuotteen sisältä vät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saa-tiin tahmea kiinteä aine, joka pestiin kuivalla eetterillä saaden valkea kiinteä aine FTC (6,00 g, 88 %). ^H-NMR: \ (DMSO-d6) 8,18 (1H, d, H6, J = 8,4 Hz), 7,81 & 7,57 (2H, S 35 leveä, NH2), 6,12 (1H, dd, Hr, J = 5,7 & 4,2 Hz), 5,40 (1H, 24 114915 t, OH, J = 5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H4,, J = 3 - 6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H5,), 3,41 (1H, dd, 1H2., J = 5,7 & 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H2., J = 4,2 & 11,7 Hz); 13C-NMR: (DMSO-d6) 157,85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, J = 241 Hz), 126,01 5 (d, J = 32,6 Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07; s.p. 195 - 196 °C.

III. Nukleosidienantiomeerien erottelu Tässä tarjotaan menetelmä nukleosidienantiomeerien mukaan lukien, mutta mainittuihin rajoittumatta, FTC:n 10 (+)- ja (-)-enantiomeerit, raseemisten seosten erottelemi seksi. Menetelmää voidaan myös käyttää hiilihydraattien tai hiilihydraattien kaltaisten yhdisteiden kuten 1,3-oksatiolaanin ja 1,3-dioksolaanin johdannaisten raseemisten seosten erotteluun. Menetelmään sisältyy sellaisen 15 entsyymin käyttö, joka valikoivasti katalysoi yhden rasee-misessa seoksessa olevan enantiomeerin reaktiota. Reagoinut enantiomeeri erotetaan reagoimattomasta enantiomeeris-tä uuden eron fysikaalisessa rakenteessa perusteella. Tässä esitetyn perusteella alan ammatti-ihminen kykenee va-20 litsemaan entsyymin, joka on selektiivinen valitun nukleo-sidienantiomeerin suhteen (tai selektiivinen ei-halutun enantiomeerin suhteen, menetelmänä sen poistamiseksi), valitsemalla jonkun alla tarkastelluista entsyymeistä tai ... arvioimalla systemaattisesti muita tunnettuja entsyymejä.

« ♦ » . 25 Tässä esitetyn perusteella alan ammatti-ihminen ymmärtää myös miten modifioida substraattia tarpeen mukaan halutun erottamisen aikaansaamiseksi. Käyttämällä joko kiraali- * t · • NMR-siirtymäreagensseja, polarimetriaa tai kiraali-HPLC:aa voidaan määrittää talteen saadun esterin optinen rikastu- 30 minen.

Seuraavat esimerkit valaisevat lisää entsyymien käyttöä enantiomeerien raseemisten seosten erotteluun.

’ . Muita tunnettuja menetelmiä raseemisten seosten erottele- » miseksi voidaan käyttää yhdessä tässä esitellyn erottelu- 1 · 25 114915 menetelmän kanssa. Kaikkien näiden muunnelmien katsotaan sisältyvän keksinnön piiriin.

Erottelu C5'-nukleosidiesterien hydrolyysin perusteella 5 Yhdessä suoritusmuodossa menetelmässä annetaan nuk- leosidirasemaattien seoksen C5' -hydroksyyliryhmän reagoida asyyliyhdisteen kanssa sellaisten C5 1-esterien muodostamiseksi, joissa nukleosidi on esterin "karbinoli"-päässä. Nukleosidi-C5'-esterien raseemista seosta käsitellään 10 sitten entsyymillä, joka vaikoivasti halkaisee tai hydrolysoi toisen enantiomeereista eikä toista määrätyn ajan kuluessa.

Tämän menetelmän etuna on, että sitä voidaan käyttää laajan valikoiman nukleosideja erotteluun, mukaan lu-15 kien pyrimidiini- ja puriininukleosideja, jotka ovat valinnaisesti substituoituja hiilihydraattiosassa tai emäs-osassa. Menetelmää voidaan myös käyttää sellaisten nukleosidi johdannaisten erotteluun, jotka sisältävät lisähetero-atomeja hiilihydraatiosassa, esimerkiksi FTC ja BCH-189.

20 Tämän menetelmän laaja soveltuvuus perustuu osaksi siihen, että vaikka esterin karbinoliosalla on merkitystä entsyymi· min kyvylle erottaa enantiomeerejä, näiden entsyymien tär- ;Y: kein tunnistuskohta on esterin karboksyylihappo-osassa.

Lisäksi voidaan kyetä onnistuneesti ekstrapoloimaan yhden ,·. 25 entsyymi/substraattitutkimuksen tulokset toiseen, erilai- seita näyttävään systeemiin, edellyttäen että kyseisen ! kahden substraatin karboksyylihappo-osat ovat samat tai oleellisesti samanlaiset.

Toinen tämän menetelmän etu on, että se on alueen 30 suhteen valikoiva. Estereitä hydrolysoivat entsyymit tyypillisesti eivät katalysoi asiaankuulumattomia reaktioita molekyylin muissa osissa. Esimerkiksi entsyymi lipaasi katalysoi 2-hydroksimetyyli-5-okso-l, 3-oksatiolaanin esterin hydrolyysiä hydrolysoimatta sisäistä laktonia. Tämä 26 114915 eroaa jyrkästi esterien hydrolyysin "kemiallisista" ratkaisumalleista .

Vielä eräs tämän menetelmän etu on, että hydroly-soimattoman enantiomeerin ja hydrolysoidun enantiomeerin 5 erottaminen reaktioseoksesta on aivan yksinkertaista. Hyd-rolysoimaton enantiomeeri on rasvahakuisempi kuin hydrolysoitu enantiomeeri, ja se voidaan tehokkaasti saada talteen yksinkertaisesti uuttamalla jollakin laajasta valikoimasta poolittomia orgaanisia liuottimia tai liuotinse-10 oksia mukaan lukien heksaani ja heksaani/eetteri. Vähemmän rasvahakuinen, polaarisempi hydrolysoitu enantiomeeri voidaan sitten saada uuttamalla polaarisemmalla orgaanisella liuottimena, esimerkiksi etyyliasetaatilla, tai lyofi-lisoimalla, mitä seuraa uuttaminen etanolilla tai me-15 tanolilla. Alkoholia tulisi välttää hydrolyysin aikana, koska se voi denaturoida entsyymejä määrätyissä olosuhteissa .

Entsyymejä ja substraatteja

Valitsemalla entsyymi ja substraatti yhteensopivik- 20 si voidaan järjestää olosuhteet jommankumman nukleosidi- enantiomeerin eristämiseksi. Haluttu enantiomeeri voidaan eristää käsittelemällä raseemista seosta entsyymillä, joka V.: hydrolysoi halutun enantiomeerin (mitä seuraa polaarisen n hydrolysaatin uuttaminen polaarisella liuottimena) tai 25 käsittelemällä entsyymillä, joka hydrolysoi ei-halutun enantiomeerin (mitä seuraa ei-halutun enantiomeerin pois- ;·. taminen ei-polaarisella liuottimena) .

> «

Esterien hydrolyysiä katalysoivia entsyymejä ovat . esteraasit, esimerkiksi sian maksan esteraasi, lipaasit 30 mukaan lukien sian haiman lipaasi ja Amano PS-800 -lipaa- ’;·* si, subtilisiini ja α-kymotrypsiini.

*:**: Kuvio 3 on juoksukaavio alkalisen fosfataasin ja ·;··· käärmeenmyrkyn fosfodiesteraasin spesifisyydestä FTC:n ( + )- ja (-)-enantiomeerin suhteen. Kuten on osoitettu, ’ , 35 alkalinen fosfataasi hydrolysoi FTC:n kummankin enantio meerin trifosfaatin eikä sen vuoksi ole tehokas erotuskei- 27 114915 nona. Fosfodiesteraasi I hydrolysoi valikoivasti FTC: n (+)-isomeerin sen monoesteriksi, joka voidaan sitten saattaa 5'-nukleotidaasin vaikutuksen alaiseksi (+)-FTC:n aikaansaamiseksi .

5 Tehokkain asyyliryhmä käytettäväksi nukleosidin C5'-aseman esteröintiin voidaan määrittää ilman turhaa kokeilua arvioimalla monia homologeja käyttäen valittua entsyymijärjestelmää. Esimerkiksi kun 1,3-oksatiolaaninuk-leosideja esteröidään voihapolla, erottelut sekä sian mak-10 san esteraasilla että Amano PS-800:lla tapahtuvat suurella enantioselektiivisyydellä (94 - 100 % enantiomeeriylimää-rä) ja vastakkaisella selektiivisyydellä. Sian maksan es-teraasi hydrolysoi valikoivasti FTC:n (+)-enantiomeerin, ja Amano PS-800 hydrolysoi valikoivasti FTC:n (-)-enantio-15 meerin. Taulukossa 1 ilmoitettu prosenttinen enantiomeeri-ylimäärä on puhdistetun butyraattiesterin määrä, joka jää entsyymillä käsiteltyyn seokseen (s.o. (-)-FTC:n butyraat-tiesteri PLE:n tapauksessa ja (+)-FTC:n butyraattiesteri Amano PS-800 :n tapauksessa).

20 Ei-rajoittavia esimerkkejä asyyliryhmistä, joita voidaan arvioida määrätyn nukleosidienantiomeeriseoksen ja määrätyn entsyymin kanssa käyttöä varten, ovat alkyyli-karboksyylihapot ja substituoidut alkyylikarboksyylihapot mukaan lukien etikkahappo, propionihappo, voihappo ja pen-25 taanihappo. Eräiden entsyymien tapauksessa voi olla edul- ^ lista käyttää asyyliyhdistettä, joka on merkittävästi ! elektroneja vetävä, hydrolyysin helpottamiseksi heikentä- ' ' mällä esterisidosta. Esimerkkejä elektroneja vetävistä asyyliryhmistä ovat α-halogeeniesterit kuten 2-klooripro-30 pionihappo, 2-kloorivoihappo ja 2-klooripentaanihappo.

,* α-halogeeniesterit ovat erinomaisia substraatteja lipaa- seille.

Erotteluolosuhteet

Entsymaattiset hydrolyysit suoritetaan tyypillises-35 ti käyttäen katalyyttistä määrää entsyymiä vesipuskuri- 28 114915 liuoksessa, jonka pH on lähellä kysymyksessä olevan entsyymin optimi-pH-arvoa. Reaktion edistyessä pH-arvo laskee vapautuneen karboksyylihapon johdosta. Vedellä laimennettua emästä tulisi lisätä pH-arvon pitämiseksi lähellä ent-5 syymin optimiarvoa. Reaktion edistyminen voidaan helposti määrittää tarkkailemalla pH-arvon muutosta ja emäsmäärää, joka tarvitaan pH-arvon säilyttämiseksi. Hydrofobinen esteri (hydrolysoimaton ennätiomeeri) ja polaarisempi alkoholi (hydrolysoitu enantiomeeri) voidaan uuttaa peräkkäin 10 ja selektiivisesti liuoksesta valitsemalla järkevästi orgaaniset liuottimet. Vaihtoehtoisesti eroteltavan aineen voidaan antaa kulkea sellaisen pylvään lävitse, joka sisältää entsyymin immobilisoituna kiinteään kantajaan. Heterogeenisissä olosuhteissa suoritetut entsymaattiset 15 hydrolyysit voivat kärsiä heikosta toistettavuudesta. Sen vuoksi on edullista, että hydrolyysi suoritetaan homogeenisissä olosuhteissa. Alkoholiliuottimet eivät ole edullisia, koska ne voivat denaturoida entsyymit. Homogeenisyys voidaan aikaansaada käyttämällä ionoitumattomia pin-20 ta-aktiivisia aineita kuten Triton X-100. Kuitenkaan näiden pinta-aktiivisten aineiden lisääminen ei ainoastaan avusta lähtöaineen liuottamisessa, vaan ne myös lisäävät tuotteen vesiliukoisuutta. Näin olleen vaikka entsymaatti-nen reaktio voi edistyä tehokkaammin lisättäessä ionoitu-,; ; 25 matonta pinta-aktiivista ainetta kuin heterogeenisissä ; olosuhteissa, sekä talteen otetun lähtöaineen että tuot- * teen eristäminen voi tulla vaikeammaksi. Tuote voidaan '· ' eristää sopivien kromatografisten ja kemiallisten (esim.

selektiivinen suolan muodostus) tekniikkojen avulla. Di-: 30 asyloituja nukleosideja voidaan käyttää, mutta ne ovat usein varsin rasvahakuisia ja vaikeita liuottaa käytettyyn väliaineeseen.

t * 29 114915

Esimerkki 2

Enantioselektiivisen lipaasin katalysoima FTC-este- rien hydrolyysi

Valmistettiin monia FTC:n 5'-O-asyyliJohdannaisia 5 (±)-FTC:n N-hydrokloridisuolan selektiivisen O-asyloinnin avulla (katso taulukko 1 ja kuvio 4). Tutkittiin johdannaisten lipaasien avulla hydrolysoitumisen tehokkuutta. Kuten taulukossa 1 on esitetty, sian maksan esteraasi (PLE) osoittaa suurta selektiivisyyttä FTC:n (+)-enantio-10 meerin esterin hydrolyysin suhteen jättäen (-)-FTC:n buty-raatin pääasiallisesti HPLC:n avulla analysoituun seokseen. Sitä vastoin PS-800 hydrolysoi valikoivasti FTC:n (-)-enantiomeerin esteriä jättäen (+)-FTC:n butyraatin pääasiallisesti HPLC:n avulla analysoituun seokseen. Hyd-15 rolyysin nopeuden todettiin myös riippuvan asyyliryhmän laadusta; asetyylijohdannainen oli merkittäästi hitaampi kuin butyryylijohdannainen. Nyt on havaittu, että FTC:n propionihappoesterin hydrolyysin nopeus on vielä nopeampi kuin butyraattijohdannaisen tapauksessa havaittu. Prosent-20 tinen talteensaanti ja prosenttinen enantiomeeriylimäärä määritettiin kummatkin käyttäen HPLC. Vaikka enantioselek-tiivisyys on erinomainen käytettäessä PLE (tyypillisesti 97 % enantiomeeriylimäärä tai suurempi), lisärikastusta ’ voidaan aikaansaada peräkkäisten entsymaattisten hydrolyy- , !*’ 25 sireaktioiden avulla, joissa PLE:n katalysoimasta hydro- lyysistä saadulle enantiomeerin suhteen rikastetulle buty-• ·* raatille suoritetaan entsymaattinen hydrolyysi PS-800;n *' ' avulla.

30 114915

Taulukko 1

Esterin vaikutusta entsymaattiseen hydrolyysiin koskeva vertailu

Prosenttinen 5 Prosenttinen enantiomeeri -

Substraatti talteensaanti ylimäärä (s.m.) FTC-esterit PLE:n avulla:

(-)-FTC

10 (butyraatti) asetaatti 32,68 ei määr.

propionaatti 39,87 ei määr.

butyraatti 48,00 98 butyraatti 45,71 98,6 15 FTC-esterit PS-800:n avulla: (+)-FTC-butyraatti asetaatti 73,17 ei määr.

20 propionaatti 52,67 ei määr.

butyraatti 58,34 ei määr.

,T valeraatti 41, 50 94 < ·

Esimerkki 3 25 Menetelmä (+) - ja (-) -FTC:n valmistamiseksi FTC- ‘. butyraatin enantioselektiivisen, lipaasin kataly soiman hydrolyysin avulla (±)-FTC:n 5'-O-butyraattia (0,47 millimoolia, . 149 mg) liuotettiin 16 ml:aan liuosta, jossa oli suhteessa 30 4:1 pH-arvon 8 omaava puskuriliuos : CH3CN. Kirkasta * · liuosta sekoitettiin ja käsiteltiin 26 mg:lla sian maksan ’:' : esteraasia (PLE-A). Reaktion edistymistä tarkkailtiin ·;··· HPLC:n avulla (kuvio 4) . 20 tunnin kuluttua (52 % muuttu- minen) reaktioseosta uutettiin 2 x 80 ml:11a CHC13 ja ‘ , 35 80 ml :11a etyyliasetaattia. Orgaaniset uutekerrokset yh- • » · i · 31 114915 distettiin, kuivattiin käyttäen vedetöntä MgS04, suodatettiin ja konsentroitiin kiertohaihduttimen avulla. Tulokseksi saatua jäännöstä eluoitiin 2 x 1000m pTLC -levyillä käyttäen etyyliasetaattia eluenttina (kaksoiseluutio),

5 jolloin saatiin, eristämisen jälkeen, 53 mg (lähtöaineen perusteella 36 %) FTC-butyraattia, jossa määritettiin olevan 98 % enantiomeeriylimäärä (e.y.) HPLC-analyysin avulla. Enantiomeerin suhteen rikastettua butyraattia käsiteltiin sitten 1,6 ml:11a metanolia ja sen jälkeen 0,38 mil-10 limoolilla (20 mg) natriummetoksidia. Tulokseksi saatua seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa ja reaktion edistymistä tarkkailtiin HPLC:n avulla. Reaktio tapahtui loppuun 30 minuutin kuluessa. Liuotin poistettiin kiertohaihduttimen avulla, jolloin saatiin raaka valkea kiinteä aine 15 (76 mg), jota eluoitiin 1000m pTLC -levyllä käyttäen suhteen 5 : 1 omaavaa etyyliasetaatti : etanolia. (-)-FTC

eristettiin valkeana kiinteänä aineena (33 mg; 82 % saanto). FTC:n HPLC-analyysi sen 5'-O-asetaattijohdannaisena osoitti 97 % e.y.; [a](20,D) -120,5° (c = 0,88; abs. eta- 20 noli).

Emulsioita voidaan välttää käsittelyvaiheessa li-··· säämällä HCC13 reaktioseokseen reaktion loppuunsaattamisen V. jälkeen (minkä avulla myös voidaan denaturoida entsyymi), .·, poistamalla liuottimet tyhjössä ja uuttamalla sitten 25 HCC1,: 11a.

» · J

, ! Samalla tavoin 1,2 millimoolia (375 mg) (±)-FTC:n 5'-O-butyraattia liuotettiin 40 ml:aan 4 : 1 -seosta pH-arvon 8 omaava puskuriliuos - CH3CN. Kirkasta liuosta sekoitettiin ja käsiteltiin 58 mg:11a sian maksan esteraasia 30 (PLE-A). Reaktion edistymistä tarkkailtiin HPLC:n avulla.

90 minuutin kuluttua (38 % muuttuminen) reaktioseos lisät-, tiin 150 ml:aan CHC13. Kerrokset erotettiin ja vesikerros lyofilisoitiin liuottimen poistamiseksi. Lyofilisoinnista saatua valkeaa jäännöstä uutettiin 3 x 10 ml:11a absoluut-35 tista etanolia. Uutteet suodatettiin, yhdistettiin ja kon- 32 114915 sentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin 179 mg raakaa öljyä. Raakaa ainetta eluoitiin 45 x 30 mm:n silikageelipylväässä käyttäen 3 x 75 ml etyyliasetaattia ja sen jälkeen suhteen 5 : 1 omaavaa etyyliasetaatti-etanolia. (+)-FTC eristet-5 tiin valkeana kiinteänä aineena (109 mg; lähtöbutyraatin perusteella 37 %). (+)-FTC:n HPLC-analyysi sen 5'-0-ase-taattijohdannaisena osoitti 97,4 % e.y.; [a]0(20,D) +113,4° (c = 2,53; absoluuttinen etanoli).

Samanlainen reaktio suoritettiin käyttäen 0,12 mil-10 limoolia (37 mg) FTC:n 5'-O-butyraattia ja 7 mg PS-800 4,0 ml:ssa 4 : 1 -seosta pH-arvon 8 omaava puskuriliuos : CH3CN. Reaktio oli huomattavsti hitaampi kuin reaktio PLE-A:n kanssa ja vaati 74 tuntia 59 % muuttamista varten. Talteen saadun butyraatin (11,4 mg; 31 %:a alkumäärästä) 15 todettiin osoittavan 94 % e.y. HPLC:n avulla.

Nukleosidienantiomeerien erottelu sytidiini-deoksi-sytidiinideaminaasin avulla

Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käytetään syti-diini-deoksisytidiinideaminaasia 2-hydroksimetyyli-5-(sy-20 tosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaanin ja sen johdannaisten, mukaan lukien 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-.j. 1,3-oksatiolaani, raseemisten seosten erotteluun. Entsyymi katalysoi sytosiiniryhmän deaminaatiota urasiiliksi. On • · · havaittu, että toinen 1,3-oksatiolaaninukleosidien enan- • · · 25 tiomeereistä on sytidiini-deoksisytidiinideaminaasin suo- • · # I,; sima substraatti. Enantiomeeri, jota ei muuteta urasiili- • · · • ·’ johdannaiseksi (ja joka siksi on vielä emäksinen), uute- • * taan liuoksesta happamalla liuoksella. Tulisi varoa käyt tämästä vahvoja happamia liuoksia (pH-arvo alempi kuin 30 3,0), jotka voivat halkaista oksatiolaanirenkaan.

: Sytidiini-deoksisytidiinideaminaasi voidaan eristää rotan maksasta tai ihmisen maksasta tai ilmentää rekombi-! nanttisekvensseistä prokaryoottijärjestelmässä kuten colissa.

33 114915

Menetelmää sytidiininukleosidienantiomeerien erottelemiseksi käyttäen sytidiini-deoksisytidiinideaminaasia voidaan käyttää ainoana erottelumenetelmänä tai sitä voidaan käyttää yhdistettynä muiden erottelumenetelmien kans-5 sa mukaan lukien erottelu 5'-O-nukleosidiesterien entsy-maattisen hydrolyysin avulla kuten yllä on kuvattu.

Entsymaattisen erottelun yhdistäminen klassisten erottelumenetelmien kanssa

Yllä kuvattu menetelmä nukleosidienantiomeerien 10 raseemisten seosten erottelemiseksi voidaan yhdistää muiden klassisten enantiomeerienerottelumenetelmien kanssa lopputuotteen optisen puhtauden suurentamiseksi.

Klassiset erottelumenetelmät käsittävät monia erilaisia fysikaalisia ja kemiallisia tekniikkoja. Usein yk-15 sinkertaisin ja tehokkain tekniikka on uudelleenkiteyttä-minen, joka perustuu siihen, että rasemaatit ovat usein liukoisempia kuin vastaavat yksittäiset enantiomeerit. Uudelleenkiteyttäminen voidaan suorittaa missä tahansa vaiheessa mukaan lukien asyloiduille yhdisteille tai lo-20 pulliselle enantiomeerituotteelle. Mikäli tämä yksinkertainen menettelytapa on tuloksekas, se edustaa valittavaa menetelmää.

Jos uudelleenkiteyttäminen ei onnistu aikaansaamaan ’ ; hyväksyttävän optisen puhtauden omaavaa ainetta, voidaan 25 arvioida muita menetelmiä. Jos nukleosidi on emäksinen (esimerkiksi sytidiini), voidaan käyttää kiraalihappoja, ,· jotka muodostavat diastereomeeriseoksia, jotka voivat oma- : ta merkittävän erilaisia liukoisuusominaisuuksia. Ei-ra- joittavia esimerkkejä kiraalihapoista ovat omenahappo, 30 mantelihappo, dibentsoyyliviinihappo, 3-bromikamferi-8- sulfonihappo, 10-kamferisulfonihappo ja di-p-toluoyylivii- nihappo. Samoin vapaan hydroksyyliryhmän asylointi kiraa- ;; * * lihappojohdannaisella johtaa myös sellaisten diastereomee- '···* riseosten muodostumiseen, joiden fysikaaliset ominaisuudet ' 35 voivat erota riittävästi mahdollistaakseen erottelun.

' » * *

» I

34 114915

Pieniä määriä enantiomeerin suhteen rikastettuja nukleosideja voidaan saada tai puhdistaa antamalla rasee-misen seoksen kulkea sellaisen HPLC-pylvään läpi, joka on suunniteltu kiraalierotteluja varten, mukaan lukien syklo-5 dekstriinikytketyt kolonnit, joita myy Rainin Corporation.

Esimerkki 4

Nukleosidien raseemisten seosten erottelu HPLC:n avulla (±)-FTC:n C4'-enantiomeerien erottelut suoritettiin 10 käyttäen kiraalisyklodekstriinikytkettyä (cyclobond AC-I) -kolonnia, joka oli hankittu toiminimeltä Rainin Corporation (Woburn, MA). Olosuhteet olivat seuraavat: isokraat-tinen 0,5 % metanoli vedessä; virtausnopeus 1 ml/min, UV-osoitus aallonpituudella 262 nm. HPLC-laatua oleva me-15 tanoli hankittiin toiminimeltä J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). Raseemiset seokset injektoitiin ja koottiin fraktioita. Kunkin enantiomeereistä sisältävät fraktiot yhdistettiin, jäädytettiin ja lyofilisoitiin sitten. Yhdisteet karakterisoitiin UV-spektroskopian ja niiden HPLC-reten-20 tioaikojen avulla. Yleensä (-)-enantiomeereillä on lyhyemmät retentioajat kuin (+)-enantiomeereillä [katso J.

:. Liquid Chromatography 7 (1984) 353 - 376]. Yhdisteiden pitoisuudet määritettiin UV-spektroskopian avulla käyttäen tunnetun pitoisuuden (15 μΜ) omaavaa kantaliuosta, joka « 1 25 oli valmistettu veteen biologista arviointia varten. Ero-·_ ·* tettujen enantiomeerien retentioajat on annettu taulukos- i sa 2.

*

Taulukko 2 30 FTC:n enantiomeerien retentioaikoja : ’ : Yhdiste R£ (min) (-)-ftc 8,3 (+) -FTC 8,7 j 35 35 114915

Esimerkki 5

Vaihtoehtoisia menetelmiä FTC-enantiomeerien erottelemiseksi käyttäen kiraalipylvästä Käytettäessä Cyclobond I-Ac -pylvästä (5 pm, 25 cm 5 x 4,6 mm, Rainin Corporation, Woburn, MA, luettelon nro AST-41049) ja virtausnopeutta 0,6 ml/min 0,5 % isokraat-tista metanolia (Fisher Scientific, Inc., HPLC-laatu, luettelon nro A-452-4, vedessä) ja UV-osoittamista aallonpituudella 262 nm, FTC-enantiomeerit osoittivat retentio-10 aikoja 12,68 minuuttia [(-)-FTC] ja 13,20 minuuttia [( + )-FTC].

Käytettäessä Chiralpak AS -pylvästä (10 pm, 25 cm x 4,6 mm, J.T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, luettelon nro 7406-00, sarjanumero 09-29-10320) ja virtausnopeutta 0,8 15 ml/min isopropyylialkoholia (HPLC-laatu, Fisher Scientific, Inc., luettelon n:o A-451-4) ja UV-osoittamista aallonpituudella 262 nm, FTC-enantiomeerit osoittivat re-tentioaikoja 5,9 minuuttia [(-)-FTC] ja 9,8 minuuttia ((+)-FTC] 20 IV. 2-Hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)- 1,3-oksatiolaanin ("FTC") kyky estää HIV:n repli-kaatiota ’ Usein on suotavaa seuloa monia nukleosidien rasee- misia seoksia esivaiheena, jotta saataisiin määritettyä, 25 mitkä antavat aihetta lisäerottelulle enantiomeerin suh-j teen rikastetuiksi komponenteiksi ja sopivat virusvastai- ' sen aktiivisuuden lisäarviointiin. Nukleosidien kyky estää HIV:tä voidaan mitata monenlaisten koetekniikkojen avulla. Tässä käytetty ja alla yksityiskohtaisesti kuvattu tek-30 niikka mittaa virusreplikaation estämistä fytohemaggluti-niinilla (PHA) stimuloiduissa ihmisen periferisen veren yksitumaisissa (PBM) soluissa, jotka on infektoitu HIV-l:llä (kanta LAV). Tuotettu virusmäärä määritetään mittaamalla viruksen koodaamaa käänteiskopioijaentsyymiä. Tuo-; 35 tettu entsyymimäärä on verrannollinen tuotettuun virusmää- 36 114915 rään. Taulukossa 3 on annettu monien (±)-l,3-oksatiolaani-nukleosidien EC50-arvot (nukleosidipitoisuus, joka estää viruksen replikaatiota 50 %:lla PBM-soluissa, arvioitu 10 % virhetekijä) ja IC50-arvot (nukleosidipitoisuus, joka 5 estää mitogeenillä stimuloitujen infektoimattomien ihmisen PBM-solujen kasvusta 50 %).

Esimerkki 6 (±)-1,3-0ksatiolaaninukleosidien HIV:n vastainen aktiivisuus 10 A. Kolmen päivän ikäisiä fytohemagglutiniinilla stimuloituja PBM-soluja (106 solua/ml), jotka olivat peräisin hepatiitti B ja HIV-l-seronegatiivisilta terveiltä luovuttajilta, infektoitiin HIV-l:llä (kanta LAV) käyttäen pitoisuutta, joka oli noin 100 kertaa 50 % kudosviljel-15 mistä infektoiva annos (TCID 50) ml:aa kohti, ja viljeltiin virusvastaisten yhdisteiden erilaisten pitoisuuksien läsnä ollessa ja ilman niitä.

B. Noin yksi tunti infektoinnin jälkeen elatusaine, jossa oli testattava yhdiste (2 kertaa lopullinen pitoi- 20 suus elatusaineessa) tai josta yhdiste puuttui, lisättiin pulloihin (5 ml; lopullinen tilavuus 10 ml). AZT käytettiin positiivisena kontrollina.

C. Solut pantiin alttiiksi virukselle (noin 2 x 105 hajoamista minuutissa (dpm)/ml määritettynä käänteisko- 25 pioijamäärityksen avulla) ja pantiin sitten C02-solujenvil-> jelykaappiin. HIV-1 (kanta LAV) hankittiin laitoksesta the

Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. Menetelmät, joita käytettiin PBM-solujen viljelemiseksi, viruksen kokoamiseksi ja käänteiskopioija-aktiivisuuden määrittämi-30 seksi, olivat niitä, joita ovat kuvanneet McDougal et ai.

[J. Immun. Meth. 76 (1985) 171 - 183] ja Spira et ai. [J. Clin. Meth. 25 (1987) 97 - 99], paitsi että fungitsonia ei sisällytetty elatusaineeseen [katso Schinazi et ai., Anti-microb. Agents Chemoter. 32 (1988) 1784 - 1787; sama 34 35 (1990) 1061 - 1067].

37 114915 D. Päivänä 6 solut ja supernatantti siirrettiin 15 ml:n putkeen ja sentrifugoitiin nopeudella noin 900 g 10 minuutin ajan. Viisi ml supernatanttia poistettiin ja virus konsentroitiin sentrifugoimalla nopeudella 40 000 5 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan (Beckman 70.1 Ti -roottori). Liuotettua viruspellettiä käsiteltiin käänteis-kopioijatasojen määrittämistä varten. Tulokset on ilmaistu hajoamisina minuutissa (dpm)/ml supernatanttinäytettä. Pienemmistä tilavuuksista supernatanttia (1 ml) peräisin 10 oleva virus voidaan myös konsentroida sentrifugoimalla ennen liuottamista ja käänteiskopioijatasojen määritystä.

Keskitehokas (EC50) pitoisuus määritettiin keskivai-kutusmenetelmän avulla [Antimicrob. Agents Chemoter. 30 (1986) 491 - 498]. Lyhyesti kuvattuna viruksen prosentti-15 nen estäminen, määritettynä käänteiskopioijan mittauksista, esitetään graafisesti yhdisteen mikromolaarista pitoisuutta vastaan. EC50 on se yhdisteen pitoisuus, jolla esiintyy viruksen kasvun 50 % estyminen.

E. Mitogeenillä stimuloituja infektoimattomia ihmi-20 sen PBM-soluja (3,8 x 10 5 solua/ml) viljeltiin lääkkeen läsnä ollessa ja puuttuessa samanlaisissa olosuhteissa kuin ne, joita käytettiin yllä kuvattua virusvastaisuus- määritystä varten. Solut laskettiin 6 päivän kuluttua i käyttäen hemasytometriä ja trypaanisininen-ekskluusiomene- 25 telmää kuten ovat kuvanneet Schinazi et ai., Antimicrobial ; Agents and Chemotherapy 22 (3) (1982) 499. IC50 on se yh- • ·* disteen pitoisuus, joka estää normaalien solujen kasvusta V : 50 %.

* · i < · I I k t · 38 114915

Taulukko 3 l,3-0ksatiolaaninukleosidien erilaisten analogien ECm ja ICM ihmisen PBM-soluissa

Virus- Myrkyllisyys 5 vastainen soluille

Koodi X tai Y R EC50,pM ΙΟ^,,μΜ DLS-009 X = O H 100 100 DLS-010 X = O Me 64,4 100 DLS-027 X = 0 F 100 100 10 DLS-028 X = O Cl 60,8 100 DLS-044 X = O Br 100 100 DLS-029 X = O I 100 100 DLS-020 Y = NH2 H 0,02 100 DLS-011 Y = NH2 Me 10 100 15 DLS-022 Y = NH2 F 0,01 100 DLS-023 Y = NH2 Cl 38,7 100 DLS-021 Y = NH2 Br 77,4 100 DLS-026 Y = NH2 I 0,72 100 DLS-058 (-) Y = NH2 F 0,008 100 20 DLS-059 (+) Y = NH2 F 0,84 100 DLS-053 Y = NH2 CF3 60,7 100 : - τΥ rV' tai

;. -yJ

Kuten taulukossa 3 on osoitettu, substituoidut sy-tosiini-1,3-oksatiolaaninukleosidit ovat yleensä aktiivi-“ sempia kuin vastaavat urasiilinukleosidit. Virhe EC50- ja 35 IC50-mittauksissa on arvioitu ±10 %:ksi.

39 114915

Yksi yhdisteistä, (±)-FTC, (josta on käytetty nimitystä "DLS-022", yhdiste 8) ei ainoastaan osoita poikkeuksellista aktiivisuutta (noin 10 nM PBM-soluissa), vaan myös aivan alhaista myrkyllisyyttä ( 100 μΜ PBM-, Vero- ja 5 CEM-soluissa).

(±)-FTC:n IC50 oli yli 100 μΜ, mikä osoittaa, että yhdiste ei ollut myrkyllinen infektoimattomissa PBM-soluissa arvioituna pitoisuuteen 100 μΜ saakka.

Esimerkki 7 10 HPLC:n avulla eroteltujen FTC:n enantiomeerien vi- rusvastainen aktiivisuus FTC:n enantiomeerit eristettiin esimerkin 4 menetelmän avulla ja virusvastainen aktiivisuus arvioitiin esimerkin 6 menetelmän avulla. Tulokset on annettu taulu-15 kossa 4 ja esitetty kuviossa 5.

I « » i t • · 40 114915

Taulukko 4 FTC:n (+)- ja (-)-enantiomeerien virusvastainen aktiivisuus Käsittely Pitoisuus Hajoami- Prosenttinen EC50: μΜ 5 μΜ siä minuu- estäminen tissa (korjattu) (dpm)/ml FTC (±) 0,0001 73 755 26,6 0,018 10 0,005 83 005 16,3 0,01 60 465 41,3 0,05 34 120 70,4 0,1 14 160 92,4 0,5 18 095 88,1 15 17 555 99,7 5 7 940 99,3 10 5 810 101,7 FTC (-) 0,001 76 275 23,8 0,02 0,005 58 590 43,3 20 0,01 75 350 24,8 0,05 28 890 76,2 0,1 13 175 93,5 0,5 9 485 97,6 FTC ( + ) 0,001 94 340 3,8 0,28 25 o,oo5 107 430 -10,6 f 0,01 99 465 -1,8 0,05 87 120 11,8 v : 0,1 86 340 12,7 0,5 33 225 71,4 30 1 Kuten taulukossa 4 on osoitettu, tässä kokeessa FTC:n (-)-enantiomeeri näyttää olevan noin yhtä suuruus-^ luokkaa tehokkaampi kuin (+)-FTC-enantiomeeri, ja sillä on suunnilleen sama HIV:n vastainen aktiivisuus kuin raseemi-• · 35 sella seoksella. Eivät enantiomeerit eikä raseeminen seos I » 41 114915 ole myrkyllisiä pitoisuuteen 100 μΜ saakka mitattuna try-paanisininen-ekskluusiomenetelmällä ihmisen PBM-soluissa.

Esimerkki 8

Esimerkin 3 menetelmän avulla eroteltujen FTC-enan-5 tiomeerien virusvastainen aktiivisuus (±)-FTC:n enantiomeerit eroteltiin myös esimerkin 3 menetelmän avulla ja virusvastainen aktiivisuus arvioitiin esimerkin 6 menetelmän avulla. Tulokset on esitetty kuviossa 6. Kuten kuviossa 6 on osoitettu, FTC:n raseemisen 10 seoksen EC50 oli 0,017 μΜ, (-)-FTC:n EC50 oli 0,0077 μΜ ja (+ )-FTC:n EC50 oli 0,84 μΜ.

Esimerkki 9 (±)-FTC:n otto ihmisen PBM-soluihin

Suoritettiin tutkimuksia käyttäen radioaktiivisuu-15 della merkittyä FTC alkuperäisen lääkkeen ja solussa todettujen aineenvaihduntatuotteiden solunsisäisten profiilien seuraamiseksi. Kaikki tutkimukset suoritettiin kahtena rinnakkaiskokeena. Ihmisen periferisen veren yksitumaisia soluja (PBM-soluja) suspendoitiin RPMI 1640 -ela-20 tusaineeseen, joka sisälsi 10 % sikiökautisen vasikan seerumia ja antibiootteja (2 x 106 solua/ml, 10 ml ajankohtaa kohti) ja inkuboitiin lisäten 10 μΜ FTC (ominaisaktii-visuus noin 700 hajoamista minuutissa/pikomooli). Solujen annettiin olla lääkkeen vaikutuksen alaisina 2, 6, 12 ja , ! 25 24 tunnin ajan. Näinä ajankohtina elatusaine poistettiin ,, ; ja solut pestiin kaksi kertaa kylmällä Hankin tasapainote- \ tulla suolaliuoksella. Uuttaminen suoritettiin lisäten '·' 0,2 ml 60 % kylmää metanoli/vettä ja säilytettiin yön ajan -70 °C:ssa. Seuraavana aamuna suspensiot sentrifugoitiin : V 30 ja uuttamisia toistettiin kaksi kertaa 0,5 tunnin ajan : -70 °C:ssa. Kaikki supernatantit (0,6 ml) lyofilisoitiin , kuiviin. Jäännökset uudelleensuspendoitiin 250 pl:aan vet- !!! tä ja näytteitä, jotka olivat 50 - 100 μΐ, analysoitiin » *” HPLC:n avulla. Solunsisäiset alkuperäisen lääkkeen ja ai- ,· * 35 neenvaihdunnallisten johdannaisten määrät määritettiin « » 42 114915 HPLC:n avulla. Joidenkin yhdisteiden mahdollisen haponkes-tämättömyyden vuoksi käytettiin lähellä fysiologista pH-arvoa olevaa puskurijärjestelmää aineenvaihduntatuotteiden erotteluun.

5 Kuvio 7 on graafinen esitys tritiumilla merkityn (±)-FTC:n läsnäolosta (otosta) ihmisen PBM-soluissa (soluihin) (kahden määrityksen keskiarvo) esitettynä aika (tunteja) pikomooleja/106 solua vastaan. Ottotutkimukset osoittavat, että radioaktiivisuudella merkitty FTC tulee 10 helposti otetuksi ihmisen imusoluihin, jotka tuottavat hyvin suuria määriä FTC:n 5'-trifosfaattijohdannaista. Esimerkki 10 FTC:n retrovirusvastainen aktiivisuus erilaisissa soluiinjoissa 15 Mitattiin FTC:n retrovirusvastainen aktiivisuus monissa solulinjoissa käyttäen menetelmiä, jotka olivat samankaltaisia mutteivät identtisiä esimerkissä 6 esitetyn menetelmän kanssa. Solulinjoja hankittiin joko ihmisluo-vuttajilta, AIDS Research and Reference Reagent Program, 20 NIH, Rockville, Maryland, ATCC tai Punaiselta Ristiltä. CEM-tymidiinikinaasivajäitä soluja valmistettiin tekemällä CEM-soluista peräkkäisiä alaviljelmiä 5-bromi-2'-deoksi-] .’t uridiinin läsnä ollessa. Tulokset on annettu taulukossa 5.

» · > t · • * > » · · » · 43 114915

Taulukko 5 FTC:n retrovirusvastainen aktiivisuus erilaisissa solujärjestelmissä

Solujärjestelmä EC^ (μΜ)

5 (viruskanta) (±)-FTC

HIV-1 PBMC (LAV-1) 0,027 MT2 (HTLViiib) 0,89 10 CEM (LAV-1) 0,08 CEM-TK(_) (LAV-1) 0,026 CEM (HTLViiib) NIH 0,09 HIV-2

PBMC (R0D2) 0,0038 (±)-FTC

15 0,0007 (-)-FTC

0,026 (+)-FTC

SIV

AA-2 (SIV251) 4,6 C-8166 (SIV251) 8,0

20 FIV

CrFK (61E) <1

Esimerkki 11 , ,·, (±)-FTC:n poistuminen ihmisen PBM-soluista ;·^ 25 Suoritettiin tutkimuksia käyttäen radioaktiivisuu- !. ! della merkittyä FTC alkuperäisen lääkkeen ja solussa to- ’tt) dettujen aineenvaihduntatuotteiden solunsisäisten profii- '·' lien seuraamiseksi sen jälkeen kun oli inkuboitu elatusai- neessa lääkkeen kanssa 24 tunnin ajan ja sitten poistettu 30 lääke. Tämä tutkimus mittaa aikaa, joka tarvittiin trifos-faattien solunsisäisten tasojen alenemiseen. Tutkimukset suoritettiin kahtena rinnakkaiskokeena. Infektoimattomia soluja (2 x 106/ml) suspendoitiin sopivaan elatusaineeseen, > johon oli lisätty seerumia, (10 ml ajankohtaa kohti) ja : 35 inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02 sisältävässä solujenkasvatus- 44 114915 kaapissa. Radioaktiivisuudella merkityn FTC:n pitoisuus oli 10 μΜ. Sen jälkeen kun soluja oli käsitelty merkityllä yhdisteellä 24 tunnin ajan, solut pestiin perusteellisesti ja niille annettiin sitten tuoretta elatusainetta ilman 5 virusvastaisia lääkkeitä (0 tuntia). Ajankohtina 0, 2, 4, 6, 12, 24 ja 48 tuntia (toinen inkubaatioaika) solut poistettiin ja uutettiin välittömästi 60 % kylmällä metanoli/-vedellä. Uute saatiin sentrifugoimalla ja poistamalla so-lupelletti. Uutteet lyofilisoitiin ja säilytettiin sitten 10 -70 °C:ssa. Ennen analyysiä aine uudelleensuspendoitiin

250 mikrolitraan HPLC-puskuriliuosta ja analysoitiin välittömästi. Solunsisäisten alkuperäisen lääkkeen ja aineenvaihdunnallisten johdannaisten määrät määritettiin HPLCrn avulla, käyttäen joko Micromeritics tai Hewlett-15 Packard malli 1090 -HPLC-järjestelmää ja anioninvaihto-Partisil 10 SAX -pylvästä (Whatman, Inc.), virtausnopeutta 1 ml/min, painetta 1 kpsi ja UV-osoittamista aallonpituudella 262 nm. Liikkuvan faasin muodosti deionoitu vesi (A), 2 mM NaH2P04/16 mM NaOAc (pH = 6,6) (B), 15 mM NaH2-20 PO4/120,2 mM NaOAc (pH = 6,6) (C) ja 100 mM NaH2P04/800 mM

NaOAc (pH = 6,6) (D).

Erottelumenetelmä: isokraattinen 5 minuutin ajan käyttäen A, mitä seuraa 15 minuutin lineaarinen gradientti 100 % B:ksi, mitä seuraa 20 minuutin lineaarinen gradient-25 ti 100 % C:ksi, mitä seuraa 10 minuutin lineaarinen gra-; dientti 100 % D:ksi, mitä seuraa 30 minuuttia isokraattis- ‘ ta 100 % D:llä.

t

Retentioaikoja (minuutteja) ihmisen soluissa: 30 Yhdiste Muuttu- Mono- Difosfaatti Trifosfaatti maton fosfaatti (±)-ftc 5,0 39,0 55,0 68,0 45 114915

Kuvio 8 on graafinen esitys radioaktiivisuudella merkityn (±)-FTC:n ulosmenosta ihmisen PBM-soluista, mitattuna tunteina lääkkeen poistamisen jälkeen pitoisuutta (pikomoolia/106 solua) vastaan. Kuten kuviossa on osoitet-5 tu, FTC-trifosfaatin solunsisäinen puoliintumisaika on noin 12 tuntia ja se voidaan helposti todeta solunsisäi-senä pitoisuuksina 1 - 5 μΜ 48 tuntia solun ulkopuolisen lääkkeen poistamisen jälkeen, mikä on hyvinkin yhdisteen EC50-arvon yläpuolella. Lisäksi affiniteetti (K1) (±)-FTC-10 trifosfaattia kohtaan käytettäessä HIV-RT on 0,2 μΜ, mikä on 48 tunnin pitoisuustason alapuolella.

Esimerkki 12 (±)-FTC:n farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten HIV:n vastainen aktiivisuus 15 a. Monia (±)-FTC:n farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia, jotka oli valmistettu käyttämällä johdannaisten tekoon 5'- ja N4-asemia, arvioitiin HIV:n vastaisen aktiivisuuden suhteen PBM-soluissa käyttäen samanlaista menetelmää kuin esimerkissä 6 kuvattu. Tulokset ovat seu-20 raavanlaiset. (±)-FTC:n 5'-O-butyraattiesterillä oli EC50-arvo 0,0017. (±)-FTC:n N4-asetyylijohdannaisen EC50-arvo oli 0,0028. (±)-FTC:n 5'-O-butyraatti-, N4-esterillä oli EC50 = 0,0058.

b. (±)-FTC:n 5’-O-butyraattiesterin HIV:n vastainen 25 aktiivisuus MT4-järjestelmässä (EC50) oli 0,04 μΜ. Samassa määrityksessä asyloimattomalla (±)-FTC:llä oli IC50-arvo 0,52 μΜ. AZT:llä oli IC50 tässä järjestelmässä 0,09 μΜ.

> » V. FTC:n kyky estää HBV:n repiikaatiota

Esimerkki 13 ’,· 30 FTC:n ( + )- ja (-)-enantiomeerien aktiivisuuden ar- : viointi 2.2.15-soluviljelmissä , ' ·, FTC:n enantiomeerien kyky estää viruksen kasvua > i · !!', 2.2.15-soluvil jelmissä (HepG2-soluja, jotka on transfor- moitu hepatiittivirionilla) on kuvattu yksityiskohtaisesti : 35 alla.

» · 46 114915

Tiivistelmä ja kuvaus virusvastaisten vaikutusten määrityksestä tässä viljelyjärjestelmässä ja HBV-DNA:n analyysi on kuvattu [Korba ja Milman, Antiviral Res. 15 (1991) 217], Virusvastaisuuden arvioinnit suoritettiin 5 solujen kahdella erillisellä alaviljelmällä. Kaikkiin kuoppiin kaikilla levyillä oli istutettu samalle tiheydelle ja samana ajankohtana.

Koeparametrej ä

Sekä solunsisäisten että solun ulkopuolisten HBV-10 DNA-tasojen luontaisista vaihteluista johtuen ainoastaan sellaisia alenemia, jotka ovat suurempia kuin 3,5-ker-taisia (HBV-virioni-DNA:n tapauksessa) tai 3,0-kertaisia (HBV-DNA:n replikaatiovälituotteiden tapauksessa) verrattuna näiden HBV-DNA-muotojen keskimääräisiin tasoihin kä-15 sittelemättömissä soluissa, pidetään tilastollisesti merkitsevinä [P 0,05]. Integroituneen HBV-DNA:n tasoja kussakin solu-DNA-valmisteessa (jotka tasot pysyvät muuttumattomina solua kohti näissä kokeissa) käytettiin solunsisäisten HBV-DNA-muotojen tasojen laskemiseen, varmistaen 20 siten, että yhtä suuria solu-DNA-määriä verrattiin eri näytteiden kesken.

·, Tyypilliset arvot solun ulkopuoliselle HBV-virioni- DNA:lle käsittelemättömillä soluilla olivat väliltä 50 -! 150 pg/ml viljelyainetta (keskiarvo noin 76 pg/ml). Solun- ; 25 sisäisiä HBV-DNA-replikaatiovälituotteita oli käsittele- ’ mättömissä soluissa väliltä 50 - 100 pg/pg solu-DNA:ta ·' ·' (keskiarvo noin 74 pg/pg solu-DNA: ta). Yleensä alenemat > » » v ‘ solunsisäisen HBV-DNA:n tasoissa virusvastaisilla yhdis teillä käsittelemisen johdosta ovat vähemmän selviä ja ; ’J 30 esiintyvät hitaammin kuin alenemat HBV-virioni-DNA:n ta- soissa [Korba ja Milman, Antiviral Res. 15 (1991) 217].

Tapa, jolla hybridisaatioanalyysit suoritettiin • » t ;;; näissä kokeissa, johti noin 1,0 pg:n solunsisäistä HBV-

• I

DNA:ta samanarvoisuuteen 2-3 genomikopion kanssa solua » t I i t i 11» * 1 I > ) t 47 114915 kohti ja määrän 1,0 pg/ml solun ulkopuolista HBV-DNA:ta samanarvoisuuteen 3 x 105 viruspartikkelin/ml kanssa.

Myrkyllisyysanalyysi

Suoritettiin myrkyllisyysanalyysejä tarkoituksessa 5 tutkia, johtuivatko mitkään havaitut virusvastaiset vaikutukset yleisestä vaikutuksesta solujen elinkykyisyyteen. Tässä käytetty menetelmä oli neutraalin punaisen väriaineen oton mittaus, joka on yleinen ja laajasti käytetty solun elinkykyisyyden määritys monissa erilaisissa virus-10 isäntäjärjestelmissä mukaan lukien HSV ja HIV. Myrkylli-syysanalyysit suoritettiin 96-kuoppaisilla tasapohjaisilla kudosviljelylevyillä. Soluja viljeltiin myrkyllisyys-analyysejä varten ja käsiteltiin koeyhdisteillä käyttäen samaa ohjelmaa kuin on kuvattu virusvastaisuuden määrityk-15 siä varten alla. Kukin yhdiste testattiin 4 pitoisuutena, kukin kolmessa rinnakkaisviljelmässä (kuopat "A", "B" ja "C"). Neutraalin punaisen värin ottoa käytettiin suhteellisen myrkyllisyystason määrittämiseen. Sisäänotetun värin absorbanssia aallonpituudella 510 nm (Asin) käytettiin kvan-20 titatiiviseen analyysiin. Arvot on esitetty prosenttimää ränä keskimääräisistä Asin-arvoista 9 erillisessä käsittelemättömien solujen viljelmässä, joita ylläpidettiin samalla ; 96-kuoppaisella levyllä kuin koeyhdisteitä. Värin otto 9 kontrolliviljelmässä levyllä 5 oli väliltä 91,6 % - 25 110,4 % ja levyllä 6 96,6 % - 109 %. Tulokset on annettu . _ taulukossa 6.

> * · i » 48 114915

Taulukko 6

Koeyhdi s teiden myrkyllisyysanalyysi 2.2.15-soluissa Pitoi- Värinotto (% kontrollista)

Levy Yhdiste suus (μΜ) kuoppa A kuoppa B kuoppa C

5 _ 5 DMSO 10,0* 0,7 1,6 0,9 3,3 55,9 68,7 61,7 1,0 91,2 96,4 106,8 0,3 98,7 102,9 93,5 10 6 (-)-FTC 300 53,0 51,1 51,5 100 64,1 66,6 77,6 30 98,7 94,3 96,4 10 94,3 94,9 92,2 6 (+) -FTC 300 43,4 56,7 58,5 15 100 77,7 66,3 72,1 30 81,1 88,3 88,1 10 90,9 99,4 90,5 * DMSO:n tapauksessa pitoisuudet on esitetty prosentteina 20 alkuperäisestä kantaliuoksesta.

Myrkyllisyyden arviointi ; Kuten taulukossa 6 on osoitettu, merkitsevää . myrkyllisyyttä (yli 50 % alenemaa käsittelemättömissä so- 25 luissa havaituista värinottotasoista) ei havaittu koe-yhdisteillä pitoisuuksilla, joita käytettiin virusvastai-suuden arviointeihin. Kummatkin koeyhdisteet, (-)-FTC ja (+)-FTC, näyttivät olevan myrkyllisiä suurimpana pitoisuutena, jota käytettiin myrkyllisyyskokeisiin (330 μΜ).

30 Virusvastaisuuden arvioinnit

Kontrollit ·': Normaalien vaihtelujen rajoissa HBV-virioni-DNA:n ja solunsisäisten HBV:n replikaatiovälituotteiden [HBV-RI] tasot pysyivät muuttumattomina käsittelemättömissä soluis- • 49 114915 sa ärsytysajan kestäessä. DMSO ei 1 % pitoisuutena vaikuttanut HBV-replikaation tasoihin 2.2.15-soluviljelmissä. Koeyhdisteet

Kuten taulukossa 7 on osoitettu, sekä (-)-FTC että 5 (+)-FTC esti merkitsevästi HBV:n replikaatiota testatuilla tasoilla. Kuten taulukossa 8 on osoitettu, (-)-FTC estää vielä merkittävästi HBV-virioni-DNA:n ja solunsisäisen HBV-DNA:n synteesiä pitoisuuksina 4, 1 ja 0,25 μΜ.

50 114915

Taulukko 7

Koeyhdlsteiden vaikutus HBV:n tuottamiseen 2.2.15-soluviljelmissä 5 HBV-virioni-DNA* Solunsisäinen (pg/ml viljelyainetta) HBV-DNA (pg/pg solu-DNA:sta)

Kuoppa Käsittely Päivä 0 Päivä 4 Päivä 9 MONO Rl 10 7A Käsittele- 59 75 94 2,7 93 mättömät solut 7B -"- 47 64 88 2,5 93 8A -"- 65 100 71 2,2 97 15 8B -"- 77 65 110 2,4 62 7K DMSO @ 1,00% 100 50 48 1,9 95 7L DMSO 0 1,00% 48 96 54 2,8 98 8K DMSO @ 1,00% 93 63 68 2,2 86 20 8L DMSO @ 1,00% 66 57 59 1,6 97 9U (-)-FTC @ 10 μΜ 120 36 1 1,1 14 9V (-)-FTC @ 10 μΜ 89 48 1 1,5 19 10U (-)-FTC @ 10 μΜ 58 41 0,1 1,9 13 25 10V (-)-FTC @ 10 μΜ 110 32 0,1 1,2 16 9W (+)-FTC @ 10 μΜ 88 42 0,1 0,8 14 : 9X (+)-FTC @ 10 μΜ 58 57 0,2 0,4 19 10W (+)-FTC @ 10 μΜ 69 55 0,1 0,7 17 • 30 10X (+)-FTC @ 10 μΜ 45 39 0,1 0,4 15 : : * Herkkyysraja HBV-virioni-DNA:lie oli 0,1 pg/ml.

X @ Solunsisäinen HBV-DNA analysoitiin 24 tuntia 9. käsitteli, lypäivän jälkeen. Integroituneen HBV-DNA:n tasoja kussakin solu-DNA-valmisteessa käytettiin episomaalisten 3,2 kilo-:,· j 35 emäksen HBV-genomien (MONO.) ja HBV-DNA:n replikaatioväli-: tuotteiden (Rl) tasojen laskemiseen.

51 114915

Taulukko 8

Koeyhdisteiden vaikutus HBV:n tuottamiseen 2.2.15-so-luviljelmissä 5 HBV-virioni-DNA1 Solunsisäinen (pg/ml viljelyainetta) HBV-DNA (pg/pg solu-DNA:sta)

Kuoppa Käsittely Päivä 0 Päivä 4 Päivä 9 MONO Rl 10 31A Käsittele- 64 54 65 2,8 65 mättömät solut 31B 51 54 77 2,0 53 32A 100 76 56 3,5 81 15 32B 53 97 83 3,1 68 35A (-)-FTC @ 4 μΜ 74 27 >0,1 1,4 1 35B (-)-FTC @ 4 μΜ 87 28 >0,1 0,5 1 36A (-)-FTC @ 4 μΜ 120 20 1 0,9 1 20 36B (-)-FTC @ 4 μΜ 59 16 0,2 0,2 2 35C (-)-FTC @ 1 μΜ 70 13 >0,1 1,7 2 35D (-)-FTC @ 1 μΜ 62 15 >0,1 1,2 3 36C (-)-FTC @ 1 μΜ 60 22 1 1,4 2 25 36D (-)-FTC @ 1 μΜ 89 28 0,3 1,5 4 35E (-)-FTC @ 0,25 μΜ 84 15 >0,1 1,5 4 35F (+)-FTC @ 0,25 μΜ 89 16 4 2,2 4 36E (+)-FTC @ 0,25 μΜ 66 13 1 1,8 8 V 30 36E (+)-FTC @ 0,25 μΜ 45 19 0,1 0,3 9

Herkkyysraja HBV-virioni-DNA:lie oli 0,1 pg/ml.

·, + Solunsisäisen HBV-DNA:n analyysi oli 24 tuntia 9. käsitte- ‘1' lypäivän jälkeen. Integroituneen HBV-DNA:n tasoja kussakin :: 35 solu-DNA-valmisteessa käytettiin episomaalisten 3,2 kilo- ·.· emäksen HBV-genomien (MONO.) ja HBV-DNA:n replikaatioväli- tuotteiden (Rl) tasojen laskemiseen.

n 491 5 52

Esimerkki 14 (±)-FTC:n otto ihmisen maksasoluihin; FTC:n aktiivisuus HBV:tä kohtaan

Esimerkin 9 menetelmä toistettiin ihmisen maksasoluil- 5 la (HepG2-soluja, saatavana kokoelmasta ATCC) tarkoituksessa määrittää FTC:n otto näihin soluihin ja sen aineenvaihdunta niissä. Kuten kuviossa 9 on esitetty, HepG2-solut ottavat (±)-FTC:a suurina määrinä. Nämä ihmisen maksasolut muuttavat suuren prosenttimäärän (±)-FTC:sta aineenvaihdunnallisesti 10 (±)-FTC-trifosfaatiksi.

Nämä tiedot, yhdessä muiden tässä annettujen tietojen kanssa, osoittavat, että (±)-FTC samoin kuin myös sen (-)-ja (+)-enantiomeerit fosforyloituvat maksasoluissa. Nämä solut voidaan transformoida hepatiitti B -viruksella.

15 Esimerkki 15 FTC:n ulosmeno ihmisen HepG2-soluista Kuvio 10 esittää [3H]-(±)-FTC:n ja sen fosforyloitujen johdannaisten ulosmenoa ihmisen HepG2-soluista pikomoolei-na/106 solua ajan funktiona sen jälkeen kun soluja on käsi-20 telty 10 μΜ [3H]-(±)-FTC:11a (700 hajoamista minuutissa (dpm)/pikomooli) 24 tunnin ajan ja on arvioitu yhdisteen *;· pitoisuutta 24 tuntia poistamisen jälkeen.

Kuvio 11 esittää [3H]-(±)-FTC:n ja sen fosforyloitujen . johdannaisten yhdistetyn pitoisuuden vähenemistä ihmisen 25 HepG2-soluista sen jälkeen kun on inkuboitu 10 μΜ [3H]-(±)~ ^ FTC:n (700 hajoamista minuutissa/pikomooli) kanssa 24 tunnin ! ajan, esitettynä pikomooleina/106 solua ajan funktiona.

Kuten on esitetty, jopa ajankohtana 48 tuntia yli 1 μΜ aktiivista yhdistettä (mikä on merkittävästi enemmän kuin 30 yhdisteen EC50) on vielä läsnä soluissa.

53 114915 V. Myrkyllisyys granulosyytti-makrofaagiedeltäjäso-luissa.

Esimerkki 16 FTC:n vaikutus granulosyytti-makrofaagiedeltäjäsolujen 5 pesäkkeiden muodostukseen

Kuvio 12 on graafinen esitys FTC:n (-)- ja (+)-enan-tiomeerien vaikutuksesta granulosyytti-makrofaagiedeltäjä-solujen pesäkkeiden muodostukseen mitattuna prosenttisena eloonjäämisenä μΜ pitoisuutta vastaan [(-)-FTC avoin ympyrä; 10 (+)-FTC tummennettu ympyrä; AZT tummennettu neliö). Kuten on osoitettu, FTC;n (-)-enantiomeeri näyttää olevan vähemmän myrkyllinen, s.o. sillä on suurempi IC50-arvo kuin (+)-enan-tiomeerilla tai AZT:llä tässä solulinjassa.

VI. FTC:n farmakokinetiikka 15 Esimerkki 17 FTC:n aineenvaihdunta rotille antamisen jälkeen (±)-FTC annettiin rotille laskimoon annostuksina 10, 50 ja 100 mg/kg ja arvioitiin käyrän, joka esitti lääkkeen pitoisuutta plasmassa aikaa vastaan, alla olevan alueen pin- 20 ta-ala (AUC), kokonaispoistuminen (CLT), jatkuvuustilan esiintymistilavuus (Vss), keskimääräinen viipymisaika (MRT) • ja puoliintumisaika (t1/2). Tulokset on annettu taulukossa 9.

Taulukko 9 25 FTC:n farmakokineettisiä parametrejä sen jälkeen kun on annettu rotille laskimoon 10, 50, 100 mg/kg* »

Annos AUC CLt V„ MRT t% mg/kg mg h/L mg h/kg L/kg h h 30 10 9,65 0,988 0,758 0,768 0,757 50 57,11 0,874 0,699 0,800 0,815 100 120,72 0,830 0,663 0,798 0,969 AUC = lääkkeen pitoisuutta plasmassa aikaa vastaan esittä-1 35 vän käyrän alla olevan alueen pinta-ala; CL = kokonaispois- : : tuminen; V6S = jatkuvuustilan esiintymistilavuus; MRT = kes- kimääräinen viipymisaika ja t1/2 = puoliintumisaika.

54 114915

Esimerkki 18 FTC:n farmakokineettisiä parametrejä sen jälkeen kun on annettu FTC laskimoon ja oraalisesti

Mallista riippumattomia farmakokineettisiä parametrejä 5 saatiin (±)-FTC:lle antamalla [laskimoon (I.V.) ja oraalisesti (P.O.)] 33,3 mg/kg reesusapinoille. Tulokset on annettu taulukossa 10. Tärkeää on, että yhdisteen keskimääräinen biologinen hyötyosuus oli apinoissa 73 % (± 6 %).

10 Taulukko 10

Mallista riippumattomia farmakokineettisiä parametrejä, jotka on saatu FTC:lie sen jälkeen kun on annettu laskimoon (I.V.) tai oraalisesti (P.O.) 33,3 mg/kg reesusapinoille* Apina AUC CLt V„s MRT t% Kal h- F % 15 mg h/L mg h/kg L/kg h h I.V.

RUh 19,14 1,74 2,71 1,56 1,28 RMi 26,31 1,26 1,97 1,56 1,22 RJd 22,51 1,48 2,00 1,36 1,47 20 Keskiarvo 22,65 1,49 2,23 1,49 1,32 ± keskihajonta 3,59 0,24 0,42 0,12 0,13 P.O.

25 RUh 13,21 2,07 1,58 0,48 71 RMi 21,11 2,32 1,08 0,43 80 RJd 15,29 3,23 1,47 0,31 68

Keskiarvo 16,54 2,54 1,38 0,41 73,00 V 30 (±6) ± keskihajonta 4,09 0,61 0,26 0,09 6,24 : * AUC = käyrän, joka esittää lääkkeen pitoisuutta plasmassa 35 aikaa vastaan, alla olevan alueen pinta-ala; CL = kokonais-, poistuminen; Vss = jatkuvuustilan esiintymistilavuus; MRT = ; keskimääräinen viipymisaika ja t1/2 = puoliintumisaika; F = ; biologinen hyötyosuus ja Ka = ensimmäisen kertaluvun absorp- tionopeusvakio.

55 114915

Taulukko 11 FTC: n ja sen deaminoidun aineenvaihduntatuotteen CSF/seerumi-suhde 1 tunti käsittelyn jälkeen 5 Apina Reitti FTC Aineenvaihdunta- tuote (FTU) RUh I.V. 0,076 0,024 RMi I.V. 0,062 0,032 10 RJd I.V. 0,162 0,052

Keskiarvo 0,054 0,014 ± keskihajonta 0,054 0,014 RUh P.O. 0,048 0,026 15 RMi P.O 0,039 0,037 RJd P.O. 0,117 0,055

Keskiarvo 0,068 0,039 ± keskihajonta 0,043 0,015 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Esimerkki 19 2 FTC:n ja sen aineenvaihduntatuotteiden CSF/seerumi- 3 suhde reesusapinoissa 4 (±)-FTC:n kykyä läpäistä veri-aivoeste arvioitiin 5 antamalla 33,3 mg/kg aktiivista yhdistettä reesusapinoilla 6 ja mittaamalla (±)-FTC:n määrä aivoselkäydinnesteessä 7 (CSF) ja veren seerumissa yksi tunti antamisen jälkeen.

8

Tulokset on annettu taulukossa 11. Tulokset osoittavat, 9 ‘ että merkittävä määrä aktiivista yhdistettä läpäisee veri- 10 aivoesteen tässä nisäkkäässä.

11 III. Farmaseuttisten koostumusten valmistaminen : HIV- tai HBV-infektion aiheuttamista sairauksista kärsiviä ihmisiä voidaan hoitaa antamalla potilaalle tehokas määrä (±)-FTC:a tai sen (-)- tai (+ )-enantiomeeriä tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista tai * 35 suolaa farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja- tai laimen- 56 114915 nusaineen läsnä ollessa. Aktiiviset aineet voidaan antaa mitä tahansa sopivaa reittiä, esimerkiksi suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, laskimoon, ihon sisään, ihon alle tai paikallisesti, nestemäisessä tai kiin-5 teässä muodossa.

Aktiivista yhdistettä sisällytetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja- tai laimennusaineeseen määränä, joka on riittävä toimittamaan potilaalle terapeuttisesti tehokkaan määrän yhdistettä viruksen replikaation in vivo, 10 erityisesti HIV:n ja HBV:n replikaation, estämiseksi aiheuttamatta vakavia myrkyllisyysvaikutuksia hoidetussa potilaassa. "Estävällä määrällä" tarkoitetaan aktiivisen aineosan määrää, joka on riittävä aikaansaamaan estävän vaikutuksen mitattuna esimerkiksi sellaisen kokeen kuin 15 tässä kuvatut avulla.

Edullinen annos (-)-, (+)- tai (±)-FTC:a kaikkia yllä mainittuja tiloja varten on väliltä noin 1-50 mg/kg, edullisesti 1-20 mg/kg ruumiinpainoa päivää kohti, yleisemmin 0,1 - noin 100 mg kilogrammaa saajan ruu-20 miinpainoa kohti päivässä. Farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten tehokas annostusalue voidaan laskea toimitettavan alkuperäisen nukleosidin painon perusteella. Jos johdannainen itse osoittaa aktiivisuutta, tehokas annostus voidaan arvioida kuten yllä käyttäen johdannaisen painoa 25 tai muulla alan ammatti-ihmisten tuntemalla tavalla.

Yhdiste annetaan sopivasti missä tahansa sopivassa annos-tusyksikkömuodossa mukaan lukien, mutta mainittuihin rajoittumatta, sellainen, joka sisältää 7 - 3000 mg, edullisesti 70 - 1400 mg aktiivista aineosaa annostusyksikkömuo-30 toa kohti. Oraalinen annostus, joka on 50 - 1000 mg, on yleensä sopiva.

Ihanteellisesti aktiivista aineosaa tulisi antaa niin että saavutetaan aktiivisen yhdisteen huippupitoi- suuksia plasmassa, jotka ovat noin 0,2 - 70 μΜ, edullises-35 ti noin 1,0 - 10 μΜ. Tämä voidaan saavuttaa esimerkiksi 57 114915 antamalla ruiskeena laskimoon 0,1 - 5 % liuos, jossa on aktiivinen aineosa valinnaisesti suolaliuoksessa, tai antamalla aktiivisen aineosan oraalisena (bolus) annoksena.

Aktiivisen yhdisteen pitoisuus lääkekoostumuksessa 5 riippuu lääkkeen absorboitumis-, inaktivoitumis- ja erit-tymisnopeudesta sekä muista alan ammatti-ihmisten tuntemista tekijöistä. Huomattakoon, että annostusmäärät vaih-televat myös lievitettävän tilan ankaruuden mukaan. Lisäksi on selvää, että kellä tahansa määrätyllä henkilöllä 10 spesifisiä annostusohjeita tulisi säätää ajan kuluessa yksilöllisen tarpeen ja koostumuksia antavan tai niiden antamista valvovan henkilön ammatillisen arvioinnin mukaan ja että tässä ilmoitetut pitoisuusalueet ovat ainoastaan esimerkillisiä eikä niiden ole tarkoitettu rajoittavan 15 patenttivaatimuksiin sisältyvän keksinnön suojapiiriä tai käytäntöä. Aktiivinen aineosa voidaan antaa kerralla tai se voidaan jakaa moniksi pienemmiksi annoksiksi annettavaksi vaihtelevin väliajoin.

Edullinen aktiivisen yhdisteen antamistapa on suun 20 kautta antaminen. Oraaliset koostumukset sisältävät yleensä inerttiä laimennusainetta tai syötävää kantaja-ainetta.

·· Ne voidaan sisällyttää gelatiinikapseleihin tai puristaa tableteiksi. Oraalista terapeuttista antamista varten ak-, tiivinen yhdiste voidaan yhdistää täyteaineiden kanssa ja 25 käyttää tablettien, suussa liukenevien tablettien tai kap-!, ! selien muodossa. Farmseuttisesti yhteensopivia sideaineita *it; ja/tai adjuvanttiaineita voidaan sisällyttää osaksi koos- * · t ’ · ’ ’ tumusta.

Tabletit, pillerit, kapselit, suussa liukenevat V 30 tabletit ja vastaavat voivat sisältää mitä tahansa seuraa- vista aineosista tai luonteeltaan samanlaisia yhdisteitä: ,*, sideainetta kuten hienokiteistä selluloosaa, tragantti- kumia tai gelatiinia; täyteainetta kuten tärkkelystä tai laktoosia, hajottavaa ainetta kuten algiinihappoa, Primo-* 35 geliä tai maissitärkkelystä; voiteluainetta kuten mag- 58 114915 nesiumstearaattia tai Sterotesiä; liukastavaa ainetta kuten kolloidista piidioksidia; makeutusainetta kuten sakkaroosia tai sakkariinia tai mausteainetta kuten piparminttu-, metyylisalisylaatti- tai appelsiinimaustetta. Kun 5 annostusyksikkömuoto on kapseli, se voi sisältää yllä mainittua tyyppiä olevan aineen lisäksi nestemäistä kantaja-ainetta kuten rasvaöljyä. Lisäksi annostusyksikkömuodot voivat sisältää erilaisia muita aineita, jotka muuntavat annostusyksikön fysikaalista muotoa, esimerkiksi päällys-10 tyksiä, jotka ovat sokeria, sellakkaa tai muita suolisto-liukoisia aineita.

(±)-FTC tai sen (-)- tai (+)-enantiomeeri tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia tai suoloja voidaan antaa eliksiirin, suspension, siirapin, voh-15 velikeksin, purukumin tai vastaavan komponenttina. Siirappi voi sisältää aktiivisten yhdisteiden lisäksi sakkaroosia makeutusaineena ja määrättyjä säilytysaineita, värejä ja värjäysaineita ja mausteita.

(±)-FTC tai sen (-)- tai (+ )-enantiomeerejä tai 20 niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia tai suoloja voidaan myös sekottaa muiden sellaisten aktiivisten aineiden kanssa, jotka eivät heikennä haluttua vaikutusta, tai sellaisten aineiden kanssa, jotka täydentävät haluttua vaikutusta kuten antibiootit, sieniä tuhoavat >,, 25 aineet, tulehdusta vastustavat aineet tai muut virusvas- . ! täiset aineet mukaan lukien muita nukleosidi-anti-HIV-yh- disteitä.

Liuokset tai suspensiot, joita käytetään ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, ihon sisään, ihon alle tai pai-: 30 kallisesti antamiseen, voivat sisältää seuraavia komponentteja: steriiliä laimennusainetta kuten ruiskeeseen tarkoitettua vettä, suolaliuosta, rasvaöljyjä, polyeteeni-glykoleja, glyseriiniä, propeeniglykolia tai muita synteettisiä liuottimia; bakteerinvastaisia aineita kuten i 35 bentsyylialkoholia tai metyyliparabenejä; antioksidantteja *

1 I I

59 114915 kuten askorbiinihappoa tai natriumbisulfiittia; kelatoivia aineita kuten eteenidiamiinitetraetikkahappoa; puskuriai-neita kuten asetaatteja, sitraatteja tai fosfaatteja ja aineita toonisuuden säätämiseksi kuten natriumkloridia tai 5 dekstroosia. Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annettava valmiste voidaan sulkea ampulleihin, kertakäyttöruiskuihin tai monen annoksen pulloihin, jotka on tehty lasista tai muovista.

Jos annetaan laskimoon, edullisia kantaja-aineita 10 ovat fysiologinen suolaliuos tai fosfaatilla puskuroitu suolaliuos (PBS).

Edullisessa suoritusmuodossa aktiiviset yhdisteet valmistetaan sellaisten kantaja-aineiden kanssa, jotka suojaavat yhdistettä nopealta poistumiselta ruumiista, 15 kuten kontrolloidusti vapauttava valmiste mukaan lukien siirrännäisiä ja mikrokapseloituja luovutusjärjestelmiä. Biologisesti hajottuvia, biologisesti sopivia polymeerejä voidaan käyttää kuten eteenivinyyliasetaattia, polyanhyd-ridejä, polyglykolihappoa, kollageeniä, polyortoestereitä 20 ja polymaitohappoa. Menetelmät tällaisten koostumusten valmistamiseksi ovat alan ammatti-ihmisille selviä. Aineet * voidaan myös hankkia kaupallisesti toiminimeltä Alza Cor- . poration and Nova Pharmaceuticals, Inc.

Liposomisuspensiot (mukaan lukien liposomeja, jotka 25 on suunnattu infektoituneisiin soluihin virusantigeenien vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden avulla) ovat ; myös edullisia farmaseuttisesti hyväksyttävinä kantaja- aineina. Näitä voidaan valmistaa alan ammatti-ihmisten tuntemien menetelmien mukaan, esimerkiksi kuten on kuvattu ; 30 US-patentissa 4 522 811 (joka liitetään tähän viitteenä ' kokonaisuudessaan). Esimerkiksi liposomivalmisteita voi daan valmistaa liuottanmalla sopiva(t) lipidi(t) (kuten t stearoyylifosfatidyylietanoliamiini,stearoyylifosfatidyy- likoliini, arakadoyylifosfatidyylikoliini ja kolesteroli) ; · 35 epäorgaaniseen liuottimeen, joka haihdutetaan sitten jät- I *

I I I I

60 114915 täen ohut kalvo kuivattua lipidiä astian pinnalle. Vesi-liuos, jossa on aktiivista yhdistettä tai sen monofosfaat-ti-, difosfaatti- ja/tai trifosfaattijohdannaisia, lisätään sitten astiaan. Astiaa pyöritetään sitten käsin lipi-5 diaineen vapauttamiseksi astian seinämiltä ja lipidiaggre-gaattien dispergoimiseksi muodostaen siten liposomisuspen-sio.

IV. FTC:n fosfaattijohdannaisten valmistus FTC:n mono-, di- ja trifosfaattijohdannainen voi-10 daan valmistaa kuten alla on kuvattu.

Monofosfaatti voidaan valmistaa Imain et ai. menetelmän mukaan, J. Org. Chem. 34 (6) (kesäkuu 1969) 1547 -1550. Esimerkiksi noin 100 mg:n FTC ja noin 280 μ1:η fos-foryylikloridia annetaan reagoida sekoittaen noin 8 ml:ssa 15 kuivaa etyyliasetaattia noin 0 °C:ssa noin neljän tunnin ajan. Reaktio tukahdutetaan jään avulla. Vesifaasi puhdistetaan aktiivihiilipylvään avulla eluoiden 5 % ammonium-hydroksidilla seoksessa, jossa on 1 : 1 etanolia ja vettä. Haihduttamalla eluentti saadaan ammonium-FTC-5'-monofos-20 faatti.

Difosfaatti voidaan valmistaa Davissonin et ai.

*· menetelmän mukaan, J. Org. Chem. 52 (9) (1987) 1794 - 1801. FTC-difosfaatti voidaan valmistaa vastaavasta tosy-laatista, joka voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla ’ ! 25 nukleosidin reagoida tosyylikloridin kanssa pyridiinissä ; ; huoneenlämpötilassa noin 24 tunnin ajan ja käsittelemällä tuotetta tavanomaisesti (esim. pesemällä, kuivaamalla ja kiteyttämällä se).

Trifosfaatti voidaan valmistaa Hoardin et ai. mene-30 telmän mukaan, J. Am. Chem. Soc. 87 (8) (1965) 1785 - : 1788. FTC aktivoidaan (valmistamalla imidatsolidi alan ammatti-ihmisten tuntemien menetelmien mukaan) ja käsitellään tributyyliammoniumpyrofosfaatilla DMFrssa. Reaktiosta saadaan pääasiallisesti nukleosidin trifosfaattia ja jon-• 35 kin verran reagoimatonta monofosfaattia ja jonkin verran 61 114915 difosfaattia. Puhdistusta anioninvaihtokromatografian avulla käyttäen DEAE-pylvästä seuraa trifosfaatin eristäminen, esim. tetranatriumsuolana.

Tämä keksintö on kuvattu sen edullisten suoritus-5 muotojen avulla. Keksinnön vaihteluja ja muunnoksia selviää alan ammatti-ihmisille edellä olevan keksinnön yksityiskohtaisen kuvauksen perusteella. Tarkoitus on, että kaikki nämä vaihtelut ja muunnokset sisältyvät oheisten patenttivaatimusten suoj apiiriin.

10 i · • » • ♦

Claims (15)

62 114915

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten β-2-hydroksimetyyli-5-(5—fluorisytosin-l-yyli)-1,3-5 oksatiolaanin enantiomeerien valmistamiseksi, joilla on kaava I nh2 HO. V-°^ S—* 10 tunnettu siitä, että (A) mahdollisesti suojattu 5-fluoripyrimidiini, jolla on kaava nh2 ;· \M-^\ N oz 15 : jossa Z on vety tai suojaryhmä, kuten trialkyylisilyyli- ryhmä, saatetaan reagoimaan 1,3-oksatiolaanin kanssa, jolla on kaava » RlaO V°^

20 S—* t .jossa R on vety tai hydroksyylin suojaryhmä mukaan luki- I · ’! en asyyliryhmä ja L on lähtevä ryhmä, ja tarvittaessa 63 114915 poistetaan hydroksyylin suojaryhmä, minkä jälkeen erotetaan enantiomeerit i) saattamalla raseeminen seos Amano PS-800-lipaa-sin, α-kymotrypsiinin tai sellaisen entsyymin vaikutuksen 5 alaiseksi, joka selektiivisesti katalysoi toisen enantio-meerin deaminaatiota, ja eristämällä haluttu enantiomeeri sopivalla kromatografisella tai kemiallisella menetelmällä tai ii) erottamalla raseeminen seos enantiomeereikseen 10 kemiallisesti millä tahansa sinänsä tunnetulla tavalla; tai (B) erotetaan kaavan I mukaiset enantiomeerit saattamalla kaavan I mukaisten enantiomeerien yhdistelmä asetyloidun β-syklodekstriinikiraalipylvään läpi tai Chi-15 ralpak AS -pylvään läpi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää menetelmän, jolla valmistetaan 1,3-oksatiolaani, jolla on kaava RiaO 20 » jossa Ria ja L ovat edellä määriteltyjä, siten että ! i) otsonoidaan kaavan HOCH2CHCHCH2OH tai y; ROCH2CHCHCH2OR mukainen yhdiste, jossa R on suojaryhmä, • *’ 25 jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava H R.aO. ; · X) ’’ jossa Ria on edellä määritelty, 30 ii) saatetaan vaiheen i) tuote reagoimaan merkap- ,.· toetikkahapon kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on rakenne 64 114915 R.aO jossa Rla on edellä määritelty, ja 5 iii) pelkistetään vaiheen ii) tuote ja saatetaan se sitten reagoimaan karboksyylihappoanhydridin, alkyloi-van aineen tai halogenoivan aineen kanssa, jolloin muodostuu haluttu 1,3-oksatiolaani.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että kohdassa i) käytetty entsyymi on sytidiini-deoksisytidiinideaminaasi, Amano PS-800 -li-paasi tai a-kymotrypsiini.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty entsyymi on Amano

15 PS-800 -lipaasi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää vaiheen, jossa kaikki suojaryhmät poistetaan ennen entsymaattista erottamista, minkä jälkeen nukleosidienantiomeerien 5'- 20 hydroksyylit asyloidaan ja sitten suoritetaan entsymaatti-nen erottaminen Amano PS-800 -lipaasilla tai a-kymotrypsiinillä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asylointiin käytetty yhdiste 25 on etikkahappo, propionihappo, voihappo, pentaanihappo, 2-klooripropionihappo, 2-kloorivoihappo tai 2- klooripentaanihappo.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ,,,'· tunnettu siitä, että nukleosidienantiomeerit ero- 30 tetaan saattamalla raseeminen seos kulkemaan pylvään läpi, joka sisältää entsyymin immobilisoituna kantajaan. ψ

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, : I tunnettu siitä, että nukleosidienantiomeerit ero- • tetaan sekoittamalla raseeminen seos entsyymin kanssa 35 liuoksessa. 65 114915

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen reaktio suoritetaan ionittoman pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää vaiheen, jossa kohdassa i) saatu tuote saatetaan toisen entsyymin vaikutuksen alaiseksi, joka parantaa enantiomeerien erottumista .

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että saatu tuote lisäksi uudel- leenkiteytetään.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu tuote lisäksi käsitellään kiraalisella hapolla, kuten omenahapolla, manteliha- 15 polla, dibentsoyyliviinihapolla, 3-bromikamferi-8-sulfoni-hapolla, 10-kamferisulfonihapolla tai di-p-toluoyyliviini-hapolla.

13. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajaan immobilisoitu ent- 20 syymi on esteraasi, lipaasi, subtilisiini, a-kymotrypsiini, tai sytidiini-deoksisytidiinideaminaasi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, * tunnettu siitä, että kantajaan immobilisoitu ent syymi on sian maksan esteraasi.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, .. i tunnettu siitä, että vaiheessa (B) käytetään syk- I, ; lodekstriinisidottua I-AC-kiraalipylvästä. • · » » » * # * · > 66 114915