RO122814B1 - Procedeu de separare a unui amestec de derivaţi de 1,3-oxatiolan - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de separare a unui amestec de derivaţi de 1,3-oxatiolan, utilizaţi în tratarea infecţiei cu HIV. Procedeul conform invenţiei constă în supunerea amestecului racemic de 2-hidroximetil-5-(5-fluorcitosin-1-il)-1,3-oxatiolan unei etape de rezoluţie, sub acţiunea unei enzime selectată din grupul care constă în esterază, lipază, substilisin, alfa-chimotripsină, citidin-dezoxicitidin dezaminază, care catalizează, preferenţial, o reacţie a unuia dintre enantiomeri, urmată de expunerea produsului rezultat, acţiunii unei a doua enzime care intensifică rezoluţia, recristalizarea produsului de rezoluţie şi tratarea acestuia cu un acid chiral, ales dintr-un grup care constă în acid malic, acid mandelic, acid 10-camforsulfonic, acid 3-bromcamfor-8-sulfonic, acid di-benzoiltartric şi acid di-para-toluoiltartric.

Description

Orice persoana are dreptul să formuleze în scris și motivat, la

OSIM, o cerere de revocare a brevetului de invenție, in termen de 6 luni de la publicarea mențiunii hotărârii de acordare a acesteia

RO 122814 Β1

Invenția se referă un procedeu de separare a unui amestec de derivați de 1,3oxatiolan, utilizați în tratamentul infecției cu HIV.

Este cunoscut, încă din 1981, faptul că sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA) este o boală care afectează sever sistemul imunitar uman și care aproape fără excepție duce la deces. în 1983, cauza etiologică a sindromului imunodeficienței dobândite (SIDA) a fost determinată a fi virusul imunodeficienței umane (HIV). în decembrie 1990, Organizația Mondială a Sănătății a estimat că între 8 și 10 milioane de oameni din lumea întreagă sunt infectați cu virusul imunodeficienței umane (HIV), din care între 1000000 și 1400000 sunt din Statele Unite ale Americii.

în 1985, s-a raportat că nucleozida sintetică 3'-azido-3'-dezoxitimidina (AZT) inhibă replicarea virusului imunodeficienței umane. De atunci, s-au prezentat și alte nucleozide sintetice eficiente față de virusul imunodeficienței umane (HIV), incluzând 2',3'-didezoxiinozina (DDI), 2',3'-didezoxicitidina (DDC), 3'-fluoro-3'-dezoxitimidina (FLT) și 2',3'-didezoxi2',3'-didehidrotimidina (D4T).

S-a demonstrat, de asemenea, că și alte 2',3'-didezoxinucleozide inhibă dezvoltarea in vitro a unei varietăți din aceste virusuri. Se pare că, după fosforilare celulară la 5'-trifosfat cu ajutorul kinazelor celulare, aceste nucleozide sintetice sunt încorporate în filamentul de dezvoltare al acidului dezoxiribonucleic (ADN) viral, producând astfel oprirea catenei, datorită absenței grupării 3'-hidroxil.

Succesul diferitelor 2',3'-didezoxinucleozide în inhibarea replicării virusului imunodeficienței umane HIV in vivo sau in vitro a condus la un număr de teme de cercetare pentru găsirea și testarea nucleozidelor care substituie un heteroatom la atomul de carbon din poziția 3' a nucleozidei. Norbeck și colaboratorii, descriu faptul că (±)-1-((2p,4P)-2-(hidroximetil)-4-dioxolanil)timina (se referă la forma de (±)-dioxolan-T) prezintă o activitate modestă față de virusul imunodeficienței HIV (EC₅₀ de 20 pm în celulele ATH 8) și nu este toxic față de celulele martor neinfectate, la o concentrație de 200 pM, Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). Cererea de brevet europeană cu publicația WO/0337713 și brevetul US 5041449, având ca titular IAF BioChem Internațional, Inc., descriu 1,3-dioxolanii-2-substituiți4-substituiți care prezintă o activitate antivirală.

US 5047407 și cererea de brevet european nr. 0382526 având, de asemenea, ca titular IAF BioChem Internațional, Inc., descriu un număr de nucleozide 1,3-oxatiolan 2substituite-5-substituite, cu activitate antivirală, și raportează, în mod specific, că amestecul racemic (aproximativ poziția C4') de izomer Cl'-β al 2-hidroximetil-5-(citozin-1 -il)-1,3oxatiolanului (se referă, mai departe, la (+)-BCH-189) are aproximativ aceeași activitate față de virusul imunodeficienței ca AZT și nu este toxic la nivelurile testate. S-a descoperit, de asemenea, că (±)-BCH-189 inhibă replicarea virusului imunodeficienței HIV rezistent la AZT, care se izolează in vitro de la pacienții care au fost tratați cu nucleozida sintetică 3'-azido-3'dezoxitimidina (AZT) timp de mai mult de 36 de săptămâni.

Un alt virus care cauzează probleme serioase în sănătatea omului este virusul hepatitei B (HBV). Virusul hepatitei B este inferior numai tutunului ca și cauză a cancerului uman. Mecanismul prin care virusul hepatitei B induce cancerul este necunoscut, așadar este postulat că acesta poate declanșa direct dezvoltarea tumorii sau poate declanșa dezvoltarea tumorii indirect prin inflamație cronică, ciroză și prin regenerarea celulară asociată cu infecția.

După o perioadă de incubare de două până la șase luni în care gazda este infectată cu virusul hepatitei B, evoluția bolii ajunge la stadiul de hepatită acută și la distrugerea ficatului, ceea ce produce dureri abdominale, icter și niveluri ridicare ale enzimelorîn sânge.

Virusul hepatitei B poate determina hepatita fulminantă, cu progresie rapidă, adesea fatală ca formă de boală, în care porțiuni masive din ficat sunt distruse.

RO 122814 Β1

Pacienții bolnavi de hepatită acută sunt, adesea, recuperați. La unii pacienți totuși, 1 nivelurile ridicate de antlgen viral persistă în sânge o perioadă îndelungată sau nedefinită, producând o infecție cronică. Infecțiile cronice pot duce la hepatite cronice persistente. 3 Pacienții infectați cu virusul hepatitei B persistent, în majoritate se găsescîn țările dezvoltate.

La mijlocul anului 1991, existau aproximativ 225 milioane de purtători cronici de virus al 5 hepatitei B numai în Asia și aproape 300 milioane de purtători în lumea întreagă. Hepatita cronică persistentă poate cauza extenuare, ciroza ficatului și carcinomul hepatocelular, un 7 cancer primar hepatic.

în țările industrializate occidentale, grupurile cu un risc mare de infectare cu virusul 9 hepatitei B includ acele persoane care vin în contact cu purtătorii de virus al hepatitei B sau cu probe din sângele acestora. Epidemiologia virusului hepatitei B este foarte asemănătoare 11 cu cea a sindromului imunodeficienței dobândite, ceea ce explică de ce infecția cu virusul hepatitei B este comună printre pacienții cu sindromul SIDA sau cu complexul legat de 13 sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA). Cu toate acestea, virusul hepatitei B este mult mai contagios decât virusul imunodeficienței umane (HIV). 15

Un vaccin derivat din serul uman a fost dezvoltat pentru imunizarea pacienților față de virusul hepatitei B. în timp ce acesta a fost găsit eficient, producerea vaccinului este 17 complicată, deoarece furnizarea serului uman de la purtătorii cronici este limitată și procesul de purificare este lung și costisitor. Mai mult decât atât, fiecare serie de vaccinuri preparate 19 din diferite seruri trebuie să fie testată pe cimpanzei pentru o siguranță mai bună. Vaccinurile au fost așadar produse prin inginerie genetică. Tratamentele zilnice cu interferonul alfa, o 21 proteină de inginerie genetică, s-au arătat a fi promițătoare. Cu toate acestea, pentru datare, nu există nici un agent farmaceutic cunoscut care să inhibe efectiv replicarea virusului. 23 Pentru a lansa pe piață o nucleozidă pentru scopuri farmaceutice, aceasta trebuie să fie nu numai eficientă, cu o toxicitate scăzută, dar trebuie, de asemenea, să aibă un cost 25 convenabil pentru a fi fabricată. O temă însemnată de cercetare și dezvoltare a fost orientată către procedee noi, cu costuri scăzute pentru producția de nucleozide pe scară largă. 2',3'- 27 didezoxinucleozidele sunt preparate, în mod curent, printr-una din următoarele două căi: derivatizarea unei nucleozide intacte sau condensarea unui fragment de zahăr cu o bază 29 heterociclică. Deși există numeroase dezavantaje asociate obținerii unor noi analogi de nucleozide prin modificarea unor nucleozide intacte, un avantaj major al acestui procedeu 31 este acela că stereochimia absolută convenabilă a fost deja stabilită în mod natural. Cu toate acestea, procedeul nu poate fi utilizat în producerea de nucleozide care conțin fie baze care 33 se produc în mod nenatural, fie fragmente de carbohidrați care se produc în mod nenatural (și care, pentru acest motiv, nu sunt preparate din nucleozide intacte), cum arfi, de exemplu, 35 1,3-oxatiolan nucleozidele și 1,3-dioxolan nucleozidele.

în cazul în care se condensează un fragment carbohidrat sau un compus cu o 37 structură asemănătoare unui carbohidrat cu o bază, pentru a se forma o nucleozidă sintetică, nucleozidă care se produce are două centre chiralice (în pozițiile C1' și C4‘) și astfel există 39 ca pereche diastereomerică. Fiecare diastereomer există ca un set de enantiomeri. De aceea, produsul este un amestec de patru enantiomeri. 41

Adesea s-a găsit că nucleozidele cu stereochimie produsă în mod nenatural fie în poziția C1fie în poziția C4', sunt mai puțin active decât aceleași nucleozide cu stereochimie 43 stabilită în mod natural. De exemplu, Carter și colaboratorii au raportat că concentrația de (-)-enantiomer de carbovir (2',3'-didehidro-2',3'-didezoxiguanozina) în cultura de celule 45 necesară pentru reducerea activității revers transcriptazei cu 50% (EC₅₀) este de 0,8 μΜ, în timp ce EC₅₀ pentru (+)-enantiomerul de carbovir este mai mare de 60 μΜ. Antimicrobial 47

Agentsand Chemotherapy, 34: 6,1297-1300 (June 1990).

RO 122814 Β1

WO 91/11186 descrie că 1,3-oxatiolan nucleozidele pot fi preparate cu o diastereoselectivitate superioară (procentaj superiorde nucleozide cu configurație (3 la legătura dintre atomul de carbon C1' și baza heterociclică), printr-o selecționare minuțioasă a acidului Lewis utilizat în procedeul de condensare. S-a descoperit, de asemenea, că condensarea nucleozidei 1,3-oxatiolan cu o bază se produce cu o β-stereospecificitate aproape completă, atunci când clorură stanică este utilizată drept catalizator de condensare. Alți acizi Lewis determină o selectivitate CT-β joasă (sau nulă) sau nu pot cataliza reacțiile.

Având în vedere faptul că sindromul imunodeficienței dobândite, complexul legat de SIDA și virusul hepatitei B au înregistrat în lumea întreagă niveluri epidemice și au efecte tragice asupra pacienților infectați, apare o mare necesitate de a se furniza noi agenți farmaceutici eficienți pentru tratamentul acestor boli, care să aibă o toxicitate scăzută față de organismul gazdă.

Apare, de asemenea, necesitatea de a se găsi un procedeu viabil comercial, având un cost rentabil, pentru a se produce nucleozide importante din punct de vedere farmaceutic și care să atingă o β-stereospecificitate în poziția C4' a nucleozidelor sintetice, preparate prin condensarea unui fragment cu o structură asemănătoare unui carbohidrat cu o bază.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta un procedeu de separare a derivaților de 1,3-oxatiolan.

Procedeul pentru separarea derivaților de 1,3 oxatiolan, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că amestecul racemic de 2 hidroximetil-5-(5fluorocitosin-1 -il)-1,3-oxatiolan se supune unei etape de rezoluție sub acțiunea unei enzime selectate din grupul constând din esterază, lipază, substilizină, α-chimotripsină, citidindezoxicitidin dezaminază, care catalizează preferențial o reacție într-unul dintre enantiomeri, urmată de expunerea produsului rezultat la acțiunea unei a doua enzime selectate din grupul esterază, lipază, subtilizină α-chemotripsină, care intensifică rezoluția prin favorizarea reacției de legare a unuia dintre enantiomeri, recristalizarea produsului de rezoluție și tratarea acestuia cu un acid chiral ales dintr-un grup constând din acid malic, acid mandelic, acid 10-camforsulfonic, acid 3-bromocamfor-8-sulfonic, acid di-benzoil tartric și acid di-paratoluoiltartric.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- se obțin derivați de 1,3-oxatiolan cu activitate antivirală mărită;

- prezenta metodă este regioselectivă.

Procedeul pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan constă în reacția 5-fluorocitozinei, opțional protejată cu 1,3-oxatiolan având formula:

în care R_1a este un atom de hidrogen sau o grupare de protecție hidroxi, o grupare acil și L este o grupare labilă; și opțional se îndepărtează orice grupare de protecție a grupării hidroxi.

Un alt procedeu pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan constă în reacția unui compus de formula următoare:

NHRț_b

S

RO 122814 Β1 în care R_1a este o grupare de protecție a grupării hidroxi și R_1b este o grupare de protecție a grupării amino, cu un agent de fluorurare care introduce atomul de fluor în poziția 5 a ciclului citozinei și apoi, opțional, se îndepărtează grupele de protecție.

Un alt procedeu pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan constă în reacția unui compus având formula:

în care R_1a este o grupă de protecție hidroxi, cu un agent care convertește grupa oxo în 15 poziția 4 a ciclului uracil în grupa amino și apoi se îndepărtează grupele de protecție.

Derivatul de 1,3-oxatiolan se prepară prin:17 (i) ozonizarea compusului cu formula CH₂=CH-CH₂-OR sau ROCH₂-CH=CH-CH₂OR, în care radicalul R este o grupă de protecție, obținându-se compusul cu formula:19

(ii) reacționarea compusului obținut în faza (I) cu acid mercaptoacetic pentru a forma compusul cu structura:25

(iii) reducerea compusului obținut în faza (ii) și apoi aducerea în reacție a acestuia cu anhidrida acidului carboxilic, cu un agent de alchilare sau agent de halogenare, pentru a se obține compusul cu formula:

în care L este o grupă labilă.

Un alt obiect al invenției de față constă în compoziția farmaceutică ce conține drept compus activ un derivat de 1,3-oxatiolan și un purtător pentru administrare orală și este condiționat sub formă de capsulă sau sub formă de tabletă.

Deci, un obiect al prezentei invenții este o metodă și o compoziție pentru tratamentul pacienților umani infectați cu virusul imunodeficienței umane, HIV.

Un alt obiect al prezentei invenții este acela de a furniza o metodă și o compoziție pentru tratamentul pacienților umani sau a altor animale gazdă, infectate cu virusul hepatitei B, HBV.

Un alt obiect al prezentei invenții constă, de asemenea, în nucleozide îmbogățite enantiomeric în 1,3-oxatiolan.

Prezenta invenție mai conține o metodă de descompunere a enantiomerilor C4' ai nucleozidelor 1,3-oxatiolan.

RO 122814 Β1

Pentru tratamentul infecțiilor cu virusul imunodeficienței umane HIV și cu virusul hepatitei B, HBV, la oameni și la alte animale gazdă, conform prezentei invenții, pentru tratamentul menționat mai sus, se prevede administrarea unei cantități eficiente de 2-hid roxi metil5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan, un derivat al acestui compus acceptabil din punct de vedere farmaceutic, incluzând derivatul 5' sau N⁴ alchilat sau derivatul 5' sau N⁴ acilat sau o sare a acestui compus acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, într-un vehicul acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

De asemenea, s-a constatat că 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan (FTC) prezintă în mod surprinzător o activitate intensă față de virusul imunodeficienței umane, cu o toxicitate foarte redusă față de celula gazdă. De asemenea, s-a mai constatat că compusul 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan (FTC) prezintă o activitate foarte semnificativă față de virusul hepatitei B, HBV, și de aceea poate fi utilizat pentru tratamentul pacienților care au o varietate de maladii asociate infecției cu virusul hepatitei B, HBV.

Studiile de toxicitate și de farmacocinetică confirmă completa utilizare a compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan (FTC), ca agent antiviral pentru administrarea farmaceutică. Compusul FTC și enantiomerii acestuia sunt netoxici față de celulele măduvei osoase umane, periferice, la concentrații de peste 50 μΜ și alte linii celulare la concentrații de peste 200 μΜ. Compusul FTC-TP este un metabolit intracelular major în PBMC și celulele HepG2. Compusul FTC-TP inhibă competitiv virusul imunodeficienței umane HIV-1 ca revers transcriptaza (RT) cu K1 pentru 0,2 pM, utilizându-se un poli(l) oligo(dC)templat-primer. Utilizându-se analize secvențiale, compusul FTC-TP demonstrează a fi un terminator potent al catenei acidului dezoxiribonucleic ADN, când se utilizează virusul imunodeficienței umane HIV-RT (C-stop-uri).

Tratamentul cronic cu compusul FTC nu este toxic pentru animalele rozătoare, chiar în doze orale de 85 mg per kilogram pentru o zi, timp de cel puțin două luni. Studiile farmacocinetice ale compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan (FTC) la maimuțele Rhesus indică o biodisponibilitate orală mare (aproximativ 73+6%) și o perioadă de înjumătățire plasmatică terminală de aproximativ 1,34+0,18 (media administrării orale și intravenoase).

în prezenta descriere se tratează, de asemenea, un procedeu pentru descompunerea unui amestec racemic al enantiomerilor nucleozidei, incluzând amestecul racemic de FTC, acesta incluzând faza de expunere a amestecului racemic la acțiunea unei enzime care în mod preferențial catalizează o reacție într-unul din enantiomeri. Procedeul poate fi utilizat pentru rezolvarea unei game largi de nucleozide, incluzând pirimidin nucleozidele și purin nucleozidele care, opțional, sunt substituite la partea de carbohidrat sau la partea de bază. Procedeul poate fi așadar utilizat pentru rezolvarea derivaților de nucleozide care conțin heteroatomi adiționali în partea de carbohidrat, de exemplu (±)-FTC și (±)-BCH-189. Rezoluția nucleozidelor poate fi realizată pe scară largă la costuri moderate. Utilizându-se modelele descrise în prezenta invenție, FTC poate fi separat în enantiomerii săi (+)-beta-D și (-)-beta-L. Enantiomerul (-)-beta-L pare a fi mult mai activ decât enantiomerul (+)-beta-D față de HIV, HBV și SIV. Enatiomerul (+) al FTC este, așadar, activ față de HIV, HBV și HIV.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de nucleozidă îmbogățită enantiomeric’’ se referă la o compoziție de nucleozidă, inclusiv cel puțin 95% dintr-un singur enantiomer al acelei nucleozide.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de FTC” se referă la compusul

2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan (forma racemică sau enantiomerii), așadar la compusul 2'-dezoxi-5-fluor-3'-tiacitidină.

RO 122814 Β1

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (±)-FTC se referă la (±)-beta-D, L-2-h id roxi metil-5-(5-fl u orocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (-)-FTC se referă la (-)-beta-L-2hidroximetil-beta-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (+)-FTC se referă la (+)-beta-D2-hidroxi metil-5-(5-fl uorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenii FTC-MP, FTC-DP și FTC-TP se referă la monofosfatul FTC, difosfatul FTC și respectiv trifosfatul FTC.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul BCH-189 se referă la 2hidroximetil-5-(5-citozin-1-il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de cataliză enzimatică preferențială se referă la cataliza cu ajutorul unei enzime a unui substrat în locul altui substrat.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, o grupare mobilă reprezintă o grupare funcțională care se formează la o carbonatare incipientă, atunci când se separă de molecula de care este legată această grupare.

în concluzie, în prezenta invenție se prezintă un procedeu de separare a unui amestec de derivați de 1,3 oxatiolan, iar prepararea compusului 2-hidroximetil-5-(5fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan constă în:

(i) reacția dintre 5-fluorocitozină, opțional protejată, cu 1,3-oxatiolan având formula în care R_1a este hidrogen sau o grupare de protecție a grupării hidroxil, incluzând o grupare acil și L este o grupare mobilă; și opțional se îndepărtează orice grupare de protecție a grupării hidroxil;

(ii) reacția compusului cu formula B:

(în care R_1a este definit ca mai sus și R_1b este o grupare de protecție a grupării amino), cu un agent de fluorurare care participă la introducerea unui atom de fluor în poziția 5 a ciclului citozinic; sau (iii) reacția unui compus având formula C:

RO 122814 Β1 (în care radicalul R_1a este definit ca mai sus), cu un agent care participă la transformarea grupării oxo din poziția 4 a ciclului uracil, în grupare amino; orice grupare de protecție rămasă poate fi îndepărtată pentru a se obține compusul dorit;

în procedeu, în etapa (i), gruparea de protecție a grupării hidroxi include grupările de protecție descrise în detaliu mai jos, incluzând grupările acil (de exemplu acetil), arilacil (de exemplu, benzoil sau benzoil substituit), tritil sau monometoxitritil, benzii sau benzii substituit, silii trisubstituit incluzând trialchilsilil (de exemplu, dimetil-t-butilsilil) sau difenilmetilsilil. Compusul 5-fluorocitozin poate fi, opțional, protejat cu grupări silii trisubstituite. Grupările de protecție pot fi îndepărtate prin orice metodă convențională. Gruparea mobilă L este o grupare mobilă tipică, cunoscută în literatura de specialitate, privind chimia nucleozidelor, de exemplu, un halogen cum arfi clorul sau bromul, alcoxi cum arfi, de exemplu, metoxi sau etoxi sau acil cum ar fi, de exemplu, acetil sau benzoil.

Reacția (i) poate fi efectuată într-un solvent organic (de exemplu, 1,2-dicloretan sau acetonitril) în prezența unui acid Lewis, de preferință clorura stanică sau trimetilsilil triftalat.

Compușii cu formula A (în care L reprezintă o grupare acil, de exemplu, o grupare acetil) pot fi obținuți prin reacția compusului cu formula D:

(în care R_1a este definit ca mai sus) cu un agent de reducere, de exemplu, hidrură de aluminiu-litiu, după care urmează tratarea cu un reactiv convențional potrivit, pentru a se obține compusul intermediar dorit, de exemplu, anhidrida acidului carboxilic, cum este anhidrida acetică, pentru acilare, reactivi de clorurare sau bromurare pentru halogenare sau reactivi de alchilare.

Compusul cu formula D poate fi preparat prin reacția compusului cu formula E:

H ^Βι.°^ν-^Ζ^»ο ^E cu compusul HSCH₂CO₂H la o temperatură ridicată.

Compusul cu formula E poate fi preparat prin ozonoliză, plecând de la un alil eter sau alil ester având formula CH₂=C-CH₂-OR sau un dieter sau un diester de 2-buten-1,3-diol având formula RO-CH₂-CH=CH-CH₂-OR, în care R este o grupare de protecție, cum ar fi, de exemplu, o grupare alchil, silii sau acil.

Cu privire la etapa (ii) din procedeu, substituentul 5-fluor poate fi introdus prin metode cunoscute în literatura de specialitate (M. J. Robins și colaboratorii, în Nucleic Acid Chemistry, Part 2, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (19/8) și referințele cuprinse; R. Duschinsky în Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York43-46 (1978) și referințele cuprinse). Agentul de fluorurare poate fi, de exemplu, trimetilhipofluorit în fluortriclormetan.

Cu privire la etapa (iii) din procedeu, compusul cu formula C poate fi tratat cu 1,2,4triazol, împreună cu 4-clorfenil diclorfosfat, pentru a forma compusul 4-(1,2,4-triazoilil) corespunzător, care este apoi transformat în compusul 4-amino(citidină) dorit, de exemplu prin reacția cu metanol.

RO 122814 Β1

Materialele inițiale cu formulele B și C pot fi preparate, de exemplu, prin reacția unei 1 baze corespunzătoare (opțional protejate), cu un compus cu formula A într-o manieră asemănătoare celei descrise în etapa de procedeu (i). Compușii 5-fluorouracii și 5-fluor- 3 ocitozină sunt compuși comerciali furnizați de la firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl 53233, USA. 5

Rezoluția enantiomerilor (+) poate fi completată așa cum se va specifica în detaliu în continuare. 7

Compusul FTC poate fi transformat în esterul acceptabil din punct de vedere farmaceutic, prin reacția cu un agent de esterificare convenabil, de exemplu, o halogenură acidă 9 sau o anhidridă. Compusul FTC sau derivatul acceptabil din punct de vedere farmaceutic al acestui compus, poate fi transformat într-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, 11 într-o maniară convenabilă, de exemplu, prin tratarea cu o bază corespunzătoare. Esterul sau sarea compusului FTC se pot transforma în compusul FTC, de exemplu prin hidroliză. 13

I. Prepararea compușilor activi

Amestecul racemic al compusului FTC poate fi preparat conform metodei descrise 15 în detaliu în publicarea cererii PCT, WO 91/11186, publicat pe 8 august 1991, având ca titular Emory University, sau prin procedeul descris în exemplul 1. în general, metoda include 17 ozonizarea fie a unui eter alilic sau a unui ester alilic având formula CH₂=CH-CH₂-OR sau a unui dieter sau diester al 2-buten-1,3-diolului având formula RO-CH₂-CH=CH-CH₂-OR, în 19 care radicalul R este o grupare de protecție, cum arfi de exemplu alchil, silii sau o grupare acil, pentru a forma o glicoaldehidă având formula OHC-CH₂-OR; adăugarea acidului 21 tioglicolic la glicoaldehidă pentru a forma o lactonă cu formula 2-(R-oxi)-metil-5-oxo-1,3oxatiolan; reducerea lactonei la diferiți compuși conținând o grupare mobilă în poziția 5 a 23 ciclului oxatiolanic; cuplarea acestor compuși cu 5-fluorocitozin-siliat în prezența SnCI₄ pentru formarea izomerului beta al FTC; și opțional îndepărtarea grupelor de protecție. 25

Se dau în continuare exemplele de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1 ...12, care reprezintă:27

- fig. 1, o ilustrare a structurii chimice a compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 - il)-1,3-oxatiolan (FTC);29

- fig. 2, o ilustrare a procedeului pentru prepararea compusului 2-hidroximetil-5-(5- fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan;31

- fig. 3, o diagramă a fluxului specificității fosfatazel alcaline și a fosfodiesterazei din veninul de șarpe, pentru enantiomerii (+) și (-) ai compusului FTC;33

- fig. 4, un grafic indicând evoluția hidrolizei catalizate de lipază, a esterului 5'-butiriI al compusului FTC în timp, utilizându-se enzimele Amano PS-800® (pătrat deschis) și PLE 35 (cerc deschis punctat);

- fig. 5, un grafic al efectului concentrației (μΜ) a compușilor racemici și enantio- 37 merilor îmbogățiți ai FTC (preparați prin metoda din exemplul 4) față de procentul de inhibare al celulelor PBM umane infectate cu HIV-1 (cerc închis, (±)-FTC), (cerc deschis, (-)-FTC), 39 (suprafață închisă, (+)-FTC);

- fig. 6, un grafic al concentrației de compus FTC (μΜ) îmbogățit racemic și enantio- 41 meric (preparat prin procedeul din exemplul 3) asupra procentului de inhibare a celulelor

PBM umane infectate cu ΗIV-1 (cercînchis, (±)-FTC), (cerc deschis, (-)-FTC), (pătrat închis, 43 (+)-FTC);

- fig. 7, un grafic al absorbției compusului (+)-FTC saturat cu tritiu, în celulele PBM 45 umane (media a două determinări) în timp (ore) față de celulele pmol/10⁶;

- fig. 8, un grafic al ieșirii compusului (±)-FTC radiomarcat din celulele PBM umane, 47 măsurată în ore față de celulele pmol/10⁶;

RO 122814 Β1

- fig. 9, prezența compusului [³H](±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestuia în celulele HepG-2 umane (media a două determnări), incubate într-un mediu care conține 10 μΜ [³H](±)-FTC, măsurat în celulele pmol/10⁶ în timp;

- fig. 10, ieșirea compusului [³H](±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestuia în celulele HepG-2 umane în pmol/10⁶ celule față de celule depășite ca timp după impulsionarea celulelor cu 10 μΜ [³H](±)-FTC (700 DPM/pmol) pentru 24 h și evaluarea concentrației compusului la 24 h după eliminare;

-fig. 11, descreșterea în concentrația combinată a [³H](±)-FTC și în derivații fosforilați ai acestuia din celulele HepG-2 umane după incubare cu 10 μΜ [³H](±)-FTC (700 DPM/pmol) timp de 24 h, în pmol/10⁶ celule depășite ca timp;

- fig. 12, un grafic al efectului enantiomerilor FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocitmacrofage, așa cum s-au măsurat, în procente de supraviețuire față de concentrația în μΜ (-)-FTC, cerc deschis; (+)-FTC cerc închis; AZT, pătrat închis.

Exemplul 1. Prepararea compusului (±)-beta-D_JL-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1il)-1,3-oxatiolan

Procedeul pentru prepararea amestecului racemic al compusului FTC este ilustrat în fig. 2 și este descris în detaliu mai jos.

Protecția 2-buten-1,4-diolului într-un flacon de 2 I, cu 3 gâturi, uscat, în atmosferă inertă, 100 g (93,5 ml = 1,135 moli = 1,00 echivalenți) 2-buten-1,4-diol și 15 g (aproximativ 0,1 echivalenți) de DMAP (4-dimetilaminopiridiă) se dizolvă în 800 ml de piridină uscată și se menține sub agitare, în timp ce amestecul de reacție se răcește până la 0°C. Apoi se adaugă încet, pentru prevenirea supraîncălzirii, clorură de butiril (260 ml = 2,2 echivalenți) și amestecul se mai lasă sub agitare timp de o oră. Reacția este terminată prin adăugarea în ulei de cantități mici de apă cu gheață. Lichidul este apoi decantat din sare și evaporat sub vid. Sarea care rămâne este dizolvată în apă și soluția apoasă este extrasă de două ori cu eter etilic. Celelalte straturi combinate sunt spălate o dată cu o soluție saturată de CuSO₄, de două ori cu o soluție saturată de NaHCO₃ conținând Norit® și apoi se filtrează sub vid printr-un filtru de celită®.

Amestecul de reacție concentrat este dizolvat în eter și spălat, urmând același procedeu ca mai sus pentru soluția de sare. Straturile organice combinate sunt concentrate pe evaporatorul rotativ și apoi sunt aduse sub vid. Pentru ca această reacție să decurgă cantitativ, este necesar mediul închis. Vidul poate fi crescut atât cât este necesar. Produsul, 1,4-dibutiril-2-buten-1,4-diol, este incolor până la ușor galben, sub forma unui lichid clar.

Ozonoliza diolului protejat

Compusul 1,4-dibutiril-2-buten-1,4-diol (1,365 moli) este dizolvat în 41 de clorură de metilen (CH₂CI₂) uscată, într-un flacon uscat prevăzut cu 3 gâturi, de 51 capacitate, echipat cu un tub larg de uscare și un tub deschis pentru introducerea gazului. Tubul este un tub de barbotare a gazului, nefritat, care se va obtura prin expunere la soluția concentrată. Soluția este apoi agitată și răcită până la temperatura de -70°C, în timp ce gazul inert este barbotat prin soluție. Orificiul de intrare a gazului este sigilat, în timp ce soluția este răcită suficient și flaconul și aparatul de agitare sunt transferate la generatorul de ozon. Oxigenul este barbotat prin soluția menținută sub agitare, timp de cel puțin 20 min, în timp ce se menține pe o baie de gheață. Un aparat Cryocool este ideal pentru menținerea unei temperaturi scăzute pentru o reacție de durată îndelungată. Ozonul este apoi introdus la 0,56 kg/cm²0,60 kg/cm² (8 până la 8,5 psi). După completare, fluxul de ozon este oprit și oxigenul este barbotat prin soluție, timp de aproximativ o jumătate de oră, înainte de adăugarea a 3 echivalenți de Me₂S. Flaconul este apoi îndepărtat de pe baia de gheață și transportat într-o nișă, unde se menține sub agitare timp de aproximativ 2 zile, pentru a obține o reducere completă. Soluția este apoi evaporată și adusă sub vid pentru mai multe ore.

RO 122814 Β1

Această reacție produce, în mod obișnuit, aproximativ 95% de aldehidă protejată (2- 1 butiriloxiacetaldehidă), un lichid clar, incolor până la galben.

Ciclizarea aldehidei cu acid mercaptoacetic 3

Aldehidă (1,0 echivalenți) este dizolvată în toluen pentru a se obține o soluție de 0,80 până la 0,85 M, care se aduce într-un flacon prevăzut cu un dispozitiv separator de tip Dean 5 Stark. Se adaugă acidul tioglicolic (1,1 echivalenți) și amestecul este încălzit la temperatura de reflux. Apa este îndepărtată azeotropic cu ajutorul separatorului. Recția este completă în 7 3 h și amestecul este menținut la rece la temperatura camerei. Soluția organică este spălată de două ori cu volume egale de soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ și 9 apoi este spălată o dată cu apă, uscată pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit, după care se filtrează sub vid prin celită, înainte de a fi evaporată sub vid. Prima soluție apoasă de bicar- 11 bonat de sodiu NaHCO₃ este extrasă o dată cu eter; eterul este spălat o dată cu apă, uscat pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit®, filtrat prin celită® sub vid și evaporat la un loc cu alte 13 materiale organice, din soluția de toluen. Materialul combinat este plasat sub vid până a doua zi. 15 în mod uzual, prin reacție se obține un randament de 90% din compusul 2-(butiriloxi)metil-5-oxo-1,3-oxatiolan. 17

Reducerea lactonei și conversia în acetat

Compusul 2-butiriloxi-metil-5-oxo-1,3-oxatiolan (1,00 echivalent) se dizolvă în tetra- 19 hidrofuran (THF) uscat, pentru a se obține o soluție 0,23 M care se aduce într-un flacon uscat prevăzut cu 3 gâturi și echipat cu un agitator mecanic și se menține în atmosferă 21 inertă. Soluția este agitată și răcită până la temperatura de 0°C, după ce s-a adăugat, prin canulă, un echivalent de 1,0 M Li (t-BuO)₃AIH în tetrahidrofuran (THF). Reducerea este 23 completă în aproximativ trei ore, așa cum este observat prin cromatografie în strat subțire TLC, utilizându-se ca sistem de solvenți, 2 părți eter și 1 parte hexan și anisaldehidă drept 25 colorant.

Aproximativ 10 echivalenți de Ac₂O proaspăt distilat se adaugă apoi și se ține sub 27 agitare timp de 2 zile, pentru a se obține produsul acetilat. Reacția este finalizată prin adăugarea soluției saturate de bicarbonat de sodiu NaHCO₃, care se menține sub agitare până 29 a doua zi. Soluția este apoi evaporată și supusă agitării cu mai multă soluție de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ până a doua zi. Această soluție este apoi extrasă cu eterul care este apoi 31 spălat (cu atenție) de două ori cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ și o dată cu apă, apoi este uscată pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit®, după care se filtrează prin 33 celită® sub vid și se evaporă. Produsul este un lichid clar, de culoare galben închis. Analiza gaz-cromatografică (Temperatura inițială-80°C; Timp inițial = 5 min; Gradul de progresie- 35 10/min; Temperatura finală = 240’C) indică o puritate tipică de aproximativ 70%.

Sililarea compusului 5-fluorocitozină 37

5-fluorocitozina (1,05 echivalenți pe baza cantității de lactol acetilat obținut în faza precedentă, utilizându-se metoda gaz-cromatografică pentru indicarea purității) este sililată 39 prin refluxare în cel puțin 10 echivalenți de hexametildisilazan conținând o cantitate catalitică de sulfat de amoniu pur (0,05 până la 0,10 echivalenți) timp de două ore, după care soluția 41 devine clară. Flaconul este apoi sigilat strâns și solventul este îndepărtat, utilizându-se o pompă de vacuum cu un separator auxiliar. Produsul, în formă solidă de culoare albă, este 43 lăsat sub vid până a doua zi, până ce este gata de utilizare în următoarea fază de reacție de cuplare. 45

Cuplarea compusului 5-fluorocitozină sililată, cu lactol acetilat

Compusul 5-fluorocitozină sililată (33,86 g, 0,124 moli), în diclormetan uscat (350 ml), 47 formează o soluție la care se adaugă o soluție de tetraclorură de staniu SnCI₄ (135,6 ml o

RO 122814 Β1 soluție 1 molară în clorură de metilen CH₂CI2) în atmosferă de azot. Soluția este agitată timp de 15 min la temperatura camerei. Această soluție este adăugată la soluția de lactol acetat printr-un tub subțire (38 g, 0,113 moli) în diclormetan (400 ml) sub atmosferă de azot, timp de peste 30 min.

Soluția de reacție este agitată timp de 2 h, punct în care reacția este completă, așa cum s-a indicat prin analiza cromatografică în strat subțire. Soluția de reacție este apoi diluată cu diclormetan (500 ml) și reacția este oprită la adăugarea soluției de hidroxid de amoniu. Soluția de hidroxid de amoniu (100 de ml) se adaugă lent, menținând temperatura de reacție sub 30’C, având ca rezultat formarea unui precipitat alb. Amestecul este apoi ținut sub agitare pentru încă 30 min și apoi se trece printr-o coloană sub formă de dop de silica gel (7 inchi 17,78 cm diametru și 2 inchi 5,08 înălțime). Coloana este eluată secvențial cu diclormetan (2 I), acetat de etil (2 I) și amestec format din 9 părți acetat de etil și 1 parte etanol (4 I). Eluentul acetat de etil și amestecul de acetat de etil și etanol conțin produsul dorit. Aceste soluții sunt combinate și evaporate la presiune redusă. Produsul solid lipicios rezidual este apoi spălat cu eter uscat (20 ml), pentru a se obține un produs solid alb (25,35 g; 71%), de FTC-5'-butirat.

Produsul FTC-5'-butirat (8,74 g; 0,026 moli) este dizolvat în 250 ml de metanol. Metoxidul de sodiu (2,85 g; 0,052 g) se adaugă la temperatura camerei. Amestecul de reacție este menținut sub agitare timp de 1 h, punct în care reacția este completă, așa cum s-a confirmat prin analiza cromatografică în strat subțire TLC. Soluția de clorură de amoniu NH₄CI (10 ml) se adaugă pentru oprirea reacției și apoi solventul este îndepărtat sub presiune redusă. Reziduul este apoi absorbit pe gel de silice (5 g) și trecut pe o coloană îngustă, utilizându-se ca eluant un amestec format din 9 părți acetat de etil și 1 parte etanol. Fracțiunile care conțin produsul sunt combinate și evaporate, când se obține un produs solid lipicios care este spălat cu eter uscat, când se formează un produs solid de culoare albă FTC (6 g, 88%).

Analiza de rezonanță magnetică nucleară are următoarele rezultate:

(¹H RMN: (DMSO-dg) 8,18 (1H, d, H_e, J = 8,4 Hz), 7,81 & 7,57 (2H, extins, NH₂), 6,12 (1H, dd, H_1f J = 5,7 &4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, J = 5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H₄, J = 3-6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H₅), 3,41 (1H, dd, 1H₂, J = 5,7 & 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H₂, J = 4,2 % 11,7 Hz);

¹³C RMN: (DMSO-d_B) 157,85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28,136,12 (d, J = 241 Hz), 126,01 (d, J = 32,6 Hz), 86, 90, 86, 84, 62, 48, 37, 07; punct de topire 195-196°C.

II. Rezoluția enantiomerilor nucleozidei

O metodă este prezentată în prezenta invenție, pentru rezoluția amestecurilor racemice a enantiomerilor nucleozidei, incluzând fără a se limita la aceasta, enantiomerii FTC (+) și (-). Metoda poate fi utilizată așadar, pentru separarea amestecurilor racemice de carbohidrați sau porțiunii cu structură asemănătoare carbohidraților, cum arfi, de exemplu, derivații de 1,3-oxatiolan și 1,3-dioxolan. Metoda constă în utilizarea unei enzime care catalizează preferențial o reacție a unui enantiomer într-un amestec racemic. Enantiomerul reacționat este separat de enantiomerul nereacționat pe baza unei noi diferențe în structura fizică. Prin descrierea dată și din literatura de specialitate apare posibilitatea de a se alege o enzimă care este selectivă pentru enantiomerul nucleozidei la alegere (sau selectivă pentru enantiomerul nedorit, ca o metodă de eliminare a acestuia), prin selectarea uneia din enzimele care se vor discuta mai jos sau prin evaluarea sistematică a altor enzime cunoscute. Din literatura de specialitate, se cunoaște așadar modul în care se modifică substratul atât cât este necesar, pentru a se ajunge la rezoluția dorită. Prin utilizarea agențilorde deplasare prin rezonanță magnetică nucleară chirală, prin polarimetrie sau cromatografie lichidă

RO 122814 Β1 de înaltă performanță chirală, se poate determina înnobilarea optică a esterului separat 1 Următoarele exemple ilustrează, în continuare, utilizarea enzimelor pentru separarea amestecurilor racemice a enantiomerilor. Alte metode cunoscute de rezoluție a amestecurilor 3 racemice se pot utiliza în combinație cu metoda de rezoluție descrisă în prezenta invenție.

Toate aceste modificări sunt considerate ca făcând parte din scopul acestei invenții. 5

Rezoluția bazată pe hidroliza esterilor nucleozidei C5'

Metoda include reacția gruparerii C5'-hidroxil a amestecului racemaților nucleozidei 7 cu un compus acil, pentru a forma esterii C5' în care nucleozida este la capătul carbinol al esterului. Amestecul racemic al esterilor 05' de nucleozidă este apoi tratat cu enzima care 9 taie sau hidrolizează preferențial la unul din enantiomeri și nu în celălalt, într-o perioadă de timp dată. 11

Un avantaj al acestei metode este acela că metoda poate fi utilizată pentru separarea unei varietăți largi de nucleozide, incluzând pirimidin nucleozida și purin nucleozida, care 13 sunt, în mod opțional, substituite în partea de carbohidrat sau în partea de bază. Metoda poate fi, așadar, utilizată pentru separarea derivaților nucleozidici care conțin heteroatomi 15 adiționali în partea de carbohidrat, de exemplu FTC și BCH-189. Aplicabilitatea largă a acestor metode rezidă parțial în faptul că, deși porțiunea de carbinol a esterului joacă un rol 17 în abilitatea unei enzime de diferențiere a enantiomerilor, porțiunea de recunoaștere majoră pentru aceste enzime este porțiunea acidului carboxilic al esterului. Mai mult decât atât, se 19 poate extrapola cu succes rezultatul obținut de la o enzimă față de studiul pe substratul altei enzime în sistem aparent diferit, asigurând că porțiunile acidului carboxilic ale celor două 21 substraturi sunt aceleași sau substanțial similare.

Un alt avantaj al acestei metode este acela că metoda aceasta este regioselectivă. 23 Enzimele care în mod tipic hidrolizează esterii, nu catalizează reacțiile străine în alte porțiuni ale moleculei. De exemplu, enzima lipază catalizează hidroliza esterului de 2-hidroximetil-5- 25 oxo-1,3-oxatiolan fără să hidrolizeze lactona internă. Aceasta contrastează marcant cu metodele chimice de hidroliză a esterului. 27 încă un avantaj al acestei metode este acela că separarea enantiomerului nehidrolizat și a enantiomerului hidrolizat din amestecul de reacție este foarte simplă. Enantiomerul 29 nehidrolizat este mai lipofilic decât enantiomerul hidrolizat și poate fi recuperat eficient prin simpla extracție cu unul dintr-o largă varietate de solvenți organici nepolari sau din ames- 31 tecuri de solvenți, incluzând hexanul și amestecul de hexan și ester. Enantiomerul hidrolizat, mai polar, cel mai puțin lipofilic, poate fi obținut apoi prin extracție cu solvenți organici mult 33 mai polari, de exemplu, acetatul de etil, sau prin liofilizare, după care urmează extracția cu etanol sau metanol. Alcoolul trebuie să fie evitat în timpul hidrolizei, deoarece acesta poate 35 denatura enzimele în anumite condiții.

Enzimele și substraturile 37

Cu o combinare potrivită a enzimei și substratului, condițiile pot fi stabilite pentru izolarea oricărui enantiomer de nucleozidă. Enantiomerul dorit poate fi izolat prin tratamentul 39 amestecului racemic cu o enzimă care hidrolizează enantiomerul dorit (după care urmează extracția hidrolizatului polar cu solvent polar) sau prin tratamentul cu o enzimă care 41 hidrolizează enantiomerul nedorit (după care urmează îndepărtarea enantiomerului nedorit cu un solvent nepolar). 43

Enzimele care catalizează hidroliza esterilor, includ esterazele, de exemplu esteraza din ficat de porc, lipazele incluzând lipaza pancreatică de porcine și Amano PS-Boo, lipaza, 45 substillisin șl alfa-chimotripsina.

RO 122814 Β1

Fig. 3 reprezintă diagrama fluxului specificității fosfatazei alcaline și fosfodiesterazei din veninul de șarpe, pentru enantiomerii (+) și (-) ai compusului FTC. Așa cum este indicat, fosfataza alcalnă hidrolizează trifosfatul ambilor enantiomeri la compusul FTC și de aceea nu este eficientă ca un mijloc de separare. Fosfodiesteraza I hidrolizează preferențial izomerul (+) al compusului FTC în monoesterul acestuia, care apoi poate fi expus la 5'nucleotidază pentru a obține compusul (+)-FTC.

Gruparea acil cea mai eficientă pentru esterificareaîn poziția C5' a nucleozidei poate fi determinată fără o experimentare nepotrivită, prin evaluarea unui număr de omologi, utilizându-se un sistem de enzime selectate. De exemplu, când 1,3-oxatiolan nucleozidele sunt esterificate cu acidul butiric, rezoluțiile atât cu esteraza din ficat de porc, cât și cu esteraza Amano PS-800, se procedează cu o enantioselelctivitate superioară (94-100% exces enantiomeric) și selectivitate opusă. Esteraza în ficatul de porc hidrolizează preferențial enantiomerul (+) al compusului FTC și enzima Amano-800C hidrolizează preferențial enantiomerul (-) al compusului FTC. Procentul de exces enantiomeric raportat în tabelul 1 este cantitatea de ester butirat purificată, care rămâne în amestecul tratat enzimatic (de exemplu, esterul butiric al enantiomerului (-) al compusului FTC în cazul esterazei din ficatul de porc și esterul butiric al enantiomerului (+) al compusului FTC în cazul Amano PS-800).

Exemplele nelimitate de grupări acil care pot fi evaluate pentru utilizare cu un amestec enantiomeric de nucleozide și în special enzime, include acizii alchil carboxilici și acizii carboxilici alchilați substituiți, incluzând acidul acetic, acidul propionic, acidul butiric și acidul pentanoic. împreună cu anumite enzime, se preferă să se utilizeze un compus acil care este lipsit, în mod semnificativ, de electroni liberi, pentru a facilita hidroliză prin slăbirea legăturii esterice. Exemplele de grupări acil lipsite semnificativ de electroni liberi includ alfahaloesterii, cum ar fi acidul 2-cloropropionic, acidul 2-clorobutiric și acidul 2-cloropentanoic. Alfa-haloesterii sunt substraturi excelente pentru lipaze.

Condițiile de rezoluție

Hidrolizele enzimatice sunt efectuate, în mod obișnuit, cu o cantitate catalitică de enzimă într-o soluție apoasă de tampon care are pH-ul optim apropiat de enzima discutată. Așa cum se desfășoară reacția, valorile pH rezultă din eliberarea acidului carboxilic. Baza apoasă se va adăuga pentru menținerea valorii de pH aproape de valoarea optimă pentru enzimă. Procesul reacției poate fi ușor determinat prin monitorizarea schimbării de pH și prin cantitatea de bază necesară pentru menținerea pH-ului. Esterul hidrofobic (enantiomerul nehidrolizat) și alcoolul mult mai polar (enantiomerul hidrolizat poate fi secvențial și selectiv extras din soluție printr-o alegere judicioasă a solvenților organici. în mod alternativ, materialul care trebuie separat, poate fi trecut printr-o coloană care conține enzima imobilizată pe un suport solid. Hidrolizele enzimatice realizate în condiții heterogene pot suferi de o reproductibilitate redusă. De aceea, este de preferat ca hidroliză să se efectueze în condiții omogene. Solvenții alcoolici nu sunt preferați, deoarece aceștia pot denatura enzimele. Omogenitatea poate fi obținută prin utilizarea unor agenți tensioactivi neionici, ca de exemplu Triton X-100. Cu toate acestea, adiția acestor agenți tensioactivi nu ajută numai la dizolvarea materialului inițial, ci ei contribuie, de asemenea, la solubilitarea în apă a produsului. De aceea, reacția enzimatică poate să aibă loc mult mai eficient prin adiția unui agent tensioactiv neionic decât în condiții heterogene, izolarea atât a materiei prime, cât și a produsului rezultat putând fi efectuată mult mai dificil. Produsul poate fi izolat prin procedee chimice și cromatografice mult mai convenabil (de exemplu, formarea sării selective). Nucleozidele diacilate pot fi utilizate, dar adesea sunt foarte lipofile și tari, pentru a putea fi dizolvate în mediul utilizat.

RO 122814 Β1

Exemplul 2. Hidroliză enantioselectivă a compusului FTC, catalizată de lipază 1

Un număr de derivați 5'-O-acil ai compusului FTC sunt preparați prin O-acilare selectivă a sării N-clorhidrat (vezi tabelul 1 și fig. 4) a compusului (±)-FTC. A fost investigată 3 eficiența hidrolizei derivaților prin lipaze. Așa cum se arată în tabelul 1, esteraza din ficatul de porc (PLE) prezintă un nivel superior de selectivitate pentru hidroliză esterului enantio- 5 merului (+) al compusului FTC, prin eliminarea predominantă a butiratului enantiomerului (-) al compusului FTC în amestecul analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. 7 Din contra, enzima PS-800 hidrolizează esterul enantiomerului (-) al compusului FTC preferențial, prin eliminarea predominantă a butiratului compusului enantiomerului (+) al FTC 9 în amestecul analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. Gradul de hidroliză s-a găsit a fi dependent de natura grupării acil; derivatul acetil este semnificativ mai inactiv 11 decât derivatul butiril. S-a descoperit acum că gradul de hidroliză a esterului acidului propionic al compusului FTC este chiar mai rapid decât cel observat pentru derivatul butirat. 13

Procentul de separare și procentul de exces enantiomeric se determină, ambele, utilizânduse cromatografia lichidă de înaltă performanță HPLC. Așadar, enantioselectivitatea este 15 excelentă când se utilizează esteraza din ficatul de porc (PLE) (în mod obișnuit este de 97% ee, sau mai mare), îmbogățirea adițională poate fi însoțită de reacții de hidroliză enzimatice 17 secvențiale, în care butiratul enantiomeric îmbogățit de hidroliză catalizată de enzima din ficatul de porc PLE este supus la o hidroliză enzimatică cu PS-800. 19

Tabelul 1

Compararea efectului esterului asupra hidrolizei enzimatice

Substratul	%Separare	%E.E. (s.m.)
Esteri de FTC cu PLE:
		(-)-FTC (butirat)
Acetat	32,68	N.D.
Propionat	39,87	N.D.
Butirat	48,00	98
Butirat	45,71	98,6
Esteri de FTC cu PS-800:
		(+)-FTC (butirat)
Acetat	73,17	N.D.
Propionat	52,67	N.D.
Butirat	58,34	N.D.
Butirat	41,50	94

Exemplul 3. Procedeu de preparare a (+)- și (-)-FTC prin hidroliză enantioselectivă 37 a butiratului de FTC, catalizată de lipază

5'-O-butiratul compusului (±)-FTC (0,47 mmoli, 149 mg) se dizolvă în 16mldesoluție 39 formată din 4 părți soluție tampon și 1 parte CH₃CN la pH=8. Soluția clară este agitată și tratată cu 26 mg de esteraza din ficatul de porc (PLE-A). Evoluția reacției este monitorizată 41 prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (fig. 4). După 20 h (conversie 52%), amestecul de reacție este extras de două ori cu câte 80 ml de CHCI₃ cloroform și apoi cu 43 ml de acetat de etil. Stratul organic al extractelor este combinat, uscat pe sulfat de magneziu anhidru MgSO₄, apoi este filtrat și concentrat prin evaporare la rotavapor. Reziduul 45

RO 122814 Β1 astfel rezultat este eluat pe discuri 2x1000 m pTLC, utilizându-se acetatul de etil ca eluant (eluție dublă), pentru a se obține după izolare 53 mg (36% pe baza materialului inițial) de butirat FTC, care este determinat prin analiza cromatografică lichidă de înaltă performanță HPLC ca având un exces enantiomeric de 98%. ButiratuI enantiomeric îmbogățit este apoi tratat cu 1,6 ml de metanol și apoi cu 0,38 mmoli (20 mg) de metoxid de sodiu. Amestecul care rezultă este agitat la temperatura camerei și evoluția reacției este monitorizată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță, HPLC. Reacția este completă în 30 min. Solventul este îndepărtat prin evaporare la rotavapor, pentru a se obține un produs brut solid, de culoare albă (76 mg), care este eluat pe 1000 m pTLC, utilizând ca eluant un amestec format din 5 părți de acetat de etil și 1 parte de etanol. Enantiomerul (-) al FTC este izolat ca produs solid de culoare albă (33 mg; 82% randament). Analiza cromatografică de înaltă performanță HPLC a compusului FTC ca derivat 5'-O-acetat arată 97% exces enantiomeric (e.e.): [oc](²⁰,D)-120,5° (c=0,88; în etanol absolut). Emulsiile în fază de prelucrare trebuie să fie evitate prin adăugare de cloroform HCCI₃ la amestecul de reacție pentru completare (care servește așadar pentru denaturarea enzimei), urmând apoi striparea solvenților sub vid și apoi extragerea cu cloroform HCCI₃.

în mod similar, 1,2 mmoli (375 mg) de 5'-0-butirat de (±)-FTC se dizolvă în 40 ml de amestec format din 4 părți soluție tampon pH=8 și 1 parte CH₃CN. Soluția clară este agitată și tratată cu 58 mg de esterază de ficat de porc (PLE-A). Evoluția reacției este monitorizată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. După 9 min (38% conversie), amestecul de reacție este adăugat la 150 ml de cloroform HCCI₃. Straturile sunt separate și stratul apos este liofilizat pentru îndepărtarea solventului. Reziduul alb de la liofilizare este extras de 3 ori cu câte 10 ml de etanol absolut. Extractele sunt filtrate, combinate și concentrate în vacuum, pentru a se obține 179 mg de ulei brut. Materialul brut este apoi eluat pe o coloană de silica gel de 45 x 30 mm, utilizându-se ca eluant un amestec format din 3 x 75 ml de acetat de etil și 5 părți acetatul de etil cu 1 parte etanol. Produsul (+)-FTC este izolat sub formă de solid alb (109 mg; 37% pe baza butiratului inițial). Analiza cromatografică de înaltă performanță HPLC a compusului (+)-FTC ca derivat 5'-O-acetat arată 97,4% exces enantiomeric; [a]O(20,D)+113,4°(c=2,53; etanol absolut).

O reacție similară este efectuată utilizând 0,12 mmoli (37 mg) de 5'-0-butirat de FTC și 7 mg de PS-800 în 4,0 ml amestec format din 4 părți soluție tampon pH=8 și 1 parte metilcian CH₃CN. Reacția este considerabil mai slabă decât cea cu esterază din ficatul de porc PLE-A și necesită 74 h pentru 59% conversie. Butiratul separat (11,4 mg; 31% din cantitatea inițială) prezintă 94% exces enantiomeric e.e., prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC.

Rezoluția enantiomerilor nucleozidei, cu citidin-dezoxicitidin dezaminaza în mod alternativ, citidin-dezoxicitidin dezaminaza este utilizată pentru separarea amestecurilor racemice de 2-hidroximetil-5-(citozin-1 -il)-1,3-oxatiolan și derivații acestui compus, incluzând 2-hidroximetil-5-(5-fluor-citozin-1-il)-1,3-oxatiolan.

Enzima catalizează dezaminarea jumătății de citozină, la un uracil. S-a descoperit că unul dintre enantiomerii 1,3-oxatiolan nucleozidei este substrat preferat pentru citidindezoxicitidindezaminaza. Enantiomerul care nu este convertit în derivatul de uracil (și de aceea este încă bazic) este extras din soluție cu o soluție acidă. Se va avea grijă să se evite soluțiile puternic acide (pH-ul sub 3,0), care pot desface ciclul oxatiolanic. Citidindezoxicitidinodezaminaza poate fi izolată din ficatul de șobolan sau din ficatul uman, sau poate fi exprimată din secvențe recombinate într-un sistem procariot, cum ar fi, de exemplu, Escherechia Coli.

RO 122814 Β1

Metoda de rezoluție a enantiomerilor citidin nucleozidei, utilizând citidin-dezoxi- 1 citidinodezaminaza, poate fi utilizată ca unică metodă de rezoluție sau poate fi utilizată în combinație cu alte metode de rezoluție, incluzând rezoluția prin hidroliză enzimatică a 3 esterilor 5'-O-nucleozidei, așa cum s-a descris mai sus.

Combinația dintre rezoluția enzimatică și metodele clasice de rezoluție 5

Procedeul descris mai sus pentru separarea amestecurilor racemice ale enantiomerilor nucleozidei poate fi combinat cu alte metode clasice de separare enantiomerică, 7 pentru creșterea purității optice a produsului finit.

Metodele clasice de separare includ o varietate de tehnici fizice și chimice. Adesea 9 tehnica mult mai eficientă și cea mai simplă este recristalizarea, bazată pe principiul că, racemații sunt adesea mult mai solubili decât enantiomerii individuali corespunzători. 11 Recristalizarea poate fi efectuată în orice fază, incluzând compușii acilați sau produsul enantiomeric finit. Dacă rezultatul este cu succes deplin, această cale simplă reprezintă o 13 metodă care merită aleasă.

Atunci când prin recristalizare nu se ajunge la obținerea unui material cu o puritate 15 optică acceptabilă, pot fi evaluate alte metode. Dacă nucleozida este bazică (de exemplu, o citidină), se pot utiliza acizi chirali care formează amestecuri diastereomerice care pot avea 17 proprietăți de solubilitate diferite semnificativ. Exemplele nelimitative de acizi chirali includ acidul malic, acidul mandelic, acidul dibenzoil tartric, acidul 3-bromcamfor-8-sulfonic, acidul 19 10-camforsulfonic și acidul di-para-toluiltartric. în mod asemănător, acilarea grupării hidroxil libere cu un derivat acid chiral are ca rezultat așadar, formarea amestecurilor diastereo- 21 merice ale căror proprietăți fizice pot fi diferite suficient pentru a permite separarea.

Cantități mici de nucleozide îmbogățite enantiomeric pot fi obținute sau purificate prin 23 tratarea amestecului racemic printr-o coloană HPLC care a fost desemnată pentru separări chirale, incluzând coloanele cu legături de ciclodextrină, comercializate de Rainin 25 Corporation.

Exemplul 4. Separarea amestecurilor racemice de nucleozide prin cromatografie 27 lichidă de înaltă performanță HPLC

Rezoluțiile enantiomerilor C4' ai (±)-FTC sunt efectuate utilizând o coloană chirală cu 29 legături de ciclodextrină (ciclolegătura AC-I), obținută de la Rainin Corporation (Woburn, MA). Condițiile sunt următoarele:metanol 0,5% izocratic, în apă; debitul fluidului de 1 ml pe 31 minut, detecție în ultraviolet la 262 nm. Metanol de puritate HPLC este obținut de la J.T.Baker (Phillipsburg, N J). Amestecurile racemice sunt injectate și fracțiunile sunt 33 colectate. Fracțiunile conținând fiecare dintre enantiomerii menționați sunt colectate, congelate și apoi liofilizate. Compușii sunt caracterizați prin spectroscopie în ultraviolet și prin 35 timpii lor de retenție, prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. în general enantiomerii (-) au timpi de retenție mai scăzuți decât enantiomerii (+) (vezi J. Liquid 37 Chromatography, 7: 353-376, 1984). Concentrațiile de compuși sunt determinate prin spectroscopie în ultraviolet, utilizând o soluție stoc de concentrație cunoscută (15 μΜ) 39 preparată în apă pentru evaluare biologică. Timpii de retenție pentru enantiomerii separați sunt prezentați în tabelul 2. 41

Tabelul 2

Timpii de retenție ai enantiomerilor compusului FTC

Compusul	Rf (minute)
(-)-FTC	8,3
(+)-FTC	8,7

RO 122814 Β1

Exemplul 5. Metode alternative pentru separarea enantiomerilor FTC utilizând o coloană chirală

Utilizând o coloană Cyclobond l-Ac (cu legătură ciclică) (5 pm, 25 cm x 4,6 ml, Rainin Corporation, Wobum, MA, Catalog no. AST-41049) cu un debit al fluidului de 0,6 ml pe minut de metanol izocratic 0,5% (Fisher Scientific, Inc. HPLC grade catalog nr. A-452-4 în apă) și detecția în ultraviolet la 262 nm, enantiomerii FTC prezintă timpi de retenție de 12,68 min ((-)FTC) și 13,20 min ((+)-FTC).

Utilizând o coloană Chiralpak AS (10 pm, 25 cm x 4,6 mm J.T.Baker Inc., PhilIsburg, NJ, catalogul nr. 7406-00, serial nr. 09-29-10320) cu un debit de fluid de 0,8 ml pe minut de alcool izopropilic (grad pentru cromatografiere lichidă de înaltă performanță HPLC, Fisher Scientific, Inc. cat nr. A-451-4) și detecția în ultraviolet la 262 nm, enantiomerii compusului FTC prezintă timpi de retenție de 5,9 min ((-)-FTC) și 9,8 minute ((+)-FTC).

III. Abilitatea compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)1,3-oxatiolan (FTC) de a inhiba replicarea virusului HIV

Deseori este de dorit efectuarea screening-ului unui număr de amestecuri racemice de nucleozide ca o fază preliminară pentru determinare dacă se justifică în continuare separarea ulterioară în componentele îmbogățite enantiomeric și o evaluare ulterioară a activității antivirale. Capacitatea nucleozidelordea inhiba virusul imunodeficienței uman HIV poate fi măsurată prin tehnici experimentale diverse. Tehnicile utilizate în prezenta invenție și care sunt descrise în detaliu în continuare, măsoară inhibarea replicării virale în fitohemaglutinină (PHA) în celulele mononucleare sanguine periferice umane stimulate (PBM) cu fitohematoglutinină (PHA) infectate cu HIV-1 (tulpina LAV). Cantitatea de virus produsă este determinată prin măsurarea enzimei revers transcriptază pe virusul codificat. Cantitatea de enzimă produsă este proporțională cu cantitatea de virus produs. Tabelul 3 prezintă valorile EC₅₀ (concentrația nucleozidei care inhibă replicarea virusului la 50% din celulele mononucleare sanguine periferice umane stimulate (PBM) estimate cu un factor de eroare de 10%) și valorile IC₅₀ (concentrația nucleozidei care inhibă 50% dezvoltarea celulelor mononucleare sanguine periferice umane mitogen-stimulate (PBM) neinfectate) a unui număr de (±)-1,3-oxatiolan și nucleozide.

Exemplul 6. Activitatea anti-HIVa (±)-1,3-oxatiolan nucleozidelor

A. Celulele PBM fitohemaglutinin stimulate, de 3 zile ca vârstă (10⁶ celule per ml) de la donori sănătoși seronegativi față de HIV-1 și față de virusul B al hepatitei, sunt infectate cu HIV-1 (tulpina LAV) la o concentrație de aproximativ 100 ori doza care infectează 50% cultura tisulară (TICD) per ml și acestea se cultivă în prezența și absența diferitelor concentrații ale compușilor antivirali.

B. La aproximativ o oră după infectare, mediul cu compusul care trebuie testat (de 2 ori concentrația finală în mediu) sau fără compus, se adaugă în flacoane (5 ml, având volumul final de 10 ml). Se utilizează AZT ca un martor pozitiv.

C. Celulele sunt expuse virusului (aproximativ 2 x IO⁵ dpm/ml, așa cum s-a determinat prin analiza revers transcriptazei) și apoi sunt plasate într-un incubator cu CO₂. HIV-1 (tulpina LAV) se obține de la Centrul de Control al Bolilor din Atlanta, Georgia. Metodele utilizate pentru cultivarea celulelor PBM, recoltarea virusului și determinarea activității revers transcriptazei sunt cele descrise de către Mc Dougal și colab., (J. Immun. Meth. 76,171-183,1985) și Spira și colab., (J. Clin. Meth. 25,97-99,1987) exceptând faptul că fungizona nu s-a inclus în mediu (vezi Schinazi și colab., Antimicrob. Agents Chemother. 32,1784-1787 (1988); Id 34: 1061-1067 (1990)).

D. în ziua a 6-a, celulele și supernatantul sunt transferate într-un tub de 15 ml și centrifugate la aproximativ 900 g, timp de 10 min. 5 ml de supernatant sunt îndepărtați și virusul este concentrat prin centrifugare la 40000 rotații pe minut, timp de 30 min (Beckman

RO 122814 Β1

70,1 Ti rotor). Peleta cu virus solubilizat este prelucrată pentru determinarea nivelurilor de 1 revers transcriptază. Rezultatele sunt exprimate în dpm/ml de probă de supernatant. Virusul din volumele mai mici de supernatant (1 ml) poate fi așadar concentrat prin centrifugare 3 înainte de solubilizare și determinarea nivelurilor revers transcriptazei.

Concentrația mediană eficientă (EC₅₀) este determinată prin metoda efectului median 5 (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491-498 (1986)). Pe scurt, procentul de inhibiție al virusului, așa cum a fost determinat din măsurătorile revers transcriptazei, este reprezentat 7 grafic față de concentrația micromolară a compusului. EC₅₀este concentrația compusului la care există o inhibare de 50% a dezvoltării virale. 9

E. Celulele PBM umane neinfectate stimulate mitogen (3,8 x 10⁵ celule per ml) sunt cultivate în prezența și în absența medicamentului în condiții similare cu cele utilizate pentru 11 analiza antivirală descrisă mai sus. Celulele sunt numărate după 6 zile, utilizându-se un hemacitometru și metoda de excluziune cu Trypan Blue, așa cum s-a descris de către 13 Schinazi și colab., Antimicrobial Agents and Chemotherapy22 (3), 499 (1982). Valoarea IC 50 este concentrația compusului care inhibă 50% din creșterea normală a celulelor. 15

Tabelul 3 17

EC₅₀ și IC₅₀ la diferiții analogi de 1,3-oxatiolan nucleozide în celulele umane PBM

Cod	X sau Y	R	Citotoxicitate antivirală
EC60, μΜ	Ιθ5ο> MM
DLS-009	X=O	H	>100	>100
DLS-010	X=O	Me	64,4	>100
DLS-027	X=O	F	>100	>100
DLS-028	X=O	CI	60,8	>100
DLS-044	X=O	Br	>100	>100
DLS-029	X=O	I	>100	>100
DLS-020	y=nh2	H	0,02	>100
DLS-011	y=nh2	Me	>10	>100
DLS-022	y=nh2	F	0,1	>100
DLS-023	y=nh2	CI	38,7	>100
DLS-021	y=nh2	Br	77,4	>100
DLS-026	y=nh2	I	0,72	>100
DLS-058(-)	y=nh2	F	0,008	>100
DLS-059(+)	y=nh2	F	0,84	>100
DLS-053	y=nh2	cf3	60,7	>100

Așa cum s-a indicat în tabelul 3, în general, nucleozidele citozin 1,3-oxatiolan 37 substituite sunt mult mai active decât nucleozidele uracil corespunzătoare. Erorile în măsurătorile EC₆₀ și IC₅₀ sunt estimate la +10%. 39

Unul dintre compușii (±)-FTC (menționat ca compusul 8 DLS 022) prezintă nu numai o activitate excepțională (de aproximativ 10 nM în celule PBM), ci și o toxicitate foarte 41 scăzută (>100 pm în celule PBM, Vero și CEM).

RO 122814 Β1

IC₅₀ ale (+)-FTC sunt peste 100 pM, indicând că compusul nu este toxic în celulele PBM neinfectate, evaluate până la 100 pm.

sau

Exemplul 7. Activitatea antivirală a enantiomerilor compusului FTC, separat prin HPLC

Enantiomerii compusului FTC sunt izolați prin metoda din exemplul 4 și activitatea antivirală este evaluată prin metoda din exemplul 6. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4 și ilustrate în fig. 5.

Tabelul 4

Activitatea antivirală a enantiomerilor (+) și (-) ai FTC

Concentrația de tratament pM	DPM/ml	%lnhibiție (corectată)	EC60: μΜ
FTC (+)	0,0001	73,755	26,6	0,018
	0,005	83,005	16,3
	0,01	60,465	41,3
	0,05	34,120	70,4
	0,1	14,160	92,4
	0,5	18,095	88,1
	1	7,555	99,7
	5	7,940	99,3
	10	5,810	101,7
FTC(-)	0,001	76,275	23,8	0,02
	0,005	58,590	43,3
	0,01	75,350	24,8

RO 122814 Β1

Tabelul 4 (continuare) 1

Concentrația de tratament μΜ	DPM/ml	%lnhibiție (corectată)	ECso- μΜ
	0,05	28,890	76,20
	0,1	13,175	93,5
	0,5	9,485	97,6
FTC(+)	0,001	94,340	3,8	0,28
	0,005	107,430	-10,6
	0,01	99,465	-1,8
	0,05	87,120	11,8
	0,1	86,340	12,7
	0,5	33,225	71,4

Așa cum este indicat în tabelul 4, în acest experiment enantiomerul (-) al compusului 13 FTC pare să fie mai activ cu aproximativ un ordin de mărime decât enantiomerul (+) al compusului FTC și are aproximativ aceeași activitate anti-HIV ca a amestecului racemic. Nici 15 enantiomerii și nici amestecul racemic nu au toxicitate, până la 100 μΜ, așa cum s-a măsurat prin metoda de excluziune Tryptan Blue în celulele umane PBM. 17

Exemplul 8. Activitatea antivirală a enantiomerilor FTC, separați prin metoda din exemplul 3 19

Enantiomerii (±)-FTC sunt așadar separați prin metoda din exemplul 3 și activitatea antivirală este evaluată prin metoda din exemplul 6. Rezultatele sunt ilustrate în fig. 6. Așa 21 cum s-a indicat în fig. 6, EC₅₀ a amestecului racemic al compusului FTC are valoarea de 0,017 μΜ, EC₅₀ a compusului (-)-FTC la 0,0077 μΜ și EC₅₀ a compusului (+)-FTC la 0,84 pM. 23

Exemplul 9. Absorbția (+)-FTC în celulele PBM umane

Au fost efectuate studii utilizând compusul FTC radiomarcat, pe următoarele profiluri 25 intracelulare ale medicamentului de origine și pe metaboliții detectați în celule. Toate studiile au fost conduse în duplicat. Celulele mononucleare sanguine periferice umane (celulele 27 PBM) au fost suspendate în RPML1640, mediul conținând 10% ser de vițel fetal și antibiotice (2 x 10⁶ celule pe ml), 10 ml per timpul fixat și incubate cu adiție de 10 μΜ FTC (activitate 29 specifică de aproximativ 700 dpm/pmol) Celulele sunt expuse apoi medicamentului timp de 2,6,12 și 24 h. La acești timpi fixați, mediul este separat și celulele sunt spălate de două ori 31 cu o soluție de sare, răcită, Hank, echilibrată. Extracția este efectuată cu adiție de 0,2 ml de 60% metanol/apă rece și se menține până a doua zi la temperatura de -70’C. în următoarea 33 dimineață, suspensiile sunt centrifugate și extracțiile sunt repetate de două ori, timp de 0,5 h la temperatura de -70°C. Supernatanții totali (0,6 ml) sunt liofilizați până la sec. Reziduurile 35 sunt resuspendate în 250 pl de apă și părțile alicote cuprinse între 50 și 100 pl sunt analizate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. Analiza cantitativă a medicamentului 37 de origine intracelular și a derivaților metabolici este condusă prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. Deoarece unii dintre acești compuși au o labilitate acidă potențială, 39 sistemul tampon apropiat de pH-ul fiziologic este utilizat pentru separarea metaboliților.

Fig. 7 reprezintă un grafic al prezenței (consum) compușilor (±)-FTC tritiați în celule 41

PBM umane (media a două determinări) în timp (ore) față de pmol/10⁶ celule. Studiile de consum indică faptul că, compusul FTC radiomarcat este deja absorbit în limfocitele umane, 43 care produc cantități foarte mari de derivat 5'-trifosfat al compusului FTC.

RO 122814 Β1

Exemplul 10. Activitatea antiretrovirală a compusului FTC în diferite linii celulare

Activitatea antiretrovirală a compusului FTC este măsurată într-un număr de linii celulare, utilizându-se proceduri asemănătoare, dar nu identice cu cele menționate în exemplul 6. Liniile celulare sunt obținute fie de la donori umani, fie de la AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC sau Red Cross. Celulele deficiente în timid in kinază CEM sunt preparate prin trecerea secvențială a celuleleor CEM în prezența 5-brom-2'-dezoxiuridinei. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5.

Tabelul 5

Activitatea antiretrovirală a FTC, în diferite sisteme celulare

Sistemul celular (tulpina de virus)	EC50 (μΜ (+)-FTC
HIV-1
PBMC (LAV-1)	0,027
MT2 (HTLV1118)	0,89
CEM (LAV-1)	0,08
CEM-TK() (LAV-1)	0,026
CEM (HTLV111B) NTH	0,09
HIV-2
PBMC (ROD2)	0,0038(±)-FTC 0,0007(-)FTC 0,026(+)-FTC
SIV
AA-2(SIV251)	4,6
C-8166 (SIV251)	<8,0
FIV
CrFK (61E)	<1

Exemplul 11. Ieșirea compușilor (±)-FTC din celulele PBM umane

Au fost efectuate studii care au utilizat compusul FTC radiomarcat, pentru a urmări profilurile intracelulare ale medicamentului de origine și metaboliții detectați în celulă după incubare în mediul cu medicament timp de 24 h, după care se îndepărtează medicamentul. Acest studiu măsoară timpul necesar pentru ca nivelurile intracelulare ale trifosfaților să scadă. Studiile sunt realizate în duplicat. Celulele neinfectate (2 x 10⁶ ml) sunt suspendate într-un mediu corespunzător suplimentat cu ser (10 ml per timpul fixat) și incubate la temperatura de 37°C în incubatorul cu 5% CO₂. Concentrația compusului FTC radiomarcat este de 10 μΜ. După pulsația celulelor cu compusul marcat un timp de 24 h, celulele sunt spălate temeinic și apoi sunt umplute cu mediu proaspăt fără medicamente antivirale (0 ore). La 0, 2, 4, 6,12, 24 și 48 h (timpul de incubare secundar), celulele sunt îndepărtate și apoi sunt imediat extrase cu un amestec rece de metanol/apă de 60%. Extractele sunt obținute prin centrifugarea și îndepărtarea peletelor celulare. Extractele sunt liofilizate și apoi sunt păstrate la temperatura de -70°C. înainte de analiză, materialul este resuspendat în 250 pl de amestec tampon pentru HPLC. Analiza cantitativă a medicamentului de origine intracelular și a derivaților metabolici este efectuată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță FPLC, utilizându-se fie un Micrometrics sau un sistem HPLC 1090 model Hewlett-Packard,

RO 122814 Β1 cu o coloană de schimbători anionici de tip Partisil 10 SAX (Whatman Inc.) cu un debit al 1 fluidului de 1 ml per minut, la o presiune de 0,07 kg/cm² (1 kpsi), cu o detecție în ultraviolet la 262 nm. Faza mobilă constă din apa neionozată (A), 2 mM NaH₂PO₄/16 mM NaOAc 3 (pH=6,6) (B), 15 mM NaH₂PO₄/120,2 mM NaOAc (pH=6,6) (C) și 100 mM NaH₂P0₄/800 mM NaOAc (pH=6,6) (D). 5

Metoda de separare: izocratic pentru 5 min cu A, urmat de gradient liniar 15 min până la 100% B, urmat de gradient liniar 20 min până la 100% C, urmat de gradient liniar 10 min 7 până la 100% D, urmat de izocratic 30 min cu 100% D.

Timpii de retenție (minute) în celulele umane

Compusul	Neschimbat	Monofosfat	Difosfat	Trifosfat
(±)-FTC	5,0	39,0	55,0	68,0

Fig. 8 este o reprezentare grafică a ieșirii compușilor (±)-FTC marcat din celulele PBM umane, măsurată în ore, după îndepărtarea medicamentului față de concentrația 15 (pmol/10⁶ celule). Așa cum este indicat în această figură, FTC-trifosfatul are o perioadă de înjumătățire intracelulară de aproximativ 12 h și poate fi ușor detectat intracelular la concen- 17 trațiile de 1-5 μΜ la 48 h după îndepărtarea medicamentului extracelularcare este valoarea de mai sus EC₅₀ pentru acest compus. în continuare, afinitatea (K¹) pentru (±)-FTC trifosfat 19 utilizând HIV RT este de 0,2 pM, care este sub nivelul concentrației la 48 h.

Exemplu 12. Activitatea anti-HIV a derivaților acceptabili farmaceutic a compușilor 21 (±)-FTC

a. Numărul de derivați acceptabili din punct de vedere farmaceutic ai compusului (±)-23

FTC preparați prin derivatizarea pozițiilor 5'și N⁴ se evaluează pentru activitatea anti-HIV în celulele PBM, utilizând un procedeu asemănător cu cel descris în exemplul 6. Rezultatele 25 sunt după cum urmează. Esterul 5'-0-butirat al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC₅₀ de 0,0017. Derivatul N⁴-acetil al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC₅₀ de 0,0028.27

N⁴-esterul 5'-0-butirat al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC₅₀ de 0,0058.

b. Activitatea anti-HIV a esterului 5'-0-butirat al compusului (±)-FTC în sistemul 29 MT4(EC_S0) este de 0,04 μΜ. în aceeași analiză compusul neacilat (±)-FTC prezintă o valoare a IC₅₀ de 0,52 pM. Valoarea IC₅₀ pentru AZT în acest sistem este de 0,09 pM.31

V. Abilitatea compusului FTC de inhibare a replicării HBV

Exemplul 13. Evaluarea activitățiienantiomerilor (+) și (-) aiFTC în culturile celulare33

2.2.15

Abilitatea enantiomerilorcompusului FTC de inhibarea dezvoltării virusuluiîn culturile 35 celulare 2.2.15 (celulele HepG2 transformate cu virionul hepatitei) este descrisă în detaliu mai jos. Au fost descrise un sumar și o descriere a analizei pentru efectele antivirale în acest 37 sistem de cultură și analiza acidului dezoxiribonucleic ADN în virusul hepatitei B (Korba și Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). Evaluările antivirale sunt efectuate pe două pasaje 39 separate de celule. Toate godeurile din toate plăcile sunt însămânțate cu aceeași densitate și în același timp. 41

Parametrii de analiză. Datorită variațiilor inerente în nivelurile de HBV DNA intracelular și extracelular, numai depresiunile mai mari de 3,5 ori (pentru acidul dezoxiribonucleic 43

ADN al virionului HBV) sau de 3,0 ori (pentru intermediarii de replicație ai acidului dezoxiribonucleic ADN la HBV) de la nivelurile medii pentru aceste forme de ADN la HBV, care se for- 45 mează în celulele netratate, sunt considerate a fi semnificativ statistic. (P < 0,05). Nivelurile de acid dezoxiribonucleic ADN integrat la virusul hepatitei B HBV la fiecare preparare de acid 47

RO 122814 Β1 dezoxiribonucleic ADN celular (care rămâne constant, raportat la o pereche celule, în aceste experimente) se utilizează pentru calcularea nivelurilor formelor de acid dezoxiribonucleic ADN intracelular al HBV, asigurându-se astfel că între probele separate au fost comparate cantități egale de acid dezoxiribonucleic ADN celular.

Valorile tipice pentru acidul dezoxiribonucleic ADN al virionului HBV extracelularîn celulele netratate sunt cuprinse între 50 și 150 pg/ml de mediu de cultură (media a aproximativ 76 pg/ml). Intermediarii de replicare ai acidului dezoxiribonucleic ADN la virusul HBV intracelular în celulele netratate sunt cuprinse între 50 și 100 pg/pg de acid dezoxiribonucleic ADN celular (media a aproximativ 74 pg/pg de acid dezoxiribonucleic ADN celular). în general, scăderile în nivelurile de acid dezoxiribonucleic ADN al virusului HBV intracelular, datorită tratamentului cu compuși antivirali, sunt mai puțin pronunțate și se produc mult mai încet decât scăderile în nivelurile de acid dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV (Korba și Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217).

Maniera în care analizele de hibridizare sunt realizate pentru aceste experimente a avut ca rezultat echivalența a aproximativ 1,0 pg de acid dezoxiribonucleic ADN HBV intracelular până la 2-3 copii genomice per celulă și 1,0 pg/ml de acid dezoxiribonucleic ADN la HBV extracelular până la 3 x 10⁵ particule virale per ml.

Analiza toxicității

Analizele de toxicitate sunt realizate pentru a se stabili dacă efectele antivirale observate se datorează unui efect general privind viabilitatea celulară. Metoda utilizată în prezenta invenție a fost măsurarea absorbției colorației roșie naturală, o analiză standard și utilizată pe scară largă pentru viabilitatea celulară într-o varietate de sisteme gazdă pentru virusuri, incluzând HSV și HIV. Analizele de toxicitate sunt efectuate pe plăci de culturi de țesuturi plate la partea inferioară cu 96 de godeuri. Celulele pentru analizele de toxicitate sunt cultivate și tratate cu compușii de testat cu aceeași schemă descrisă mai jos pentru evaluările antivirale. Fiecare compus este testat la 4 concentrații, fiecare în culturi triplicat (godeuri A, B și ”C). Absorbția colorantului roșu natural este utilizată penru determinarea nivelului relativ al toxicității. Absorbanta colorantului internalizat la 510 nm (A_sin) este utilizată pentru analiza cantitativă. Valorile sunt prezentate ca procent al mediei valorilor A_sin în 9 culturi separate ale celulelor netratate menținute pe aceeași placă cu 96 de godeuri, ca și compușii de testat. Absorbția colorantului în cele 9 culturi de control pe placa 5 este cuprinsă între 91,6 până la 110,4% și pe placa 6 de la 96,6 până la 109%. Rezultatele sunt date în tabelul 6.

Tabelul 6

Analiza toxicității compușilor de testare în celulele 2.2.15

Discul	Compus	Conc. (μΜ)	Absorbția colorantului (% din control)
Godeu A	Godeu B	Godeu C
5	DMSO	10,0*	0,7	1,6	0,9
3,3	55,9	68,7	61,7
1,0	91,2	96,4	106,8
0,3	98,7	102,9	93,5

RO 122814 Β1

Tabelul 6 (continuare) 1

Discul	Compus	Conc. (μΜ)	Absorbția colorantului (% din control)
Godeu A	Godeu B	Godeu C
6	(-)-FTC	300	53,0	51,1	51,5
100	64,1	66,6	77,6
30	98,7	94,3	96,4
10	94,3	94,9	92,2
6	(+)-FTC	300	43,4	56,7	58,5
100	77,7	66,3	72,1
30	81,1	88,3	88,1
10	90,9	99,4	90,5

* pentru DMSO, concentrațiile sunt prezentate ca procente de soluție originală stoc.

* pentru DMSO, concentrațiile sunt prezentate ca procente de soluție originală stoc.

Evaluarea toxicității

Așa cum s-a indicat în tabelul 6, nu s-a observat nicio toxicitate semnificativă (mai 17 mare decât scăderea 50% a nivelurilor de absorbție observate în celulele netratate) pentru compușii de testat la concentrațiile utilizate pentru evaluările antivirale. Ambii compuși de 19 testat, (-)-FTC și (+)-FTC, apar a fi toxici la concentrații mai ridicate utilizate pentru testele de toxicitate (330 μΜ). 21

Evaluările antivirale

Control 23 în cadrul variațiilor normale, nivelurile de acid dezoxiribonucleic ADN pentru virionul

HBV și intermediarii de replicație HBV intracelular (HBV RI) rămân constante la celulele 25 netratate peste perioada testată. DMSO la o concentrație de 1% nu afectează nivelurile replicației HBV în culturile celulare 2.2.15. 27

Compușii de testare

Așa cum s-a indicat în tabelul 7, ambii compuși (-)-FTC și (+)-FTC inhibă semnificativ 29 replicația HBV la nivelurile de testare. Așa cum este indicat în tabelul 8, compusul (-)-FTC inhibă încă semnificativ sinteza acidului dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV și sinteza 31 acidului dezoxiribonucleic ADN la HBV intracelular la concentrațiile de 4,1 și 0,25 μΜ.

Tabelul 7

Efectul compușilor de testat asupra producerii HBV în culturile celulare 2.2.15. 35

Godeu	Tratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelular (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO	RI
7A	Celule netratate	59	75	94	2,7	93
7B	Celule netratate	47	64	88	2,5	93
8A	Celule netratate	65	100	71	2,2	97
8B	Celule netratate	77	65	110	2,4	62

RO 122814 Β1

Tabelul 7 (continuare)

Godeu	Tratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelular (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO	Rl
7K	DMSO @ 1,00%	100	50	48	1.9	95
7L	DMSO @1,00%	48	96	54	2,8	98
8K	DMSO @ 1,00%	93	63	68	2,2	86
8L	DMSO @ 1,00%	66	57	59	1,6	97
9U	(-)-FTC @ 10 μΜ	120	36	1	1,1	14
9V	(-)-FTC @ 10 μΜ	89	48	1	1,5	19
10U	(-)-FTC @ 10 μΜ	58	41	0,1	1,9	13
10V	(-)-FTC @ 10 μΜ	110	32	0,1	1,2	16
9W	(+)-FTC@10pM	88	42	0,1	0,8	14
9X	(+)-FTC@ 10 μΜ	58	57	0,2	0,4	19
10W	(+)-FTC@ 10 μΜ	69	55	0,1	0,7	17
10X	(+)-FTC @ 10 μΜ	45	39	0,1	0,4	15

‘Senzitivitatea de separare pentru ADN la virionul HBV este de 0,1 pg/ml.

@ ADN HBV intracelular a fost analizat 24 h, urmând după a 9-a zi de tratament. Nivelurile de ADN HBV integrat în fiecare preparare a ADN celular sunt utilizate pentru calcularea nivelurilor genomelor HBV episomale 3,2 kb (MONO.) și a intermediarilor (Rl) de replicație a acidului dezoxiribonucleic ADN în cazul virusului HBV.

Tabelul 8

Efectul compușilor de testat asupra producerii HBV în culturile celulare 2.2.15.

Godeu	T ratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelu-lar* (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO.	Rl
31A	Celule netratate	64	54	65	2,8	65
31B	Celule netratate	51	54	77	2,0	53
32A	Celule netratate	100	76	56	3,5	81
32B	Celule netratate	53	97	83	3,1	68
35A	(-)-FTC @ 4 μΜ	74	27	>0,1	1,4	1
35B	(-)-FTC@4pM	87	28	>0,1	0,5	1
36A	(-)-FTC @ 4 μΜ	120	20	1	0,9	1
36B-	(-)-FTC @ 4 μΜ	59	16	0,2	0,2	2
35C	(-)-FTC @ 1 μΜ	70	13	>0,1	1,7	2

RO 122814 Β1

Tabelul 8 (continuare) 1

Godeu	Tratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelu-lar* (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO.	Rl
35D	(-)-FTC @ 1 μΜ	62	15	>0,1	1,2	3
36C	(-)-FTC @ 1 μΜ	60	22	1	1,4	2
36D	(-)-FTC @ 1 μΜ	89	28	0,3	1,5	4
35E	(-)-FTC @ 0,25 μΜ	84	15	>0,1	1,5	4
35F	(-)-FTC @ 0,25 μΜ	89	16	4	2,2	4
36E	(-)-FTC @ 0,25 μΜ	66	13	1	1,8	8
36F	(-)-FTC @ 0,25 μΜ	49	19	0,1	0.3	9

‘Senzitivitatea de separare pentru acidul dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV este de 0,1 pg/ml.

‘Senzitivitatea de separare pentru acidul dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV este de 0,1 pg/ml.

@ Analiza ADN HBV intracelular a fost la 24 h, urmând după a 9-a zi de tratament. Nivelurile de ADN HBV integrat în fiecare preparare a ADN celular sunt utilizate pentru calcularea 15 nivelurilor genomelor HBV episomale 3,2 kb (MONO) și a intermediarilor (Rl) de replicație a acidului dezoxiribonucleic ADN în cazul virusului HBV. 17

Exemplul 14. Absorbția (+)-FTC în celulele ficatului uman: activitatea HBV asupra compusului FTC 19

Procedeul din exemplul 9 este repetat cu celulele din ficatul uman (celulele HepG2, disponibile de la ATCC) pentru determinarea absorbției și metabolismului compusului FTC 21 în aceste celule. Așa cum s-a arătat în fig. 9, compusul (±)- FTC este absorbit de către celulele HepG2 în cantități mari. Aceste celule din ficatul uman metabolizează un procentaj 23 mare de (+)- FTC până la (±)-FTC trifosfat.

Aceste date, în conjuncție cu alte date prevăzute în prezenta invenție, arată că (±)- 25

FTC ca și enantiomerii (-) și (+) ai acestui compus, sunt fosforilați în celulele din ficat. Aceste celule pot fi transformate cu virusul hepatitei B. 27

Exemplul 15. Ieșirea compusului FTC din celulele umane HepG2

Fig. 10 ilustrează ieșirea compusului [³H]-(±)-FTC și a derivațilorfosforilați ai acestuia 29 în HepG2 uman în pmol/10⁶ celule în timp, după pulsarea celulelor cu 10 μΜ [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) pentru 24 h și evaluarea concentrației compusului la 24 h după separare. 31 Fig. 11 ilustrează descreșterea în concentrație combinată a [³H]-(±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestui compus, din celulele umane HepG2 după incubare cu 10 μΜ 33 [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) timp de 24 h, în celule pmol/10⁶ în timp.

Așa cum se ilustrează, chiar la 48 h, mai mult decât 1 μΜ din compusul activ (care 35 este semnificativ mai mare decât EC₅₀ pentru compus) este încă prezent în celule.

V. Toxicitatea în celulele precursoare granulocit-macrofage 37

Exemplul 16. Efectul compusului FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocit-macrofage 39

Fig. 12 este o reprezentare grafică a efectului enantiomerilor (+) și (-) ai compusului

FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocite-macrofage, așa cum s-a 41 măsurat în procente de supraviețuire în raport cu concentrația în μΜ de (-)-FTC în cerc deschis; (+)-FTC în cerc închis; AZT pătrat închis. Așa cum s-a indicat, enantiomerul (-) al 43 compusului FTC pare să fie mai puțin toxic, de exemplu acesta are o valoare mai mare pentru IC₅₀, fie decât enantiomerul (+) sau AZT în această linie celulară. 45

RO 122814 Β1

VI. Farmacocinetica compusului FTC

Exemplul 17. Metabolismul compusului FTC la administrarea la șobolani

Compusul (±)-FTC este administrat intravenos în doze de 10, 50 și 100 mg per kilogram la șobolani. Au fost evaluate suprafața sub curba concentrația medicamentului în plasmă în raport cu timpul (AUC), clearance total (CL_Ț), volumul în regim staționar al distribuției (V_ss), timpul mediu de staționare (MRT) și perioada de înjumătățire (t_1/2). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 9.

Tabelul 9

Parametrii farmacocinetici ai FTC după administrarea intravenoasă a 10, 50,100 mg per kilogram la șobolani

Doza	AUC	1— o	Vss	MRT	L/2
mg/kg	mg h/L	L/h/kg	L/kg	h	h
10	9,65	0,988	0,758	0,768	0,757
50	57,11	0,874	0,699	0,800	0,815
100	120,72	0,830	0,663	0,798	0,969

*AUC = suprafața sub curba concentrație medicament în plasmă în raport cu timpul; CL = eliberare totală; Vss = volum în regim staționar a distribuției; MRT = timp mediu de staționare (clearence) și t_V2 = perioadă de înjumătățire.

Exemplul 18. Parametrii farmacocinetici pentru FTC după administrarea orală și intravenoasă a compusului FTC

Parametrii farmacocinetici cu model independent sunt derivați pentru (±)-FTC prin administrarea (intravenoasă (i.v.) și orală (p.o.)) a 33,3 mg/kg la maimuțe Rhesus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 10. Important este că biodisponibilitatea medie a compusului la maimuțe este de 73% (± 6%).

Tabelul 10

Parametrii farmacocinetici cu model independent derivați pentru FTC după administrarea intravenoasă (i.v.) sau orală (p.o.) a 33,3 mg/kg la maimuțele Rhesus*

Maimuța	AUC mg h/L	CLT L/h/kg	v5S L/kg	<: -1	tl/2 h	Ka h1	F %
I.V.
Ruh	19,14	1,74	2,71	1,56	1,28
Rmi	26,31	1,26	1,97	1,56	1,22
RJd	22,51	1,48	2,00	1,36	1,47
Media	22,65	1,49	2,23	1,49	1,32
±S.D.	3,59	0,24	0,42	0,12	0,13
P.O.
Ruh	13,21			2,07	1,58	0,48	71
Rmi	21,11			2,32	1,08	0,43	80
Rjd	15,29			3,23	1,47	0,31	68
Media	16,54			2,54	1,38	0,41	73,00(±6)
S.D.	4,09			0,61	0,26	0,09	6,24

*AUC = suprafața sub curba concentrației de medicament în plasmă în timp; CL = eliberare totală; Vss = volum în regim staționar al distribuției; MRT = timp mediu de staționare și t_1/2 = perioadă de înjumătățire; F = biodisponibilitate; și K_a = constanta de ordin întâi a vitezei de absorbție.

RO 122814 Β1

Tabelul 11 1

Raportul CSF/ser al compusului FTC și metabolitul dezaminat al acestui compus la o oră după tratament_________________________ 3

Maimuța	Calea	FTC	Metabolitul (FTU)
RUh	I.V.	0,076	0,024
RMi	I.V.	0,062	0,032
RJd	I.V.	0,162	0,052
Media		0,100	0,036
±S.D.		0,054	0,014
RUh	P.O.	0,048	0,026
RMi	P.O.	0,039	0,037
RJd	P.O.	0,117	0,055
Media		0,068	0,039
±S.D.		0,043	0,015

Exemplul 19. Raportul CSF/ser al compusului FTC și metaboliții acestuia la maimuțele Rhesus. 17

Capacitatea compușilor (±)-FTC de a traversa bariera hematoencefalică a fost evaluată prin administrarea a 33,3 mg per kilogram din compusul activ la maimuțele Rhesus 19 și prin măsurarea cantității de compus (±)-FTC în fluidul cerebro-spinal (CSF) și în ser sanguin la o oră după administrare. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 11. Datele arată 21 că o cantitate semnificativă din compusul activ trece bariera hematoencefalică la acest mamifer. 23

VII. Prepararea compozițiilor farmaceutice

Oamenii care suferă de boli cauzate de o infecție cu virusul hepatitei B HBV sau cu 25 virusul imunodeficienței HIV pot fi tratați prin administrarea la pacienta unei cantități eficiente din compusul (±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) ai acestui compus, sau dintr-un derivat sau 27 o sare a acestui compus acceptabil din punct de vedere farmaceutic, în prezența unui vehicul sau a unui diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Materialele active pot fi 29 administrate pe orice cale convenabilă, ca de exemplu pe cale orală, parenterală, intravenoasă, intradermală, subcutanată sau topică, sub formă lichidă sau solidă. 31

Compusul activ este inclus într-un vehicul sau un diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic, într-o cantitate suficientă pentru a se elibera către pacient o cantitate 33 eficientă terapeutic din compusul care inhibă replicarea virală in vivo, în special în cazul replicării virusurilor HIV și HBV, fără să cauzeze efecte toxice serioase la pacientul tratat. 35 Prin cantitate inhibitoare se înțelege cantitatea de ingredient activ care este suficientă pentru a exercita un efect de inhibare, așa cum s-a măsurat, de exemplu, prin analiza efec- 37 tuată așa cum s-a menționat mai înainte.

O doză preferată de (-), (+) sau (+)-FTC, pentru toate condițiile menționate mai 39 înainte, se va situa în intervalul de la aproximativ 1 la 50 mg per kilogram, de preferință 1 până la 20 mg per kilogram greutate corporală pe zi, mult mai general 0,1 până la aproxi- 41 mativ 100 mg per kilogram greutate corporală a organismului care primește doza, pe zi.

Intervalul de dozaj efectiv al derivaților acceptabili din punct de vedere farmaceutic poate fi 43 calculat pe baza greutății nucleozidei de origine care trebuie să fie eliberată. Dacă derivatul prezintă el însuși activitate, dozajul efectiv poate fi estimat ca mai sus, utilizând greutatea 45 derivatului sau prin alte mijloace cunoscute în literatura de specialitate.

RO 122814 Β1

Compusul este administrat în mod convențional în unități de orice formă de dozaj convenabilă, incluzând, darfără a se limita la acestea, de la 7 până la 3000 mg, de preferință de la 70 până la 1400 mg de ingredient activ per unitate de formă de dozare unitară. O dozare orală de la 50 la 1000 mg este convenabilă de obicei. în mod ideal, ingredientul activ va fi administrat astfel încât să se obțină vârful de concentrații ale compusului activ în plasmă de la aproximativ 0,2 până la 70 μΜ, preferabil de la aproximativ 1,0 la 10 μΜ. Aceasta poate fi obținută de exemplu, prin injectarea intravenoasă a unei soluții 0,1 până la 5% din compusul activ, opțional în soluție salină, sau se administrează ca un bolus de ingredient activ.

Concentrația de compus activ în compoziția de medicament va depinde de vitezele de absorbție, inactivare și excreția medicamentului, ca și de alți factori cunoscuți în literatura de specialitate. Este de notat că valorile de dozare vor varia și cu gradul de severitate a afecțiunii care trebuie să fie îmblânzită. Trebuie în continuare să se înțeleagă că pentru oricare subiect particular, regimurile de dozaj specifice trebuie ajustate în timp conform nevoilor individuale și a judecății profesionale a persoanei care administrează sau supraveghează administrarea compozițiilor și ca intervalele de dozare stabilite în prezenta invenție să fie date numai ca exemple, fără a se intenționa limitarea la scopul sau la practica compoziției revendicate. Ingredientul activ poate fi administrat deodată sau poate fi divizat într-un număr de doze mai mici care să fie administrate la diferite intervale de timp. Un mod preferat de administrare a compusului activ este calea orală. Compozițiile farmaceutice care pot fi administrate oral vor include în general un diluant inert sau un vehicul comestibil. Aceste compoziții pot fi incluse în capsule gelatinoase sau pot fi comprimate în tablete. Pentru scopul administrării terapeutice pe cale orală, compusul activ poate fi încorporat cu excipienții și utilizat sub formă de tablete, pastile sau capsule. Agenții lianți compatibili farmaceutic și/sau materialele adjuvante pot fi incluse ca o parte a compoziției. Tabletele, pilulele, capsulele, pastilele și alte forme asemănătoare pot conține oricare dintre ingredientele următoare sau compuși având o natură asemănătoare: un agent liant, ca de exemplu celuloza microcristalină, guma tragacant sau gelatina; un excipient cum ar fi de exemplu amidonul sau lactoza, un agent de dezintegrare cum ar fi acidul alginic, primogelul sau amidonul de porumb; un lubrifiant cum ar fi de exemplu stearatul de magneziu sau Steroții; un glidant cum ar fi de exemplu dioxidul de siliciu coloidal; un agent de edulcorare cum arfi de exemplu zaharoza sauzaharinasau un agentaromatizant, cum arfi, de exemplu, menta, salicilatul de metil sau aromele de portocale. Când forma unității de dozare este capsula, aceasta poate conține în plus față de tipul de materiale menționate mai sus, un vehicul lichid cum ar fi de exemplu un ulei gras. în plus, formele unitare de dozare pot conține diferite alte materiale care să modifice forma fizică a unității de dozare, ca de exemplu acoperirile de zahăr, shellacul pentru drajefiere sau alte substanțe cu rol de agenți enterici.

(±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) ai acestuia sau derivații sau sărurile acestuia acceptabili din punct de vedere farmaceutic pot fi administrate ca un component de elixir, suspensie, sirop, pișcot, gumă de mestecat sau alte forme asemănătoare. Un sirop poate conține în plus față de compușii activi, zaharoză sau un agent edulcorant și anumite substanțe cu rol de conservare, coloranți, vopsele și substanțe de aromatizare.

(±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) sau derivații sau sărurile acestui compus acceptabile din punct de vedere farmaceutic pot fi amestecate de asemenea cu alte materiale active care să nu stânjenească activitatea dorită sau cu alte materiale care să suplimenteze acțiunea dorită, cum ar fi antibioticele, substanțele antifungice, antiinflamatoare sau alte substanțe antivirale, incluzând alți compuși de nucleozide anti-HIV.

Soluțiile sau suspensiile utilizate pentru aplicare parenterală, intradermică, subcutanată sau topică pot include următoarele componente: un diluant steril cum ar fi apa pentru injecții, o soluție salină, uleiurile fixe, polietilen glicolii, glicerina, propilenglicolul sau alți solvenți sintetici; agenții antibacterieni cum ar fi, de exemplu, alcoolul benzilic sau metil

RO 122814 Β1 parabenii; anti-oxidanții cum arfi acidul ascorbic sau bisuIfitul de sodiu; agenți de chelare ca, 1 de exemplu, acidul etilendiaminotetraacetic, agenți de tamponare ca acetații, citrații sau fosfații, agenți pentru redarea tonicității ca de exemplu clorură de sodiu sau dextroza. 3 Preparatul original poate fi inclus în fiole, seringi dispozabile sau flacoane cu doze multiple, fabricate din sticlă sau din material plastic. 5

Dacă administrarea este intravenoasă, se preferă vehicule din soluție fiziologică salină sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). într-o realizare preferată, compușii activi 7 sunt preparați cu vehicule care vor proteja compusul față de eliminarea rapidă din organism, cum arfi o formulare cu eliberare controlată, incluzând implanturile și sistemele de eliberare 9 microîncapsulate. Polimerii biocompatibili, biodegradabili pot fi utilizați de asemenea, cum ar fi, de exemplu, etilen vinii acetatul, polianhidridele, acidul poliglicolic, colagenul, poliorto- 11 esterii și acidul polilactic. Metodele pentru prepararea acestor formulări sunt evidente pentru persoanele de specialitate. Materialele pot fi și obținute comercial de la Alza Corporation and 13

Nova Pharmaceuticals, Inc.

Suspensiile lipozomale (incluzând lipozomii țintiți la celulele infectate cu anticorpi 15 monoclonali, până la antigeni virali) sunt de asemeni preferați ca vehicule acceptabile din punct de vedere farmaceutic. Aceste suspensii pot fi preparate conform unor metode 17 cunoscute persoanelor de specialitate, cum sunt de exemplu cele descrise în brevetul US 4522811 (care sunt încorporate în întregime ca referințe, în prezenta invenție). De 19 exemplu, formulările cu lipozomi pot fi preparate prin dizolvarea de lipide corespunzătoare (ca de exemplu stearoil fosfatidil etanolamina, stearoil fosfatidil colina, arachadoil fosfatidil 21 colina, și colesterolul) într-un solvent anorganic care este apoi evaporat și care lasă în urmă un fir subțire de lipidă uscată pe suprafața conteinerului. O soluție apoasă din compusul activ 23 sau derivații lui monofosfat, difosfat și/sau trifosfat sunt apoi introduși în container. Containerul este apoi răsucit manual, pentru a se elibera materialul lipidic de pe părțile 25 laterale ale containerului și pentru a dispersa agregatele lipide, obținându-se astfel o suspensie lipozomală. 27

Derivații monofosfați, difosfați și trifosfați ai compusului FTC pot fi preparați, așa cum se va descrie mai jos. 29

Monofosfatul poate fi preparat conform procedeului dat de Imai și colaboratorii, din

J. Org. Chem. 34 (6), 1547-1550 (June 1969). De exemplu, aproximativ 100 mg din 31 compusul FTC și aproximativ 280 pl de clorură de fosforil reacționează sub agitare în aproximativ 8 ml de acetat de etil uscat la aproximativ O’C, timp de aproximativ patru ore. 33 Reacția este oprită cu gheață. Faza apoasă este purificată pe o coloană de cărbune activ, iar eluarea se efectuează cu 5% hidroxid de amoniu într-un amestec de părți egale de etanol 35 și apă. Prin evaporarea eluantului se obține FTC-5'-monofosfatul de amoniu.

Difosfatul poate fi preparat conform procedeului descris de către Davisson și 37 colaboratorii în J. Org. Chem. 52 (9), 1794-1801 (1987). Difosfatul compusului FTC poate fi preparat din tosilatul corespunzător, care poate fi preparat, de exemplu, prin reacția 39 nucleozidei cu clorură de tosil în piridină la temperatura camerei, timp de aproximativ 24 h, prelucrând apoi produsul într-o manieră obișnuită (de exemplu prin spălare, uscare și 41 cristalizarea produsului).

Trifosfatul poate fi preparat conform procedeului lui Hoard și colaboratorii, din J. Am. 43

Chem. Soc. 87(8), 1785-1788 (1965). Compusul FTC este activat (fiind transformat în imidazolidă conform unor metode cunoscute în literatura de specialitate) și tratat cu tributil 45 amoniu pirofosfat în dimetilformamidă DMF. Reacția duce în primul rând la formarea trifosfatului de nucleozidă, alături de cantități mici de monofosfat și difosfat nereacționate. 47

Purificarea prin cromatografie schimbătoare de anioni pe o coloană DEAE este urmată de izolarea trifosfatului, ca de exemplu sare tetrasodică. 49

Claims (15)

1. Revendicări

   1. Procedeu de separare a derivaților de 1,3-oxatiolan, cu formula chimică generală:

   NHRg caracterizat prin aceea că amestecul racemic de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3oxatiolan este supus unei etape de separare sub acțiunea unei enzime selectate din grupul constând din esterază, lipază, substilisin,a-chimotripsină, citidin-dezoxicitidin dezaminază, care catalizează preferențial o reacție într-unul dintre enantiomeri, urmată de expunerea produsului rezultat la acțiunea unei a doua enzime care intensifică separarea, recristalizarea produsului de separare și tratarea acestuia cu un acid chiral ales dintr-un grup constând din acid malic, acid mandelic, acid 10-camforsulfonic, acid 3-bromocamfor-8-sulfonic, acid dibenzoil tartric și acid di-para-toluoiltartric.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prepararea derivaților de 1,3-oxatiolan, cuprinde etapele de:

   (i) ozonizarea unui compus cu formula CH₂=CH-CH₂-OR sau RO-CH₂-CH=CH-CH₂OR, în care R este o grupare protectoare, obținându-se compusul cu formula:

   în care R_1a este o grupare protectoare a grupării hidroxil;

   (ii) reacția de ciclizare a aldehidei obținute în etapa (i) cu acid mercaptoacetic, când se obține o lactonă cu formula:

   (iii) reducerea lactonei obținute în etapa (ii) și reacția acesteia cu anhidrida acidului carboxilic, obținându-se compusul cu formula:

   în care L este o grupare scindabilă;

   RO 122814 Β1 (iv) sililarea 5-fluorocitosinei opțional cu grupa amino protejată, obținându-se compusul:

   unde R_1b este o grupare amino protectoare, Z= Si(CH₃)₃;

   (v) cuplarea 5-fluorocitosinei sililate cu lactolul protejat, obținându-se compusul cu formula:

   în care R_1a este o grupare hidroxil protectoare, iar R_1b este o grupare amino protectoare, apoi 19 grupele de protecție sunt opțional îndepărtate, obținându-se 2 hidroximetil-5-(5-fluorocitosin1-il)-1,3-oxatiolan. 21
3. 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prepararea derivaților de 1,3-oxatiolan poate fi realizată plecând de la compusul cu formula: 23 în care R_1a, este o grupare hidroxil protectoare, iar R_1beste o grupare amino protectoare, care reacționează cu un agent de fluorurare pentru a introduce atomul de fluor în poziția 5 a ciclului de citosină, urmată de eliminarea grupărilor protectoare.
4. 4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prepararea derivaților de 1,3-oxatiolan poate fi realizată plecând de la compusul cu formula:

   în care R_1a este o grupare hidroxil protectoare, care reacționează cu un agent care transformă gruparea oxo din poziția 4 a nucleului uracil într-o grupare amino, urmată de eliminarea grupărilor protectoare.
5. 5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că anhidrida acidului carboxilic este anhidrida acetică.

   RO 122814 Β1
6. 6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că esteraza este esteraza din ficat de porc.
7. 7. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că lipaza este selectată dintr-un grup care constă din lipaza din pancreasul de porcine și lipaza din Pseudomonas Cepacia.
8. 8. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că amestecul racemic este acilatîn poziția C5'-hidroxil, înaintea etapei de separare, cu un compus selectat dintr-un grup care constă din acizi alchil carboxilici și acizi alchil carboxilici substituiți.
9. 9. Procedeu conform revendicărilor 1 și 8, caracterizat prin aceea că acidul alchil carboxilic este selectat din grupul constând din acid acetic, acid propionic, acid butiric, acid pentanoic, acid 2-clorpropionic, acid 2-clorbutiric și acid 2-clorpentanoic.
10. 10. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că amestecul racemic este trecut printr-o coloană care include enzima imobilizată pe suport.
11. 11. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că amestecul racemic este amestecat cu enzima într-o soluție.
12. 12. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că reacția enzimatică are loc în prezența unui agent tensioactiv neionic, care este 4-(C₈H₁₇)C₆H₄(OCH₂CH₂)_nOH, cu n~10.
13. 13. Procedeu conform revendicărilor 1-12, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde suplimentar, etapa de separare a amestecului enantiomeric, îmbunătățită printr-o coloană chirală.
14. 14. Procedeu conform revendicării 13, caracterizat prin aceea că, coloana chirală este o coloană Cyclobond l-Ac.
15. 15. Procedeu conform revendicării 13, caracterizat prin aceea că, coloana chirală este o coloană Chiralpak AS.