EA004767B1

EA004767B1 - Аналоги нуклеозида (варианты) и их применение, комбинация и способ лечения вирусных инфекций, фармацевтическая композиция

Info

Publication number: EA004767B1
Application number: EA200100711A
Authority: EA
Inventors: Нгхе Нгуйен-Ба
Original assignee: Шайре Байокем Инк.
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2004-08-26
Also published as: ID30477A; CN1334814A; CA2355712C; UY25878A1; DE69912842D1; US6358963B1; AP2001002207A0; IL143867A0; CZ20012352A3; CN1117751C; EA200100711A1; US20040058893A1; HUP0104827A3; KR20020013485A; AU1765700A; DK1140937T3; DE69912842T2; NO20013163L; NO20013163D0; ES2209532T3

Abstract

В настоящем изобретении разработан нуклеозидный аналог формулы I или Ia, который используют в качестве противовирусного агента.

Description

Настоящее изобретение относится к новым аналогам пуриновых нуклеозидов, используемых в качестве противовирусных агентов. В частности, изобретение относится к пуриновым нуклеозидам с улучшенными фармакокинетическими свойствами.

Уровень техники

Каждый год в США происходит более 12 миллионов новых случаев венерических заболеваний (ВЗ). Из десяти зарегистрированных заболеваний в США пять относятся к ВЗ, включая хламидию, гонорею, сифилис, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и инфекцию вирусом гепатита В (ВГВ), из которых инфекции СПИД и ВГВ не поддаются лечению.

В случае СПИД Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предсказывает, что в 2000г. во всем мире число людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), то есть вирусом, который вызывает СПИД, достигнет 40 млн человек. Инфицирование гепатитом поражает в 5 раз больше людей, чем вирусом ВИЧ. По опубликованным ВОЗ данным, 2 млрд человек, живущих в настоящее время, инфицированы ВГВ, причем из них 350 миллионов инфицированы хронически и, следовательно, входят в группу риска смертности от заболевания печени.

Хотя коэффициент смертности от СПИД снижается благодаря новым терапевтическим средствам, СПИД остается второй главной причиной смертности взрослых в возрасте от 29 до 40 лет. В настоящее время стандартным способом лечения инфицированных ВИЧ людей является сочетание средств против ВИЧ. В настоящее время существует 11 лекарственных средств против ВИЧ, доступных по назначению врача. Указанные средства против ВИЧ разделяются на три категории: аналоги нуклеозидов, которые включают зидовудин, диданозин, зальцитабин, ставудин или ламивудин; ингибиторы протеаз, которые включают индинавир, нелфинавир, саквинавир и ритонавир; и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ), которые включают невирапин, делавирдин и эфавиранц. По сравнению с ВИЧ, в настоящее время существует лишь несколько лицензионных лекарственных средств для случаев хронического ВГВ, к которым относятся интерферон и ламивудин. Другие лекарственные средства в настоящее время находятся на стадии клинических испытаний, включая фамцикловир, лобукавир и адефовир. Однако многие исследования показали, что у большинства пациентов наблюдается рецидив после завершения лечения и развивается устойчивость к лекарственным средствам.

Основной проблемой при лечении инфекций ВИЧ и ВГВ оказалось развитие устойчивости (резистентности). Обычно устойчивость развивается, если используемые лекарственные средства не достаточно эффективны для полного прекращения размножения вируса. Если вирус может полностью воспроизводиться в присутствии лекарственных средств, то существует возможность возникновения изменений в его структуре, называемых мутациями, до тех пор, пока не будет найден один тип мутации, который может воспроизводиться несмотря на лекарственные средства. Как только мутация произошла, этот тип вируса растет необнаруженным и скоро становится основным штаммом вируса в данном организме. Лекарственное средство становится все менее эффективным по отношению к новому штамму. Существуют также возрастающие проблемы с перекрестной устойчивостью. Перекрестная устойчивость возникает, если мутации, которые приводят к устойчивости к одному лекарственному средству, вызывают также устойчивость к другому лекарственному средству. Некоторые исследования показали, что объединение двух лекарственных средств замедляет развитие устойчивости к одному или обоим лекарственным средствам по сравнению с использованием каждого лекарственного средства в отдельности. Другие исследования позволяют предположить, что объединение трех лекарственных средств даже еще в большей степени усиливает указанный эффект. В результате многие люди полагают, что лучшим способом предотвращения или, по крайней мере, замедления возникновения устойчивости является использование при лечении комбинаций из многих лекарственных средств. Однако при увеличении числа лекарственных средств увеличивается риск взаимодействия лекарственных веществ и токсичности.

Одним из способов увеличения эффективности лекарственного средства является улучшение его фармакокинетических свойств, которые вносят вклад в его терапевтическую активность. Фармакокинетикой называют исследование факторов, которые определяют количество химических агентов в участках проявления их биологического действия в различные периоды времени после введения агента или лекарственного средства в биологическую систему. Фармакокинетика включает исследование абсорбции и распределения лекарственного средства (биотранслокализации), исследование химических изменений, которые могут происходить в структуре лекарственного средства в организме (биотрансформации) и исследование механизмов, по которым лекарственные средства сохраняются в организме и выводятся из него. При лечении хронических заболеваний биодоступность является наиболее важным фактором, так как она определяет степень абсорбции лекарственного средства и его попадания в кровоток или, в другом случае, степень доступности в участке организма, подлежащем лечению. Биодоступность напрямую связана со способностью лекарственного средства растворяться в биологических жидкостях.

Согласно опубликованным данным, (-)-βЭ-2,6-диаминопуриндиоксолан (ДАПД) и (-)-βЭ-1,3-диоксолангуанин (ДГ) являются высокоэффективными по отношению к ВИЧ-1 в различных клеточных системах, обладают минимальной перекрестной устойчивостью с ламивудином и низкой токсичностью. Однако эти соединения обладают низкими фармакокинетическими свойствами, которые следует усилить. Таким образом, существует необходимость в разработке соединений с улучшенной фармакокинетикой для использования при лечении пациентов, инфицированных ВИЧ и ВГВ.

Сущность изобретения

Одним объектом настоящего изобретения являются новые пуриновые цис-нуклеозиды, представленные формулой I

(I) и их фармацевтически приемлемые соли, где η равно 1 или 2,

Кд выбирают из следующих заместителей: Н, СООН, СОИН2, ОН, 8Н, ΝΗ2, ΝΟ2, С^алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, галоген, СОК_а, где К_аозначает С1-6алкил, С2-6алкенил, С2-6алкинил или СООКь, где К_ь означает С_1-6алкил, С_2-6алкенил или С_2-6алкинил;

К₃ означает Н или С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С2-6алкинил;

Х выбирают из Н, монофосфата, дифосфата, трифосфата, карбонила, замещенного следующими группами: С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, С_6-10арил или

--Р—ОВс

I ОВс где каждый Кс независимо выбирают из Н, С_1-6алкила, С2-6алкенила, С2-6алкинила или защитной группы для гидроксильной группы;

причем упомянутый нуклеозид присутствует в форме (-)-энантиомера, (+)-энантиомера и их смесей, включая рацемические смеси.

Соединения по настоящему изобретению пригодны для лечения, прежде всего, в качестве противовирусных средств.

Другим объектом изобретения является способ лечения вирусных инфекций у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем способ включает введение субъекту терапевти чески эффективного количества соединения или композиции по настоящему изобретению.

Другим объектом является фармацевтическая композиция, включающая в себя соединение по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

Одним аспектом настоящего изобретения является разработка способа лечения вирусных инфекций у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем способ включает введение субъекту комбинации, включающей в себя по крайней мере одно соединение формулы I и по крайней мере один дополнительный терапевтический агент, выбранный из аналогов нуклеозидов, ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) или ингибиторов протеаз.

Другим аспектом изобретения является разработка фармацевтической композиции, содержащей по крайней мере одно соединение формулы I, по крайней мере один дополнительный терапевтический агент, выбранный из аналогов нуклеозидов, ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) или ингибиторов протеаз, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Еще одним объектом настоящего изобретения является использование соединения формулы I для производства лекарственного средства для лечения вирусных инфекций.

Перечень фигур чертежей

На фигуре представлены результаты анализа токсичности соединения А (-) по отношению к митохондриальной ДНК.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Согласно одному варианту воплощения изобретения соединения по настоящему изобретению включают те соединения, которые представлены в следующих вариантах воплощения изобретения, либо каждое соединение независимо, либо в их комбинации.

В одном из вариантов воплощения Х означает Н.

-Еояо

В другом варианте X означает «Γζ где каждый Кс независимо выбирают из Н, С_1-6алкила, С2-6алкенила, С2-6алкинила или защитной группы для гидроксильной группы, выбранной из 8-ацилтиоэтилового эфира, ацилоксиметилового эфира или алкилметилкарбоната. В другом ί

--Р—ОВс варианте Х означает овс , где каждый Кс независимо означает защитную группу для гидроксильной группы, выбранную из ацетил-2тиоэтилового эфира, пивалоилоксиметилового эфира или изопропилоксикарбонилоксиметилового эфира.

В другом варианте η равно 1.

В другом варианте К3 означает Н или метил.

В другом варианте К₃ означает Н.

В другом варианте В₄ выбирают из следующих заместителей: Н, СООН, ΟΟΝΗ₂, С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил или СООВ_Ь, где Κ.ι_:, означает С_1-6алкил, С_2-6алкенил или С₂₆алкинил.

В другом варианте В₄ означает Н, СООН или С_1-6алкил.

В другом варианте В₄ означает Н, СООН, метил или этил.

В другом варианте Я₄ означает метил или этил.

В другом варианте В₄ означает СООН.

В другом варианте В₄ означает Н.

В другом варианте В₃ означает Н или метил, а Я₄ означает Н.

В другом варианте В₄ и В₃ означают Н.

В одном варианте соединения по настоящему изобретению представлены формулой 1а

(1а) и их фармацевтически приемлемыми солями, где каждый из X, В₃ и В₄ определены выше.

Специалистами в данной области будет оценено то, что соединения формулы I и 1а содержат по меньшей мере два хиральных центра, отмеченных звездочкой (*) в общей формуле I и 1а. Таким образом, соединения формулы I и 1а существуют в форме двух различных оптических изомеров (т.е. (+)- или (-)-энантиомеры или β-Ь и β-Ό). Все подобные энантиомеры и их смеси, включая рацемические смеси, включены в объем притязаний настоящего изобретения. Отдельный оптический изомер или энантиомер может быть получен методом, хорошо известным в данной области техники, таким как хиральная ВЭЖХ, ферментативное разделение или вспомогательное хиральное вещество, или может быть синтезирован стереоспецифичным способом.

В соответствии с настоящим изобретением разработаны соединения, обладающие улучшенными фармакокинетическими свойствами.

Согласно одному из вариантов воплощения настоящего изобретения разработаны соединения, обладающие улучшенной биодоступностью.

Согласно другому варианту воплощения настоящего изобретения разработан способ лечения субъекта, инфицированного вирусной инфекцией и нуждающегося в таком лечении, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Согласно следующему варианту воплощения настоящего изобретения разработан способ лечения субъекта, инфицированного ретровирусной инфекцией и нуждающегося в таком лечении, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Согласно другому варианту воплощения настоящего изобретения разработан способ лечения субъекта, инфицированного ВИЧ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Согласно еще одному варианту воплощения настоящего изобретения разработан способ лечения субъекта, инфицированного ВГВ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Соединения по настоящему изобретению включают соединение А: цис-2-гидроксиметил-4-(2'амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолан

соединение В: цис-2-гидроксиметил-4-(2'амино-6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан

соединение С: цис-2-гидроксиметил-4-(2'амино-6'-[1-карбоновая кислота-циклопропиламино]пурин-9'-ил)-1,3-диоксолан

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению включают соединение А (-): (-)-(2В,4В)-2-гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин9'-ил)-1,3-диоксолан

соединение В (-): (-)-(2К,4К)-2-гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-циклобутиламинопурин-9'ил)-1,3-диоксолан

соединение С (-): (-)-(2К,4К)-2-гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-[1 -карбоновая кислота-циклопропиламино]пурин-9'-ил)-1,3-диоксолан

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (+)-энантиомера, по меньшей мере 95% которого не содержат соответствующего (-)-энантиомера.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (+)-энантиомера, по меньшей мере 97% которого не содержат соответствующего (-)-энантиомера.

В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (+)-энантиомера, по меньшей мере 99% которого не содержат соответствующего (-)-энантиомера.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (-)-энантиомера, по меньшей мере 95% которого не содержат соответствующего (+)-энантиомера.

Еще в одном варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (-)-энантиомера, по меньшей мере 97% которого не содержат соответствующего (+)-энантиомера.

В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению получают в форме (-)-энантиомера, по меньшей мере 99% которого не содержат соответствующего (+)-энантиомера.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединением по настоящему изобретению является соединение А.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединением по настоящему изобретению является соединение А (-).

Разработаны также фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению. Термин фармацевтически приемлемые соли соединений общей формулы I и 1а означает соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислот включают соляную, бромисто-водородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин2-сульфоновую и бензолсульфоновую кислоты. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, не будучи фармацевтически приемлемыми, могут использоваться в качестве промежуточных соединений при получении соединений по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей.

Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов (например, натрия), щелочно-земельных металлов (например, магния), аммония и соли ΝΚ/ (где В означает С_1-4алкил).

Ссылки на соединения по настоящему изобретению, использованные в данном описании, включают соединения общей формулы I и 1а и их фармацевтически приемлемые соли.

Если специально не отмечено, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют те значения, которые приняты в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном описании, полностью включены в описание в виде ссылок. В случае конфликтной ситуации настоящее описание изобретения, включая определения, будет отрегулировано. Кроме того, все материалы, способы и примеры приведены только для иллюстрации и не ограничивают объем притязаний изобретения.

Термин алкил, использованный в данном описании, означает незамещенный или замещенный (следующими группами: галоген, нитро, ΟΟΝΗ₂, СООН, О-С_1-6алкил, О-С_2-6алкенил, О-С_2-6алкинил, гидроксил, амино или СОО9, где 9 означает С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил), неразветвленный, разветвленный или циклический углеводородный остаток (например, изопропил, этил, фторгексил или циклопропил). Термин алкил также означает алкилы, в которых один или более атомов водорода замещены галогеном, более предпочтительно фтором (например, СЕ₃- или СЕ₃СН₂-).

Термины алкенил и алкинил означают алкил, содержащий по крайней мере одну ненасыщенную группу (например, аллил).

Термин защитная группа для гидроксильной группы хорошо известен в области органической химии. Такие защитные группы описаны в книге Т. Стееие, Рго!есйуе Сгоирк Ιη Огдашс 8уп111С5Й (Защитные группы в органическом синтезе), Ιοίιη ^йеу & 8опк, 1981. Примеры защитных групп для гидроксильных групп включают в себя без ограничения перечисленным ацетил-2-тиоэтиловый эфир, пивалоилоксиметиловый эфир и изопропилоксикарбонилоксиметиловый эфир.

Если присутствует атом серы, то он может быть в различной степени окисления: 8, 8О или 8О₂. Все указанные степени окисления атома серы включены в объем притязаний настоящего изобретения.

Термин галоген, использованный в данном описании, означает фтор, хлор, бром, йод, например фтор.

Следует понимать, что количество соединения по настоящему изобретению, требуемое для лечения, будет изменяться не только в соответствии с определенным выбранным соединением, но также в соответствии со способом введения, природой патологического состояния, подлежащего лечению, возрастом и состоянием пациента, а также, в конечном итоге, будет зависеть от мнения практикующего врача или ветеринара. Однако, в основном, подходящая доза находится в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 750 мг/кг массы тела пациента в сутки, предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 60 мг/кг/сутки и наиболее предпочтительно в диапазоне от 1 до 20 мг/кг/сутки.

Как обычно, необходимую дозу можно вводить в виде однократной дозы или разделенной на несколько доз, которые вводят через соответствующие интервалы, например две, три, четыре или более доз в сутки.

Обычно соединение вводят в форме стандартной дозы, например, содержащей от 10 до 1500 мг, обычно от 20 до 1000 мг, более предпочтительно от 50 до 700 мг активного компонента в стандартной лекарственной форме.

В идеальном случае активный компонент следует вводить таким образом, чтобы максимальная концентрация активного соединения в плазме достигала от приблизительно 1 до приблизительно 75 мкМ, предпочтительно от приблизительно 2 до 50 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 30 мкМ. Такие концентрации могут быть получены, например, с помощью внутривенной инъекции от 0,1 до 5%-ного раствора активного компонента, по выбору в физиологическом растворе, или с помощью перорального приема болюсов, содержащих от приблизительно 1 до приблизительно 500 мг активного компонента. Требуемый уровень в крови можно поддерживать с помощью капельницы - от приблизительно 0,01 до приблизительно 5,0 мг/кг/ч, с помощью дробного вливания, содержащего от приблизительно 0,4 до приблизительно 15 мг/кг активного компонента.

В то время как при использовании в терапии существует возможность вводить соединение по изобретению в виде неочищенного химического соединения, предпочтительным является присутствие активного компонента в составе фармацевтической композиции. В настоящем изобретении разработана фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы I или 1а или их фармацевтически приемлемую соль, наряду с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, и по выбору с другими терапевтическими и/или профилактическими компонентами. Носитель^) должен быть приемлемым, то есть совместимым с другими компонентами композиции и не оказывать отрицательного действия на реципиента.

Фармацевтические композиции включают подходящие для орального, ректального, назального, местного (включая трансбуккальный и подъязычный), чрескожного, вагинального и парентерального (включая внутримышечный, подкожный и внутривенный) способов введения или композиции, подходящие для лечения ингаляционным способом или путем вдувания. В соответствующих случаях композиции традиционно могут быть представлены в виде отдельных стандартных доз и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармакологии. Все способы включают стадию объединения активного компонента с жидкими носителями, или мелкоизмельченными твердыми носителями, или с обоими и затем, при необходимости, обработку продукта для получения требуемой композиции.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде стандартных форм, таких как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество активного компонента, в виде порошка или гранул, в виде раствора, суспензии или эмульсии. Активный компонент может быть также представлен в виде болюса, электуария и пасты. Таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать обычные наполнители, такие как связующие агенты, наполнители, замасливатели, дезинтеграторы и смачивающие агенты. Таблетки могут иметь покрытия, полученные согласно методам, хорошо известным в данной области. Жидкие составы для перорального введения могут быть в форме, например, водной или масляной суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или могут быть представлены в виде сухого продукта, который необходимо растворить в воде или другом растворителе перед использованием. Такие жидкие составы могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульгаторы, неводные растворители (которые могут включать пищевые масла) или консерванты.

Соединения по настоящему изобретению могут быть также получены в формах для парентерального введения (например, путем инъекции, например путем струйного вливания или путем непрерывного вливания) и могут быть представлены в виде унифицированной лекарственной формы в ампулах, предварительно наполненных шприцах, капельницах небольшого объема или контейнерах, содержащих множество доз с добавленным консервантом. Композиции могут быть использованы в виде таких форм, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях, и могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие агенты, стабилизаторы и/или диспергирующие агенты. В другом случае активный компонент может быть в порошкообразной форме, полученной путем выделения стерильного твердого вещества в стерильных условиях или лиофилизацией из раствора для последующего растворения в подходящем растворителе, например в стерильной апирогенной воде перед использованием.

Для местного введения на эпидермис соединения по настоящему изобретению могут быть получены в виде мазей, кремов или лосьонов или пластырей (повязок) для чрескожного введения. Такие пластыри для чрескожного введения могут содержать усилители проницаемости, такие как линалоол, карвакрол, тимол, цитраль, ментол и трет-анетол. Мази и кремы могут, например, быть на жидкой или масляной основе с добавлением подходящих загустителей и/или гелеобразующих агентов. Лосьоны могут содержать водную или масляную основу и, в основном, могут также содержать один или более эмульгаторов, стабилизаторов, диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, загустителей или красителей.

Композиции, подходящие для местного введения в полость рта, включают таблетки, включающие активный компонент на основе ароматизатора, обычно на основе сахарозы, аравийской камеди или трагаканта; пастилки, включающие активный компонент на инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь; и жидкость для полоскания рта, включающую активный компонент в подходящем жидком носителе.

Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, в которых носителем является твердое вещество, наиболее предпочтительно представлены в виде суппозиториев со стандартной дозой. Подходящие носители включают масло какао и другие материалы, хорошо известные в данной области техники, и суппозитории могут быть получены обычным смешиванием активного компонента с размягченным или расплавленным носите лем(ями), с последующим охлаждением и формованием в пресс-форме.

Композиции, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, мыл или спреев, содержащих кроме активного компонента носители, которые хорошо известны в данной области техники.

Для интраназального введения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы в виде жидкого спрея или диспергированного порошка или в форме капель. Капли могут содержать водную или неводную основу, а также один или более диспергирующих агентов, солюбилизаторов или суспендирующих агентов. Жидкие спреи обычно вводят из упаковок под давлением.

Для введения путем ингаляций соединения по настоящему изобретению обычно вводят из порошковдувателя, распылителя или из упаковок под давлением или из других удобных стандартных упаковок для распыления аэрозолей. Упаковки под давлением могут включать подходящий газ-вытеснитель, такой как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой подходящий газ. В случае аэрозольной упаковки под давлением стандартную дозу можно дозировать с помощью специального клапана для введения определенного количества.

В другом случае для введения путем ингаляции или вдувания соединения по настоящему изобретению могут быть в форме сухой порошкообразной композиции, например в порошкообразной смеси соединения и подходящей основы, такой как лактоза или крахмал. Порошокообразная композиция может быть представлена в виде капсул или картриджей или, например, в виде желатиновых или блистерных упаковок, из которых порошок может быть введен с помощью ингаляции или порошковдувания.

При необходимости могут быть использованы описанные выше композиции, приспособленные для пролонгированного выделения активного компонента.

Соединения по настоящему изобретению могут быть также использованы в комбинации с другими противовирусными агентами.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения комбинации по настоящему изобретению включают комбинации, которые представлены следующими вариантами воплощения изобретения, либо независимо, либо в сочетании.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из нуклеозидных аналогов, ННИОТ или ингибиторов протеаз.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения нуклеозидным аналогом является аналог 1,3-оксатиолана.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения аналогом 1,3-оксатиолана является ламивудин, ковирацил или 2-гидроксиметил-4-(цитозин-1'-ил)-1,3-оксатиолан.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения аналогом 1,3-оксатиолана является 2-гидроксиметил-4-(цитозин-1'-ил)-1,3-оксатиолан.

В следующем варианте воплощения настоящего изобретения аналогом 1,3-оксатиолана является 2В-гидроксиметил-4В-(цитозин-1'-ил)1,3-оксатиолан.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения аналогом 1,3-оксатиолана является 28-гидроксиметил-48-(цитозин-1'-ил)-1,3оксатиолан.

Еще в одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из следующего ряда: зидовудин, диданозин, зальцитабин, ставудин, ламивудин, невирапин, делавирдин, эфавиренц, индинавир, нелфинавир, саквинавир или ритонавир.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из ряда: невирапин, эфавиренц, зидовудин, ставудин или ламивудин.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из следующего ряда: эфавиренц, зидовудин, ставудин или ламивудин.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из эфавиренца, зидовудина или ламивудина.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению используют вместе с эфавиренцом, зидовудином или ламивудином.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из невирапина, зидовудина, ставудина или ламивудина.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению используют вместе с невирапином, зидовудином, ставудином или ламивудином.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изо бретению могут быть использованы вместе по крайней мере с одним другим противовирусным агентом, который выбирают из зидовудина, ставудина или ламивудина.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению используют вместе с зидовудином, ставудином или ламивудином.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе с зидовудином.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе со ставудином.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе с ламивудином.

В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе с невирапином.

Еще в одном варианте воплощения настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть использованы вместе с эфавиренцом.

Комбинации, описанные выше, традиционно могут быть представлены для использования в виде фармацевтических составов, включающих в себя комбинации, описанные выше, наряду с фармацевтически приемлемым носителем и, следовательно, представляют собой еще один аспект изобретения.

Индивидуальные компоненты таких комбинаций могут вводиться либо последовательно, либо одновременно, в виде отдельных или объединенных фармацевтических составов.

В случае, если соединения I и 1а или их фармацевтически приемлемые соли используют в комбинации со вторым терапевтическим агентом, активным против того же вируса, доза каждого соединения может быть одинаковой или отличаться от дозы соединения, используемого отдельно. Подходящие дозы могут быть легко определены специалистами в данной области.

Соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может быть легко определено специалистами, компетентными в данной области. Например, соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:50. В другом варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:30. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:20. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:15. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения соотношение соединение по настоящему изобретению/ второй терапевтический агент может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3. Если добавляют дополнительный терапевтический агент, соотношения могут быть подобраны соответствующим образом.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены следующим образом.

Следующие примеры представлены для иллюстрации различных вариантов воплощения настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем притязаний настоящего изобретения.

^Вг°Д° + 2х°у^с°°· . ^вю-уу=°°«· ύ^Β’°~[_:α^^ο°^{Η βζ}°^°°^Η

3 4а

4Ь

a) п-ТСК, 100°С, неразбавленный;

b) ЬЮН, МеОН-Н₂О;

с) РЬ(ОА_с)₄, МеСЫ, пиридин;

6) ТМСТФ, СН₂С1₂, ТМС-6-С1-гуанин, 80%;

е) ЕЮН, циклопропиламин, 80°С;

1) ЫН₃, МеОН.

Конечное соединение может быть получено в соответствии со следующей схемой.

Стадия а.

2-Бензоилоксиацетальдегид 1 взаимодей ствует с метиловым эфиром (К.)-(+)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислоты 2 в присутствии п-толуолсульфокислоты (п-ТСК) в условиях переацетализации, при этом получают 2-бензоилоксиметил-1,3-диоксолан-4-карбоксиметиловый эфир 3 в виде смеси цис- и трансизомеров в соотношении 3:1, обогащенной цис изомером.

Стадия б.

Карбоксиметиловый эфир 3 подвергают селективному гидролизу с использованием гидроксида лития, при этом получают соответствующие производные кислоты 4а и 4Ь. Смесь разделяют экспресс-хроматографией и каждый изомер в дальнейшем используют отдельно.

Стадия в.

Затем карбоксильную функциональную группу соединения 4а превращают в замещаемую ацетоксигруппу путем обработки тетраацетатом свинца.

Стадия г.

(2К.)-2-Бензоилоксиметил-1,3-диоксолан-4ацетокси 4а конденсируют с силилированным 2амино-6-хлорпурином с использованием в качестве активатора триметилсилилтрифторметилсульфоната (ТМСТФ), при этом получают смесь цис- и транс-изомеров нуклеозидных аналогов 6а и 6Ь в соотношении 1,2:1, обогащенную цисизомером. Затем смесь разделяют экспрессхроматографией и каждый изомер в дальнейшем используют отдельно.

Стадия д.

(-)-(2К,4К.)-2-Бензоилоксиметил-4-(2'-амино6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолан 6а обрабатывают циклопропиламином в этаноле, при этом получают соответствующий (-)-(2К,4К.)-2-бензоилоксиметил-4-(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан 7 с хорошим выходом.

Стадия е.

Удаление бензоильной защитной группы достигают обработкой (-)-(2К,4К.)-2-бензоилоксиметил-4-(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин9'-ил)-1,3-диоксолана 7 раствором аммиака в метаноле, при этом получают требуемый продукт (-) -(2К,4К.) -2 -гидроксиметил-4-(2'-амино -6'циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан А с хорошим выходом.

Пример 1. Метиловый эфир 2-(К,8)-бензоилоксиметил-1,3-диоксолан-4-(К.)-карбоновой кислоты.

К раствору метил-2,3-О-изопропилиден-Оглицерата (производства фирмы Б1ика, номер по каталогу 59449), (9,76 г, 60,9 ммоль, 1 экв.) и бензоилоксиацетальдегида (10 г, 60,9 ммоль, 1 экв.) в толуоле (20 мл) при 80°С добавляют ртолуолсульфокислоту (460 мг, 2,4 ммоль, 4 мол.%). Реакционную колбу выдерживают в вакууме в течение 1 ч и в течение этого периода времени собирают дистиллят (80-85°С). Остаток охлаждают до комнатной температуры и очищают колоночной хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси гексан/этилацетат, при этом получают 13,2 г (81%) требуемого соединения в виде смеси цис- и транс-изомеров в соотношении 3:1.

Цис-изомер:

Ή-ЯМР (СБС1₃) δ (часть/млн): 3,75 (δ, 3Н, СНз), 4,15 (бб, 1Н, С5-СН), 4,30 (бб, 1Н, С5-СН),

4,5 (т, 2Н, СН₂-О-СО-С₆Н₅), 4,7 (т, 1Н, С₄-СН),

5,4 (1, 1Н, С₂-СН), 7,45-8,1 (т, 5Н, Аг-СН).

Транс-изомер:

Ή-ЯМР (СПС1₃) δ (часть/млн):3,8 (8, 3Н, СН₃), 4,1 (бб, 1Н, С₅-СН), 4,35 (бб, 1Н, С₅-СН),

4,45 (т, 2Н, СН₂-О-СО-С₆Н₅), 4,75 (т, 1Н, С₄СН), 5,5 (1, 1Н, С₂-СН), 7,45-8,1 (т, 5Н, Аг-СН).

Пример 2. (2К,4К)-2-Бензоилоксиметил1,3-диоксолан-4-карбоновая кислота. (28,4К)-2Бензоилоксиметил-1,3 -диоксолан-4-карбоновая кислота.

К раствору метилового эфира 2-(К,8)-бензоилоксиметил-1,3-диоксолан-4-(К)-карбоновой кислоты (411 г, 1,54 ммоль, 1 экв., смесь цис- и транс-изомеров 2:1) в смеси ТГФ и воды 1:1 в течение 30 мин порциями добавляют гидроксид лития (64,8 г, 1,54 моль, 1 экв.), при этом температуру в реакционной колбе поддерживают ниже 30°С. Через 90 мин ТГФ удаляют в вакууме и водный раствор подкисляют до рН 2,5-3,2 путем добавления по каплям 30 мас.%-ного раствора серной кислоты. Полученный раствор экстрагируют дихлорметаном (4х400 мл). Объединенную органическую фазу промывают солевым раствором, сушат над сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 380 г масла темного цвета. Изомеры разделяют колоночной хроматографии на силикагеле, с использованием 2%-ной уксусной кислоты в дихлорметане, при этом получают 220 г цис-изомера (56,5%) и 116 г транс-изомера (30%). Каждый изомер используют отдельно на следующей стадии.

Цис-изомер: (2К,4К)-2-бензоилоксиметил-1,3диоксолан-4-карбоновая кислота.

Ή-ЯМР (СЦС1₃) δ (часть/млн): 4,2 (1, 1Н, С₅-Н), 4,4 (т, 1Н), 4,5 (т, 1Н), 4,7 (т, 2Н), 5,4 (1, 1Н, С₂-СН), 7,45-8,1 (т, 5Н, Аг-СН), 7,2-8,0 (ушир. 8, 1Н, СООН).

Транс-изомер:

(28,4К)-2-бензоилоксиметил-1,3-диоксолан4-карбоновая кислота.

Ή-ЯМР (СЦС13) δ (часть/млн): 4,15 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,4 (1, 1Н, С₅-Н), 4,45 (т, 2Н, СН₂-ОСО-С₆Н₅), 4,8 (бб, 1Н, С₄-СН), 5,6 (1, 1Н, С₂-СН), 7,45-8,1 (т, 5Н, Аг-СН), 8,3-8,8 (ушир. 8, 1Н, СООН).

Пример 3. (2К)-2-Бензоилоксиметил-4-(К,8)ацетокси-1,3-диоксолан.

1. РЬ(0Ас)_4> ΟΗ,ΟΝ, пиридин ч, комн, температура

К раствору (2К,4К)-2-бензоилоксиметил1,3-диоксолан-4-карбоновой кислоты (130 г,

0,515 моль, 1 экв.) и пиридина (60 мл, 0,741 моль, 1,44 экв.) в ацетонитриле при 4°С в течение 20 мин добавляют тетраацетат свинца (по данным анализа, 95%, 300 г, 0,678 моль, 1,25 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Неорганические вещества удаляют фильтрованием, фильтрат выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия (2 л), затем добавляют твердый бикарбонат натрия (рН=7-8). Органическую фазу отделяют и водную фазу экстрагируют этилацетатом (3х400 мл). Объединенную органическую фазу концентрируют и очищают колоночной хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси гексан/этилацетат, при этом получают 93,5 г (68%) требуемого соединения в виде смеси цис- и транс-изомеров в соотношении 2:1. Смесь используют на следующей стадии.

Цис/транс-изомеры:

Ή-ЯМР (СЦС1₃) δ (часть/млн): 2,0, 2,15 (8, 3Н, СН₃), 4,05-4,45 (т, 4Н, СН), 5,45, 5,55 (1, 1Н, С₂-СН), 6,4, 6,45 (бб, 1Н, С₄-СН), 7,45-8,1 (т, 5Н, Аг-СН).

Пример 4. (2К,4К) и (2К,48)-2-Бензоилоксиметил-4-(2'-амино-6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3диоксолан.

2-Амино-6-хлорпурин (4,15 г, 1,3 экв.) в 50 мл гексаметилдисилазана (ГМДС), содержащего 100 мг сульфата аммония, нагревают с обратным холодильником в течение 3 ч, после чего прозрачный раствор упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 100 мл безводного 1,2-дихлорэтана. (2К)-2-Бензоилоксиметил-4ацетокси-1,3-диоксолан (5 г) сушат путем совместного упаривания с бензолом дважды (2х30 мл) и растворяют в 100 мл безводного 1,2дихлорэтана. Затем раствор переносят в реакционную колбу, содержащую раствор силилированного 2-амино-6-хлорпурина. Смесь помещают на предварительно нагретую до 60°С масляную баню на 15 мин, затем добавляют триметилсилилтрифлат (ТМСТФ, 3,8 мл, 1,1 экв.). Смесь нагревают с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 3 ч, после чего раствор становится коричневым. По данным ТСХ (гексан/Е1ОАс, 7:3 для сахарида и гексан/Е1ОАс, 1:4 для продукта), реакция завершается с исчезновением сахарида и с появлением двух хорошо разрешимых пятен цис-и транс-продуктов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия (100 мл) и перемешивают в течение 10 мин. Органический слой собирают и водный слой экстрагируют дважды хлористым метиленом (2х50 мл). Объединенный органический раствор промывают водой, солевым раствором и сушат над Мд§О₄ обычным способом, растворитель упаривают досуха, при этом получают пенообразный продукт (7 г). Данные НЯМР для неочищенного продукта свидетельст вуют о том, что происходит прямая реакция с образованием цис- и транс-продуктов в соотношении 1,2:1 с обогащением по цис-изомеру. Неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием в качестве элюента градиента концентрации смеси гексан/этилацетат, 7:3, 1:1 и 2:3, при этом получают 2,5 г транс-изомера (менее полярного, α-аномера) в виде пены, который кристаллизуется из этилового спирта, 3 г цис-изомера (более полярного, β-аномера) в виде пены, которая кристаллизуется из этилового спирта, и 0,3 г смеси цис- и транспродуктов, обогащенной цис-изомером, в виде пены, с общим выходом 82%.

Транс-изомер: (+)-(2Я,48)-2-бензоилоксиметил-4-(2'-амино6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолан.

Я_£: 0,40 (гексан/ЕЮАс, 3:7) [α_ο] +21,16° (с 0,293 в СН₂С1₂)

Ή-ЯМР (СБС1₃) δ (часть/млн): 4,45-4,55 (т, 4Н, С₅-Н₂, С,-СН;-ОВ/). 5,16 (Ь, 2Н, ΝΗ₂),

5,83 (ΐ, 1Н, С₂-Н, 1=3,8 Гц), 6,39 (бб, 1Н, С₄-Н), 7,45 (1, 2Н, ароматика), 7,62 (I. 1Н, ароматика),

7,92 (к, 1Н, Св-8), 8,10 (б, 2Н, ароматика).

УФ-спектр: (СН₃ОН) λ^.: 312 нм.

Цис-изомер:

(-)-(2Я,4Я)-2-бензоилоксиметил-4-(2'-амино6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолан.

Я_£: 0,26 (гексан/ЕЮАс, 3:7) [α_ο] -87,7° (с 0,2565 в СН₂С1₂)

Ή-ЯМР (СЦС1з) δ (часть/млн): 4,25-4,33 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,60-4,64 (т, 3Н, С₅-Н и С₅Н₂ΟΒζ), 5,17 (Ь, 2Н, ΝΉ₂), 5,42 (ί, 1Н, С₂-Н, 1=3,5 Гц), 6,33 (бб, 1Н, С4-Н), 7,45 (ί, 2Н, ароматика), 7,62 (ί, 1Н, ароматика), 7,95 (б, 2Н, ароматика), 8,05 (к, 1Н, Сз'-8).

УФ-спектр: (СН₃ОН) λ^.: 312 нм.

Пример 5. (-)-(2Я,4Я)-2-Бензоилоксиметил4-(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)1,3-диоксолан.

К раствору (-)-(2Я,4Я)-2-бензоилоксиметил4-(2'-амино-6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолана (600 мг) в этаноле (30 мл) добавляют циклопропиламин (2 мл, 18 экв.) Смесь слабо нагревают с обратным холодильником (80-85°С) в течение 18 ч и охлаждают до комнатной температуры. Растворитель упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 100 мл хлористого метилена, промывают насыщенным раствором NаНСО₃, водой, солевым раствором и сушат над Мд§О₄. Растворитель удаляют в вакууме и остаток очи щают на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси ЕЮАс/МеОН, при этом получают требуемый продукт в виде пены с выходом 80% (506 мг).

Я_£: 0,26 (СН₂С1₂/МеОН, 95:5) [α_ο] -67,7° (с 0,2565 в СН₂С1₂)

Ή-ЯМР (СЦС1₃) δ (часть/млн): 0,64-0,68 (т, 2Н, СН2 циклопропила), 0,91-0,96 (т, 2Н, СН₂ циклопропила), 3,06 (Ь, 1Н, СН циклопропила), 4,27-4,30 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,54-4,57 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,60 (ί, 2Н, С5-СН₂-ΟВζ), 5,37 (Ь, 2Н, ΝΉ₂), 5,42 (ί, 1Н, С₂-Н, 1=3,5 Гц), 6,28 (Ь, 1Н, ΝΉ), 6,35 (бб, 1Н, С₄-Н); 7,45 (ί, 2Н, ароматика), 7,58 (ί, 1Н, ароматика), 7,77 (к, 1Н, 08), 8,01 (б, 2Н, ароматика).

УФ-спектр: (СН₃ОН) λ^.: 283 и 260 нм.

Пример 6. (-)-(2Я,4Я)-2-Гидроксиметил-4(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолан (соединение А).

Раствор (-)-(2Я,4Я)-2-бензоилоксиметил-4(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолана (480 мг) в 30 мл насыщенного раствора аммиака в метаноле перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 20 мл воды, дважды промывают 10 мл хлористым метиленом и высушивают лиофильно, при этом получают 283 мг твердого вещества белого цвета с выходом 80%.

ΙΤ: 0,26 (СН₂С1₂/МеОН, 9:1) [α_ο] -35,9° (с 0,344 в МеОН)

Ή-ЯМР (ОМ8О_б-6) δ (часть/млн): 0,55 (т, 2Н, СН₂ циклопропила), 0,95 (т, 2Н, СН₂ циклопропила), 3,15 (Ь, 1Н, СН из циклопропила),

3,80 (т, 2Н, СН₂ОН), 4,30 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,55 (бб, 1Н, С₅-Н), 5,08 (ί, 1Н, С₂-Н), 5,17 (Ь, Н, ОН), 6,15 (Ь, 2Н, ΝΉ₂), 6,52 (бб, 1Н, С₄-Н), 7,72 (Ь, 1Н, ΝΉ), 8,12 (к, 1Н, С₈'-8).

УФ-спектр: (СН₃ОН) λ^.: 283 и 260 нм.

Пример 7. (-)-(2Я,4Я)-2-Бензоилоксиметил4-(2'-амино-6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолан.

К раствору (-)-(2Я,4Я)-2-бензоилоксиметил4-(2'-амино-6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолана (250 мг) в этаноле (25 мл) добавляют циклобутиламин (0,17 мл, 3 экв.) Смесь слабо нагревают с обратным холодильником (80-85°С) в течение 18 ч и охлаждают до комнатной температуры. Растворитель упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 100 мл хлористого метилена, промывают насыщенным раствором №1НСО₃, водой, солевым раствором и сушат над Мд§О₄. Растворитель удаляют в вакууме и остаток очищают на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси ЕЮАс/МеОН, 95:5, при этом получают требуемый продукт в виде пены с выходом 84% (230 мг).

Я_£: 0,31 (СН₂С1₂/МеОН, 95:5) [α_ο] -62,5° (с 0,4925 в СН₂С1₂)

Ή-ЯМР (ΟΌΟ1₃) δ (часть/млн): 1,74-1,78 (т, 2Η, СН₂ циклобутила), 1,95-2,00 (т, 2Н, СН₂циклобутила), 2,43-2,45 (т, 2Н, СН₂ циклобутила), 4,27-4,30 (бб, 1 Н, С₅-Н), 4,54-4,57 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,59 (1, 2Н, С₂-СН₂-ОВ/), 4,75 (Ь, 1Н, СН циклобутила), 5,37 (Ь, 2Н, ИН₂), 5,41 (1, 1Н, С₂Н, 1=3,6 Гц), 6,00 (Ь, 1Н, ИН), 6,35 (бб, 1Н, С₄Н), 7,45 (1, 2Н, ароматика), 7,58 (1, 1Н, ароматика), 7,75 (к, 1Н, С₈'-8), 8,01 (б, 2Н, ароматика).

УФ=спектр: (СН₃ОН) λ,^.: 283 и 263 нм.

Пример 8. (-)-(2В,4В)-2-Гидроксиметил-4(2'-амино-6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолан (соединение В).

Раствор (-)-(2В,4В)-2-бензоилоксиметил-4(2'-амино-6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3диоксолана (214 мг) в 20 мл насыщенного раствора аммиака в метаноле перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 20 мл воды, дважды промывают 10 мл эфира и упаривают досуха совместным упариванием с этанолом, при этом получают 154 мг чистого продукта в виде пены с выходом 96%.

В_г: 0,52 (СН₂С1₂/МеОН, 9:1) [α_ο] -29,04° (с 0,396 в МеОН)

Ή-ЯМР (ИМ§О_б-6) δ (часть/млн): 1,61 (т, 2Н, СН2 циклобутила), 2,06 (т, 2Н, СН2 циклобутила), 2,18 (т, 2Н, СН₂ циклобутила), 3,58 (т, 2Н, СН₂ОН), 4,17 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,40 (бб, 1Н, С₅-Н), 4,90 (Ь, 1Н, СН циклобутила), 5,01 (1, 1Н, С₂-Н), 5,42 (Ь, Н, ОН), 5,87 (Ь, 2Н, ИН₂), 6,19 (бб, 1Н, С₄-Н), 7,62 (Ь, 1Н, ИН), 7,85 (к, 1Н, С₈'-8).

УФ-спектр: (СН₃ОН) λ,^.: 283 и 260 нм.

Пример 9. (-)-(2В,4В)-2-Гидроксиметил-4(2'-амино-6'-{ 1-карбоновая кислота-циклопропиламино}пурин-9'-ил)-1,3-диоксолан (соединение С).

К раствору (-)-(2В,4В)-2-бензоилоксиметил4-(2'-амино-6'-хлорпурин-9'-ил)-1,3-диоксолана (210 мг) в этаноле (30 мл) добавляют 1-амино-1циклопропанкарбоновую кислоту (113 мг, 2 экв.) и триэтиламин (0,2 мл, 2,5 экв.). Смесь слабо нагревают с обратным холодильником (80-85°С) в течение 72 ч и охлаждают до комнатной температуры. Растворитель упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в растворе аммиака в метаноле (20 мл) и перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют в вакууме, и остаток очищают на силикагеле с использованием градиента концентрации смеси СН₂С1₂/МеОН от 95:5 до 9:1 для удаления побочного продукта реакции, и, наконец, элюируют требуемый продукт смесью СН₂С1₂/МеОН 4:1, содержащей 0,5% уксусной кислоты, при этом получают 80 мг чистого продукта (выход 42,5%).

К.{=0,34 (смесь СН₂С1₂/МеОН, 4:1, содержащая 0,5% уксусной кислоты)

Ή-ЯМР (ДМСОб-6) δ (часть/млн): 1,05 (Ь, 2Н, СН₂ циклопропила), 1,45 (Ь, 2Н, СН₂ циклопропила), 3,58 (Ь, 2Н, СН₂-ОН), 4,17 (бб, 1Н, С₅Н), 4,41 (бб, 1Н, С₅-Н), 5,12 (1, 1Н, С₂-Н), 5,15 (Ь, 1Н, ОН), 5,82 (Ь, 1Н, ИН), 6,19 (бб, 1Н, С₄-Н), 7,71 (Ь, Н, ИН), 7,86 (к, 1Н, С₈'-8).

УФ-спектр (СН₃ОН) λ,^.: 283 и 264 нм.

Пример 10. Противовирусная активность против ВИЧ.

Определение противовирусной активности.

Активность соединения А (-) против ВИЧ-1 оценивают с использованием ВИЧ-1_1ПВ на ряде типов клеток, как описано ранее (Си и соавт., Иоуе1 ти1айои ίη 1йе йитаи 1ттииобейс1еису У1гик 1уре 1 геуегке 1гапкспр1аке деие 1йа1 еисобек сгоккгек1к1аисе 1о 2',3'-б1беохутокте апб 2',3'б1беохусуйбте (Новая мутация гена обратной транскриптазы ВИЧ-1, которая кодирует перекрестную устойчивость к 2',3'-дидезоксиинозину и 2',3'-дидезоксицитидину), 1. Упо1., (1992) 66:12-19; Си и соавт., 1беиййсайои о! а ти1айои а1 собои 65 щ 1йе ΙΚΚΚ той! о! геуегке 1гаг1кспр1аке 1йа1 еисобе йитаи ттииобейаеису уник гек1к1аисе 1о 2',3'б1беохусуйбте аиб 2',3'-б1беоху-3'-1й1асуйбте (Идентификация мутации в кодоне 65 мотива ΙΚΚΚ обратной транскриптазы, которая кодирует перекрестную устойчивость ВИЧ-1 к 2',3'дидезоксицитидину и 2',3'-дидезокситиацитидину), АийшкгоЬ. Адеи1к Сйето1йег., (1994) 38:275-281; Си и соавт., Месйаткт о! асйои аиб т уйго ас(1у|(у о! ЕУ-бюхок-туфтше иис1еок1бе аиа1одиек адатк1 кеикШуе аиб бгид-гек1к1аи1 йитаи штииобейаеису упик 1уре 1 уапагИк (Механизм действия и активность ш νίθΌ аналогов 1',3'-диоксоланилпуринового нуклеозида против вариантов чувствительных и устойчивых к лекарственным средствам ВИЧ-1), Аη1^т^с^оЬ^а1 Адеи1к аиб Сйето1йегару, (1999) 43:2376-2382; Ваибо и соавт., §ирргеккюи о! йитаи ттииобейаеису νίгик 1уре 1 асбуйу т νίνυ Ьу ойдоиис1еойбе тейюй Гогт Ш1гато1еси1аг 1е1габк (Подавление активности ВИЧ-1 ш νί\Ό олигонуклеотидами, которые образуют тетрады), 1. Вю1. Сйет., (1995) 270:17541760; 8а1отои и соавт., Сотрапкои о! согб Ь1ооб аиб репрйега1 Ь1ооб тоиоиис1еаг се11к ак 1агде1к !ог У1га1 1ко1айои аиб бгид кеηк^1^ν^1у к1иб1ек шуо1ушд йитаи штииобейаеису ут.1к 1уре 1 (Сравнение мононуклеарных клеток из пуповинной и периферийной крови в качестве мишеней для выделения вируса и исследования чувствительности лекарственных средств, включая ВИЧ-1), 1. Сйи.

МюгоЬюй, (1994) 32:2000-2002). Клетки инкубируют с вирусом при множественности заражения (МО1) 0,005 в случае Т клеток и 0,5 в случае моноцитарных клеток в течение 3 ч. Несвязанный вирус удаляют путем промывки клеток с последующим пересевом клеток на 96-луночном план23 шете. Инфицированные клетки культивируют в присутствии серийных разведений концентрации тестируемого соединения в течение 5-7 суток. Противовирусную эффективность против ВИЧ-1 оценивают путем определения активности КТ или уровня р24 для ВИЧ-1 в супернатантах клеточной культуры. Все определения выполняют, дважды повторяя каждое определение. В каждом эксперименте в качестве контроля используют зидовудин и/или ламивудин.

Сравнение соединения А (-) с разрешенными к применению агентами против ВИЧ-1.

Величина ЕС₅₀ для соединения А (-) против ВИЧ-1_Шв на клетках МТ-2 составляет 0,083 мкМ, что равно уровню активности против ВИЧ-1 ламивудина, ставудина, зальцитабина и абакавира, но ниже активности зидовудина (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение активности против ВИЧ-1 соединения А (-) с разрешенными к применению агентами против ретровирусов (определено по активности КТ)

Соединение	ЕС^мкМ) +стандарт. отклон. в клетках МТ-2
Соединение А (-)	0,082 ± 0,022
дг	0,065±0,039
Зидовудин	0,0051 ±0,0025
Ламивудин	0,061 ±0,028
Ставудин	0,38 ±0,26
Зальцитабин	0,05
Абакавир	0,10

Активность соединения А (-) против ВИЧ1 на различных клетках.

Активность соединения А (-) против ВИЧ1 определяют с использованием различных типов клеток, включая линии клеток периферических моноцитов человека (РВМСк), Т клеток (МТ-2 и МТ-4) и моноцитарных клеток (И937). Соединение А (-) характеризуется субмикромолярными величинами ЕС₅₀ против ВИЧ-1_ШВ на различных исследованных типах клеток (табл. 2).

Таблица 2 Эффективность соединения А (-) против ВИЧ-1 на различных типах клеток (определено по активности КТ)

	ЕС₅₀ (мкМ)
Клетки	Соединение А (-)	Зидовудин	Ламивудин
РВМСв (3)'	0,22	0,0027	0,035
МТ-2 (4)	0,082	0,0051	0,061
МТ-4 (2)	0,14	0,015	0,17
иэз7 (1)	0,82	0,027	0,014

* Числа в скобках означают число определений.

Кроме того, определяют активность соединения А (-) против ретровирусов с использованием различных штаммов ВИЧ-1. Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что соединение А (-) проявляет активность против не индуцирующего синцитий (ВИЧ19881), дуального трофического (ВИЧ-1_тасвдь) и моноцитрофического (ВИЧ-1_ВДКМ8488) штаммов.

Таблица 3 Противовирусная активность соединения А (-) против различных типов штаммов ВИЧ-1 (определено по уровню антигена р24)

	ЕС₅₀ (мкМ)
Вирус	Клетки	Соединение А (-)	Зидовудин
ВИЧ-1 _9М1	РВМСв	0,59	0,0017
Вич-1	РВМСз	4,14	0,043
	т/т	0,022	<0,0011
ВИЧ-1 мямадзз	т/т	0,028	<0,0011

Пример 11. Оценка токсичности.

Клеточную токсичность соединений оценивают на различных клетках с использованием включения [³Н]тимидина. Различные клетки, включая ΜοΙί-4, НТ1080, ϋυ-145, Нерб-2 и Н8Е, вносят в лунки с концентрацией 1-2х10³клеток в лунке 96-луночного планшета. После инкубирования в течение 24 ч в культуральную среду добавляют 10-кратные серийные разбавления соединений (от 10^-4 до 10^-10 М) и клетки снова инкубируют в течение 72 ч. [³Н]Тимидин добавляют в течение последних 18 ч инкубирования. После инкубирования с [³Н]тимидином клетки промывают 1 раз буферным раствором РВ8, обрабатывают трипсином, если клетки слипаются, и затем ресуспендируют в воде (гипотонический лизис клеток). Экстракт клеток непосредственно вносят в прибор для сбора клеток ТопИес Натуейег 96. С помощью указанного прибора экстрагированную ДНК адсорбируют на фильтры, промывают и определяют число импульсов включенного [³Н]тимидина. 50%-ную цитотоксическую концентрацию (СС50) определяют путем сравнения числа радиоактивных импульсов в мин для образцов в присутствии соединений и числа импульсов в контрольных образцах.

Клеточную токсичность соединений определяют также с использованием проявления реагентом ^8Т-1 для оченки пролиферации клеток МТ-2, Н9, Лика!. υ937 и СВМСк. Исследуемые клеточные линии культивируют в среде КРМ1 в 96-луночных планшетах с плотностью 5х10⁴ клеток в лунке, в то время как клетки СВМСТ наносят с концентрацией 0,5х10⁶ клеток в лунке. В нулевой день в лунки добавляют 10кратные серийные разведения соединения (10^-410^-7 М). На четвертый день клетки пересевают путем замены половины среды, содержащей соответственно разбавленное соединение. Клеточную активность определяют на седьмой день с использованием реагента №8Т-1 (производства фирмы Воейппдег Маппйет) по методике, представленной фирмой-производителем. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Токсичность

• Эффект прироста веса тела при внутрибрюшинном введении у мышей (СБ1, взрослые особи, самцы) в дозе 50 мг/кг/день в течение 5 дней.

Пример 12. Предварительные фармакокинетические исследования.

Биодоступность соединений определяют у взрослых самцов крыс, получивших внутривенную дозу через хвостовую вену (5 мг/кг) и пероральную дозу (20 мг/кг). Образцы плазмы собирают через 2, 5, 15, 30, 60, 90, 120 и 240 мин после внутривенного введения и через 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240 и 360 мин после перорального введения.

Методики эксперимента

Подготовка плазмы.

Образцы крови (1 мл) как в случае внутривенного, так и в случае перорального введения отбирают из хвостов крыс в вакуумированный контейнер, содержащий ЭДТУ (3 мл). Образцы плазмы получают путем центрифугирования при 2000 х д в течение 15 мин при 4°С.

Анализ ВЭЖХ.

Условия анализа.

Система ВЭЖХ: две системы с насосом \Ха1сг5 616 и две системы АШапее 2690 с приставкой ΡΌΑ 996.

Колонка: Рйепотепех Ьипа С18 (2), 5 мкм, 250х4,6 мм.

Градиент: 0-35% растворителя А в течение 20 мин, растворитель А содержит 0,01% ТФУ в ацетонитриле, и растворитель В содержит 0,01% ТФУ в воде Мййроте (фильтр 0,25 мкм).

Скорость потока: 1,0 мл/мин, УФ: 200-350 нм. Твердофазная экстракция.

Образцы плазмы (разбавленные до 1 мл водой) наносят на сорбент АЪ^ейП Ыехик (# 12103100) и отсасывают в низком вакууме приблизительно 16,931 кН/м² (приблизительно 5 ртутного столба). К сорбенту добавляют 1 мл деионизированной воды и отсасывают в вакууме. Экстракционную колонку высушивают в высоком вакууме >33,863 кН/м² (>10 ртутного столба). В колонку с сорбентом АЪ^ейП Ыехик добавляют 1 мл метанола и элюент собирают при скорости 1-2 мл/мин. Элюент упаривают досуха на приборе 8реебУае и образцы снова растворяют в 120 мкл воды; для нанесения используют 100 мкл. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Фармакокинетические свойства и оральная биодоступность

Соед-е	Введение (мг/кг)	Живот- ное	Оральная биодоступ. (%)	дис (•г/мл.ч)	Т1/2 (ч)	Стах (•г/мл)
дг	о', 20	крыса	4,43 ±1,65	0,91 ±0,34	2,45±0,59	0,27 ±0,03
	в/в, 5	крыса		5,15	0,62	29,02
ДАПД	о, 20	крыса	7,42±1,58	1,89±0,40	0,77±0,31	1,04±0,24
Соед-е	о, 20	крыса	45,56±2,78	8,64±О,53	0,64±0,24	4,20 ±0,65
А (-)	в/в, 5	крыса		4,74	0,37	14,26
Соед-е	о, 20	крыса	13,75	3,08	1,20	1,12
В(-)	в/в, 5	крыса		5,60	0,31	13,26
Соед-е	о, 20	крыса	4,58	0,44	0,31	0,67
С(-)	в/в, 5	крыса		2,40	0,32	14,53

* орально ** внутривенно *** оральная биодоступность

Пример 14. Устойчивость соединения А (-) в качестве лекарственного средства.

Рекомбинантные варианты ВИЧ-1 получают путем введения определенных мутаций в ΗΧΒ2-Ό с помощью сайт-направленного мутагенеза по описанной методике (Си и соавт., 1. νίτοί., (1992) 66:12-19; Си и соавт., Ап11Ш1стоЪ. Адепй СйешоШет., (1994) 38:275-281). Биомассу вируса получают путем трансфекции клеток МТ-4 конструкциями инфекционной вирусной ДНК. Противовирусную активность соединения А (-) определяют, как описано в примере 10. Соединение А (-) обладает несколько сниженной активностью против вариантов ВИЧ-1, содержащих мутации К65К и/или М184V в обратной транскриптазе, но сохраняет чувствительность к другим вариантам, которые устойчивы к зидовудину, не нуклеозидным ингибиторам и ингибиторам протеаз (табл. 6).

Таблица 6 Эффективность соединения А (-) к рекомбинантным вариантам ВИЧ-1, устойчивым к лекарственным средствам (определено по активности КТ)

1. ЕС₅₀ для невирапина составляет >10.М

2. ЕС₅о для саквинавира составляет 0,028.М; ЕС₅₀\\1 НХВ2-И для саквинавира составляет 0,0015.М.

Пример 15. Эффективность соединения А (-) против клинических изолятов ВИЧ-1.

Клинические штаммы выделяют из клеток РВМСк субъектов, инфицированных ВИЧ-1, путем совместного культивирования с РВМС из нормальных доноров. Для определения генотипа ВТ клинических изолятов ВИЧ-1 провирусную ДНК экстрагируют из Т-клеток или РВМС, инфицированных СИ4⁺, и методом ПЦР амплифицируют полные кодирующие участки ВТ, как описано ранее (Си и соавт., I. νίτοί., (1992) 66:12-19). Продукт ПЦР очищают и затем напрямую секвенируют с использованием праймера (5'-ССААААСТТА ААСААТ66С-3'), который расположен в 5'-фрагменте кодирующего участка ВТ (нуклеотид 26032621 в координатах НХВ2-И). Противовирусную активность определяют, как описано в примере 10.

Таблица 7 Активность соединения А (-) против клинических изолятов ВИЧ-1 (определено по активности ВТ)

Вирус (число изолятов)	ЕС₅₀ (мкМ)
	Соед-ие А (-)	Зидовудин	Ламивудин
Зидовудин³¹®¹/ Ламивудин³ (7)	0,15 ^<б> (0,032-0,31)^(<5)	0,021 (0,0034-0,051)	0,23 (0,028-0,69)
Зидовудин³/ Ламивудин” (3)	0,38 (0,13-0,51)	0,012 (0,0026- 0,019)	(5,1->10)
Зидовудин”/ Ламивудин³ (3)	0,19 (0,066-0,33)	0,83 (0,25-1,74)	0,25 (0,096-0,34)
Зидовудин”/ Ламивудин” (2)	0,33 (0,27/0,39)	1,15 (0,49/1,81)	4,1 (3,6/4,6)

a. 8 означает чувствительный. В означает устойчивый.

b. Средние величины ЕС₅₀.

c. Диапазоны величин ЕС₅₀ изолятов в одной и той же группе.

Таблица 8 Активность соединения А (-) против клинических изолятов, устойчивых к лекарственным средствам, в клетках РВМС (определено по уровню р24)

В означает устойчивый.

Пример 16. Эффекты комбинации лекарственных средств.

Эффекты комбинации соединения А (-) с противовирусными агентами против ВИЧ-1 определяют в клетках МТ-2 или РВМС с использованием ВИЧ-1_ШВ. Комбинации осуществляли с использованием концентраций лекарственных средств, определенных по схеме шахматной конфигурации. Противовирусную активность определяли путем измерения активности ВТ в супернатантах культур. Данные анализируют по методу, описанному С1ои и Та1а1ау (С1ои аиб Та1а1ау, Оиашйайус аиа1у818 о Г боке сГГсс! те1айои8Ыр8: Не сотЫиеб еГГесЦ оГ тц1йр1е бгидк ог соху те й11йЬйог5 (Количественный анализ действия соотношений доз: действие объединения многих лекарственных средств или ингибиторов ферментов), Абу. Епхуте Веди1., (1984) 22:27-55) и Рпсйатб (Рйсйатб и соавт., 8(га1ед1с бек1дп апб 1Ьгее-б1тепйоиа1 апа1уС оГ апйу1та1 бгид сотЫиайоик (Стратегия разработки и трехмерного анализа комбинаций противовирусных лекарственных средств), АпШшсгоЬ. АдеШк СйетоШет., (1993) 37:540-545). Индексы комбинации (С1) соединения А (-) с другими агентами против ВИЧ-1 рассчитывают с использованием программного обеспечения Са1си8уи (фирмы Вюкой, СатЬпбде, ИК). Теоретически величина С1, равная 1, означает аддитивный эффект, С1>1 указывает на антагонизм, а С1<1 указывает на синергизм. Для расчета объема синергизма или антагонизма комбинации лекарственных средств используют программное обеспечение Мас8уиегду II.

Таблица 9

Эффект комбинации соединения А (-) и зидовудина в клетках МТ-2

Молярное соотношение	Величины С! при :	Величина синергизма (мкМ²%)
		ЕС50	ЕЦ75	ЕС95
				достоверность 95%
Соед-ие А (-): ΑΖΤ
5 : 1	0,92	0,96	1,03
10 : 1	0,64	0,70	0,82
20 : 1	0,27	0,37	0,63
40 : 1	0,20	0,23	0,31
I				69,3

Таблица 10 Эффект комбинации соединения А (-) и А2Т (зидовудина) в клетках РВМС

Молярное соотношение	Величины С! при:	Величина синергизма (мкМ²%)
		ЕС50	ЕО75	ЕС95
				достоверность 95%
Соед-ие А {-): ΑΖΤ
1,1 : 1	0,84	0,74	0,61
3,33 : 1	0,49	0,53	0,63
10 : 1	0,40	0,37	0,37
30 : 1	0,40	0,27	0,16
\|				17,03

Таблица 11

Эффект комбинации соединения А (-) и ламивудина в клетках МТ-2

Молярное соотношение	Величина С! при:	Величина синергизма (мкМ²%)
		ЕС50	Εϋ75	ЕС95
				достоверность 95%
Соед-ие А (-): Ламивудин
1 : 2	0,80	0,85	0,95
1 : 1	0,78	0,74	0,68
2 : 1	0,81	0,78	0,73
4 : 1	0,91	0,96	1,06
					-7,89/-11,6

Таблица 12

Эффект комбинации соединения А (-) и ставудина (б4Т) в клетках МТ-2

Молярное соотношение	Величины С1 при:	Величина синергизма (мкМ²%)
		ЕС50	ЕО75	ЕС95
				достоверность 95%
Соед-е А (-): с!4Т
1 : 4	0,61	0,55	0,68
1 : 2	0,75	0,79	1,07
2 : 1	0,68	0,64	0,65
					2,81/-5,64

Таблица 13 Эффект комбинации соединения А (-) и невирапина в клетках МТ-2

Молярное соотношение	Величины С! при:	Величина синергизма (мкМ²%)
		ЕС50	ЕЭ75	ЕС95
				достоверность 95%
Соед-ие А (-): невирапин
5 : 1	0,81	0,78	0,77
10 : 1	0,68	1,0	1,14
20 : 1	0,86	0,99	1,04
					-0,73

Пример 17. Анализ цитотоксичности.

Клеточную токсичность определяют методом включения [³Н]тимидина (бе Миук и соавт., Αηίί-йитап 1ттипобеПс1епсу νίπ.15 1уре 1 асйуйу, ш1гасе11и1аг те1аЬо118т, апб рйагтасокТ пе11с еуа1иайоп о£ 2'-беоху-3 '-оха-4’-ШюсуИбше (Оценка противовурусной активности против ВИЧ-1, метаболизма и фармакокинетических свойств 2'-дезокси-3'-окса-4'-тиоцитидина),

Апйт1сгоЬ. Адеп1§ СйетоШег., (1999) 43:18351844) и с помощью проявления реагентом А8Т-

1. В экспериментах по включению [³Н]тимидина клетки Мо11-4, НТ1080, Эи-145. НерС2 и Н8Р наносят в концентрации 1-2х10³клеток в лунки 96-луночного планшета. ФГАстимулированные клетки РВМСк культивируют при концентрации 4х10⁴ клеток в лунке. После предварительного инкубирования в течение 24 ч добавляют тестируемые соединения (от 10^-4 М до 10^-10 М) и клетки снова инкубируют в течение 72 ч. [³Н]Тимидин добавляют в течение последних 18 ч инкубирования. Затем клетки промывают 1 раз буферным раствором РВ8, обрабатывают трипсином, если клетки являются поверхностно-зависимыми, и затем ресуспендируют в воде (гипотонический лизис клеток). Экстракт клеток непосредственно вносят в прибор для сбора клеток Тот1ес Нагуейег 96. 50%ную цитотоксическую концентрацию (СС₅₀) определяют путем сравнения числа радиоактивных импульсов в мин для образцов, тестируемых в качестве лекарственных средств, и числа импульсов в контрольных (необработанных) клетках.

В экспериментах с проявлением реагентом А8Т-1 клеточные линии культивируют в среде КРМ1 в 96-луночных планшетах с плотностью 5х10⁴ клеток в лунке. Клетки СВМСк наносят с концентрацией 0,5х10⁶ клеток в лунке. В нулевой день добавляют соединения (10^-4-10^-7 М). Клеточную активность определяют на седьмой день с использованием реагента А8Т-1 (производства фирмы Воейппдег Маппйеип) по методике, представленной фирмой-производителем.

Соединение А (-) обладает значительно меньшей цитотоксичностью по сравнению с зидовудином и зальцитабином на различных типах клеток, причем цитотоксичность определяют по включению [³Н]тимидина и с проявлением реагентом А8Т-1 (табл. 14).

Таблица 14

Цитотоксичность соединения А (-)

Пример 18. Анализ токсичности по отношению к митохондриальной ДНК.

Токсичность соединения А (-) по отношению к митохондриальной ДНК определяют на клетках НерС2. Клетки культивируют в присутствии соединения в течение 28 суток. Клетки пересевают 1 раз в неделю. Однако культуральную среду, содержащую соответствующую концентрацию соединения, заменяют 2 раза в неделю. В качестве контроля используют зальцитабин. Токсичность определяют по соотношению содержания митохондриальной ДНК и ядерной ДНК (рибосомальная ДНК 28§), которое измеряют методом саузерн-гибридизации (бе Миук и соавт., АпНтютоЬ. Адепй СНешоШег.. (1999) 43:1835-1844). Соединение А (-) не проявляет значительной токсичности по отношению к митохондриальной ДНК при концентрации вплоть до 100 мкМ, то есть при самой высокой из исследованных концентраций (см. фигуру).

Пример 19. Фармакокинетическое исследование соединений по изобретению.

Соединение А (-), ДФПД и ДГ вводят в виде однократной дозы либо внутривенно в шейную вену в дозе 10 мг/кг, либо перорально в дозе 20, 125, 500, 1000 или 2000 мг/кг. Перед пероральным введением все крысы голодают в течение 12 ч. В качестве носителей как для внутривенного, так и для перорального введения используют 0,1% карбоксиметилцеллюлозу и 0,1% Твин™ 80 в дистиллированной воде, подкисленные 1 н. НС1 до рН 3,15. В случае всех пероральных доз у крыс отбирают образцы крови через промежутки времени, указанные на представленной ниже схеме. У всех 10 крыс для каждого введения образцы крови отбирают через семь временных периодов (2, 5, 15, 30, 60, 120 и 240 мин) в случае внутривенного введения в шейную вену и в случае перорального введения в дозе 20 мг/кг через периоды 5-360 мин, а при пероральном введении в дозе 125-2000 мг/кг образцы крови отбирают в двух дополнительных точках времени через 480 и 1440 мин. В результате через каждый временной период отбирают по четыре пробы, за исключением 1440 мин, когда образцы крови отбирают через шейную вену у всех крыс перед бустированием.

Схема отбора образцов крови у крыс, получивших оральную дозу

Методики эксперимента

Подготовка плазмы.

Анализ ВЭЖХ.

Условия анализа.

Система ВЭЖХ: две системы с насосом \Уа1ег5 616 и две системы АШапсе 2690 с приставкой ΡΌΑ 996.

Колонка: РНепотепех Ьипа С18 (2), 5 мкм, 250х4,6 мм.

Градиент: 0-35% растворителя А в течение 20 мин, растворитель А содержит 0,01% ТФУ в ацетонитриле, и растворитель В содержит 0,01% ТФУ в воде М1Шроте (фильтр 0,25 мкм).

Образцы плазмы (разбавленные до 1 мл водой) наносят на сорбент АЬ§е1и1 Ыехик (#12103100) и отсасывают в низком вакууме приблизительно 16,931 кН/м² (приблизительно 5 ртутного столба). К сорбенту добавляют 1 мл деионизированной воды и отсасывают в вакууме. Экстракционную колонку высушивают в высоком вакууме >33,863 кН/м² (>10 ртутного столба) в течение 1 мин. В колонку с сорбентом АЬ§е1и1 Ыехик добавляют 1 мл метанола и элюент собирают при скорости 1-2 мл/мин. Элюент упаривают досуха на приборе 8реебУас и образцы снова растворяют в 120 мкл воды; для нанесения используют 100 мкл. Результаты представлены в табл. 15 и 16.

Таблица 15 Фармакокинетические параметры соединения А (-) после внутривенного введения (10 мг/кг) или перорального введения (20 мг/кг) крысам

Крыса	Самец	Самка
Способ введения	в/в	о	в/в	о
Доза (мг/кг)	10	20	10	20
Размер образца	4	4	4	4
Стах (МКГ/МЛ)	19,2	4,6	22,9	5,5
Т_тах (мин)		23,4		22,8
Полупериод выведения (мин)	34,2	72,5	36,9	57,1
АиС (мкг.мин/мл)	304	600	328	602
Биодоступность (%)	-	99		92

Плазму получают приблизительно из 1 мл крови, отобранной через каждый период времени у каждой крысы.

Таблица 16 Фармакокинетические параметры ДАПД и ДГ после внутривенного введения или перорального введения ДАПД самцам и самкам крыс

Параметр	Самка	Самец
Способ введения	в/в (10 мг/кг)	о (20 мг/кг)	в/в (10 мг/кг)	о (20 мг/кг)
С_тах (мкг/мл)	22,1	2,5	16,2	1,96
Т_тах (мин)		45		35

1*1/2	31,5	31,3	36,2	34
дис (мкг.мин/мл)	357,9	307,2	271,2	196,5
С1 (мл/мин)	6,6	13,7	9,5	23,6
Биодоступность (%)		43		36

Ниже представлен полный список публикаций, использованных в описании настоящего изобретения.

1. Эе Миук Ι-М., Η. Соигбеаи, Ν. ΝβΐινοηВа, Ό.Τ. Тау1ог, Р.8. Л1ипеб. Т. Мапкоиг, С. Босак, Ν. Вкбагб, М.А. \Уаб1Ьегд и В.Р. Вапбо. 1999. Ληΐί-Нитап 1штипобеДс1епсу уиик !уре 1 асбубу, 1п1гасе11и1аг те1аЬоНкт, апб рбагшасокшебс еуаЛабоп оГ 2'-беоху-3'-оха-4'-Лшсуббше (Оценка противовурусной активности против ВИЧ-1, метаболизма и фармакокинетических свойств 2'дезокси-3'-окса-4'-тиоцитидина), Апбш1сгоЬ. Адеп1к СбешоЛег., 43:1835-1844.

2. Си Ζ., О. Сао, М.А. Рагшак и М.А. \Уаб1Ьегд. 1992. Ште1 шЛабоп ίη Ле бишап 1шшипобейаепсу уиик 1уре 1 геуегке бапкспр1аке депе 1На1 епсобек сгокк-гекШапсе 1о 2',3'б1беохушокше апб 2',3'-б1беохусуббше (Новая мутация гена обратной транскриптазы ВИЧ-1, которая кодирует перекрестную устойчивость к 2',3'-дидезоксиинозину и 2',3'-дидезоксицитидину), 1. Убок, 66:12-19.

3. Си Ζ., О. Сао, Η. Рапд, Η. 8а1ошоп, М.А. Рагшак, Е. Со1бЬегд, 1. Сашегоп и М.А. ^ашЬегд. 1994а. !беп11Г1са11оп оГ а шЛабоп а1 собоп 65 ш Ле IККК шобГ оГ геуегке бапкспр1аке Ла! епсобе бишап шшшпобеПаепсу у1гик гекМапсе 1о 2',3'-б1беохусуббше апб 2',3'б1беоху-3'-Л1асуббше (Идентификация мутации в кодоне 65 мотива ГККК обратной транскриптазы, которая кодирует перекрестную устойчивость ВИЧ-1 к 2',3'-дидезоксицитидину и 2',3'дидезокситиацитидину), АпбшкгоЬ. Адеп1к СбешоЛег., 38:275-281.

4. Си Ζ., М.А. ^ашЬегд, Ν. Nдиуеη-Ва, Ь. Ь'Неигеих, Б-М. бе Миук, Т.Ь. ВоМш и В.Р. Вапбо. 1999. Месбашкш оГ асбоп апб ш У11го ас11уйу оГ Г,3'-бшхо1апу1ршше пис1еок1бе апа1одиек адашк! кепкбАе апб бгид-гекМагИ Иишап тшипобейаепсу у1гик 1уре 1 уапаЛк (Механизм действия и активность ш У11го аналогов 1',3' диоксоланилпуринового нуклеозида против вариантов чувствительных и устойчивых к лекарственным средствам ВИЧ-1), Апбш1сгоЬ1а1 АдеЛк апб СбешоЛегару, 43:2376-2382.

5. Сбои Т.С. и Р. Та1а1ау. 1984. Оиапб1абуе апа1ук1к оГ боке еГГсс! ге1абопкЛрк: Ле сошЬшеб еГГес!к оГ ши1бр1е бгидк ог епхуше шЛЬбогк (Количественный анализ действия соотношений доз: действие объединения многих лекарственных средств или ингибиторов ферментов), Абу. Еп/уше Веди1., 22:27-55.

6. Рпсбагб М.К, Ь.Е. Рпсбагб и С. 8Лршап, 1г. 1993. 81га1ед1с бебдп апб Лгее-б1шепбопа1 апа1ук1к оГ апбуба1 бгид сошЬшабопк (Стратегия разработки и трехмерного анализа комбинаций противовирусных лекарственных средств), АпЛшсгоЬ. Адеп1к СбешоЛег., 37:540-545.

7. Вапбо В., 1. Оруапд, А. ЕЛаддап, С.В. Веуек, В. Тшбег, М.8. МсСгаЛ и М.Е. Нодап. 1995. 8ирргеккюп оГ бишап шшшпобеПаепсу у1гик 1уре 1 ас!1У11у ш у|уо Ьу обдопис1еоббе \\!ис11 Гогш шбашо1еси1аг 1е1габк (Подавление активности ВИЧ-1 ш угуо олигонуклеотидами, которые образуют тетрады), ί. Вю1. СИеш., 270:1754-1760.

8. 8а1ошоп Н., А. Ве1шойе, К. Nдиуеη, Ζ. Си, М. Се1Гапб апб М.А. \Уаб1Ьегд. 1994. Сошрапкоп оГ согб Ь1ооб апб репрбега1 Ь1ооб шопопис1еаг се11к ак 1агде1к Гог упа1 1ко1абоп апб бгид кепк111у11у к!иб1ек шуоМпд Иишап 1шшипобейс1епсу уиик 1уре 1 (Сравнение мононуклеарных клеток из пуповинной и периферийной крови в качестве мишеней для выделения вируса и исследования чувствительности лекарственных средств, включая ВИЧ-1), 1. С1ш. МкгоЬшк, 32:2000-2002.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. цис-Нуклеозид формулы I (I) и его фармацевтически приемлемые соли, где п равно 1 или 2,

В4 выбирают из следующих заместителей: Н, СООН, СОХН. ОН, 8Н, ΝΗ2, ΝΟ2, С^алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, галоген, СОВ_а, где В_аозначает С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил или СООВ_Ь, где В_Ь означает С1_-6алкил, С_2-6алкенил или С_2-6алкинил;

В₃ означает Н или С1_-6алкил, С_2-6алкенил,

С2-6алкинил;

Х выбирают из Н, монофосфата, дифосфата, трифосфата, карбонила, замещенного сле35 дующими группами: С1_₆алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, С_6-10арил;

причем упомянутый нуклеозид присутствует в форме (-)-энантиомера, (+)-энантиомера и их смесей, включая рацемические смеси.
2. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что он по меньшей мере на 95% представлен формой (-)-энантиомера.
3. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что он по меньшей мере на 97% представлен формой (-)-энантиомера.
4. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что он по меньшей мере на 99% представлен формой (-)-энантиомера.
5. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что защитная группа для гидроксильной группы выбрана из ацетил-2-тиоэтилового эфира, пивалоилоксиметилового эфира или изопропилоксикарбонилоксиметилового эфира.
6. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что Х означает Н.
7. Нуклеозид по п.1, отличающийся тем, что η равно 1.
8. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что Я₃ означает Н или метил или К₄ означает Н.
9. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что Я₄ означает Н, СООН, СОИН₂, С_!-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил или СООК_Ь, где К_ь означает С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил.
10. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что В₄ означает Н, СООН или С1_-6алкил.
11. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что В₄ означает метил или этил.
12. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что К₄ означает СООН.
13. Нуклеозид по п.7, отличающийся тем, что К₃ и К₄ означают Н.
14. цис-2-Г идроксиметил-4-(2'-амино-6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан и его фармацевтически приемлемые соли.
15. цис-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан и его фармацевтически приемлемые соли.
16. цис-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-[1карбоновая кислота-циклопропиламино] пурин9'-ил)-1,3-диоксолан и его фармацевтически приемлемые соли.
17. (-)-(2К,4К)-2-Г идроксиметил-4-(2'-амино6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (-)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
18. (+)-(28,48)-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино6'-циклопропиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (+)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
19. (-)-(2К,4К)-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (-)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
20. (+)-(28,48)-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино6'-циклобутиламинопурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (+)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
21. (-)-(2К,4К)-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-[1-карбоновая кислота-циклопропиламино] пурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (-)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
22. (+)-(28,48)-2-Гидроксиметил-4-(2'-амино-6'-[1-карбоновая кислота-циклопропиламино] пурин-9'-ил)-1,3-диоксолан, представленный в форме (+)-энантиомера по меньшей мере на 97%.
23. Применение нуклеозида по любому из пп.1-22 в качестве лекарственного средства для медицинской терапии.
24. Применение по п.23 в качестве средства для лечения вирусных инфекций.
25. Применение по п.24 в качестве средства для лечения инфекции ВИЧ.
26. Применение по п.24 в качестве средства для лечения инфекции ВГВ.
27. Применение по п.23 в качестве активного компонента лекарственного средства для лечения вирусных инфекций.
28. Комбинация, используемая для лечения вирусных инфекций, отличающаяся тем, что она содержит по крайней мере одно соединение по любому из пп.1-21 или его фармацевтически приемлемые соли и по крайней мере один дополнительный терапевтический агент, выбранный из нуклеозидных аналогов, ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы или ингибиторов протеаз.
29. Комбинация по п.28, отличающаяся тем, что в качестве нуклеозидного аналога она содержит зидовудин, диданозин, зальцитабин, ставудин или ламивудин.
30. Комбинация по п.28, отличающаяся тем, что в качестве ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы она содержит невирапин, делавирдин или эфавиренц.
31. Комбинация по п.28, отличающаяся тем, что в качестве ингибитора протеаз она содержит индинавир, нелфинавир, саквинавир или ритонавир.
32. Способ лечения вирусных инфекций, отличающийся тем, что вводят терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-22 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что проводят лечение вирусной инфекции, представленной инфекцией вируса иммунодефицита человека.
34. Способ по п.32, отличающийся тем, что проводят лечение вирусной инфекции, представленной инфекцией вируса гепатита В.
35. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит по крайней мере одно соединение по любому из пп.1-22 и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.