CN104388403A - 一种高温酯酶、基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高温酯酶、基因及其应用，从海洋嗜热菌Geobacillussp.JM6中克隆得到新的酯酶基因，并在E.coli中进行表达和纯化，得到重组酯酶；酶学性质研究表明，酶的最适反应温度和pH分别为60℃和7.5；在100℃条件下处理18h，酶能保持68%活力；37℃条件下，酶在pH5.0~12.0的缓冲液中处理1h，酶仍能保留60%以上的活力；苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制重组酯酶的活性，表明该酶含有在催化机制中有重要作用的丝氨酸残基；重组酶对测试使用的洗涤剂、变性剂和有机溶剂都具有较好的耐受性。该重组酯酶具有优良的酶学性质，同时本发明也成功地构建了含上述新型酯酶基因的重组载体，实现了异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。

Description

一种高温酯酶、基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程的技术领域，尤其涉及一种高温酯酶、基因及其应用。
背景技术
酯酶广义上是指具有催化水解酯键能力的一类水解酶的统称，其主要分成两类：羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)和脂肪酶(EC 3.1.1.3)，而通常所说的酯酶往往指羧酸酯酶，主要用来催化水解脂肪酸族及芳香族酯类的化合物。一般来说，脂肪酶催化水不溶性、长链酰基甘油酯(酰基链碳原子数大于10)的水解及合成，而羧酸酯酶对水溶性、短链酰基甘油酯(酰基链碳原子数小于10)的活力较强。作为一种重要的工业酶类，酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，并具有良好的区域选择性和立体选择性，广泛应用于医药、化工、食品、能源及环境保护等领域。
酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中。由于动植物来源有限，生产成本高，使得其来源的酯酶的应用受到了很大程度的限制。微生物酯酶进行的催化反应具有反应条件温和、反应介质的选择性大、不需辅酶、便于生产和获得高纯度制剂等优点。
来自嗜热微生物的酶具有高的热稳定性，而且对有机溶剂和多种变性环境有抗性，在工业上有很大的应用潜能。由于嗜热微生物培养条件一般比较苛刻，有些甚至在实验室中难以培养，可以通过基因工程技术，将热稳定酶基因在中温型微生物(例如E.coli)中高效表达，生产大量的热稳定酶。嗜热微生物酯酶由于具有对高温和有机溶剂的稳定性而备受关注，这些酶也可以用于蛋白质热稳定性的分子机制研究。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种高温酯酶、基因及其应用，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高温酯酶、基因及其应用，该酯酶可用于短链酰基甘油酯降解及其他酯类化合物的生物催化转化。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种编码酯酶EstJM6的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小为750bp。
一种酯酶蛋白EstJM6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该蛋白编码249个氨基酸残基，将该氨基酸序列在GenBank中利用BLAST进行相似性搜索，发现它与来自Geobacillus sp.GHH01(GenBank收录号为YP 007402135)的热稳定单酰甘油脂肪酶的相似度高达98％。结构预测显示，Ser97、Asp196和His226构成了Geobacillus sp.JM6酯酶的催化三联体。
一种酯酶表达载体，含有所述的酯酶EstJM6基因的表达载体pET-28a-est。
一种重组酯酶的制备方法，包括采用所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。当然，也可将酯酶EstJM6基因转染到合适的真核生物宿主中，包括酵母及哺乳动物细胞等。
作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为大肠杆菌。
作为实施例的优选方式，包括采用所述的酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组酯酶。
作为实施例的优选方式，所述的IPTG终浓度为0.25mmol/L，诱导温度为37℃。
一种重组酯酶，包括采用所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶。
作为实施例的优选方式，在100℃条件下处理18h，酶能保持68％活性；37℃条件下，酶在pH 5.0～12.0的缓冲液中处理1h，酶仍能保留60％以上的活性
通过酯酶活力测定，本次发明的酯酶EstJM6或者表达酯酶基因的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如对硝基苯乙酸酯和对硝基苯丁酸酯，其中底物为对硝基苯乙酸酯时，酶的催化活性最高。
该酯酶为一种热稳定酯酶，催化水解的温度范围为20～90℃，最适温度为60℃；所述的水解pH范围为6.0～9.0，最适pH为7.5。在60～100℃条件下处理18h，酶蛋白仍可保持60％以上的相对活力。在pH5.0～12.0条件下处理1h，酶蛋白仍可保持60％以上的相对活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制重组酶的活性，表明该酶含有在催化机制中有重要作用的丝氨酸残基。重组酶对测试使用的洗涤剂、变性剂和有机溶剂都具有较好的耐受性。
本发明从海洋嗜热菌JM6中克隆获得了新的热稳定酯酶基因，发现了该基因编码的酶蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯的生产过程。同时，本次发明也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该酯酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。
附图说明
图1为酯酶EstJM6的诱导表达及其纯化检测的SDS-PAGE图。其中，M：分子量标准蛋白；1：含pET-28α(+)阴性菌，IPTG诱导；2：含pET-28α-est阳性菌，未诱导；3：含pET-28α-est阳性菌，IPTG诱导；4：纯化后的重组蛋白；
图2为酯酶EstJM6的最适反应温度曲线图；
图3为酯酶EstJM6的最适反应pH曲线图；
图4为酯酶EstJM6的热稳定性曲线图；
图5为酯酶EstJM6的pH稳定性曲线图。
具体实施方式
实施例1：酯酶基因的获取
利用细菌基因组提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取嗜热菌Geobacillus sp.JM6的基因组，利用酯酶基因简并引物，扩增酯酶基因：
上游引物(SEQ ID NO.3)：5′-ATGARWGAACRATATCC-3′；
下游引物(SEQ ID NO.4)：5′-TCMRGCRTGYTTGGCGA-3′；
PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，46℃45sec，72℃，1min30个循环；72℃10min。PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收目的基因，产物与T载体进行常规连接，采用CaCl2转化法转化至E.coli DH5α细胞中。从氨苄青霉素筛选平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定含酯酶基因的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，分析插入序列，获得长度为750bp的酯酶基因的开放阅读框序列。
实施例2：酯酶基因的重组表达质粒与重组菌株的构建
将本发明获得的酯酶基因克隆到表达载体上，构建重组表达质粒。利用扩增酯酶全基因的特异性引物，扩增基因全长序列：
上游引物(SEQ ID NO.5)：5′-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3′，
下游引物(SEQ ID NO.6)：5′-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3′；
PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃45sec，72℃，1min30个循环；72℃10min。采用酶切克隆的方法构建重组表达质粒，即用BamHI和HindIII双酶切PCR产物，割胶回收酶切后的片段与同样经BamHI和HindIII双酶切的质粒pET-28a(+)进行连接，采用CaCl2转化法转化至E.coli DH5α中。从卡那霉素筛选平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定含酯酶基因est的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，验证插入序列。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，构建重组酯酶表达菌株。
实施例3：利用重组表达菌株表达和纯化重组酯酶
重组表达菌株过夜培养后，按体积比1：100转接到200mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，37℃、180r/min培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.25mmol/L IPTG，37℃、180r/min培养6h。离心收集菌体，重悬于Buffer A(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，15mmol/L咪唑，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。4℃下离心，收集上清，然后进行Ni-NTA亲和层析，经过洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，30mmol/L咪唑，pH 8.0)洗涤后，利用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，纯化后的重组酯酶蛋白的分子量为32.8kDa，结果如图1所示。用Bradford法测定蛋白质浓度，得到浓度约1.0mg/mL的重组酯酶EstJM6。
实施例4：重组酯酶的活性检测
采用对硝基苯酚丁酸酯法测定酯酶的活力。具体操作：将对硝基苯酚丁酸酯用乙腈稀释到100mmol/L，将乙腈(包含底物)/异丙醇/50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)按1:4:95配制底物溶液，保证对硝基苯酚丁酸酯终浓度为1mmol/L；加入3μL的稀释后的酶液(1:3稀释)，60℃下温育15min后，测定反应溶液在405nm的吸光值。
实施例5：酯酶EstJM6最适反应条件的研究
酯酶最适反应温度在20～90℃的范围内测定。具体操作：采取前文所用的体系，分别在20、30、40、50、60、70、80和90℃条件下反应15min，测定405nm的吸光值。测定结果表明：酯酶EstJM6的最适反应温度为60℃，在90℃仍然具有约40％的相对活力，结果如图2所示。
酯酶的最适反应pH在4.0～12.0的范围内测定。测定使用的缓冲液为：50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0～6.0)，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0～7.5)，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5～9.0)，50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠(pH9.0～11.0)和50mmol/L磷酸二氢钠-氢氧化钠(pH11.0～12.0)。测定结果表明：酯酶EstJM6的最适反应pH为7.5，在pH范围6.0～9.0范围内都具有活性，结果如图3所示。
实施例6：酯酶EstJM6的酶学稳定性分析
酯酶的热稳定性在60～100℃范围内进行测定。具体操作为：将纯化后的酶液分别保温在60、70、80、90和100℃下，每隔2h取出部分酶液，进行酶活测定。测定结果表明：酯酶EstJM6具有极好的热稳定性，即使经过100℃处理18h，仍可保留68％的相对活力，结果如图4所示。
酯酶的pH稳定性在4.0～12.0范围内进行测定。具体操作为：将酶置于不同pH值的缓冲液中，37℃温育1h后，进行酶活力测定。测定结果显示：酯酶EstJM6具有较好的pH稳定性，在pH5.0～12.0条件下处理1h，酶蛋白仍可保持60％以上相对活力，结果如图5所示。
金属离子对酯酶活性的影响的测定具体操作为：将酶液加入含有1mmol/L或10mmol/L金属离子(Na+、K+、Li2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Hg2+、Al3+和Fe3+)的底物溶液中，60℃下温浴15min，测定酶的活力。测定结果，如表1所示：1mmol/L的Li+、Ca2+和Mn2+，1mmol/L和10mmol/L的Mg2+对酯酶EstJM6活性基本没有影响；其它的测试均为负影响，高浓度(10mmol/L)的Hg2+和Al3+的抑制效应尤为明显。
表1金属离子对酯酶活性的影响
抑制剂、洗涤剂、变性剂和有机溶剂对酯酶活性影响的测定具体操作为：将酶液置于含有1mmol/L或10mmol/L抑制剂(EDTA、β-巯基乙醇、DTT、PMSF)、0.1％或1％去垢剂(SDS、Chaps、Tween20、Tween80、Triton X-100和脱氧胆酸钠)、2.5mol/L或5mol/L变性剂(尿素和盐酸胍)、不同浓度(10％、30％、50％和90％)的有机溶剂(二甲基亚砜/DMSO、甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、二甲基亚砜/DMF、三氯甲烷/氯仿、二甲苯和正己烷)的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，37℃温育30min后，进行酶活力测定。测定结果显示：PMSF会严重抑制酯酶的活力，结果如表2所示，说明酯酶EstJM6的作用机理与经典模型Ser-Asp/Glu-His催化三联体密切相关；酯酶EstJM6对测试的洗涤剂具有好的抗性，结果如表3所示；5mol/L尿素和盐酸胍处理后，酶分别保留61％和78％的相对活力，结果如表4所示；酯酶对测试的有机溶剂具有不同程度的耐受性，结果如表5所示。
表2抑制剂对酯酶活性的影响
表3洗涤剂对酯酶活性的影响
表4变性剂对酯酶活性的影响
表5有机溶剂对酯酶活性的影响
综上所述，本发明从海洋嗜热菌JM6中克隆获得了新的热稳定酯酶基因，发现了该基因编码的酶蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯的生产过程。同时，本次发明也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该酯酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1. 一种编码酯酶EstJM6的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 一种酯酶蛋白EstJM6，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3. 一种酯酶表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的酯酶EstJM6基因的表达载体pET-28a-est。
4. 一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求3所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。
5. 根据权利要求4所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：所述的寄主细胞为大肠杆菌。
6. 根据权利要求5所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用所述的酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组酯酶。
7. 根据权利要求6所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：所述的IPTG终浓度为0.25 mmol/L，诱导温度为37℃。
8. 一种重组酯酶，其特征在于：包括采用权利要求3所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶。
9. 根据权利要求8所述的一种重组酯酶，其特征在于：在100℃条件下处理18 h，酶能保持68%活性；37℃条件下，酶在pH 5.0~12.0的缓冲液中处理1 h，酶仍能保留60%以上的活性。
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