CN109156336A - 一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法。该方法包括植株培育、恢复系的初选、复选和决选。该方法中利用PR‑CAPS分子标记筛选出具有恢复基因连锁标记的甜色素椒材料；并以其为父本、以100%核质互作型雄性不育系为母本，配制杂交组合，并对杂交种进行育性鉴定，再通过连续回交等方法选育恢复系；同时根据果实色价、褪色程度进一步选育出高色价且褪色缓慢的恢复系。本发明结合分子标记辅助筛选、杂交、连续回交、辣椒色价及褪色测定方法等技术选育出甜色素椒恢复系。以根据本发明方法选育出的雄性不育恢复系为父本，可配制出高色价、不易褪色、加工性状好的甜色素椒杂交种，对加快育种进程具有重要意义。

Description

一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法

技术领域

本发明属于辣椒育种技术领域，具体涉及一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)为茄科辣椒属植物，属于一年或多年生草本植物。原产地区是中拉丁美洲热带地区，原产国是墨西哥，明朝末年引入中国。随着我国商品经济发展和农业产业结构的调整，辣椒种植面积逐年扩大，现已成为振兴农村经济，增强农业产业发展后劲的拳头产品。近年来，我国已成为世界主要的辣椒出口国，出口量居世界第一位。其中我国生产的干辣椒已销往日本、俄罗斯、欧洲、非洲等国家。

甜色素椒是用于工业萃取辣椒红色素，且辣度低的辣椒类型，在辣椒红色素萃取工业中占有重要地位。其中辣椒红色素是一种安全无毒副的天然色素，安全性已得到世界性的公认，目前已广泛应用于食品加工、医药、保健品、化妆品等行业。辣椒色素被联合国粮农组织列为A类色素，能够不加以限量的使用。辣椒红色素是世界最走俏的产品，是销量最大的天然色素。因此，辣椒红色素受到人们的极大重视，这给它带来了巨大的市场。但是，现在所种植的甜色素椒中色素含量参差不齐，专用甜色素椒品种也很缺乏。因此选育高色价的甜色素椒已成为重要育种工作。

在果实的色价方面，辣椒杂交种具有较强的杂种优势，但由于杂交种生产中，辣椒花器小而脆嫩，蕾期人工去雄操作难度大，技术性强，用工多，种子价格较高，且纯度难以保证，因此优良杂交种的推广受到限制。而利用辣椒雄性不育三系配套制种可省去人工去雄，简化杂交制种程序，降低制种成本，并且能保证种子纯度。因此，选育符合育种目标的，具有高色价且褪色缓慢的农艺性状优良的恢复系，至关重要。但目前育种实践工作中，高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系选育方法未见报道。

目前，关于辣椒恢复系选育方面，主要是通过以下方法：①先通过稳定不育系材料与候选辣椒材料进行杂交，通过根据其杂交后代育性进行筛选，当杂种一代育性为100％可育时，其父本就是恢复系，其他材料则淘汰。利用这种方法进行恢复系筛选的优点是能够在较短的时间内完成工作；但缺点在于缺乏对杂交后代可育性低于100％的材料进行恢复系的选育方法，直接淘汰这些材料会造成资源的浪费。②利用特殊辣椒材料进行恢复系选育，如：马志虎在2015年利用芽黄辣椒胞质雄性不育系与自交系辣椒父本花粉进行混合授粉，将收获的杂交种子播种，经多次筛选可育株系及可育株，并严格自交，最终获得恢复率为的芽黄辣椒胞质雄性不育恢复系。这种育种程序简便，育种目标性状及程序可控，可大幅度提高育种效率；但由于需要特殊的芽黄辣椒胞质雄性不育系材料，不适合各辣椒育种单位推广应用。

随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助筛选技术已在辣椒恢复系选育中得到应用。辣椒雄性不育的恢复主要由一个核恢复基因Rf控制，核恢复基因Rf的存在能抑制不育基因的表达，从而使育性得到恢复。至今，辣椒的恢复基因尚未被克隆，但与恢复基因连锁的分子标记的开发已取得了较好的进展。如：米志波、张洪源等利用与恢复基因连锁标记在羊角椒、线椒、灯笼椒、朝天椒等类型辣椒中进行了标记适应性研究，然后利用适应性广的标记筛选恢复系，这种方法具有简单快速的优点，但对于甜色素椒没有涉及。李怡斐在加工型辣椒细胞质雄性不育育性基因分子标记及辅助育种中发现PR-CAPS、CRF-SCAR和OPP13-CAPS三种分子标记的适应性较强。由于这些标记是与恢复基因紧密连锁的标记，与恢复基因还存在一定的遗传距离，因此不同标记在辣椒不同类型上适应性不同。目前，还没有找到在甜色素椒中适应性广的恢复基因连锁标记，制约了甜色素椒的恢复系选育进程。

优良的甜色素椒恢复系除在杂种一代中可恢复母本的雄性不育性外，还需要具有高色价和褪色缓慢的性状。关于辣椒果实色价测定方面，目前主要有国标法(GB10783-2008)和高效液相色谱法(HPLC)两种方法。国标测定法具有快速、简单、可大批量进行操作的优点，但缺点是由于没有量化明确辣椒果实样品的取样部位及粉碎程度等前处理因素，导致辣椒色价测定结果出现结果重复性差和不同单位的测定结果可比较性差等问题，直接影响对育种材料的评价。而高效液相色谱法虽然能够准确测定辣椒色价但仪器价格昂贵，但测定时间长，需要摸索色谱实验条件。因此急需适于大量辣椒材料色价测定的简单、快速的方法。

甜色素椒在干制过程中会由于阳光的直射及储存温度导致褪色现象，导致辣椒红色素回收量降低，进而减少效益，因此选育褪色缓慢的辣椒至关重要。目前辣椒褪色研究中没有统一的试验标准和流程方法，只是简单将辣椒放在阳光下直射，通过观察褪色情况进行判断，由于没有量化试验环境的光强、温度、空气流通等因素，导致试验结果同样缺乏重复性和不同单位的可比性。

发明内容

本发明的目的是提供了一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法。本发明将会结合分子标记辅助筛选、杂交组合、花期田间育性调查、连续回交、色价及辣椒褪色测定方法等技术路线，选育出甜色素椒高色价及不易褪色的恢复系，加快了甜色素椒恢复系的选育速度，为今后的育种工作提供优良恢复系。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，它包括以下步骤：

(1)植株培育：将待筛选的甜色素椒恢复系种子和甜色素椒的100％核质互作型雄性不育系种子进行培育，在6-7叶期进行田间定植；

(2)恢复系初选：提取待筛选的恢复系的叶片的DNA进行PCR扩增，利用PR-CAPS分子标记筛选具有恢复基因连锁标记的甜色素椒；

(3)恢复系复选：以100％核质互作型雄性不育系材料为母本、以分子标记PR-CAPS筛选出的待筛选的恢复系为父本，进行杂交，培育得到杂交种，根据花器官育性鉴定的结果进行恢复系复选；

(4)恢复系决选：根据复选得到的待筛选的恢复系材料的果实色价、褪色程度进一步筛选出高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系。

进一步的：所述步骤(3)中育性鉴定方法为：

a.杂交后代植株雄性可育率为100％，则其父本为恢复系，直接入选候选恢复系；

b.杂交后代植株雄性可育率在51-99％之间，则选可育株上花朵，单株挂牌标记与父本连续回交，直至杂交后代雄性可育率达到100％，则入选候选恢复系；

c.杂交后代植株雄性可育率低于50％，则直接淘汰。

进一步的：所述步骤(4)中根据褪色程度筛选恢复系的方法为：在辣椒粉褪色检测装置中光照7-10天，若辣椒粉表面维持原来颜色或轻微颜色变淡为褪色弱；若辣椒粉表面几乎全部都变黄则为褪色强。

进一步的：所述步骤(2)中所述PR-CAPS的引物序列为：

F：5’-ATGTCACCCCCACACACTCCTTCACCT-3’，

R：5’-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3’。

进一步的：所述步骤(2)中PCR反应体系为：模板DNA 4μL、2×Master Mix 13μL、正向和反向引物各0.5μL、ddH₂O 7μL。

进一步的：所述步骤(2)中PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min并于4℃保存。

进一步的：步骤(4)中果皮色价的测定方法中粉碎度选择过100目筛、取样量选择0.1g。

进一步的：所述步骤(4)中果皮粉碎为粉状，色价≥25的辣椒材料入选，色价＜25的材料淘汰。

进一步的：所述步骤(4)使用辣椒粉褪色检测装置检测褪色程度，所述褪色检测装置包括辣椒粉褪色检测箱体、LED灯箱、门、样品盘和褪色盒、电源开关按钮、合页。

进一步的：所述辣椒是用于工业萃取辣椒红色素的低辣度的辣椒品种。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

1、本发明通过利用分子标记辅助筛选、候选材料单株与稳定雄性不育系测配、杂交组合花期田间育性调查、连续回交、色价及辣椒褪色测定等方法，建立了一种快速选育高色价且褪色缓慢的色素类型辣椒恢复系的方法。

2、应用恢复基因连锁标记PR-CAPS

(F：5’-ATGTCACCCCCACACACTCCTTCACCT-3’，

R：5’-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3’)，可快速进行甜色素椒苗期恢复系候选材料辅助筛选，且不影响植株正常生长，减少育种工作量。

3、本发明从辣椒果实取样、粉碎、溶剂提取环境、稀释倍数等角度，将测定辣椒色价的国标法进行优化，能够最大限度的降低因测定方法带来的误差，提高辣椒色价测定的重复性、可比性。

4、本发明的一种辣椒粉褪色检测装置，可快速准确鉴定辣椒褪色的快慢程度。

5、应用本方法选育的高色价、褪色慢的甜色素椒恢复系，可以在辣椒雄性不育三系配套杂交育种中作为优良父本使用，配制出高色价、不易褪色、加工性状好的甜色素椒杂交种，对加快甜色素椒选育进程有重要意义。

附图说明

图1是PR-CAPS在32份甜色素椒候选材料中的扩增结果；

图2是所述辣椒粉褪色检测装置图；其中1、检测箱体，2、LED灯箱，3、门，4、样品盘和褪色盒，5、电源开关按钮，6、合页；

图3是样品盘和塑料褪色盒；

图4是透明塑料褪色盒剖面图，7是透明塑料褪色盒侧壁；8是辣椒粉样品；

图5是应用辣椒粉褪色检测装置进行辣椒褪色鉴定的前后褪色强弱对比图；

图6是应用辣椒粉褪色检测装置进行辣椒褪色鉴定的前后对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1

1.用于恢复系选育的辣椒材料准备

1.1为选育甜色素椒恢复系的候选材料种子准备

准备待筛选的恢复系辣椒材料的种子150粒以上，其中75粒用于播种，剩下的75粒干燥保存备用。

1.2为进行甜色素椒测交所需的100％核质互作型雄性不育系种子准备

准备椒型相近的甜色素椒，且2代以上稳定遗传的100％核质互作型雄性不育系种子。种子数量依据候选恢复系材料数量确定，通常每份候选恢复系材料测交需要不育系种子10-20粒。

1.3材料培育

(1)穴盘和基质准备

准备足够的72孔穴盘、草炭和珍珠岩。将草炭和珍珠岩按2∶1混合(体积比)，加水使混合的基质含水量达到50％-60％，最后将基质装到穴盘，并用薄膜密封。

(2)辣椒种子消毒及播种

先用温水浸泡种子15min，然后放在55℃的热水中5-6hr，捞出后将种子播在穴盘中。

(3)苗床管理

将播种后的穴盘整齐的放置在苗床上，并用喷雾器喷透基质。在育苗期间，保证苗床的温度控制在25-28℃，并保持通风。辣椒苗长到3-5叶期的真叶，可进行分子标记辅助恢复系筛选的取样。

(4)定植

待在辣椒苗长到6-7叶期，进行田间定植。

2.利用恢复基因紧密连锁标记PR-CAPS筛选辣椒恢复材料

2.1采样

对甜色素椒候选恢复系材料，于3-5叶期，取2片叶片用于DNA提取，同时保留其它叶片以不影响该植株正常生长。

2.2DNA提取

(1)取辣椒幼苗新鲜幼叶于1.5mL离心管中；

(2)随即用液氮冷冻样品，待叶片冷冻完全且无液氮残留后立即用液氮冷冻过的专用玻璃棒迅速充分研磨叶片成粉末；

(3)迅速加入750μL 65℃预热的2％CTAB提取液，颠倒混匀，65℃水浴45min，期间颠倒混匀2～3次。

(4)水浴后加入等体积750μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒摇匀5min，在12000rpm离心5min。

(5)吸取400μL上清液至另一1.5ml离心管中，加入2倍上清液体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻摇颠倒几次，放置于4℃冰箱下静置待白色絮状沉淀出现；

(6)将溶液12000rpm离心5min，弃上清液，用400μL 75％的乙醇清洗2次，放入烘箱中烘干；

(7)加入100μL dd H2O(2％RNase灭菌dd H₂O)，在室温放置一夜以降解残余的RNA；

(8)涡旋仪震荡均匀，用分光光度计测定所提DNA质量和浓度，然后将DNA稀释至100ng/ml后于-20℃冰箱保存。

2.3恢复基因连锁标记信息

表1：辣椒恢复基因连锁标记信息

2.4 PCR扩增

本发明中的PCR扩增程序和体系与所有公开报道的都不一样。

(1)本实施例中根据样品DNA提取检测的浓度确定DNA模板体积，DNA的浓度保证小于0.02μg/μl，同时相应确定ddH₂O的体积，确定PCR反应体系如下：

25μLPCR反应体系：4μL模板DNA、13μL2×Master Mix、正向和反向引物各0.5μL、7μL ddH₂O。

(2)根据本实施例中所使用的试剂，本发明进行预实验优化，确定PCR反应参数，进而确定反应程序：

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min并于4℃保存。

2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物

(1)组装玻璃板

按说明正确组装玻璃板，用同一规格夹子夹紧两侧及底部，放置在实验台上。

(2)灌胶

按配方配制6％聚丙烯酰胺凝胶，摇匀后缓慢倒入玻璃板中间，并赶走气泡，插上数字，等待约40min胶面凝固。

6％聚丙烯酰胺凝胶配方：

(3)组装

将已经凝固的玻璃板安装到倒有1％TBE缓冲液的电泳槽中，赶走底部的气泡并在两侧用夹子夹紧。

(4)点样

拔掉梳子，用移液枪取2μL的PCR产物点到点样孔中。

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳

将电泳槽连接电泳仪，在180V、130mA条件下跑100-110min。

(6)银染

点泳结束后，轻轻撬开玻璃板，用染色剂染色10min。

染色剂配方：

(7)漂洗

利用蒸馏水漂洗2min，洗两遍。

(8)显色

于显色液中显色至条带清晰为止.

显色剂配方：氢氧化钠 20g

甲醛溶液 7ml

蒸馏水 1000ml

(9)漂洗

将凝胶放在蒸馏水中。

(10)结果记录

将凝胶放置在灯箱上拍照，并按照条带大小进行结果统计。

2.6甜色素椒材料中具有恢复基因连锁标记的初步筛选

利用PR-CAPS分子标记进行甜色素椒具有恢复基因连锁标记的筛选。32份甜色素椒材料中，有17份材料，18133、18137、18144、17146、18154、18155、18157、18158、18160、18171、17134-2、18138-1、18141-2、18150-1、18150-2、18170-1、18170-2，扩增出600bp目的条带，见图1，这17份材料中具有恢复基因连锁标记。因此，在32份候选材料中，经苗期PR-CAPS分子标记筛选有17份材料为候选恢复系，其它材料淘汰，见表2。

表2：分子标记PR-CAPS在甜色素椒中的扩增结果

3.甜色素椒候选恢复系的田间杂交复选

(1)配制杂交组合

a.确定父母本

按照1.3中所述的方法培育材料，40目隔离网室内种植。以遗传稳定的100％核质互作型雄性不育系材料为母本，以经分子标记PR-CAPS筛选出的17份候选恢复系为父本，花期配制杂交组合。

b.花粉制备

在花期，采摘父本即将开放的大花蕾花药，放在盛放石灰的干燥器中散粉，并做好标记。

c.花期杂交

取粉后2-4天内将父本的花药授粉到母本开放花的柱头上，同时用塑料吊签做好标记。果实红熟期，连同塑料吊签一起采收果实，取出杂交种子。

(2)杂交组合花期育性鉴定和筛选

将采收的杂交种在40目隔离网室内种植，盛花期根据花粉量多少对其进行育性鉴定：

a.杂交后代植株雄性可育率为100％，则其父本为恢复系，直接入候选恢复系；

b.杂交后代植株雄性可育率在51-99％之间，则选可育株上花朵，大蕾期去雄，单株挂牌标记与父本进行回交，连续回交，每个种植期均拔除不育株，直至杂交后代雄性可育率达到100％，则入选候选恢复系；

c.杂交后代植株雄性可育率低于50％，则直接淘汰。

(3)育性验证鉴定

通过表3可知，以遗传稳定的100％核质互作型雄性不育系材料为母本，以候选恢复系为父本，配制的杂交组合，杂交种植株育性鉴定结果，共有15份甜色素椒材料直接入选候选恢复系，2份材料需经连续回交后入选候选恢复系。

表3：杂交种田间育性鉴定结果

4.甜色素椒候选恢复系的果实色价筛选

4.1入复选辣椒恢复系的辣椒粉制备

辣椒果实色价测定的样品为辣椒粉。采摘2-5节辣椒红熟期果实于烘箱内40℃烘至恒重，并去除辣椒籽及果柄，取约25g辣椒放入FW100高速万能粉碎机中粉碎2min。辣椒粉装入自封袋中密封、黑暗、4度低温下保存待测。

4.2辣椒果皮色价的测定

(1)用电子天平称取0.1g(精确至0.0002g)过100目筛的辣椒粉(精确至0.0002g)于100ml容量瓶中，加入约70ml丙酮；

(2)于42℃恒温水浴振荡器中浸提30min，此过程黑暗避光；

(3)取出后放在暗处降至室温并准确定容至100ml；

(4)根据提取液的颜色稀释至200-600倍，根据辣椒粉颜色深浅而定；

(5)用分光光度计测定460nm处的吸光度值(吸光值需在0.3-0.7之间，否则调节稀释倍数)，以丙酮做空白对照，记录数据；

(6)色价的计算

E＝Af/m×1/100

(E为辣椒色价；A为实测样品的吸光度，f为稀释倍数，m为试样质量，单位g)。

4.3色价测定方法优化实施例

4.3.1不同粉碎度对辣椒色价测定的影响

通过测定高色价、中色价、低色价三种色价不同的辣椒材料在粉碎度为6目、10目、16目、100目下的色价值发现，四种不同粉碎度之间的色价含量存在显著差异，且在粉碎度100目时色价最高，见表4。因此，量化辣椒粉粉碎度对辣椒色价测定的重复性和不同育种单位测定结果的可比性具有重要作用。

表4：粉碎度对辣椒色价的影响

4.3.2不同取样量对辣椒色价测定的影响

通过测定高色价、中色价、低色价三种色价不同的辣椒材料在取样量为0.1g、0.2g、0.4g、0.8g下的色价发现，取样量不同对色价测定值也存在显著影响，取样量为0.1g时，色价值最高，见表5。因此，量化辣椒粉色价测定取样量对辣椒色价测定的重复性和不同育种单位测定结果的可比性具有重要作用。

表5：取样量对辣椒色价的影响

4.4根据辣椒果实色价值筛选候选甜色素椒恢复系

入选辣椒果皮色价≥25的辣椒材料，而色价＜25的材料淘汰。通过色价测定，只有18133、18144、18146、18154、18155、18141-2共6份材料入选，继续进行辣椒褪色程度的筛选，见表6。

表6：恢复系材料果实色价测定结果

5.高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系决选

5.1辣椒粉准备

以上高色价甜色素椒18133、18144、18146、18154、18155、18141-2，摘2-5节辣椒红熟期果实于烘箱内40℃烘至恒重，并去除辣椒籽及果柄，取约25g辣椒放入FW100高速万能粉碎机中粉碎2min。

5.2一种辣椒粉褪色检测装置

本实施例中使用了辣椒粉褪色检测装置检测褪色程度。

见图2所示，所述辣椒粉褪色检测装置包括检测箱体1，所述检测箱体1上设有控制LED灯箱开关的电源开关按钮5，所述检测箱体1外通过合页6与门3连接，所述检测箱体1内设有上下两层LED灯箱2，所述检测箱体1中部安装有支架，在检测箱体1底部和支架上放置样品盘和塑料褪色盒4，所述上层LED灯箱用于给支架上的样品盘和褪色盒提供光照，所述下层LED灯箱用于给底层放置的样品盘和褪色盒提供光照。

(1)辣椒粉褪色检测箱体

为遮蔽外部光照不稳定对辣椒粉褪色鉴定的影响，将待鉴定的辣椒粉样品放在褪色检测箱内，且检验箱放在25-28℃室内进行鉴定。此褪色检验箱长100cm，宽100cm，高103cm，外体材料为实芯理化板。

(2)LED灯箱

为使得检验箱内光强一致，在上下两层样品盘上方均设LED灯。LED灯箱长90cm，宽90cm，厚1cm，光强40000-43000Lux，共64个LED灯珠，可24小时连续照明，LED灯固定在厚度为1cm的实芯理化板上。

(3)门

为遮蔽外部光照，对褪色检验的影响，以厚度为1cm的实芯理化板为材料制作装置箱的门。

(4)样品盘和褪色盒

为保证待检测的辣椒粉，在同样的面积下接受光照，需将辣椒粉放在设有褪色盒的样品盘内。样品盘长70cm，宽70cm，厚1cm；材料为黑色尼龙板，厚度为1cm，见图3；样品盘中有36个透明塑料褪色盒，透明塑料褪色盒的高1.5cm、直径3cm、厚1.5mm，见图4。

(5)电源开关按钮

控制LED灯箱的开关，保证实验安全，避免使用期间因操作不当引起事故。

(6)合页

材料为不锈钢材质，方便开关门盒放置样品盘。

5.3辣椒粉褪色等级鉴定

称取0.3-0.5g样品放在所述辣椒粉褪色检测装置的塑料透明褪色盒中，并在40000-43000Lux的光强下进行褪色实验，并保证褪色箱中环境保持干燥，温度保持在25-28℃且材料受光均匀。每隔12小时搅动一次，共搅动4-7天。按照本发明提出的辣椒粉褪色等级评定标准进行鉴定。在“辣椒粉褪色检测装置”中光照7-10天后若辣椒粉表面维持原来颜色或轻微颜色变淡为褪色弱；若辣椒粉表面几乎全部都变黄则为褪色强，见图5。通过褪色实验结果，见图6，筛选出18154、18141-2、18155三份色价高且褪色缓慢的甜色素椒恢复系，结果见表7。

表7：6份高色价甜色素椒恢复系材料褪色实验结果

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcacccc cacacactcc ttcacct 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccatctag cctctgcctt ctcaaatg 28

Claims (10)

1.一种高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）植株培育：将待筛选的甜色素椒恢复系种子和甜色素椒的100%核质互作型雄性不育系种子进行培育，在6-7叶期进行田间定植；

（2）恢复系初选：提取待筛选的恢复系的叶片的DNA进行PCR扩增，利用PR-CAPS分子标记筛选具有恢复基因连锁标记的甜色素椒；

（3）恢复系复选：以100%核质互作型雄性不育系材料为母本、以分子标记PR-CAPS筛选出的待筛选的恢复系为父本，进行杂交，培育得到杂交种，根据花器官育性鉴定的结果进行恢复系复选；

（4）恢复系决选：根据复选得到的待筛选的恢复系材料的果实色价、褪色程度进一步筛选出高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系。

2.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（3）中育性鉴定方法为：

a.杂交后代植株雄性可育率为100%，则其父本为恢复系，直接入选候选恢复系；

b.杂交后代植株雄性可育率在51-99%之间，则选可育株上花朵，单株挂牌标记与父本连续回交，直至杂交后代雄性可育率达到100%，则入选候选恢复系；

c.杂交后代植株雄性可育率低于50%，则直接淘汰。

3.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（4）中根据褪色程度筛选恢复系的方法为：在辣椒粉褪色检测装置中光照7-10天，若辣椒粉表面维持原来颜色或轻微颜色变淡为褪色弱；若辣椒粉表面几乎全部都变黄则为褪色强。

4.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（2）中所述PR-CAPS的引物序列为:

F:5’- ATGTCACCCCCACACACTCCTTCACCT-3’，

R:5’-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3’。

5.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（2）中PCR反应体系为：模板DNA 4μL、2×Master Mix 13μL、正向和反向引物各0.5μL、ddH₂O 7μL。

6.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（2）中PCR反应程序为：94℃预变性 5min；94℃ 30s，退火 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃延伸 10min并于4℃保存。

7.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：步骤（4）中果皮色价的测定方法中粉碎度选择过100目筛、取样量选择0.1g。

8.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（4）中果皮粉碎为粉状，色价≧25的辣椒材料入选，色价<25的材料淘汰。

9.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述步骤（4）使用辣椒粉褪色检测装置检测褪色程度，所述褪色检测装置包括辣椒粉褪色检测箱体、LED灯箱、门、样品盘和褪色盒、电源开关按钮、合页。

10.根据权利要求1所述的高色价且褪色缓慢的甜色素椒恢复系的选育方法，其特征在于：所述辣椒是用于工业萃取辣椒红色素的低辣度的辣椒品种。