CN103314839A - 一种农作物目标性状快速聚合育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，包括如下步骤：A步骤：创建受体亲本单拷贝非连锁早花植株；获得的早花植株仅含有一个早花基因，并且早花基因与需要聚合的所有目标性状均不在同一条染色体上；B步骤：目标性状快速聚合创制综合性状改良的突破性新材料。本发明利用拟南芥早花基因诱导早花来缩短育种周期，利用目标性状功能标记辅助选择，通过聚合育种结合回交纯化的方式快速把目标性状聚合到同一个种质中，克服常规方法周期较长的缺点，在2-3年内快速创制综合性状优良的突破性新种质，大大加快聚合育种的效率和进程。
Description
技术领域：
本发明属于农作物育种技术领域。主要针对目标性状已经开发功能分子标记的农作物，利用拟南芥早花基因(FLOWERING LOCUS T，即FT基因)诱导早花缩短生育期，利用目标性状功能标记辅助选择，通过聚合育种结合回交纯化的方式快速把目标性状聚合到同一个种质中，进而快速创制突破性新材料。具体的涉及一种农作物目标性状快速聚合育种方法。
背景技术：
品种是农业生产的基础，随着生产的发展以及各种病害的不断流行，农业生产迫切需要综合性状优良的新的突破性品种以满足生产需要。在实际的育种过程中，由于多数育种材料常常是某一或某几个目标性状比较突出，其他性状表现一般或较差，因此育种家常常采用目标性状互补原则对具有不同目标性状的种质进行杂交聚合，以获得综合性状优良的品种加以利用。然而，常规聚合育种周期较长，自交纯化较慢，且常规的目标性状鉴定方法一般也比较繁琐，特别是对分离群体的单株，同时进行多目标性状的鉴定难以实现，常在鉴定的过程中优良植株就会死去，大大限制了综合性状突破性品种的培育。
近年来，随着主要农作物目标性状功能分子标记的开发，分子标记辅助选择显示出了简单高效的优势，一定程度上促进了聚合育种的进程。但大部分作物生育周期较长，即使利用分子标记辅助选择，聚合获得一个稳定的突破性材料的时间也较长，常需要8-10年，即使常规加代，也需要4-5年。如何快速实现把多个目标性状聚合于一个品种中，实现综合性状的改良，成为育种家比较关心的问题。
为解决上述问题，市面上出现了一些目标性状快速聚合的育种方法，如，中国专利申请‘2011100979390’公开了‘一种油菜多目标性状的快速聚合育种方法’。具体为：选择需要聚合的优异育种目标性状，冬季在当地温室配制单交组合，异地夏繁配制多亲本的复式杂交组合，将多个具有优异目标性状的亲本按育种需要进行组装与聚合；对已实现多目标育种性状重组聚合的复式杂交后代进行小孢子苗培养，构建双单倍体(DH)育种群体，实现多目标性状聚合后代目的基因型的快速固定与纯合；对实现多目标性状聚合的后代目的基因型按性状特性进行有效的田间和室内鉴定与筛选，重要目标性状进行分子标记辅助选择，选育符合育种目标的新材料。其采用多亲本复式杂交、当地温室加代、异地夏季扩繁、小孢子培养和分子标记辅助选育等多种技术与手段共同构建目标性状的快速聚合育种方法。然其仍属于常规加代技术，总时间长度仍需要4-5年。而且，现实操作中，同时进行多目标性状的鉴定难以实现，常在鉴定的过程中优良植株就会死去，大大限制了综合性状突破性品种的培育。
鉴于现有技术中的问题，本发明旨在提供一种农作物目标性状快速聚合育种方法，利用拟南芥早花基因诱导早花来缩短育种世代，利用目标性状功能标记辅助选择加快目标植株的鉴定选择，同时在目标性状聚合的基础上，通过回交加快遗传背景的纯化速度，克服常规方法周期较长的缺点，在2-3年内快速创制综合性状优良的突破性新种质，大大加快聚合育种的效率和进程。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种农作物目标性状快速聚合育种方法。其利用拟南芥早花基因诱导早花来缩短育种世代，利用目标性状功能标记辅助选择加快目标植株的鉴定选择，同时在目标性状聚合的基础上，通过回交加快遗传背景的纯化速度，克服常规方法周期较长的缺点，在2-3年内快速创制综合性状优良的突破性新种质，大大加快聚合育种的效率和进程。
为了实现上述目的，本发明提供了一种农作物目标性状快速聚合育种方法，中，包括如下步骤：
A步骤：创建受体亲本单拷贝非连锁早花植株；获得的早花植株仅含有一个早花基因，并且早花基因与需要聚合的目标性状均不连锁，即，早花基因与需要的所有目标性状均不在同一条染色体上；B步骤：目标性状快速聚合育种创制综合性状改良的突破性新材料。
A步骤具体为：
(1)提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA，反转录获得cDNA；
(2)在NCBI上查找拟南芥早花基因序列(＞gi|4903011|dbj|AB027504.1|Arabidopsisthaliana FT(FLOWERING LOCUS T)mRNA，complete cds)，从ORF两端设计引物，同时考虑后续表达载体所用的双酶切位点，在引物5’端加上酶切位点，设计的引物为：
F：5’酶切位点序列+ACCACCTGTTTGTTCAAGATC；
R：5’酶切位点序列+GGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；
(3)利用设计的引物，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，把扩增产物和MARKER分别点到1％琼脂糖胶上跑胶，扩增产物中574bp的片段就是早花基因片段；利用DNA纯化试剂盒直接对目标产物进行纯化；
(4)把纯化获得的拟南芥早花基因，按照常规通用的转基因技术，利用构建的不含GUS基因但含有筛选标记的表达载体，通过农杆菌介导叶盘法转化拟进行目标性状聚合的受体亲中，获得受体亲本材料转早花基因阳性植株；
(5)利用SOUTHERN杂交技术鉴定早花阳性植株中早花基因的拷贝数，筛选含有单拷贝早花基因且早花基因表达的早花植株；
(6)受体亲本单拷贝早花植株分别与需要聚合的目标性状供体亲本配制杂交组合，获得的杂交组合分别继续与非早花受体亲本进行回交(测交)，分别统计不同回交(测交)后代早花性状与目标性状的分离比例，经卡方检验选择早花基因与所有供体目标性状均不连锁的受体亲本单拷贝早花植株备用。
B步骤具体为：受体亲本多数性状优良，但不含A、B、C......等目标性状，且A、B、C......等目标性状均已经开发了功能分子标记，具体步骤如下：
(1)以创制的受体亲本的单拷贝非连锁早花植株作为父本，以具有目标性状A的供体亲本A为母本杂交；(2)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A目标性状的单株作为父本，以具有目标性状B的供体亲本B为母本杂交；(3)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A和B目标性状的单株作为父本，以具有目标性状C的供体亲本C为母本杂交；(4)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B和C的目标性状的单株作为父本，可以持续和其他目标性状供体杂交，然后重复以上目标性状聚合过程，直到所有目标性状全部聚合完成为止；(5)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......的目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本杂交；(6)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本连续回交3-4次，直到大部分性状和受体亲本基本相同为止。此时，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株自交；(7)在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有A、B、C......等目标性状，且这些目标性状均纯合的非早花单株自交留种；(8)继续种植目标性状聚合且纯合的自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列；(9)选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状改良的突破性新材料。
A步骤(2)中，根据NCBI中拟南芥FT基因(AB027504)的序列信息设计特异性引物，具体为：
上游引物FTF：5′-AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC-3′
下游游物FTR：5′-CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT-3′
A步骤(3)中，目的片段的PCR扩增：以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增的操作中，PCR反应体系为：
扩增条件为：98℃预变性30s后，98变性℃10s，49℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物即FT基因目的片段，用凝胶回收试剂盒回收获得的PCR产物，保存备用。
A步骤中，进一步包括如下步骤：中间载体构建，连接中间载体：
将纯化得到的片段与JET(ECORV)载体连接，连接体系及条件如下：
把混合好的体系放在16℃的水浴锅中，水浴过夜，进行连接反应；
转入感受态细胞：
转入感受态大肠杆菌，在37℃培养箱中倒置培养，过夜。挑取单克隆菌落，通过菌落PCR检测目的片段。PCR体系为：
挑去检测有目的条带的菌斑，摇菌提取质粒，测序；
表达载体P22-FT的构建
利用深圳华大基因研究院构建的不含GUS基因，含有SacI和SpeI两种限制性内切酶位点的P22载体作为表达载体，表达载体P22-FT的构建步骤如下：1)用SacI和SpeI两种限制性内切酶分别双酶切经测序完全正确的质粒和P22载体，酶切体系：
目的片段和载体分别50ul体系，在37℃过夜；
2)将双酶切的目的片段进行切胶回收纯化；3)纯化的目的片段与经过双酶切的P22质粒载体连接过夜；4)将上述反应产物转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃下震荡培养1h后涂板于加入了链霉素(10mg/L)的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；5)筛选转化菌株，测序正确后提取质粒用于农杆菌转化。
A步骤中，进一步包括如下步骤：FT基因表达载体的遗传转化，
植株外植体的培养：
1)70％乙醇消毒04-5002烟草种子30s后，用无菌水清洗两次，更换NaCl0处理25-30min，无菌水清洗四次；
2)将灭菌后的种子移至1/2MS固体培养基于25-26℃，14h光照/10h黑暗条件下萌发；
3)14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化；
农杆菌介导的烟草叶盘转化和筛选：
1)将菌液活化，挑取单菌落于YM培养基中28℃250rmp培养；
2)于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0.5cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；
3)10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养基的培养皿中，置于26℃黑暗条件下共培养48h；4)将共培养后的叶盘转移到分化培养基，28℃光培养。隔约15d更换培养基一次，至出现抗性芽；5)取出分化抗性芽，将其转接到生根培养基，28℃光培养；对转基因植株进行分子检测，获得单拷贝早花基因目标植株备用，
转基因植株PCR检测，基因组DNA提取，
利用DNA提取试剂盒，分别提取红花大金元转基因处理后获得的植株，
DNA水平检测：
以各植株提取的烟草基因组DNA为模板，扩增筛选标记潮霉素基因的部分片段。引物序列为：HygF：cgattccggaagtgcttgac；HygR：cgtctgctgctccatacaag。反应程序为PCR反应程序：
1％琼脂糖电泳检测PCR结果，对含有筛选标记的植株进一步进行mRNA水平检测，看是否有FT基因表达；
mRNA水平检测
以烟草看家基因NtActin基因设计特异性引物，通过半定量及荧光定量PCR技术对转基因植株中FT基因的表达进行分析，具体实验步骤如下：
1)样品总RNA的提取及cDNA合成，
2)反转录完成后直接进行PCR扩增，取2μl作模板，
外源FT基因扩增引物为：FTF：AAGCAGAGTTGTTGGAGACG；FTR：GGTTGTTCCAGTTGTAGCAG，目的片段268bp，
Actin基因扩增引物为：actinF：ATGGCAGACGGTGAGGATATTCA；actinR：TGGCGCAACACGAAGTTCGTT，目的片段300bp，反应体系同1.4；扩增程序为：
其中actin退火温度为55℃，循环数28；FT退火温度52℃，循环数35；
3)荧光定量PCR反应体系(20μL)包含10μL Thunderbird SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)，1.2μL的上下游引物(5μM)，2μL cDNA模板(约50ng/μL)以及ddH2O；PCR反应条件为：95℃1min；95℃变性15s，58℃退火40s，40个循环。荧光数据在退火时采集。以烟草中的管家基因actin作为内参基因，相对表达量采用Livak和Schmittgen(2001)的方法计算；选择FT基因在mRNA水平上有表达的植株，进行基因拷贝数的鉴定；
基因拷贝数鉴定(Southern blotting)
Southern杂交采用DIG High Prime lab/Detection Kit I(Roche)试剂盒，根据说明书操作进行；
目的片段的扩增回收：
以质粒PCR扩增的FT基因片段作为标记模板(1μg)，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用Fermentas公司DNAExtraction Kit #K0513回收，作为杂交探针使用；
基因组DNA酶切：
基因组采用HindIII单酶切，反应体系和程序如下：
地高辛探针标记和检测：
按照Roche公司DIG High Prime lab/Detection Kit I进行，选取杂交结果只有一条带的植株，用于下一步早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定。
A步骤中，进一步包括如下步骤：早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定，
(1)以鉴定获得的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交，通过回交后代早花性状与黑胫病抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株；
(2)以上面鉴定的早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交。通过回交后代早花性状与TMV抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与TMV抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株，提供下一步快速聚合育种利用。
B步骤中，以红花大金元种子为例，快速创制聚合黑胫病、TMV抗性的红花大金元新材料：1)、以创制的红花大金元单拷贝非连锁早花植株作为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交；2)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病抗性的单株作为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交；3)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本杂交；4)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本连续回交3次，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株自交；5)、在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有黑胫病和TMV抗性，且黑胫病和TMV抗性均纯合的非早花单株自交留种；6)、继续种植以上自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列。检测引物序列及扩增片段长度如下：
(1)FT基因扩增引物(Sac I/Spe I)如下，扩增片段574bp
FT-F：AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC
FT-R：CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；
(2)Ubi启动子扩增引物如下，扩增片段415bp
UbiF：CGGTCGTTCTAGATCGGAGT
UbiR：GCTGCATATGCCATCATGTAT；
(3)终止子NOS检测引物如下，扩增片段长233bp
NOSF：CCGATGTTCAAACATTTGGC
NOSR：CCGCGCGCGATAATTTAT
(4)筛选标记Hyg检测引物如下，扩增片段长度521bp
HYGF：CGATTCCGGAAGTGCTTGAC
HYGR：CGTCTGCTGCTCCATACAAG
7)、选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状聚合改良的突破性新材料。
本发明的优点为：利用拟南芥早花基因诱导早花来缩短育种世代，利用目标性状功能标记辅助选择加快目标植株的鉴定选择，同时在目标性状聚合的基础上，通过回交加快遗传背景的纯化速度，克服常规方法周期较长的缺点，在2-3年内快速创制综合性状优良的突破性新种质，大大加快聚合育种的效率和进程。例如，以红花大金元为受体亲本，聚合黑胫病和TMV抗性，从杂交开始计算时间，按照快速育种程序加代，创制一个聚合改良新材料需要770-810天(2-3年)；而按照常规程序加代，创制一个聚合改良新材料需要1310-1470天(4-5年)，快速聚合育种方法比常规聚合育种方法时间减半，大大促进了聚合育种的进程。
附图说明：
图1为创建受体亲本的单拷贝非连锁早花植株的方法的流程图。
图2为目标性状快速聚合育种创制综合性状改良的突破性新材料的方法的流程图及其各步骤所需时间的明示图。
具体实施方式：
本发明利用拟南芥早花基因诱导早花来缩短育种世代，利用目标性状功能标记辅助选择加快目标植株的鉴定选择，同时在目标性状聚合的基础上，通过回交加快遗传背景的纯化速度，克服常规方法周期较长的缺点，在2-3年内快速创制综合性状优良的突破性新种质，大大加快聚合育种的效率和进程。
本发明具体包括两个部分：1、创建受体亲本单拷贝非连锁早花植株(即获得的早花植株仅含有一个早花基因，并且早花基因与需要聚合的目标性状均不连锁，即早花基因与需要的所有目标性状均不在同一条染色体上)；2、目标性状快速聚合育种创制综合性状改良的突破性新材料。具体实施方案如下：
1、如图1所示，图1为创建受体亲本的单拷贝非连锁早花植株的方法的流程图。具体操作：
(1)提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA，反转录获得cDNA。
(2)在NCBI上查找拟南芥早花基因序列(＞gi|4903011|dbj|AB027504.1|Arabidopsisthaliana FT(FLOWERING LOCUS T)mRNA，complete cds)，从ORF两端设计引物，同时考虑后续表达载体所用的双酶切位点，在引物5’端加上酶切位点，设计的引物为：F：5’酶切位点序列+ACCACCTGTTTGTTCAAGATC；R：5’酶切位点序列+GGTTATAAAGGAAGAAGCCAT。
(3)利用设计的引物，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，把扩增产物和MARKER分别点到1％琼脂糖胶上跑胶，扩增产物中574bp的片段就是早花基因片段。利用DNA纯化试剂盒直接对目标产物进行纯化。
(4)把纯化获得的拟南芥早花基因，按照常规通用的转基因技术，利用构建的不含GUS基因但含有筛选标记的表达载体，通过农杆菌介导叶盘法转化拟进行目标性状聚合的受体亲中，获得受体亲本材料转早花基因阳性植株。
(5)利用SOUTHERN杂交技术鉴定早花阳性植株中早花基因的拷贝数，筛选含有单拷贝早花基因且早花基因表达的早花植株。
(6)受体亲本单拷贝早花植株分别与需要聚合的目标性状供体亲本配制杂交组合，获得的杂交组合分别继续与非早花受体亲本进行回交(测交)，分别统计不同回交(测交)后代早花性状与目标性状的分离比例，经卡方检验选择早花基因与所有供体目标性状均不连锁的受体亲本单拷贝早花植株备用。
2、如图2所示，图2为目标性状快速聚合育种创制综合性状改良的突破性新材料的方法的流程图及其各步骤所需时间的明示图。(图2以聚合3个目标性状为例)受体亲本多数性状优良，但不含A、B、C......等目标性状，且A、B、C......等目标性状均已经开发了功能分子标记。聚合育种的具体步骤如下：
(1)以创制的受体亲本的单拷贝非连锁早花植株作为父本，以具有目标性状A的供体亲本A为母本杂交。(2)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A目标性状的单株作为父本，以具有目标性状B的供体亲本B为母本杂交。(3)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A和B目标性状的单株作为父本，以具有目标性状C的供体亲本C为母本杂交。(4)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B和C的目标性状的单株作为父本，可以持续和其他目标性状供体杂交，然后重复以上目标性状聚合过程，直到所有目标性状全部聚合完成为止。(5)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......的目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本杂交。(6)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本连续回交3-4次，直到大部分性状和受体亲本基本相同为止。此时，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株自交。(7)在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有A、B、C......等目标性状，且这些目标性状均纯合的非早花单株自交留种。(8)继续种植目标性状聚合且纯合的自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列。(9)选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状改良的突破性新材料。
以烟草为例，烟草红花大金元品种是一个香吃味品质较好的品种，但其黑胫病、TMV病毒病抗性相对较差。黑胫病、TMV病毒病抗性已经开发了功能分子标记。以下是快速向红花大金元品种聚合黑胫病、TMV病毒病抗性的育种过程。
一、红花大金元品种单拷贝非连锁早花基因植株的创建
1、拟南芥FT基因的克隆及载体构建
1.1总RNA提取
按照invitrogen公司Trizol RNA提取试剂提取说明书(方法)进行。
1.2反转录PCR
DNA酶消化采用Fermentas公司DNaseI，反应体系按照说明书进行。
反转录合成cDNA第一链采用Fermentas公司Revert AidTM First strande DNAsynthesis Kit，反应体系按照说明书进行。
1.3引物设计
根据NCBI中拟南芥FT基因(AB027504)的序列信息设计特异性引物，上游引物FTF：5′-AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC-3′(引入SacI酶切位点)，下游游物FTR：5′-CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT-3′(引入SpeI酶切位点)。
1.4目的片段的PCR扩增
以合成的特异性引物FTF、FTR对反转录产物的cDNA进行PCR扩增。PCR反应体系为：
扩增条件为：98℃预变性30s后，98变性℃10s，49℃退火5s，72℃
延伸45s，循环30次后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物即FT基因目的片段，用凝胶回收试剂盒回收获得的PCR产物，保存备用。
1.5中间载体构建
1.5.1连接中间载体
将纯化得到的片段与JET(ECORV)载体连接，连接体系及条件如下：
把混合好的体系放在16℃的水浴锅中，水浴过夜，进行连接反应。
1.5.2转入感受态细胞
转入感受态大肠杆菌，在37℃培养箱中倒置培养，过夜。挑取单克隆菌落，通过菌落PCR检测目的片段。PCR体系为：
挑去检测有目的条带的菌斑，摇菌提取质粒，测序。
1.6表达载体P22-FT的构建
利用深圳华大基因研究院构建的不含GUS基因，含有SacI和SpeI两种限制性内切酶位点的P22载体作为表达载体，表达载体P22-FT的构建步骤如下：
1)用SacI和SpeI两种限制性内切酶分别双酶切经测序完全正确的质粒和P22载体，酶切体系：
目的片段和载体分别50ul体系，在37℃过夜；
2)将双酶切的目的片段进行切胶回收纯化；
3)纯化的目的片段与经过双酶切的P22质粒载体连接过夜；
4)将上述反应产物转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃下震荡培养1h后涂板于加入了链霉素(10mg/L)的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；
5)筛选转化菌株。测序正确后提取质粒用于农杆菌转化。
1.7表达载体转化农杆菌
2、FT基因表达载体的遗传转化
2.1烟草红花大金元植株外植体的培养：
1)70％乙醇消毒04-5002烟草种子30s后，用无菌水清洗两次，更换NaCl0处理25-30min，无菌水清洗四次；
2)将灭菌后的种子移至1/2MS固体培养基于25-26℃，14h光照/10h黑暗条件下萌发；
3)14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。
2.2农杆菌介导的烟草叶盘转化和筛选
1)将菌液活化，挑取单菌落于YM培养基中28℃250rmp培养；
2)于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0.5cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；
3)10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养基的培养皿中，置于26℃黑暗条件下共培养48h；
4)将共培养后的叶盘转移到分化培养基，28℃光培养。隔约15d更换培养基一次，至出现抗性芽；
5)取出分化抗性芽，将其转接到生根培养基，28℃光培养。
3、对转基因植株进行分子检测，获得单拷贝早花基因目标植株备用。
3.1转基因植株PCR检测
3.1.1基因组DNA提取。
利用DNA提取试剂盒，分别提取红花大金元转基因处理后获得的植株。
3.1.2DNA水平检测
以各植株提取的烟草基因组DNA为模板，扩增筛选标记潮霉素基因的部分片段。引物序列为：HygF：cgattccggaagtgcttgac；HygR：cgtctgctgctccatacaag。反应程序为PCR反应程序：
1％琼脂糖电泳检测PCR结果，对含有筛选标记的植株进一步进行mRNA水平检测，看是否有FT基因表达。
3.2mRNA水平检测
以烟草看家基因NtActin基因设计特异性引物，通过半定量及荧光定量PCR技术对转基因植株中FT基因的表达进行分析。具体实验步骤如下：
1)样品总RNA的提取及cDNA合成同1.1
2)反转录完成后直接进行PCR扩增，取2μl作模板，外源FT基因扩增引物为：
FTF：AAGCAGAGTTGTTGGAGACG；
FTR：GGTTGTTCCAGTTGTAGCAG，目的片段268bp。
Actin基因扩增引物为：actinF：ATGGCAGACGGTGAGGATATTCA；actinR：TGGCGCAACACGAAGTTCGTT，目的片段300bp。反应体系同1.4；扩增程序为：
其中actin退火温度为55℃，循环数28；FT退火温度52℃，循环数35。
3)荧光定量PCR反应体系(20μL)包含10μL Thunderbird SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)，1.2μL的上下游引物(5μM)，2μL cDNA模板(约50ng/μL)以及ddH2O。PCR反应条件为：95℃1min；95℃变性15s，58℃退火40s，40个循环。荧光数据在退火时采集。以烟草中的管家基因actin作为内参基因，相对表达量采用Livak和Schmittgen(2001)的方法计算。选择FT基因在mRNA水平上有表达的植株，进行基因拷贝数的鉴定。
3.3基因拷贝数鉴定(Southern blotting)
Southern杂交采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)试剂盒，根据说明书操作进行。
3.3.1目的片段的扩增回收
以质粒PCR扩增的FT基因片段作为标记模板(1μg)，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用Fermentas公司DNAExtraction Kit#K0513回收，作为杂交探针使用。
3.3.2地高辛探针标记和检测
按照Roche公司DIG High Prime lab/Detection Kit I进行。选取杂交结果只有一条带的植株，用于下一步早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定。
4、早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定
(1)以鉴定获得的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交。通过回交后代早花性状与黑胫病抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株。
(2)以上面鉴定的早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交。通过回交后代早花性状与TMV抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与TMV抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株，提供下一步快速聚合育种利用。
二、快速创制聚合黑胫病、TMV抗性的红花大金元新材料
1、以创制的红花大金元单拷贝非连锁早花植株作为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交。
2、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病抗性的单株作为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交。
3、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本杂交。
4、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本连续回交3次，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株自交。
5、在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有黑胫病和TMV抗性，且黑胫病和TMV抗性均纯合的非早花单株自交留种。
6、继续种植以上自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列。检测引物序列及扩增片段长度如下：
(1)FT基因扩增引物(Sac I/Spe I)如下，扩增片段574bp
FT-F：AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC
FT-R：CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT
(2)Ubi启动子扩增引物如下，扩增片段415bp。
UbiF：CGGTCGTTCTAGATCGGAGT
UbiR：GCTGCATATGCCATCATGTAT
(3)终止子NOS检测引物如下，扩增片段长233bp
NOSF：CCGATGTTCAAACATTTGGC
NOSR：CCGCGCGCGATAATTTAT
(4)筛选标记Hyg检测引物如下，扩增片段长度521bp
HYGF：CGATTCCGGAAGTGCTTGAC
HYGR：CGTCTGCTGCTCCATACAAG
7、选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状聚合改良的突破性新材料。
本发明与常规加代技术的比较：
1、时间比较：以红花大金元为受体亲本，聚合黑胫病和TMV抗性，从杂交开始计算时间，按照快速育种程序加代，创制一个聚合改良新材料需要770-810天(2-3年)；按照常规程序加代，创制一个聚合改良新材料需要1310-1470天(4-5年)，快速聚合育种方法比常规聚合育种方法时间减半，大大促进了聚合育种的进程。
2、效果：本发明快速聚合育种创制的新材料，不但可以在生产上推广应用，而且可以作为综合性状优良的亲本材料在育种中加以利用。
Claims (8)
1.一种农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
A步骤：创建受体亲本单拷贝非连锁早花植株；获得的早花植株仅含有一个早花基因，并且早花基因与需要聚合的目标性状均不连锁，即，早花基因与需要的所有目标性状均不在同一条染色体上；
B步骤：目标性状快速聚合育种创制综合性状改良的突破性新材料。
2.根据权利要求1所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，A步骤具体为：
(1)提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA，反转录获得cDNA；
(2)在NCBI上查找拟南芥早花基因序列(＞gi|4903011|dbj|AB027504.1|Arabidopsisthaliana FT(FLOWERING LOCUS T)mRNA，complete cds)，从ORF两端设计引物，同时考虑后续表达载体所用的双酶切位点，在引物5’端加上酶切位点，
设计的引物为：F：5’酶切位点序列+ACCACCTGTTTGTTCAAGATC；
R：5’酶切位点序列+GGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；
(3)利用设计的引物，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，把扩增产物和MARKER分别点到1％琼脂糖胶上跑胶，扩增产物中574bp的片段就是早花基因片段；利用DNA纯化试剂盒直接对目标产物进行纯化；
(4)把纯化获得的拟南芥早花基因，按照常规通用的转基因技术，利用构建的不含GUS基因但含有筛选标记的表达载体，通过农杆菌介导转化拟进行目标性状聚合的受体亲中，获得受体亲本材料转早花基因阳性植株；
(5)利用SOUTHERN杂交技术鉴定早花阳性植株中早花基因的拷贝数，筛选含有单拷贝早花基因且早花基因表达的早花植株；
(6)受体亲本单拷贝早花植株分别与需要聚合的目标性状供体亲本配制杂交组合，获得的杂交组合分别继续与非早花受体亲本进行回交(测交)，分别统计不同回交(测交)后代早花性状与目标性状的分离比例，经卡方检验选择早花基因与所有供体目标性状均不连锁的受体亲本单拷贝早花植株备用。
3.根据权利要求1所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，B步骤具体为：受体亲本多数性状优良，但不含A、B、C......等目标性状，且A、B、C......等目标性状均已经开发了功能分子标记，
具体步骤如下：
(1)以创制的受体亲本的单拷贝非连锁早花植株作为父本，以具有目标性状A的供体亲本A为母本杂交；
(2)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A目标性状的单株作为父本，以具有目标性状B的供体亲本B为母本杂交；
(3)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A和B目标性状的单株作为父本，以具有目标性状C的供体亲本C为母本杂交；
(4)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B和C的目标性状的单株作为父本，可以持续和其他目标性状供体杂交，然后重复以上目标性状聚合过程，直到所有目标性状全部聚合完成为止；
(5)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......的目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本杂交；
(6)在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株作为父本，以未转早花基因的受体亲本为母本连续回交3-4次，直到大部分性状和受体亲本基本相同为止。此时，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有A、B、C......等目标性状的单株自交；
(7)在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有A、B、C......等目标性状，且这些目标性状均纯合的非早花单株自交留种；
(8)继续种植目标性状聚合且纯合的自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列；
(9)选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状改良的突破性新材料。
4.根据权利要求2所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，A步骤(2)中，根据NCBI中拟南芥FT基因(AB027504)的序列信息设计特异性引物，具体为：
上游引物FTF：5′-AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC-3′
下游游物FTR：5′-CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT-3′
A步骤(3)中，目的片段的PCR扩增：以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增的操作中，PCR反应体系为：
扩增条件为：98℃预变性30s后，98变性℃10s，49℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物即FT基因目的片段，用凝胶回收试剂盒回收获得的PCR产物，保存备用。
5.根据权利要求2所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，进一步包括如下步骤：
中间载体构建，
连接中间载体：
将纯化得到的片段与JET(ECORV)载体连接，连接体系及条件如下：
把混合好的体系放在16℃的水浴锅中，水浴过夜，进行连接反应；
转入感受态细胞：
转入感受态大肠杆菌，在37℃培养箱中倒置培养，过夜。挑取单克隆菌落，通过菌落PCR检测目的片段。PCR体系为：
挑去检测有目的条带的菌斑，摇菌提取质粒，测序；
表达载体P22-FT的构建
利用深圳华大基因研究院构建的不含GUS基因，含有SacI和SpeI两种限制性内切酶位点的P22载体作为表达载体，表达载体P22-FT的构建步骤如下：
1)用SacI和SpeI两种限制性内切酶分别双酶切经测序完全正确的质粒和P22载体，酶切体系：
目的片段和载体分别50ul体系，在37℃过夜；
2)将双酶切的目的片段进行切胶回收纯化；
3)纯化的目的片段与经过双酶切的P22质粒载体连接过夜；
4)将上述反应产物转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃下震荡培养1h后涂板于加入了链霉素(10mg/L)的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；
5)筛选转化菌株，测序正确后提取质粒用于农杆菌转化。
6.根据权利要求2所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，进一步包括如下步骤：FT基因表达载体的遗传转化，
植株外植体的培养：
1)70％乙醇消毒04-5002烟草种子30s后，用无菌水清洗两次，更换NaCl0处理25-30min，无菌水清洗四次；
2)将灭菌后的种子移至1/2MS固体培养基于25-26℃，14h光照/10h黑暗条件下萌发；
3)14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化；
农杆菌介导的烟草叶盘转化和筛选：
1)将菌液活化，挑取单菌落于YM培养基中28℃250rmp培养；
2)于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0.5cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；
3)10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养基的培养皿中，置于26℃黑暗条件下共培养48h；
4)将共培养后的叶盘转移到分化培养基，28℃光培养。隔约15d更换培养基一次，至出现抗性芽；
5)取出分化抗性芽，将其转接到生根培养基，28℃光培养；
对转基因植株进行分子检测，获得单拷贝早花基因目标植株备用，
转基因植株PCR检测，
基因组DNA提取，
利用DNA提取试剂盒，分别提取红花大金元转基因处理后获得的植株，
DNA水平检测：
以各植株提取的烟草基因组DNA为模板，扩增筛选标记潮霉素基因的部分片段。引物序列为：HygF：cgattccggaagtgcttgac；HygR：cgtctgctgctccatacaag。反应程序为PCR反应程序：
1％琼脂糖电泳检测PCR结果，对含有筛选标记的植株进一步进行mRNA水平检测，看是否有FT基因表达；
mRNA水平检测
以烟草看家基因NtActin基因设计特异性引物，通过半定量及荧光定量PCR技术对转基因植株中FT基因的表达进行分析，具体实验步骤如下：
1)样品总RNA的提取及cDNA合成，
2)反转录完成后直接进行PCR扩增，取2μl作模板，
外源FT基因扩增引物为：FTF：AAGCAGAGTTGTTGGAGACG；FTR：GGTTGTTCCAGTTGTAGCAG，目的片段268bp，
Actin基因扩增引物为：actinF：ATGGCAGACGGTGAGGATATTCA；actinR：TGGCGCAACACGAAGTTCGTT，目的片段300bp，反应体系同1.4；扩增程序为：
其中actin退火温度为55℃，循环数28；FT退火温度52℃，循环数35；
3)荧光定量PCR反应体系(20μL)包含10μL Thunderbird SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)，1.2μL的上下游引物(5μM)，2μL cDNA模板(约50ng/μL)以及ddH2O；PCR反应条件为：95℃1min；95℃变性15s，58℃退火40s，40个循环。荧光数据在退火时采集。以烟草中的管家基因actin作为内参基因，相对表达量采用Livak和Schmittgen(2001)的方法计算；选择FT基因在mRNA水平上有表达的植株，进行基因拷贝数的鉴定；
基因拷贝数鉴定(Southern blotting)
Southern杂交采用DIG High Prime lab/Detection Kit I(Roche)试剂盒，根据说明书操作进行；
目的片段的扩增回收：
以质粒PCR扩增的FT基因片段作为标记模板(1μg)，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用Fermentas公司DNAExtraction Kit#K0513回收，作为杂交探针使用；
基因组DNA酶切：
基因组采用HindIII单酶切，反应体系和程序如下：
地高辛探针标记和检测：
按照Roche公司DIG High Prime lab/Detection Kit I进行，选取杂交结果只有一条带的植株，用于下一步早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定。
7.根据权利要求2所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，进一步包括如下步骤：早花基因与黑胫病、TMV抗性基因连锁关系的鉴定，
(1)以鉴定获得的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交，通过回交后代早花性状与黑胫病抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株；
(2)以上面鉴定的早花基因与黑胫病抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交，杂交F1代选择早花植株与红花大金元非早花亲本(非转基因植株)回交。通过回交后代早花性状与TMV抗性性状的分离比例，鉴定筛选出早花基因与TMV抗性不连锁的红花大金元单拷贝早花植株，提供下一步快速聚合育种利用。
8.根据权利要求3所述农作物目标性状快速聚合育种方法，其特征在于，
以红花大金元种子为例，快速创制聚合黑胫病、TMV抗性的红花大金元新材料：
1)、以创制的红花大金元单拷贝非连锁早花植株作为父本，以黑胫病抗性亲本Coker371gold为母本杂交；
2)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病抗性的单株作为父本，以TMV抗性亲本04-5002为母本杂交；
3)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本杂交；
4)、在杂交后代群体中，分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株作为父本，以非转基因的正常红花大金元亲本为母本连续回交3次，在分离群体中分子标记辅助选择早花且具有黑胫病和TMV抗性的单株自交；
5)、在自交后代群体中，分子标记辅助选择同时具有黑胫病和TMV抗性，且黑胫病和TMV抗性均纯合的非早花单株自交留种；
6)、继续种植以上自交种，从后代群体中选择田间表现优良的植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列。检测引物序列及扩增片段长度如下：
(1)FT基因扩增引物(Sac I/Spe I)如下，扩增片段574bp
FT-F：AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC
FT-R：CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；
(2)Ubi启动子扩增引物如下，扩增片段415bp
UbiF：CGGTCGTTCTAGATCGGAGT
UbiR：GCTGCATATGCCATCATGTAT；
(3)终止子NOS检测引物如下，扩增片段长233bp
NOSF：CCGATGTTCAAACATTTGGC
NOSR：CCGCGCGCGATAATTTAT
(4)筛选标记Hyg检测引物如下，扩增片段长度521bp
HYGF：CGATTCCGGAAGTGCTTGAC
HYGR：CGTCTGCTGCTCCATACAAG
7)、选择不含以上序列的非早花植株，即为创制综合性状聚合改良的突破性新材料。
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