CN1179633C - 玉米自交系花粉管通道转基因改良方法 - Google Patents
玉米自交系花粉管通道转基因改良方法 Download PDFInfo
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Abstract
玉米自交系花粉管通道转基因改良方法。外源目的基因的导入在玉米自交后6～8小时内进行，将雌穗花丝全部剪去，在切口处滴注100～300微升外源目的基因DNA液，重新套上纸袋，做好记载。将收获的种子灭菌后置于培养基上发芽生长，对幼苗进行多聚酶链式反应检测和分子杂交分析，再对转化后代进行自交纯化和农艺性状鉴定，培养出转基因玉米自交系。本发明提供了一种简便、经济、有效的玉米自交系转基因改良方法，适用于各种基因型的转化，具有转化效率高、改良时间短等优点。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程。
背景技术
玉米是世界上重要的栽培农作物之一，利用基因技术，将外源目的基因转入玉米，对玉米品种进行改良具有重要意义。目前，玉米基因转移应用较广的方法是以幼胚愈伤组织为受体系统的基因枪转化法和农杆菌介导法。这两种转移方法的主要不足是：一、II型胚性愈伤组织诱导率在基因间具有明显的差异，某些基因的II型胚性愈伤组织诱导率极低，难以建立受体系统；二、在组织培养过程中容易引发受体基因型发生变异；三、转移成本相对较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、经济、有效的玉米自交系花粉管通道转基因改良技术，以克服现有技术的不足。
本发明采用常规方法获得外源目的基因的质粒DNA，检测质粒的浓度、纯度和质粒大小，然后放入-20℃冰箱内保存，本发明外源目的基因的导入在玉米自交后6～24小时内进行，将雌穗上的纸袋摘下，用剪刀将雌穗花丝靠近穗顶部全部剪去，留下平齐的切面，然后用针式微量进样器在切口处滴注射器100～300微升纯化好的外源目的基因DNA液，立即重新套上纸袋，做好记载，标明导入的时间和用量；根据目的基因所携带的选择标志抗性基因，配制选择培养基，将收获的种子灭菌后置于选择培养基上发芽生长，选择生长发育正常的幼苗进行多酶链式反应(PCR)检测，对PCR检测呈阳性植株，进行分子杂交(Southern Blot)分析和目标性状鉴定，再对转化后代进行自交纯化和农艺性状鉴定，培养转基因玉米自交系。
本发明提供了一种简便、经济、有效的玉米自交系转基因改良方法，在玉米授粉后形成花粉管通道的特殊时间，将外源目的DNA通过花粉管通道注入到玉米的刚刚形成的胚体上，使外源目的DNA在特定时间进入到玉米胚体的组织内。本发明提供了一种全新概念的基因转化方法，与其他现有技术相比，手段简便，不需要特殊的实验室条件和技术要求，特别适用于育种研究人员掌握，便于推广应用。本发明不需要组织培养过程，避免了受体自交系发生非目标性状的遗传变异。本发明转化成本低，不存在基因型间的特异性，适用于各种基因型的转化，具有转化效率高、改良时间短等优点。
具体实施方式
实施例
将慈菇蛋白酶抑制基因(API)转入玉米自交系M017，培育抗虫玉米自交系。
在玉米开花期，从种植的M017自交系群体中选择发育正常的健壮典型植株20株，进行套袋自交。
在玉米自交后8小时进行API基因的导入，将玉米雌穗上的纸袋摘下，用剪刀将雌穗花丝靠近穗顶部全部剪去，留下平齐的切面，然后用针式微量进样器在切口处滴注射器200微升纯化好API基因DNA液，立即重新套上纸袋，做好记载，标明导入的时间和用量。
等玉米果穗成熟时，收获、晒干、脱粒，得到转化玉米粒。
根据目的基因所携带的选择标志抗性基因，配制卡那霉素选择培养基，将收获的种子灭菌后置于培养基上发芽生长，选择生长发育正常的幼苗进行多聚酶链式反应(PCR)检测，对PCR检测呈阳性植株，进行分子杂交(Southern Blot)分析和抗虫性鉴定。
对表现抗虫性的转化单株进行自交纯化和农艺性状鉴定，培育成抗玉米螟的转API基因M017自交系。
Claims (1)
1、玉米自交系花粉管通道转基因改良方法，采用常规方法获得外源目的基因的质粒DNA，检测纯度和质粒大小，然后放入-20℃冰箱内保存，其特征在于外源目的基因的导入在玉米自交后6～24小时内进行，将雌穗上的纸袋摘下，用剪刀将雌穗花丝靠近穗顶部全部剪去，留下平齐的切面，然后用针式微量进样器在切口处滴注100～300微升纯化好的外源目的基因DNA液，立即重新套上纸袋，做好记载，标明导入的时间和用量；根据目的基因所携带的选择标志抗性基因，配制选择培养基，将收获的种子灭菌后置于培养基上发芽生长，选择生长发育正常的幼苗进行多聚酶链式反应检测，对多聚酶链式反应检测呈阳性植株，进行分子杂交分析和目标性状鉴定，再对转化后代进行自交纯化和农艺性状鉴定，培养出转基因玉米自交系。
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