CN103589799A - 一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法 - Google Patents

一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：（1）从制种农户的制种棉田里的随机抽取待测棉铃；（2）随机抽取步骤（1）得到的棉铃中的棉籽；（3）分别提取步骤（2）得到的棉籽的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA；（4）分别以步骤（3）得到的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA为模板，采用SSR引物对进行鉴定，得到种皮指纹图谱和种仁指纹图谱；如果某一待测棉铃中，抽样检测的所有棉籽的种仁指纹图谱均与种皮指纹图谱一致，该棉铃为自交铃。本发明具有很大的实用价值和推广价值。

Description

一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法
技术领域
本发明涉及一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法。
背景技术
农业上，杂交种通常具有丰产、优质、抗逆性强的优点，已得到广泛的应用。杂交棉品种产量高，受到广大棉农的认可。由于存在剥大花、自交铃等问题，杂交种的纯度较难保证。近年来，由于农村劳动力的转移，棉花制种用工越来越紧缺，用工价格也越来越高，在这个大背景下，杂交棉制种的质量越来越差。
一般来说，制种公司只能在种子收获后抽样去海南加代检测纯度（田间检测），存在检测时间长、异地种植受环境条件影响大等问题，效果不是很理想。
近年来，有制种公司采用SSR标记来检测种子纯度，与田间检测相比，缩短了检测时间，并且避免了异地种植环境对植株表型的影响。种子公司都是由大量制种农户供种，所以制种公司先要以农户为单位收集大量种子然后赶在播种期前完成检测和销售，存着工作量大、批次多、时间紧的现状。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法。
本发明提供了一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法，包括如下步骤：
（1）从制种农户的制种棉田里的随机抽取待测棉铃；
（2）随机抽取步骤（1）得到的棉铃中的棉籽；
（3）分别提取步骤（2）得到的棉籽的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA；
（4）分别以步骤（3）得到的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA为模板，采用SSR引物对进行鉴定，得到种皮指纹图谱和种仁指纹图谱；
如果某一待测棉铃中，抽样检测的所有棉籽的种仁指纹图谱均与种皮指纹图谱一致，该棉铃为自交铃。
所述SSR引物对为CS62引物对、NAU1085引物对、NAU1102引物对、NAU1255引物对、NAU2274引物对、NAU1103引物对、NAU2026引物对、NAU2277引物对、NAU1186引物对和NAU1233引物对中的至少一个；所述CS62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU2274引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU1103引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成。
所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
本发明还保护一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率的方法，包括如下步骤：
（1）从制种农户的制种棉田里的随机抽取待测棉铃；
（2）随机抽取步骤（1）得到的棉铃中的棉籽；
（3）分别提取步骤（2）得到的棉籽的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA；
（4）分别以步骤（3）得到的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA为模板，采用SSR引物对进行鉴定，得到种皮指纹图谱和种仁指纹图谱；
如果某一待测棉铃中，抽样检测的所有棉籽的种仁指纹图谱均与种皮指纹图谱一致，该棉铃为自交铃；待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率=自交铃数量/待测棉铃总数量×100%。
所述SSR引物对为CS62引物对、NAU1085引物对、NAU1102引物对、NAU1255引物对、NAU2274引物对、NAU1103引物对、NAU2026引物对、NAU2277引物对、NAU1186引物对和NAU1233引物对中的至少一个；所述CS62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU2274引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU1103引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成。
所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
本发明还保护以上任一所述方法在鉴定杂交棉纯度中的应用。
本发明还保护一种引物组，由所述CS62引物对、所述NAU1085引物对、所述NAU1102引物对、所述NAU1255引物对、所述NAU2274引物对、所述NAU1103引物对、所述NAU2026引物对、所述NAU2277引物对、所述NAU1186引物对和所述NAU1233引物对中的至少一个引物对组成。
本发明还保护所述引物组在如下（a）或（b）中的应用：（a）检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法；（b）检测待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率。所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
杂交种的制备过程中，将母本去雄后授予父本的花粉，长出的棉铃中含有棉籽，棉籽的种皮（由胚珠的珠被发育来）应为母本的指纹图谱，而棉籽的种仁应为F1代的指纹图谱。如果某一棉铃中，所有棉籽的种仁（或所有抽样检测的棉籽的种仁）的指纹图谱与母本的指纹图谱一致，说明此棉铃为自交铃。如果某一棉铃中，棉籽的种仁有的为母本的指纹图谱，有的为F1代的指纹图谱，说明此棉铃为剥大花所制的棉铃，在剥花之前已部分授粉。如果某一棉铃中，棉籽的种仁均为F1代的指纹图谱，说明此棉铃为目的杂交种。
由于本发明提供的方法与现有方法相比具有如下优点：（1）可以提前1-2个月时间，为种子的销售赢得时间；（2）对检测不合格的农户提前淘汰，省去加工和运输的费用；（3）棉铃壳厚，不易散失水分，比叶片好保存，异地取样也不会氧化变质，可以在棉花制种后期到制种农户田间随机取棉铃，带回实验室后统一检测。
本发明具有很大的实用价值和推广价值。
附图说明
图1为采用CS62引物对扩增的电泳图谱。
图2为采用NAU1085引物对扩增的电泳图谱。
图3为采用NAU1102引物对扩增的电泳图谱。
图4为采用NAU1255引物对扩增的电泳图谱。
图5为采用NAU2274引物对扩增的电泳图谱。
图6为采用NAU1103引物对扩增的电泳图谱。
图7为采用NAU2026引物对扩增的电泳图谱。
图8为采用NAU2277引物对扩增的电泳图谱。
图9为采用CS62引物对扩增的带型放大图。
图10为采用NAU1085引物对扩增的带型放大图。
图11为采用NAU1102引物对扩增的带型放大图。
图12为采用NAU1255引物对扩增的带型放大图。
图13为采用NAU2274引物对扩增的带型放大图。
图14为采用NAU1103引物对扩增的带型放大图。
图15为采用NAU2026引物对扩增的带型放大图。
图16为采用NAU2277引物对扩增的带型放大图。
图17为采用NAU1186引物对扩增的带型放大图。
图18为采用NAU1233引物对扩增的带型放大图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
鄂杂棉10号（种子）为F1代，即将鄂杂棉10号的母本去雄后授予鄂杂棉10号的父本的花粉获得的F1代种子，购自湖北惠民农业科技有限公司。瑞杂816为F1代，即瑞杂816的母本去雄后授予瑞杂816的父本的花粉获得的F1代。瑞杂816的父本：济南鑫瑞种业科技有限公司。瑞杂816的母本：济南鑫瑞种业科技有限公司。
实施例1、
将鄂杂棉10号（种子）播种于田间，自然种植。待植株长出棉铃后，随机取一个代表植株，从该植株上随机取2个叶片和1个棉铃。从该棉铃中随机取24个棉籽。分别取每个棉籽的种皮和种仁。
1、分别提取各个样本(叶片、种皮或种仁)的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用8个SSR引物对进行PCR扩增。
8个SSR引物对见表1。
表1 8个SSR引物对的核苷酸序列
序号 正向引物（5’→3’） 反向引物（5’→3’）
1 CS62引物对 GATGGCTACCTCCCTTTGTA（序列1） CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA（序列2）
2 NAU1085引物对 AGTCGCCCCTTCTCTAATTT（序列3） TGTAAACCGAACTCGTTGTG（序列4）
3 NAU1102引物对 ATCTCTCTGTCTCCCCCTTC（序列5） GCATATCTGGCGGGTATAAT（序列6）
4 NAU1255引物对 CATGCAAATCCATGCTAGAG（序列7） GGTTTCTTTGGTGGTGAAAC（序列8）
5 NAU2274引物对 TCCTCGGATTATCAAAACCT（序列9） TGAAGAGGACATTGATGACG（序列10）
6 NAU1103引物对 GGAGCCAGAAGTTGAGAAAA（序列11） TTCGGCTTCTGCTTTTACTT（序列12）
7 NAU2026引物对 GAATCTCGAAAACCCCATCT（序列13） ATTTGGAAGCGAAGTACCAG（序列14）
8 NAU2277引物对 GAACTAGCCACATGATGCAC（序列15） TTGTTGAGGCATTAGTTTGC（序列16）
PCR体系为10.0μL，含0.5U Taq酶，正向引物和反向引物的浓度均为0.5μM。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min，4℃保存。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的参数如下：每孔的点样量为1.8μL；200v电压、45min。
电泳图谱见图1至图8。图1至图8中，泳道1对应叶片1，泳道2对应叶片2，泳道3至泳道8依次对应棉籽1的种皮至棉籽6的种皮，泳道9至泳道32依次对应棉籽1的种仁至棉籽24的种仁。对于棉籽1至棉籽24的种仁来说，采用每个引物对均显示有3种带型，分别命名为“带型1”、“带型2”和“带型3”，其中3型为共显带型。带型结果见表2，叶片和种皮在8个引物对扩增下均为共显带型，即为带型3，表现了F1的指纹图谱。棉籽1至棉籽24的种仁，在每对引物下扩增均表现了分离，表现了F2各单株的分离图谱。各个带型的放大图见图9至图16。
各个样本(叶片、种皮或种仁)的带型结果见表2。
表2带型结果
Figure BDA0000414800810000051
实施例2、
在制种田中，将瑞杂816的父本（父本）和瑞杂816的母本（母本）进行杂交，从制种田中随机取20个棉铃，从每一个棉铃中随机取1个种皮和4个种仁。
1、分别提取各个样本(20个种皮，80个种仁)的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用6个SSR引物对进行PCR扩增。
6个SSR引物对见表3。
表36个SSR引物对的核苷酸序列
序号 正向引物（5’→3’） 反向引物（5’→3’）
1 CS62引物对 GATGGCTACCTCCCTTTGTA（序列1） CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA（序列2）
2 NAU1103引物对 GGAGCCAGAAGTTGAGAAAA（序列11） TTCGGCTTCTGCTTTTACTT（序列12）
3 NAU1186引物对 AATGGTCCTGCTCCAGATT（序列17） AATCGTCGTCGTCGAATTAT（序列18）
4 NAU1233引物对 TTCGGGAAAGTTAGAGGAGA（序列19） TCCTCAGAGCTCGGAATAGT（序列20）
5 NAU2026引物对 GAATCTCGAAAACCCCATCT（序列13） ATTTGGAAGCGAAGTACCAG（序列14）
6 NAU2274引物对 TCCTCGGATTATCAAAACCT（序列9） TGAAGAGGACATTGATGACG（序列10）
PCR体系为10.0μL，含0.5U Taq酶，正向引物和反向引物的浓度均为0.5μM。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环；94℃变性1min、56℃退火45s、72℃延伸2min，4℃保存。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的参数如下：每孔的点样量为1.8μL；200v电压、50min。
各个样本(20个棉铃，每个棉铃1个种皮和4个种仁)的带型结果见表4。采用NAU1186可能出现的三种带型见图17。采用NAU1233可能出现的3种带型见图18。采用CS62可能出现的三种带型见图9。采用NAU1103可能出现的3种带型见图14。采用NAU2026可能出现的三种带型见图15。采用NAU2274可能出现的三种带型见图13。带型3为共显带型。
表4带型结果
Figure BDA0000414800810000081
Figure BDA0000414800810000091
棉铃4、棉铃12和棉铃16均种皮和种仁带型相同，为自交铃。其余17个棉铃均种皮与种仁带型不同。此制种田中制备的棉花杂交种含有自交种的百分率为15%，制种质量较好。
Figure IDA0000414800890000011
Figure IDA0000414800890000021
Figure IDA0000414800890000031
Figure IDA0000414800890000051
Figure IDA0000414800890000061
Figure IDA0000414800890000071
Figure IDA0000414800890000081

Claims (10)

1.一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法，包括如下步骤：
（1）从制种农户的制种棉田里随机抽取待测棉铃；
（2）随机抽取步骤（1）得到的棉铃中的棉籽；
（3）分别提取步骤（2）得到的棉籽的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA；
（4）分别以步骤（3）得到的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA为模板，采用SSR引物对进行鉴定，得到种皮指纹图谱和种仁指纹图谱；
如果某一待测棉铃中，抽样检测的所有棉籽的种仁指纹图谱均与种皮指纹图谱一致，该棉铃为自交铃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SSR引物对为CS62引物对、NAU1085引物对、NAU1102引物对、NAU1255引物对、NAU2274引物对、NAU1103引物对、NAU2026引物对、NAU2277引物对、NAU1186引物对和NAU1233引物对中的至少一个；所述CS62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU2274引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU1103引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
4.一种检测待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率的方法，包括如下步骤：
（1）从制种农户的制种棉田里的随机抽取待测棉铃；
（2）随机抽取步骤（1）得到的棉铃中的棉籽；
（3）分别提取步骤（2）得到的棉籽的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA；
（4）分别以步骤（3）得到的种皮的基因组DNA和种仁的基因组DNA为模板，采用SSR引物对进行鉴定，得到种皮指纹图谱和种仁指纹图谱；
如果某一待测棉铃中，抽样检测的所有棉籽的种仁指纹图谱均与种皮指纹图谱一致，该棉铃为自交铃；待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率=自交铃数量/待测棉铃总数量×100%。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述SSR引物对为CS62引物对、NAU1085引物对、NAU1102引物对、NAU1255引物对、NAU2274引物对、NAU1103引物对、NAU2026引物对、NAU2277引物对、NAU1186引物对和NAU1233引物对中的至少一个；所述CS62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU2274引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU1103引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
7.权利要求1至6中任一所述的方法在鉴定杂交棉纯度中的应用。
8.一种引物组，由CS62引物对、NAU1085引物对、NAU1102引物对、NAU1255引物对、NAU2274引物对、NAU1103引物对、NAU2026引物对、NAU2277引物对、NAU1186引物对和NAU1233引物对中的至少一个引物对组成；所述CS62引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述NAU1085引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述NAU1102引物对由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述NAU1255引物对由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述NAU2274引物对由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述NAU1103引物对由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述NAU2026引物对由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述NAU2277引物对由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述NAU1186引物对由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述NAU1233引物对由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成。
9.权利要求8所述所述引物组的应用，为如下（a）或（b）：（a）检测待测制种农户制备的棉花杂交种中是否有自交种的方法；（b）检测待测制种农户制备的棉花杂交种含有自交种的百分率。所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述棉花杂交种为鄂杂棉10号或瑞杂816。
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