CN101988121A - 小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于小麦谷粒中禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)的定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测方法，专门用于特异性测定麦粒中禾谷镰孢菌侵染量。该法先建立禾谷镰孢菌的实时定量PCR检测的标准曲线，然后对待测麦粒提取DNA，进行实时定量PCR反应，根据所建立的标准曲线获得待测样品中该病原菌侵染量。整个过程只需6h，检测准确率达99％以上；具有快速、简便、准确、灵敏的特点，可用于更加科学地评估麦粒赤霉病病害严重度及有关防治技术的实际效果。

Description

小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测技术

一、技术领域

本发明属于一种小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，可用于评价禾谷镰孢菌对小麦的危害程度。

二、技术背景

赤霉病是小麦上的重要真菌性病害，发生范围遍布全球。尽管很多Fusarium属的病原菌也能引起赤霉病，但是在中国，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum Schwabe)是引起小麦赤霉病的最主要的病原菌。近年来该病在亚洲、加拿大、欧洲和南美洲连续爆发，导致的禾谷类作物产量损失有10％-70％，正威胁着全球的粮食安全。禾谷镰孢菌除了导致谷物产量下降外，还因产生DON真菌毒素而降低谷物品质。如果人、畜食用了真菌毒素污染的粮食就会产生急性或慢性中毒现象，因此真菌毒素污染问题已引起人类的严重关切。在欧洲、北美和中国，DON类毒素是污染粮食的主要真菌毒素。为此，世界卫生组织制定标准规定粮食和饲料中的DON毒素含量不得超过1mg/kg和5mg/kg。我国卫生部制定的国家标准(GB16329-1996)也规定食用小麦面粉中DON的毒素含量不得超过1mg/kg。

为了防治赤霉病并避免禾谷镰孢菌DON真菌毒素污染对人畜的危害，人们一方面采用各种综合防治技术，包括培育和种植抗病品种、喷施化学杀菌剂和生物制剂、改善环境条件等减轻病害发生。另一方面，制定商品粮赤霉病病粒率或毒素含量最大允许标准。例如，我国商业部门制定的国家标准规定了收购的小麦中赤霉病病粒率不得超过4％。然而，发明人经过细致研究发现小麦赤霉病病粒率与DON毒素含量的相关性并不稳定，一些存在潜伏侵染菌丝的“健康”麦粒含有毒素，甚至在看似健康的小麦样品中，DON毒素含量也可能已达损害人体健康的水平。进一步研究发现DON毒素含量与麦粒中禾谷镰孢菌的侵染量密切正相关，这些“无病”麦粒的潜伏菌丝量与小麦灌浆期的温湿度有关。

本发明利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法检测小麦谷粒中禾谷镰孢菌的侵染量，包括样品的前处理、基因组DNA的提取和实时定量PCR扩增过程只需要6小时，即可对谷物中禾谷镰孢菌的侵染量进行精确定量。该技术操作不仅相对简单，而且还具有高通量、实时性、高效性等优点。因此，该技术可以准确评估禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度和评价抗病品种、生物防治、化学防治等技术的实际效果。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的在于提供小麦谷粒中禾谷镰孢菌量的一种高通量、快速分子检测方法。现有技术针对β-微管蛋白基因设计的引物对镰刀菌属真菌检测特异性较差。本发明以禾谷镰孢菌DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)为靶基因，重新设计Real-time PCR引物对，优化反应体系，使实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测技术能够在6小时内完成从收集样品到出具检测报告的所有过程，检测准确率高，对准确评估小麦谷粒中禾谷镰孢菌危害程度，避免DON污染小麦流入食品市场危害人体健康，具有实用价值。

技术方案 禾谷镰孢菌量的检测基因为该病原菌DON毒素合成关键基因Tri5，核苷酸全长为1368bp，编码含376个氨基酸残基的单端孢霉二烯合酶。

特异性检测小麦谷粒中禾谷镰孢菌菌量的方法共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取实验室培养的禾谷镰孢菌菌丝DNA和待测谷物样品DNA。

第二步：运用禾谷镰孢菌DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，建立禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线。

小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的实时定量PCR检测关键在于采用实时定量PCR(Real-time quantitativePCR)技术检测谷粒中禾谷镰孢菌菌丝Tri5DNA的量，故引物设计需对禾谷镰孢菌Tri5基因PCR扩增具有特异性。然后，根据Tri5DNA的量与菌丝量之间的关系，进而获得禾谷镰孢菌菌丝检测侵染量的标准曲线。

扩增禾谷镰孢菌Tri5基因片断的特异性引物对：

上游引物Tr5F：5’-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’

下游引物Tr5R：5’-AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3’

实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增条件：

禾谷镰孢菌菌丝Tri5 DNA检测量的标准曲线

反应体系：

dH₂O(灭菌蒸馏水)                           9.5μL

Platinum^TM SYBR Green qPCR SuperMix-UDG    12.5μL

Tr5F(10μM)                                0.5μL

Tr5R(10μM)                                0.5μL

ROX Reference Dye                          1μL

DNA模板                                    1μL

                                                  

总体积                                     25μL

扩增条件：

预热：50℃       2min

预变性：95℃     2min

            ↓

变性：95℃       15s

退火：60℃       30s

延伸：72℃       45s

35个循环

                  ↓

最后一步延伸：72℃        5min

熔解温度：    59℃

第三步：待测样品应用第二步中的特异性引物以相应的扩增体系和扩增程序进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的标准曲线，求出谷粒样品中相应的禾谷镰孢菌菌丝侵染量。

有益效果 本发明小麦谷粒中禾谷镰孢菌的实时定量检测方法，与现有技术相比，

1.实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法改变了禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度定量不准确的缺陷，与经典病粒率(结合平皿培养检测)和常规PCR分子检测相比，具有如下优点和积极效果。

(1)检测的高通量。即在一个反应体系中，可以对所有待检样品中禾谷镰孢菌的量进行测定；

(2)检测结果的实时性。在PCR反应进行中可以了解样品中禾谷镰孢菌量的大小；

(3)检测的高效性。经典病粒率(结合平皿培养检测)评估禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度只能单个样品进行分析，而实时定量PCR则可同时对大量样品进行测定，耗时仅为6小时；

(4)检测的高准确性。经典经典病粒率(结合平皿培养检测)和常规PCR评估禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度只能定性分析，不能准确定量，而实时定量PCR则可准确定量谷粒中禾谷镰孢菌的危害量；

(5)检测的高灵敏度。本发明使禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度很低时的检测分析成为可能；

(6)本发明是国际上首次以禾谷镰孢菌DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)为靶基因对谷粒中禾谷镰孢菌进行定量分析。不仅可以分析麦粒中侵染的病菌含量，而且还可以根据Tri5基因与DON毒素的相关性，分析麦粒受毒素污染的程度。

2.目前国内外多采用经典病粒率(结合平皿培养检测)来评估禾谷镰孢菌危害小麦谷粒严重程度，但该方法涉及采样、发病程度分级和平板培养分析等步骤，整个评估分析实验至少要6天，周期较长，只能做定性分析，对麦粒被感染的程度难以定量。常规PCR技术虽然可以快速和简便地分析禾谷镰孢菌危害小麦谷粒的情况，但是只能分析危害小麦谷粒的禾谷镰孢菌的种类，不能进行定量分析。实时定量PCR检测则可以在一个反应体系里将全部待测样品中禾谷镰孢菌的量进行定量测定，在PCR反应的进行中即可知道样品中禾谷镰孢菌量的大小，该方法对待测样品既能够进行定性分析，也能进行定量分析。

3.在所测定的56个小麦谷粒样品中，小麦谷粒中禾谷镰孢菌量与病粒率呈极显著的对数关系，说明实时定量PCR的结果相当可靠(图8)。此外小麦谷粒中禾谷镰孢菌量与谷粒中DON毒素含量间的线性相关系数高于病粒率与谷粒中DON毒素含量间的线性相关系数，说明实时定量PCR检测方法检测谷粒中禾谷镰孢菌及DON毒素含量较经典病粒率(结合平皿培养检测)更为准确(图9A和B)。

四、附图说明

图1在实时定量PCR反应中，引物(Tr5F、Tr5R)浓度优化后的扩增条带图谱。

图2在实时定量PCR反应中，样品模板DNA浓度优化后的扩增条带图谱。

图3实时定量PCR反应体系优化后的定量扩增图谱(引物Tr5F、Tr5R)。

图4在实时定量PCR反应中不同浓度模板的定量扩增曲线(灵敏度实验)。

图5在实时定量PCR反应中不同浓度模板的定量扩增产物电泳图谱。

图6建立的禾谷镰孢菌定量标准曲线。

图7在实时定量PCR反应中，引物(Tr5F、Tr5R)扩增产物的熔解曲线。

图8小麦谷粒中禾谷镰孢菌量与病粒率的相关关系(可靠性分析)。

图9小麦赤霉病病粒率(A)或谷粒中禾谷镰孢菌量(B)与谷粒中DON毒素含量之间的线性相关关系(准确性分析)。

五、具体实施方式

实施例1、适用于实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)特异性引物筛选。

由于SYBR Green I是一种与DNA双链结合的荧光染料，它不能选择特定的DNA模板，所以此法定量就要求引物不能形成二级结构和错配。基于检测谷粒中产DON毒素的禾谷镰孢菌的目的，针对Fgraminearum DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)，本发明共设计3对特异性引物，并从中筛选出1对表现优异的引物Tr5F和Tr5R。

上游引物：Tr5F(5’-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’)

          Tox-sense-2(5’-CCTTCAAGCCGGACGAGAGC-3’)

          Tox-sense-3(5’-CCCAGGAAACCCTACACTCGTCT-3’)

下游引物：Tr5R(5’-AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3’)

          Tox-antisense-2(5’-CATCTGAGCAACGGCTGACG-3’)

          Tox-antisense-3(5’-GCTTCTGAGCCTCCTTCACATCG-3’)

筛选的反应体系：

10×buffer                    2.5μL

MgCl₂(25mM)                   1.5μL

dNTP(10mM)                    2μL

上、下游引物(各10μM)         各0.5μL

DNA模板(50μg/mL)             1μL

TaqDNA聚合酶(5U/μL)          0.2μL

dH₂O(灭菌蒸馏水)              补充至25μL

                                       

总体积                        25μL

筛选的扩增条件：

预变性：94℃            5min

            ↓

变性：94℃              30s

退火：60℃              30s

延伸：72℃              45s

35个循环

            ↓

延伸：72℃               8min

            ↓

          4℃保存

先用以上引物分别对禾谷镰孢菌纯菌丝DNA进行梯度PCR(50～65℃)扩增，结果以引物对Tr5F、Tr5R在60℃扩增结果最好，即保证了对禾谷镰孢菌Tri5DNA的特异性又有较好的扩增效率。而其它引物对要么对禾谷镰孢菌Tri5DNA的特异性不强，要么是对禾谷镰孢菌Tri5DNA的扩增效率不高。

实施例2.SYBR Green I荧光染料定量PCR体系优化

为了保证检测的稳定性和可靠性，实验选用了Platinum^TM SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)。该试剂盒中的酶、Mg²⁺、dNTP等已经过优化，只需加入自己的引物和模板，因此，实验只对退火温度、引物浓度和样品DNA模板浓度进行了优化。

2.1退火温度 退火温度Tm值是反应特异性的重要保证，如果退火温度过低就会产生非特异性扩增，所以选择较高的退火温度能够大大减少引物与模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性，但太高的退火温度又会降低扩增效率，因此需要对其进行优化。实验中对引物Tr5F、Tr5R的退火温度以60℃为基础，以1℃的幅度微调，结果发现引物Tr5F、Tr5R在退火温度为60℃时检测，扩增效率高，且扩增特异性好。

2.2引物浓度 当PCR引物浓度太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进非特异性产物合成，还会增加引物二聚体的形成，造成假阳性或定量误差。根据Platinum^TM SYBR Green qPCRSuperMix-UDG试剂盒说明书推荐的反应体系进行扩增时，发现1μL引物(10μM)用量太大产生明显的引物二聚体，而引物用量小于0.25μL后有非特异条带产生且扩增效率下降，最终确定引物最佳浓度为0.5μL(图1)。

2.3样品DNA模板浓度 小麦样品中含有PCR抑制物质，样品DNA模板浓度太高会引起扩增失败，而浓度太低则扩增量小。根据Platinum^TM SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒说明书推荐的反应体系进行扩增时，发现样品DNA模板浓度高于400ng/μL产生明显引物二聚体甚至扩增失败。因此最终确定样品DNA模板浓度最佳浓度为400ng/μL(图2)。

在退火温度、引物浓度和样品DNA模板浓度优化条件下，实时定量PCR扩增图谱见图3。

实施例3SYBR Green I荧光染料定量PCR的灵敏度

将禾谷镰孢菌基因组DNA的标准品梯度稀释成8个梯度：1×10²ng/μL、1×10¹ng/μL、1ng/μL、1×10^-1ng/μL、1×10^-2ng/μL、1×10^-3ng/μL、1×10^-4ng/μL、1×10^-5ng/μL，用引物Tr5F、Tr5R定量扩增；得到的扩增图谱(图4)中，当模板浓度小于0.001ng/μL以后其扩增曲线的荧光值低于域值；而产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，当模板浓度小于0.001ng/μL后无电泳条带(图5)。由此可知，SYBR Green I荧光染料定量PCR可检测到的样本浓度最低值为0.001ng/μL，灵敏度至少是普通PCR检测方法的10～100倍。

实施例4.谷粒中禾谷镰孢菌量的标准曲线

引起小麦赤霉病的镰刀菌中禾谷镰孢菌因含有DON毒素合成关键基因簇而能够产生DON毒素，根据这一差异设计了可以扩增出禾谷镰孢菌Tri5基因特征性条带的上游游引物Tr5F(5’-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’)和下游引物Tr5R(5’-AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3’)。

反应体系：

dH₂O(灭菌蒸馏水)                 9.5μL

Platinum^TM SYBR Green qPCR SuperMix-UDG    12.5μL

Tr5F(10μM)                                0.5μL

Tr5R(10μM)                                0.5μL

ROX Reference Dye                          1μL

DNA模板                                    1μL

                                                 

总体积                                     25μL

扩增条件：

预热：50℃            2min

预变性：95℃          2min

            ↓

变性：95℃            15s

退火：60℃            30s

延伸：72℃            45s

35个循环

            ↓

最后一步延伸：72℃    5min

熔解温度：    59℃

根据灵敏度实验中确定的检测限，将禾谷镰孢菌基因组DNA的标准品梯度稀释成6个梯度：1×10²ng/μL、1×10¹ng/μL、1ng/μL、1×10^-1ng/μL、1×10^-2ng/μL、1×10^-3ng/μL，用引物Tr5F、Tr5R扩增，得到的扩增图谱中，可见到的荧光值增加时对应的循环数与用于定量的标准品的浓度梯度成负相关性，得到的标准曲线(图6)为：Y＝-2.83X+21.54  R²＝0.98(Y：Ct，X：模板浓度对数)

实施例5.定量PCR产物的熔解曲线

从熔解曲线分析定量PCR体系反应产生的扩增产物可知：引物Tr5F、Tr5R扩增得到的产物的熔解温度(Tm)为84.2℃(图7)；波峰高低与模板浓度成正相关性；基线平稳，只有一个熔解峰，证明无引物二聚体产生和非特异性扩增，产物特异性好。

实施例62007年江苏南京江浦试验农场采集的小麦谷粒样品中禾谷镰孢菌量的快速检测

小麦谷粒样品粉碎后精确称取10g，提取基因组DNA，用紫外分光光度计检查浓度，并将其稀释至400ng/μL左右(此时结果处于线性范围内，当模板浓度太大时，样品中的PCR抑制物质会导致扩增失败，如图2)加样检测，以已知浓度的禾谷镰孢菌菌丝基因组DNA标准品作为阳性对照，无模板扩增体系为阴性对照，检测结果见表1。

从以上结果可以得出，小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量与病粒率呈极显著的对数相关关系，说明实时定量PCR的结果相当可靠(图8)。

表1禾谷镰孢菌基因组DNA标准品及谷粒样品(引物Tr5F、Tr5R)的定量结果

Claims (3)

1.小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术检测谷粒中禾谷镰孢菌菌丝的侵染量。

谷粒中禾谷镰孢菌检测方法，共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取实验室培养的禾谷镰孢菌菌丝DNA和待测谷物样品DNA。

第二步：运用禾谷镰孢菌特异性DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，建立禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线。

实时定量PCR反应体系及其扩增条件：

禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线

反应体系：

dH₂O(灭菌蒸馏水)                           9.5μL

Platinum^TM SYBR Green qPCR SuperMix-UDG    12.5μL

Tr5F(10μM)                                0.5μL

Tr5R(10μM)                                0.5μL

ROX Reference Dye                          1μL

DNA模板                                    1μL

                                                      

总体积                                     25μL

扩增条件：

预热：        50℃    2min

预变性：      95℃    2min

              ↓

变性：        95℃    15s

退火：        60℃    30s

延伸：        72℃    45s

35个循环

              ↓

最后一步延伸：72℃    5min

熔解温度：    59℃

第三步：待测样品完成实时定量PCR反应后，应用第二步中已经建立好的标准曲线，计算出待测样品中禾谷镰孢菌的菌丝量。

2.根据权利要求1，小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于：基于DNA与菌量成正比的原理，利用了所研发的能够特异性扩增禾谷镰孢菌Tri5基因的引物对(上游引物Tr5F：5’-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’和下游引物Tr5R：5’-AAACCATCCAGTTCTCC ATCTG-3’)测定待测样品中禾谷镰孢菌的量。

3.根据权利要求1和2，小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于：利用禾谷镰孢菌侵染量的PCR检测结果评价小麦罹病程度和有关防治技术的效果。

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