CN112322760A - 一种植物根癌病快速无损检测方法 - Google Patents

一种植物根癌病快速无损检测方法 Download PDF

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张晗
罗斌
何璐璐
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Abstract

本发明涉及一种植物根癌病快速无损检测方法。该检测方法包括：提供从待测植物中获得的植物根癌菌DNA；其中，所述植物根癌菌DNA的浓度为20ng/μl；以所述植物根癌菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增循环数分别为20‑25次、25‑30次和30‑40次；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；根据扩增结果获得待测植物根癌病的发病程度。本发明方法可以为根癌病病菌感染寄主植物的检测分级提供定性的判别依据，同时可针对不同感病程度进行有针对性的防治提供准确的评测手段。

Description

一种植物根癌病快速无损检测方法
技术领域
本发明涉及一种植物根癌病快速无损检测方法。
背景技术
根癌病又名根瘤病，是由土壤农杆菌引起的一种土传病害，可引起葡萄、苹果、梨、桃、杏等果树发病，由于病瘤多，致使根部养分难以向上输送，轻则树体衰弱，重则全株死亡。主要危害根颈、主根、侧根，受侵染后的果树叶片狭小、发黄，树势衰弱、生长迟缓、寿命缩短，果实发育不良、产量减少，甚至死亡。此病一旦发生，不易控制，危害严重。然而，由于根癌土壤杆菌特异的侵染方式，使得传统的农业、物理及化学防治均无良好效果，防控困难。
目前国内外在根癌病的病原检测方面采用的方法有，血清取样法、滑动凝集试验及单克隆抗体检测。但上述方法操作复杂、对实验条件要求较高，同时检测周期较长、灵敏度低。因此，非常有必要对根癌病菌建立一种简单、快速、准确的检测方法，这样可以从源头上控制病害的发生。目前，田间检测可以通过茎秆及根部形态判断其感病程度，但是存在误判，无法进行潜伏期识别，且由于根瘤主要在根部进行繁殖，需要挖出根部进行诊断，对果树伤害较大。
发明内容
本发明实施例提供一种植物根癌病快速无损检测方法，可以为根癌病病菌感染寄主植物的检测分级提供定性的判别依据，同时可针对不同感病程度进行有针对性的防治提供准确的评测手段。
一种植物根癌病快速无损检测方法，包括：
提供从待测植物中获得的植物根癌菌DNA；其中，所述植物根癌菌DNA的浓度为20ng/μl；
以所述植物根癌菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增循环数分别为20-25次、25-30次和30-40次；
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；
根据扩增结果获得待测植物根癌病的发病程度。
在一些实施例中，是从待测植物的叶片、茎(枝条)或根中获得根癌病菌DNA。实际操作中可取适量的待测植物的叶片、茎或根，按常规方法提取其中的根癌病菌DNA即可。这样取样量较少，对植物的基本没有伤害或伤害很小。
在一些实施例中，是从待测植物的叶片中提取获得根癌病菌DNA。
在一些实施例中，采用StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，获得根癌病菌DNA。
在一些实施例中，所用的特异性扩增引物为：
FI: 5′-TTTCCAACTTGTTCCGCTTTA-3′
RI： 5′-CCCTTTCCTGATGATCCCTA-3′
本发明人研究发现，作为模板的植物根癌菌DNA，其浓度控制在20ng/μl为佳，这样可以更有利于引物与模板DNA进行结合，提高扩增效率；并且还可以更准确的反应果树携带柑橘黄龙病菌量的多少。若浓度低于20ng/μl，则导致非特异性扩增概率变大。
本发明人研究发现，PCR扩增时若扩增循环数低于20，则扩增产物产量过低，无法满足进一步分析操作的需要；若扩增循环数高于40，则出现非特异性扩增，得到的结果与原模板DNA比例差别较大，不能真实反应原始的比例关系。
本发明人研究发现，根据本发明实施例，若扩增20-25个循环，即可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于严重感病；若扩增25-30个循环，可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于中等感病；若扩增30-40个循环，可通过琼脂糖凝胶电泳出现条带，则待测植物属于轻微感病。
在一些实施例中，作为模板的植物根癌菌DNA，其浓度控制在20ng/μl，以所述植物根癌菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增循环数分别为20、25、30。实践中发现，这样可以更好的区分不同病树感染植物根癌菌的染病程度。
本文所指的植物根癌菌(Agrobacterium)包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
在一些实施例中，植物根癌病快速无损检测方法，包括：
(1)取不同感病程度的果树叶片，剪取叶中脉0.1g，剪成1mm左右碎片；放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，放在研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz；
(2)将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所选试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μlDNA样品；
(3)用nanodrop仪器进行DNA浓度测量，并用ddH2O(超纯水)将DNA模板配制成浓度为20ng/μl工作液，待用；
(4)用已配置的工作液为模板，进行常规PCR反应(聚合酶链式反应)，通过设置反应循环数20、25、30，进行PCR扩增。
(5)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果。
本发明还涉及上述特异性扩增引物在植物根癌病快速无损检测中的应用。
本发明基于磨样处理技术、DNA浓度定量及PCR检测技术的结合，对感染根癌病植物组织携带病菌量进行定性检测及感病程度区分。本发明能够实现对植物组织内病菌含量的精确定量检测分析，可以用于判断植物病情，对病情进行分级，提供一种用于判断病害发病程度的方法，对不同感病程度果树进行分级，为根癌病病害防治提供一种快速鉴定分级的评价方法。
本发明的关键点：
(1)本发明是基于聚合酶链式反应循环数与感染根癌病果树带菌量之间的关系进行病害无损快速鉴定分级。
(2)本发明的作用对象是不同带菌量的根癌病叶片，实现对不同果树根癌病带菌量的有效区分。本实例中以潜伏期、根瘤初步形成阶段、根瘤快速扩散期的携带根瘤菌的果树叶片作为具体研究对象。
(3)本发明检测方法是通过设置聚合酶链式反应循环数，实现带菌量的快速鉴定分级，20个循环扩增出条带属于严重感病、25个循环扩增出条带属于中等感病，30个循环扩增出条带属于轻微感病，该方法首次用于果树根癌病研究中，田间防治人员可根据这一结果对病树进行有针对性的治疗。
本发明能够实现对根癌病组织内菌含量的快速分级检测分析，可以用于判断植物病情，以及病害等级划分。为快速评估带菌植株的根癌菌含量、感病程度以及病害防控提供一种有效的评价方法。
附图说明
图1为本发明实施例植物根癌病快速无损鉴定分级检测方法流程示意图。
图2为本发明实施例植物根癌病快速无损鉴定分级检测方法中PCR扩增过程。
图3本发明实施例聚合酶连链式反应(PCR)扩增结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实例选取葡萄根癌菌对本发明作进一步的详细说明，具体测定方法如下：
(1)材料：选取不同感病时间(潜伏期、根瘤初步形成期、根瘤快速扩散期)的葡萄根癌菌感病叶片，温室无菌苗作为阴性对照。
(2)磨样处理：取叶中脉剪成1mm左右碎片，每份取0.1g，分别放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，在震荡研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz。
(3)DNA提取：将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所选试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μl DNA样品。
(4)DNA模板定量：用仪器nanodrop2.0进行DNA浓度测量，并用ddH2O(超纯水)将DNA模板配制成浓度为20ng/μl工作液，待用。
(5)PCR反应：用已配置的DNA模板工作液为扩增模板加入4μl，选取葡萄根癌病特异性扩增引物
FI:5′-TTTCCAACTTGTTCCGCTTTA-3′
RI：5′-CCCTTTCCTGATGATCCCTA-3′。
各加入0.4μl，2×Taq预混PCR反应体系10μl，加入ddH2O(超纯水)5.2μl，配制成20μl反应体系，进行常规PCR反应(聚合酶链式反应)，设置反应循环数分别为20、25、30，进行PCR扩增。(图2)
(6)电泳：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，上样量5μl/每份，通过凝胶成像系统得到扩增结果，如图3所示。图3中，1-3：20个循环扩增结果；4-6：25个循环扩增结果；7-9：30个循环扩增结果，每组的顺序是：根瘤快速扩散期、根瘤初步形成期、潜伏期。
由图3可知，根瘤快速扩散期的葡萄叶片在20、25、30个PCR循环中均有清晰扩增条带，根瘤初步形成期的葡萄叶片在25、30个PCR循环中有清晰扩增条带，潜伏期的葡萄叶片只在30个PCR循环中有清晰扩增条带，无菌对照组和水对照组在所有循环数均未扩增出条带。证明通过固定DNA模板浓度，结合设置不同循环的PCR反应循环数，可以快速检测出根癌病，同时对植株感病程度进行有效区分。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京农业信息技术研究中心
<120> 一种植物根癌病快速无损检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttccaactt gttccgcttt a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctttcctg atgatcccta 20

Claims (8)

1.一种植物根癌病快速无损检测方法，包括：
提供从待测植物中获得的植物根癌菌DNA；其中，所述植物根癌菌DNA的浓度为20ng/μl；
以所述植物根癌菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增循环数分别为20-25次、25-30次和30-40次；
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果；
根据扩增结果获得待测植物根癌病的发病程度。
2.根据权利要求1所述的植物根癌病快速无损检测方法，其中，是从待测植物的叶片、茎或根中获得植物根癌病菌DNA。
3.根据权利要求1所述的植物根癌病快速无损检测方法，其中，所述植物根癌菌(Agrobacterium)包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
4.根据权利要求1所述的植物根癌病快速无损检测方法，其中，所用的特异性扩增引物为：
FI:5′-TTTCCAACTTGTTCCGCTTTA-3′
RI：5′-CCCTTTCCTGATGATCCCTA-3′。
5.根据权利要求1所述的植物根癌病快速无损检测方法，其中，作为模板的植物根癌菌DNA的浓度为20ng/μl，以所述植物根癌菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增循环数分别为20、25、30。
6.根据权利要求1、3、4任一项所述柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：
(1)取不同感病程度的果树叶片，剪取叶中脉0.1g，剪成1mm左右碎片；放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，放在研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz；
(2)将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所选试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μlDNA样品；
(3)用nanodrop仪器进行DNA浓度测量，并用ddH2O将DNA模板配制成浓度为20ng/μl工作液，待用；
(4)用已配置的工作液为模板，进行常规PCR反应，通过设置反应循环数20、25、30，进行PCR扩增；
(5)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果。
7.用于植物根癌病快速无损检测的引物，所述引物为：
FI:5′-TTTCCAACTTGTTCCGCTTTA-3′
RI：5′-CCCTTTCCTGATGATCCCTA-3′。
8.权利要求7所述引物在植物根癌病快速无损检测中的应用。
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