KR20230168683A - 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뿌리이상비대병 병원성 균주 특이적 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 상기 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 프라이머 세트는 뿌리이상비대병 감염 식물체로부터 낮은 밀도의 뿌리이상비대병 병원성 균주만을 선택적으로 결합하여 증폭할 수 있어, 병의 육안적, 형태적 임상진단법의 한계를 극복하고 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 수경작물의 뿌리이상비대병의 조기 진단으로 인한 효율적인 방제를 가능하게 할 것이다.
Description
본 발명은 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
최근 파프리카 수경재배 중 과도하게 뿌리이상비대로 농가들 사이에서 ‘Crazy root’라고 불리는 병이 문제가 되고 있다. 처음 농가들 사이에서 뿌리 활착이 잘 되었다고 착각하게 만드는 이러한 증상은 영양생장 기간이 길어지고 생식생장으로의 전환이 늦어 착화, 착과수가 줄어들어 농가에 경제적 피해를 야기하는 병이다.
이 병은 Agrobacterium 세균에 의해 야기되며, 병원성 기작은 Ri plasmid가 지닌 T-DNA가 식물 염색체에 삽입되어 식물호르몬이 과도하게 분비되어 뿌리가 비대해진다. ‘Crazy root’라고 불리는 뿌리이상비대병은 1993년 영국 내 수경재배하는 오이에서 최초로 발생이 되었다. 이후 네덜란드, 벨기에, 러시아, 일본 등에서 발견되었고 ‘Crazy root’ 또는 ‘Hairy root’라고 불리며 확산되고 있다.
파프리카, 토마토 등 수경재배작물에서 뿌리이상비대병이 발생하면 방제가 어렵고 경제적 피해가 커서 농가에서 어려움을 겪고 있다. 따라서 뿌리이상비대병의 발생특징을 파악하고 조기에 진단하여 예방하는 것이 중요하다.
뿌리이상비대병의 원인균과 발생생태를 확인하기 위하여 감염개체로부터 원인균을 분리한 결과 Agrobacterium sp.임을 확인하였고 Koch’s의 법칙에 따라 병원성 확인을 통해 분리한 Agrobacterium sp.균이 뿌리이상비대병을 일으키는 것을 검정하였다. 뿌리이상비대병을 야기하는 Agrobacterium 병원균은 Rhizobiaceae과에 속하는 세균으로 식물 발달을 향상시키거나 방해하는 다수의 하위속이 여기에 해당된다. 질소를 암모니아로 환원하는 미생물군으로 질소를 고정하여 뿌리에 공생하는 질소고성세균과 뿌리에 혹을 일으키는 뿌리혹병, 뿌리를 과도하게 발달시키는 뿌리이상비대병 병원균이 Rhizobiaceae과에 포함된다.
뿌리이상비대병의 병원성 인자는 Ri plasmid (Root inducing plasmid)라고 하는 원형의 염색체에 의해 나타난다. Ri plasmid에는 T-DNA 부분이 존재하는데 식물의 염색체 부분에 T-DNA를 삽입함으로써 병원균의 질소공급원인 오핀과 식물호르몬인 옥신, 사이토카닌 등을 과도하게 발현시켜 뿌리를 비정상적으로 비대하게 만든다. Agrobacterium이 식물체 내 염색체에 T-DNA를 삽입하면 식물은 죽을 때까지 오핀과 식물호르몬을 비정상적으로 만들 수밖에 없다. 따라서 뿌리이상비대병이 발생하면 방제가 힘들기 때문에 예방하는 것이 중요하다.
뿌리이상비대병의 정확한 발병경로가 아직까지 밝혀지지 않은 단계이며, 한번 발생하면 경제적 피해를 일으킬 뿐만 아니라 뚜렷한 해결책이 없어 농가의 불안이 높아진다. 따라서 뿌리이상비대병을 조기에 진단하여 병 확산을 막고 예방하는 것이 중요하다.
현재 뿌리이상비대병을 진단하는 방법으로는 분자생물학적 진단방법으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)법을 이용하는 방법과 병원균 단백질과 특이적으로 결합하는 진단용 탐침 등이 연구 및 개발되어져 있으나 이들은 일부 종에 한정되어 있거나 비병원성 균주 및 병원성 균주를 특이적으로 구별할 수 있는 진단하는 방법에 대한 연구는 미흡하다.
따라서, 상기의 문제점들을 해결하기 위해 일반 RT-PCR법 및 Real-time PCR법을 이용하여 발병 식물체로부터 국내 발병 보고된 뿌리이상비대병의 병원균인 Agrobacterium 속 균주에 특이성 및 민감도가 우수한 분자유전학적 마커 개발을 통하여 병해 임상진단에 소요되는 시간의 단축과 진단의 정확성을 높이는 필요성이 절실히 대두되었다.
European Journal of Plant Pathology 161(4)
본 발명의 목적은 뿌리이상비대병 병원성 균주만을 정확하게 검출하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 특이적 프라이머 세트 및 이의 뿌리이상비대병 병원성 균주 판별 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 발병 식물체 시료에서 분리된 Total DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 뿌리이상비대병 병원성 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 뿌리이상비대병 병원성 균주를 높은 민감도로 신속 정확하게 분석할 수 있다.
도 1은 lactate dehydrogenase 유전자영역 Agrobacterium biovar 1 병원성균주와 비병원성균주의 염기서열이 차이를 보이는 부분과 특이적 프라이머 Genetic map을 나타낸 것이다
도 2는 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 qPCR condition이다.
도 3은 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 qPCR 조성을 나타낸다.
도 4는 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 및 기타 병원균으로부터 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 특이적 마커 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PNA 프로브를 사용하여 병원성/비병원성 균주의 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뿌리이상비대병 병원성 균주 프라이머 및 프로브의 특이적 민감도를 검정한 결과이다.
도 2는 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 qPCR condition이다.
도 3은 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 qPCR 조성을 나타낸다.
도 4는 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 및 기타 병원균으로부터 Agrobacterium biovar 1 병원성균주 특이적 마커 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PNA 프로브를 사용하여 병원성/비병원성 균주의 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뿌리이상비대병 병원성 균주 프라이머 및 프로브의 특이적 민감도를 검정한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트 또는 이를 포함하는 검출용 조성물에 의해 검출되는 뿌리이상비대병 병원성 균주는 아그로박테리움 속 균주일 수 있으며, 구체적으로 아그로박테리움 바이오바 1(agrobacterium biovar 1 (Ri plasmid))일 수 있다.
상기 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 프라이머 세트는 아그로박테리움 바이오바 1의 lactate dehydrogenase영역에 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머 일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 프라이머 세트 외에도 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 증폭 반응은 PCR 반응이 바람직하고, 이를 위한 DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 시료 또는 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주의 검출방법을 제공한다.
SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen (Hilden, Germany))를 이용할 수 있다.
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 뿌리이상비대병 병원성 균주의 lactate dehydrogenase 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 증폭 반응은 실시간 PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브, PNA 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
상기 실시간 PCR에 의한 상기 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 프라이머 세트의 타겟 유전자 검출의 최소 DNA 양은 100fg(femtogram) 내지 10ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 100 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출 민감도가 매우 높은 것이다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 ROX 또는 Texas Red이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 ROX 또는 Texas Red를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 표적 염기서열을 증폭하기 위해 이용된 qPCR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 멜팅 커브 분석 (melting curve analysis) 방법을 적용한다. PCR이 최종적으로 완료된 후 최종 증폭 산물(End PCR product)에 PNA 프로브가 혼성화되며 융해온도(Melt T.m)을 분석하여 뿌리이상비대병 병원성 균주를 검출할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 뿌리이상비대병 병원성 균주 특이적 분자표지인자(PCR primer 및 프로브) 개발
(1) 국내 발병 뿌리이상비대병 병원성 균주 수집
본 발명에서 사용된 아그로박테리윰 바이오바 1의 Ri plasmid를 함유한 균주(병원성 균주)들을 포함한 기타 미생물은 수경재배 토마토, 파프리카의 뿌리로부터 균주를 분리하여 얻었으며, 이들의 구체적인 출처는 표 1에 정리하였다. 균주들은 LB 배지에 28℃ 배양기에서 1~2일정도 배양하거나 액체배양 시 LB broth 3ml, 28℃, 150rpm에서 1~2일간 배양하여 실험의 공시균주로 사용하였다.
| Strain | 균주학명 | 발생기주 | 발생지역 | 병원성 | Plasmid | |
| 1 | 2B4-1 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 진주 | ++ | pRi |
| 2 | 2B4-3 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 진주 | ++ | pRi |
| 3 | 2B4-4 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 진주 | +++ | pRi |
| 4 | 2B4-L | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 진주 | + | pRi |
| 5 | 2b5-2 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 함안 | + | pRi |
| 6 | 2b5-7 (GNIY3) |
Agrobacterium sp. | 파프리카 | 함안 | +++ | pRi |
| 7 | 2r4-3 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 함안 | + | pRi |
| 8 | GS2-2-11 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 고성 | +++ | pRi |
| 9 | 5-5-3 (GNIY2) |
Agrobacterium sp. | 토마토 | 진주 | +++ | pRi |
| 대조 | HA2-10-1 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 함안 | - | pRi |
| 대조 | HA2-10-2 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 함안 | - | pRi |
| 대조 | 1r3-3 | Agrobacterium sp. | 파프리카 | 진주 | - | None |
| 대조 | E.coli | Escherichia coli | - | - | - | - |
(2) 국내 발병
Agrobacaterium
biovar 1 9종 및
대조 균주 4종
genomic DNA 분리
상기 균주들의 genomic DNA를 추출하기 위하여 표 1에 명시된 Agrobacaterium biovar 1 균주 9종과 대조균주로 활용된 비병원성 Agrobacaterium 3종, 뿌리혹병을 일으키는 Agrobacaterium (Tiplasmid 함유) 3종, 다른 속의 E.coli균 1종을 LB배지 상에서 28℃ 1~2일간 배양하여 자라나온 단일집락체를 사용하였다. 대조 균주로 활용된 Escherichia 속 균주는 LB 배지상에서 28℃ 1~2일간 자란 단일집락체를 사용하였다. 각각의 균주들을 LB broth 3ml에 각 배양 온도(E.coli; 37℃, Agrobacterium; 28℃)에서 1~2일 정도 배양한 후 배양부유액 1ml을 E-tube에 분사한 후 13,000rpm 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. Maxwell kit RSC fure food kit를 사용하여 genomic DNA를 분리하였으며 ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, NC, USA)를 사용하여 최종 DNA 농도를 10ng/㎕로 희석한 다음 아가로스겔(agarose gel)에 전기영동하여 DNA를 정량 확인하였다.
(3) 국내 발병
Agrobacaterium
biovar 1 9종 및 대조 균주 4종에 대한 Ri plasmid 서열 분석을 통한 polymorphic 마커 선발
상기 균주들의 plasmid DNA를 추출한 후 WGS 라이브러리를 제작한 후 Illumina Hiseq X 장비를 이용하여 아래와 같이 염기서열을 생산하였다.
| Sample | Sequencing file | No. of reads | Total length(bp) | GC (%)*1 | Q30 (%)*2 |
| 2B4-1 | 2B4-1_1.fastq | 4,759,607 | 718,700,657 | 57.87 | 92.78 |
| 2B4-1_2.fastq | 4,759,607 | 718,700,657 | |||
| 2B4-3 | 2B4-3_1.fastq | 4,558,902 | 688,394,202 | 58.66 | 92.58 |
| 2B4-3_2.fastq | 4,558,902 | 688,394,202 | |||
| 2B4-4 | 2B4-4_1.fastq | 4,537,189 | 685,115,539 | 58.91 | 92.56 |
| 2B4-4_2.fastq | 4,537,189 | 685,115,539 | |||
| 2B4-L | 2B4-L_1.fastq | 4,669,952 | 705,162,752 | 58.95 | 92.28 |
| 2B4-L_2.fastq | 4,669,952 | 705,162,752 | |||
| 2B5-2 | 2B5-2_1.fastq | 4,898,526 | 739,677,426 | 56.97 | 92.6 |
| 2B5-2_2.fastq | 4,898,526 | 739,677,426 | |||
| 2B5-7 | 2B5-7_1.fastq | 4,592,612 | 693,484,412 | 58.77 | 93.11 |
| 2B5-7_2.fastq | 4,592,612 | 693,484,412 | |||
| 2R4-3 | 2R4-3_1.fastq | 4,723,909 | 713,310,259 | 58.56 | 92.65 |
| 2R4-3_2.fastq | 4,723,909 | 713,310,259 | |||
| 5-5-5-3 | 5-5-5-3_1.fastq | 4,521,592 | 682,760,392 | 58.71 | 92.38 |
| 5-5-5-3_2.fastq | 4,521,592 | 682,760,392 | |||
| GS2-2-11 | GS2-2-11_1.fastq | 4,831,411 | 729,543,061 | 58.17 | 91.61 |
| GS2-2-11_2.fastq | 4,831,411 | 729,543,061 | |||
| HA2-10-1 | HA2-10-1_1.fastq | 4,954,903 | 748,190,353 | 59.87 | 92.79 |
| HA2-10-1_2.fastq | 4,954,903 | 748,190,353 | |||
| HA2-10-2 | HA2-10-2_1.fastq | 4,911,367 | 741,616,417 | 60.36 | 91.85 |
| HA2-10-2_2.fastq | 4,911,367 | 741,616,417 | |||
| Total | 103,919,940 | 15,691,910,940 |
Illumina 장비를 이용해서 생산된 raw data를 대상으로, cutadapt 프로그램으로 adaptor 서열을 제거한 후, quality trimming을 위해 SolexaQA (v3-.1.13) package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였다. 양 말단이 trimming 된 clean reads 들은 SOAPdenovo2 (ver 2.04) 프로그램을 이용하여 시퀀스 어셈플리를 수행하여 contig 서열을 확보하였다.
| Sample | No. of Total In/Del | No. of Homozygous*1 | No. of Heterozygous*2 | No. of Etc.*3 | ||||
| Total (Ins/Del) | Ins/Del | Total (Ins/Del) | Ins/Del | Total (Ins/Del) | Ins/Del | Total (Ins/Del) | Ins/Del | |
| 2B4-1 | 11 | 8/3 | 0 | 0/0 | 5 | 4/1 | 6 | 4/2 |
| 2B4-3 | 11 | 9/2 | 0 | 0/0 | 6 | 4/2 | 5 | 5/0 |
| 2B4-4 | 12 | 10/2 | 0 | 0/0 | 4 | 3/1 | 8 | 7/1 |
| 2B4-L | 12 | 9/3 | 0 | 0/0 | 6 | 4/2 | 6 | 5/1 |
| 2B5-2 | 15 | 7/8 | 2 | 1/1 | 1 | 0/1 | 12 | 6/6 |
| 2B5-7 | 10 | 8/2 | 0 | 0/0 | 6 | 5/1 | 4 | 3/1 |
| 2R4-3 | 10 | 8/2 | 0 | 0/0 | 6 | 4/2 | 4 | 4/0 |
| 5-5-5-3 | 11 | 8/3 | 0 | 0/0 | 3 | 3/0 | 8 | 5/3 |
| GS2-2-11 | 13 | 9/4 | 1 | 1/0 | 4 | 3/1 | 8 | 5/3 |
| HA2-10-1 | 17 | 7/10 | 10 | 4/6 | 2 | 1/1 | 5 | 2/3 |
| HA2-10-2 | 19 | 8/11 | 10 | 4/6 | 2 | 0/2 | 7 | 4/3 |
각 샘플별 In/Del 마커는 Reference genome과 비교하여 얻은 raw SNP (In/Del) position을 후보로 하여 합집합의 리스트를 구축하고, 이 때, 빈 영역(non-SNP loci)은 샘플의 consensus sequence로부터 채워 넣는 filling 과정을 거쳐 matrix를 작성하였다. 이후 샘플 간의 SNP (In/Del) 비교를 통해 mis-calling된 SNP (In/Del) 좌를 필터하여 final SNP (In/Del) matrix를 작성 한 후 병원성 샘플 간의 공통 변이를 선발하고 비병원성 샘플 간의 공통 변이를 선발하여 병원성/비병원성의 공통 변이를 비교하여 polymophic In/Del을 탐색하였다.
| 비교 샘플 | No. of Total In/Del | No. of Polymorphic In/Del | No. of Polymorphic In/Del | |
| No. of Homo-type*1 | No. of Hetero-type*2 | |||
| 병원성 vs 비병원성 | 36 | 7 | 6 | 1 |
최종적으로 병원성/비병원성 공통 마커는 총 6개가 선발되었으며 이 중에서 2개의 In/Del 마커 영역을 이용하여 프라이머 세트와 프로브를 디자인하였다.
(3) 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 디자인 및 제작
실시간 검출용 프라이머 세트는 뿌리이상비대병 병원성 균주 및 비병원성 균주에서 획득한 염기서열을 분석하여 lactate dehydrogenase 유전자 위치에서 Primer3 프로그램을 이용하여 100-200 bp의 PCR 산물이 생성되도록 디자인하였으며, 디자인 조건에서 GC 함량은 30~70%, 길이는 17~25bp, 융해 온도(Tm)는 58~65℃이 되도록하여 총 2쌍의 프라이머를 디자인 하였다(표 5).
또한, Taqman 프로브는 GC 함량은 40~60%, 길이는 20~30bp, 융해 온도는 50~70℃ 범위에서 확인될 수 있도록 디자인하기 위하여 eurofins (https://eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/qpcr-assay-design/)을 사용하여 총 1개의 LNA 프로브와 1개의 Taqman 프로브를 디자인하였다(표 5).
또한, PNA 프로브는 PNA tool(http://pnabio.com/support/PNA_Tool.htm)을 사용하여 GC 함량은 40~60%, 길이는 12~20bp, 융해 온도는 50~70℃ 범위에서 확인될 수 있도록 디자인하였으며, Self complementary가 발생하지 않도록 디자인하여 뿌리이상비대병 병원성 균주의 게놈 DNA에 특이적인 PNA 프로브 1개를 디자인하였다(표 5).
| 정보 | Name | Seq(5’-3’) | mer | Tm | GC rich | 비고 | PCR product size |
| 프라이머 | RIP_F1 | GCACGGCTCTAGTCGCTG | 18 | 58.6 | 66.7 | 551 | |
| 프라이머 | RIP_R1 | CCGAATGTTGCCACTGCG | 18 | 57.5 | 61.1 | ||
| 프라이머 | RIP_F2 | GATCTCGAGGAGGTGCGG | 18 | 57.6 | 66.7 | 551 | |
| 프라이머 | RIP_R2 | ATCGGTCCGAAGTCGCGC | 18 | 60.7 | 66.7 | ||
| 프라이머 | qRIP_F1 | GCAATCAGGTTTGGCTATGCG | 21 | 57.1 | 52.4 | 112 | |
| 프라이머 | qRIP_R1 | GCTGAGACTGCGCTCCAAG | 19 | 58.7 | 63.2 | ||
| 프로브 | qRIP_LTMP1 | tACTGCAGCGCAAGAAGAGAaAGtc | 25 | 66.4 | 48 | red color : LNA, lowercase : SNP |
|
| 프라이머 | qRIP_F2 | GACATCGACCTCGAGGACGA(서열번호 1) | 21 | 58.4 | 60 | 144 | |
| 프라이머 | qRIP_R2 | TCGAACATTCACGGCTACCGG(서열번호2) | 21 | 59.5 | 57.1 | ||
| 프로브 | qRIP_TMP2 | CCAGGCGACGCCAAGGTCCGC | 21 | 68 | 76.2 | ||
| 프로브 | qRIP_PP1 | CCAAGGTCCGCG(서열번호 3) | 12 | 68.4 | 75 |
<실시예 2>
Agrobacterium
sp. 균주 염기서열 검증 테스트
lactate dehydrogenase 유전자들에 대한 DNA 염기서열 정보를 얻고자 Agrobacterium 종들의 각각의 정제된 total genomic DNA에 대한 PCR 증폭을 실시하기 위해 병원성이 있는 분리균주 10종 (2B4-1, 2B4-3, 2B4-4, 2B4-L, 2b5-2, 2b5-7(GNIY3), 2r4-3, GS2-2-11, 5-5-3(GNIY2))과 병원성이 없는 Agrobacterium sp. 3종 (HA2-10-1, HA2-10-2, 1r3-3) 및 비교균주로 대장균 (Eschrichia coli) 1종에 대하여 lactate dehydrogenase 특이적 프라이머 RIP-F1/RIP-R1 및 RIP-F2/RIP-R2 primer pair를 하용하여 표 6의 조건으로 PCR을 수행하였다.
각각의 프라이머 10 pmol, 10 ng의 genomic DNA, 2X 반응액(Reaction buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 15 mM MgCl2), 10 mM dNTPs 혼합액(2.5 mM dATP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 2.5 mM dTTP), 1 unit의 Top DNA polymerase(바이오니아, 한국)를 첨가하여, 최종 부피를 50 ㎕로 하여 PCR을 수행하였다. MJ eppendorf사의 Mastercycler X50s을 이용하여 PCR 증폭을 하였으며, 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔서 100V/30분간 전기영동하여 브롬화 에티디움(ethidium bromide)로 염색하였다(도 1). UV illuminator 상에서 목적하는 DNA 단편의 증폭여부를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 증폭 산물은 EXOSAT-IT(GE Healthcare, Amersham, UK)을 이용하여 정제 후 염기서열 분석(시퀀싱;sequencing)을 실시하였다(도 1 도 2).
| Target DNA | Initial Denature | Step Cycle | Final Extention | |||
| Denature | Annealing | Extention | Cycles | |||
| lactate dehydrogenase gene | 95℃/5 min | 94℃/30 sec | 60℃/30 sec | 72℃/30 sec | 35 | 72℃/10 min |
Agrobacterium sp. 종들에 대한 유용유전자들의 염기서열들을 비교분석한 병원성을 나타내는 Ri plasmid를 가진 균주들과 병원성을 보이지 않는 Ri plasmid 균주들 간의 염기서열 차이를 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험에서 뿌리이상비대병 병원성 균주 특이적 프라이머 및 프로브를 선발 테스트를 수행하였다.
<실시예 3> 뿌리이상비대병 병원성 균주 특이적 프라이머 및 프로브 선발 테스트 (도 3 및 4)
상기 제작된 뿌리이상비대병 병원성 프로브 3개 중 하나를 선별하기 위해, qRIP-F1, qRIP-R1 프라이머 세트 및 qRIP-LTMP1프로브 조합과 qRIP-F1, qRIP-R2 프라이머 세트 및 qRIP-TMP2 프로브, qRIP-PP1를 하기 표 7의 조건으로 각각 혼합한 후 표 8의 조건으로 real-time PCR을 수행하였다.
| LNA 프로브 조합 조건 | |||
| Components | Name | Stock Conc. | 1rxn당 vol (㎕) |
| Forward primer | qRIP-F1 | 10 | 1 |
| Reverse primer | qRIP-R1 | 10 | 1 |
| LNA probe | qRIP-LTMP1 | 10 | 1 |
| Premix | EzAmpTM qPCR 2X Master Mix | 2X | 10 |
| D.W | - | 6 | |
| DNA | 1 ng | 1 | |
| Total | 20 | ||
| Taqman 프로브 조합 조건 | |||
| Components | Name | Stock Conc. | 1rxn당 vol (㎕) |
| Forward primer | qRIP-F2 | 10 | 1 |
| Reverse primer | qRIP-R2 | 10 | 1 |
| LNA probe | qRIP-TMP2 | 10 | 1 |
| Premix | EzAmpTM qPCR 2X Master Mix | 2X | 10 |
| D.W | - | 6 | |
| DNA | 1 ng | 1 | |
| Total | 20 | ||
| PNA 프로브 조합 조건 | |||
| Components | Name | Stock Conc. | 1rxn당 vol (㎕) |
| Forward primer | qRIP-F2 | 10 | 0.2 |
| Reverse primer | qRIP-R2 | 10 | 2 |
| LNA probe | qRIP-PP1 | 10 | 1 |
| Premix | EzAmpTM qPCR 2X Master Mix | 2X | 10 |
| D.W | - | 5.8 | |
| DNA | 1 ng | 1 | |
| Total | 20 | ||
| 프로브 타입 | Initial Denature | Step Cycle | ||||||||||||
| Denature | Annealing and Extention | Cycles | ||||||||||||
| LNA 프로브 및 Taqman 프로브 | 95℃/10 min | 95℃/30 sec | 60℃/45 sec* | 35 | ||||||||||
| 프로브 타입 | Initial Denature | Step cycle | Melting | |||||||||||
| Denature | Annealing | Extention | Cycles | |||||||||||
| PNA프로브 | 95℃/10 min | 95℃/30 sec | 58℃/30 sec* | 72℃/30 sec | 40 | 95℃/ 5 min |
80℃/ 30 sec |
65℃/ 30 sec |
50℃/ 30 sec |
40℃~85℃/ increment 1℃/ 5 sec Hold | ||||
Hydrolysis 타입의 프로브인 LNA와 Taqman 프로브의 경우 Melting curve analysis 분석이 불가능하므로, 실시간 증폭곡선을 확인하기 위한 Amplification curve를 확인하였으며, PNA 프로브는 melting curve analysis를 이용하여 융해온도(melting T.m)을 확인하여 뿌리이상비대병 병원성 균주와 비병원성 균주의 구별능을 확인하였다. 그 결과, LNA 프로브 및 Taqman 프로브는 병원성/비병원성 구별이 불가능 하였으며, PNA 프로브에서 병원성/비병원성 균주의 검출능을 확인하였다(도 3, 4, 및 5).
<실시예 4> 뿌리이상비대병 병원성 균주 프라이머 및 프로브의 특이적 민감도 검정
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 진단 민감도를 조사하기 위해 Agrobacterium sp. 2B5-2 게노믹 DNA를 10ng/㎕부터 연속희석법으로 10fg/㎕ 까지 희석하여 융해 곡선을 분석한 결과, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브가 게노믹 DNA 1pg/㎕ 농도까지 안정적으로 진단이 가능함을 확인하였다(도 6).
<110> REPUBLIC OF KOREA
<120> A composition for detecting pathogenic strain causing Crazy root
<130> P22G10C0010
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> qRIP_F2
<400> 1
gacatcgacc tcgaggacga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> qRIP_R2
<400> 2
tcgaacattc acggctaccg g 21
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> qRIP_PP1
<400> 3
ccaaggtccg cg 12
Claims (12)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머세트를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 뿌리이상비대병 병원성 균주는 아그로박테리움 바이오바 1(Agrobacterium biovar 1)인 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 아그로박테리움 바이오바 1(Agrobacterium biovar 1)의 lactate dehydrogenase 영역에 특이적인, 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 프라이머 세트 및 제 2항의 프로브를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 키트.
- 제5항에 있어서,
증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는, 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 키트.
- 제6항에 있어서,
증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는, 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출용 키트.
- 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 검출용 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출방법.
- 제8항에 있어서,
시료는 뿌리이상비대병 병원성 균주에 의해 뿌리이상비대병이 발병한 식물을 포함하는, 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출방법.
- 제 9항에 있어서,
상기 식물은 수경재배작물인 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출방법.
- 제8항에 있어서,
증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)를 통한 증폭 반응을 포함하는, 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출방법.
- 제8항에 있어서,
증폭 산물의 검출은 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위하여 형광 측정 또는 인광 측정을 포함하는 멜팅 커브 분석 (melting curve analysis), Probe-based fluorescence melting curve analysis (FMCA)를 이용한 아그로박테리움 바이오바 1 병원성 균주 검출방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220069264A KR20230168683A (ko) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220069264A KR20230168683A (ko) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230168683A true KR20230168683A (ko) | 2023-12-15 |
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| KR1020220069264A KR20230168683A (ko) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 뿌리이상비대병 병원성 균주 검출을 위한 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20230168683A (ko) |
-
2022
- 2022-06-08 KR KR1020220069264A patent/KR20230168683A/ko unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| European Journal of Plant Pathology 161(4) |
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