KR20220152472A - 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 맥문동 및 맥문아재비 속 6종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 6종의 맥문동 및 맥문아재비 속 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 맥문동 및 맥문아재비 속 5종의 판별 방법, 및 맥문동 및 맥문아재비 속의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 맥문동의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 맥문동의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 맥문동의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 맥문동의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
Description
본 발명은 맥문동 및 맥문아재비 속 5종 및 수입산 한약재 맥문동의 총 6종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 6종의 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 맥문동 및 맥문아재비 속 6종의 판별 방법, 및 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
맥문동(Liriope platyphylla)은 비짜루목 비짜루과의 여러해살이풀이다. 한국, 타이완, 일본 등에 분포하며 산지의 나무 그늘에서 자라며, 불사초라고도 한다. 맥문동의 덩이뿌리를 말리면 반투명한 담황색이 되는데, 기침과 가래를 멎게하거나 폐장의 기능을 돕고 기력을 돋우는데 뛰어난 효과가 있다고 알려져 있다. 한방에서는 이것을 강장ㅇ거담ㅇ진해ㅇ강심제 등에 사용한다. 최근 새집증후군이 자주 언급되면서 맥문동의 공기정화 능력이 알려져 관심을 모으고 있다.
약용으로 사용하는 맥문동은 무늬맥문동(Liriope platyphylla)가 혼동하기도 한다. 맥문동과 무늬맥문동은 학명은 동일하나, 맥문동은 5월부터 꽃이 피기 시작하지만 무늬맥문동은 8월에 꽃이 피고 잎의 가장자리로 밝은 선이 있다. 또한, 맥문동(Liriope platyphylla)과 동속에 속하는 개맥문동(Liriope spicata) 및 동속에 속하지는 않지만 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus) 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)와 혼동이 있다. 특히, 개맥문동(Liriope spicata)과 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)는 백합과 맥문아재비속에 속하는 여러해살이풀로 이들의 덩이뿌리는 맥문동과 달리 약용으로 사용하지 않는다.
이처럼 맥문동과 소엽맥문동의 약효로 이와 유사한 식물인 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비가 맥문동으로 둔갑하여 시장에서 판매되고 있는 실정이다. 더욱이, 최근에는 국가간의 왕래가 활발해짐에 따라 맥문동 및 이와 유사한 식물이 맥문동으로 둔갑하여 외국으로부터 수입되고 있다. 이러한 상황은 상품의 유통에도 혼란이 있을 수 있을 뿐만 아니라, 맥문동 속 유전자원의 확보와 관리는 물론 새로운 품종의 육종에도 상당한 혼동을 초래할 수 있다. 그러므로, 유전체 특성을 파악하여 품종 간의 차이를 확인할 필요가 있고, 더 나아가 유전자원 관리의 효율화와 신품종 개발을 위해 더 효율적이고 객관적인 구별 수단이 필요하다.
일반적으로 절편 형태로 유통되는 약용 식물의 특성상 외형적인 특징으로 기원식물을 구분하기가 매우 어렵기 때문에 위품 또는 다른 종과의 혼용 문제가 일어나고 있다. 이를 해결하기 위해 보다 체계적이고 과학적인 종(species) 판별 기술이 요구되고 있으며, 이에 가장 적합한 방법은 DNA 수준에서 종(species)을 식별할 수 있는 분자마커를 활용하는 것이다.
기존의 분자마커를 이용한 식물 DNA 바코딩의 경우 엽록체 유전체에서 변이가 많다고 알려진 rbcL, matK, trnH-GUG-pabA와 같은 특정 유전자나 유전자간 부위(intergenic region) 서열의 일부만을 대상으로 개발되어 왔다. 그러나 이들 지역을 증폭하기 위해서 사용되는 보편적인 바코딩 프라이머(universal barcoding primer)는 식물 종에 따라 PCR 증폭 효율이 떨어지거나 증폭이 되지 않는 문제점이 있으며, 증폭이 되었다 할지라도 염기서열의 다형성이 존재하지 않을 수 있는 문제점이 있다. 또한 이들 고변이 지역은 식물에 따라서는 동일한 종내에서도 변이가 발견되는 경우가 있어 동일종을 다른 종으로 구분할 수 있는 가능성을 내포하고 있다.
현재까지 DNA 수준에서 한약재로 널리 사용되고 있는 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 기원종을 대상으로 한 판별법은 한국 등록특허 제10-1492692호 및 제10-1450447호에 보고된 바가 있으나 이들 판별법은 맥문동 또는 맥문아재비 속 식물의 유전체의 일부 지역만을 대상으로 한 것이다.
이에 본 발명자들은 엽록체 유전체의 일부 지역이 아닌 엽록체 전장 유전체 서열을 분석하여 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 주요 5종 및 수입(특히 중국) 맥문동의 다형성이면서 보다 신뢰할 수 있는 변이 지역을 탐색하여 기원종을 구별하는 분자마커를 개발하고, 좀 더 실용적인 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 기원종 판별 기법을 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 5종 및 수입 맥문동의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.
상세하게는, 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 맥문아재비(Ophiopogon jaburan) 5종의 맥문동 및 맥문아재비 속(genus) 식물 및 수입 맥문동(Liriope platyphylla)의 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 맥문동 및 맥문아재비 속 5종 및 수입 맥문동의 판별 방법, 및 맥문동 및 맥문아재비 속 5종 및 수입 맥문동의 종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 맥문동 및 맥문아재비 속(genus) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 맥문아재비(Ophiopogon jaburan) 5종의 맥문동 및 맥문아재비 속(genus) 식물 및 수입 맥문동(Liriope platyphylla)으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 15로 표시되는 프로브; 서열번호 18로 표시되는 프로브; 서열번호 21로 표시되는 프로브; 서열번호 24로 표시되는 프로브; 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 151번째 또는 152번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 맥문동의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
도 1은 맥문동의 완전한 엽록체 유전체를 보여주는 도면이다. 여기에서, 유색 박스는 유전자 산물의 기능에 근거하여 분류된 보존된 엽록체 유전자를 나타낸 것이다. 또한, 원의 안쪽에 위치한 유전자는 반시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이며, 원의 바깥에 위치한 유전자는 시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이다. 한편, 안쪽 원의 점선 지역은 엽록체 게놈의 GC 함량을 의미한다.
도 2는 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan) 대상으로 FenDEL-qPCR 방법으로 분석한 6개 분자마커 별 증폭곡선 및 +, - 형질 판단 결과를 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭 곡선 중에서 파랑색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색 선은 각 마커의 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, 각 마커별 +, - 형질 판단은 내부 대조구(파랑색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)과 SNP 마커(빨강색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하는 것으로서, 이는 즉 SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)에 대한 6개의 SNP 마커의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 2는 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan) 대상으로 FenDEL-qPCR 방법으로 분석한 6개 분자마커 별 증폭곡선 및 +, - 형질 판단 결과를 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭 곡선 중에서 파랑색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색 선은 각 마커의 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, 각 마커별 +, - 형질 판단은 내부 대조구(파랑색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)과 SNP 마커(빨강색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하는 것으로서, 이는 즉 SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)에 대한 6개의 SNP 마커의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
본 발명은 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)의 엽록체 유전체 서열을 완전 해독하고, 이를 기반으로 한 종간 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 5종 및 수입 맥문동의 판별 방법, 및 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 5종 및 수입 맥문동 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 맥문동 속(Liriope) 및 맥문아재비 속(Ophiopogon)의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)를 포함하는 맥문동 속 및 맥문아재비 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 맥문동 속(Liriope)의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 8, 서열번호 11, 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 및 개맥문동(Liriope spicata)를 포함하는 맥문동 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 맥문아재비 속(Ophiopogon)의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 3 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus) 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)를 포함하는 맥문아재비 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드는 각 염기서열 내에서 151번째 또는 152번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 다형성 뉴클레오티드로, 상기 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 대한 SNP 다형성 염기 정보는 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 152번째 염기가 C인 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 152번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP; 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물에 있어서, SNP 다형성을 포함하는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 맥문동(Liriope platyphylla)을 구별할 수 있고; 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 수입 맥문동(Liriope platyphylla)을 구별할 수 있으며; 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus)를 구별할 수 있으며; 서열번호 3, 4, 7, 8, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 무늬맥문동(Liriope platyphylla)를 구별할 수 있으며; 서열번호 5, 6, 7, 8, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 개맥문동(Liriope spicata)을 구별할 수 있으며; 서열번호 3, 4, 5 및 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 중에서 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)를 구별할 수 있다(도 2 및 도 3참조).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 무늬맥문동, 및 개맥문동을 포함하는 맥문동 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 소엽맥문동 및 맥문아재비를 포함하는 맥문아재비가 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "구별"은 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 6종의 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속의 식물 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 품종의 다양성을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '판별'과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX이다. 표적 서열의 증폭 시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 15로 표시되는 프로브; 서열번호 18로 표시되는 프로브; 서열번호 21로 표시되는 프로브; 서열번호 24로 표시되는 프로브; 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 서열번호 15로 표시되는 프로브; 서열번호 18로 표시되는 프로브; 서열번호 21로 표시되는 프로브; 서열번호 24로 표시되는 프로브; 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 무늬맥문동, 및 개맥문동을 포함하는 맥문동이 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공할 수 있다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 서열번호 18로 표시되는 프로브; 서열번호 21로 표시되는 프로브; 및 서열번호 24로 표시되는 프로브;를 포함하는, 소엽맥문동 및 맥문아재비를 포함하는 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브(probe)"란 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프로브는 DNA 폴리머레이즈의 FEN (Flap endonuclease) 특이도를 이용하는 RT-PCR 기반의 대립유전자 특이 프로브로서, 프로브는 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다.
전술한 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10개 이상, 바람직하게는 10-100개의 연속 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, "실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 일치되는 서열 뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
전술한 프라이머 세트 및 프로브 세트 중 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 15로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 1 또는 2 (ID: SNP#2)의 152번째 염기인 단일염기다형성(SNP) C와 T를, 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 18로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 3 또는 4 (ID: SNP#3)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) G와 A를, 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 21로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 5 또는 6 (ID: SNP#4)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) C와 T를, 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 24로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 7 또는 8 (ID: SNP#6)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) A와 C를, 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 9 또는 10 (ID: SNP#9)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) T와 C를, 서열번호 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 11 및 12 (ID: SNP#19)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) C와 A를 구별하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 키트는 내부 대조구인 rbcL 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 33로 표시되는 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트로서, 전술한 내부 대조구와 함께 증폭되는 것을 특징으로 하는 한약재 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 기원 식물 및 원산지 구별용 키트일 수 있다.
상기 키트는 5개의 SNP 마커(SNP#2, SNP#3, SNP#4, SNP#6, SNP#9, SNP#19)를 분석하기 위한 중합효소의 플랩 엔도뉴클레아제(flap endonuclease) 활성 억제 원리가 적용된 대립유전자 특이 실시간중합효소연쇄반응(FenDEL-qPCR)법을 이용하여, 6개의 SNP 마커의 증폭 유무 조합으로 한약재 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 기원 식물 및 원산지를 판정할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상술한 프라이머 세트 및 상술한 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 분리된 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 151번째 또는 152번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 식물 재료 준비
한약재 맥문동의 기원 식물종 및 원산지 구별 마커를 개발하고자, 식물 재료로서 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 맥문아재비(Ophiopogon jaburan) 5종의 맥문동 및 맥문아재비 속(genus) 식물 및 수입 맥문동(Liriope platyphylla) 각 1점씩을 한국한의약진흥원으로부터 수집하고, 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)을 통해 상기 6종의 맥문동 및 맥문아재비 속에 대한 엽록체 유전체의 염기서열을 분석하였다.
마커 검증을 위한 검증 시료로서 맥문동은 7개 집단 37점, 수입 맥문동은 3개 집단(시중 유통 한약재) 20점, 소엽맥문동은 3개 집단 27점, 무늬맥문동은 1개 집단 10점, 개맥문동은 2개 집단(국내 채집) 20점, 맥문아재비는 4개 집단(국내 채집/국립생물자원관 분양) 17점, 총 26개 집단, 137점을 이용하였다(표 1).
하기 표 1에 마커 개발에 사용된 시료를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 종류 | 출처(집단) | 시료 성상 |
수량 | ID | |
| 1 | 기준시료 | 맥문동 | 한국한의약진흥원 | 잎(생체) | 1 | TKMII-32-1 |
| 2 | 검증시료 | 맥문동 | 기청산수목원(포항)(1~20) | 잎(생체) | 20 | TKMII-32-1-1 |
| 3 | 검증시료 | 맥문동 | 한약재(국내)(21~22) | 한약재 | 2 | TKMII-32-1-2 |
| 4 | 검증시료 | 맥문동 | 장흥(23~28) | 잎(생체) | 6 | TKMII-32-1-3 |
| 5 | 검증시료 | 맥문동 | 장흥(41~45) | 잎(생체) | 5 | TKMII-32-1-5 |
| 6 | 검증시료 | 맥문동 | 국립생물자원관(1~2) | 잎(생체) | 2 | TKMII-32-4-1 |
| 7 | 검증시료 | 맥문동 | 국립생물자원관 DNA | DNA | 1 | NIBRGR0000599555 |
| 8 | 검증시료 | 맥문동 | 식약처 표준품 | 한약재(가루) | 1 | LIPL2012 |
| 9 | 기준시료 | 맥문동(수입) | 한국한의약진흥원 | 한약재 | 1 | TKMII-32-1C |
| 10 | 검증시료 | 맥문동(수입) | 한약재(중국)(1~5) | 한약재 | 5 | TKMII-32-1C-1 |
| 11 | 검증시료 | 맥문동(수입) | 한약재(중국)(6~10) | 한약재 | 5 | TKMII-32-1C-2 |
| 12 | 검증시료 | 맥문동(수입) | 한약재(수입)(11~20) | 한약재 | 10 | TKMII-32-1C-3 |
| 13 | 기준시료 | 소엽맥문동 | 한국한의약진흥원 | 잎(생체) | 1 | TKMII-32-2 |
| 14 | 검증시료 | 소엽맥문동 | 식약처 표준품 | 한약재(가루) | 1 | OPJA2012 |
| 15 | 검증시료 | 소엽맥문동 | 기청산수목원(완도)(1~20) | 잎(생체) | 20 | TKMII-32-2-1 |
| 16 | 검증시료 | 소엽맥문동 | 장흥(21~26) | 잎(생체) | 6 | TKMII-32-2-2 |
| 17 | 기준시료 | 무니맥문동 | 한국한의약진흥원 | 잎(생체) | 1 | TKMII-32-3 |
| 18 | 검증시료 | 무니맥문동 | 미상(1~10) | 잎(생체) | 10 | TKMII-32-3-1 |
| 19 | 기준시료 | 개맥문동1 | 한국한의약진흥원 | 종자 | 1 | TKMII-32-4 |
| 20 | 검증시료 | 개맥문동2 | 이서(29~40) | 잎(생체) | 12 | TKMII-32-1-4 |
| 21 | 검증시료 | 개맥문동2 | 장흥(3~10) | 잎(생체) | 8 | TKMII-32-4-2 |
| 22 | 기준시료 | 맥문아재비 | 한국한의약진흥원 | 잎(생체) | 1 | TKMII-32-5 |
| 23 | 검증시료 | 맥문아재비 | 제주(1~5) | 잎(생체) | 5 | TKMII-32-5-1 |
| 24 | 검증시료 | 맥문아재비 | 산유화(충주)(6~15) | 잎(생체) | 10 | TKMII-32-5-2 |
| 25 | 검증시료 | 맥문아재비 | 국립생물자원관 DNA | DNA | 1 | NIBRGR0000381962 |
| 26 | 검증시료 | 맥문아재비 | 국립생물자원관 DNA | DNA | 1 | NIBRGR0000433278 |
실시예 2: 게놈 DNA 추출
상기 실시예 1에서 준비된 각 검체의 게놈 DNA는 NucleoSpin Plant Ⅱ(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 게놈 DNA의 양은 Qubit dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen)을 사용하여 측정하였다. 차세대염기서열분석(NGS)용 검체의 DNA 농도는 총 200ng 이상, 마커 검증용 시료는 최소 0.5ng/㎕씩을 준비하였다.
실시예 3: 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)
NEBNext Ultra™ Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina (NEBNext-NGS Kit)를 이용하여 상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 NGS 분석 라이브러리를 제작하였다. NGS 분석 대상 검체별로 구분되는 색인 어댑터를 사용하였고, 세부적인 라이브러리 제작 과정은 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다. 제작된 각 라이브러리는 TapStation HSD5000(Agilent)을 이용하여 상태를 분석하고, NGS 분석 적합성을 판정하였다.
NGS를 이용한 대량의 유전체 염기서열 데이터 생산은 일루미나(Illumina) 플랫폼을 이용하였고, 분석 리드 형태와 길이는 Pair-end, 151 방식으로 분석하였다. 검체 당 1 Gb의 데이터양을 생성하였다.
실시예 4: 식물 검체의 엽록체 유전체 염기서열의 조립 및 유전자 예측
상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 분석된, 각 검체의 엽록체 전체 유전체 염기서열은 ㈜제노텍의 '세포소기관 유전체 염기서열 조립 및 검증 시스템'을 이용하여 완성하였다(도 1 참조). 조립 및 검증이 완료된 각 시료의 엽록체 유전체 염기서열의 길이는 맥문동은 157,076bp, 수입 맥문동운 157,054bp, 소엽맥문동은 156,564bp, 무늬맥문동은 157,017bp, 개맥문동은 156,464bp, 맥문아재비는 156,454bp이며(표 2), 각 엽록체 유전체의 유전자 예측 분석 결과 유전자들의 순서와 방향 등이 종간에 매우 잘 보존되어 있음을 확인하였다(도 1 참조). 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체는 82~83개의 단백질을 만드는 유전자(CDS), 30~31개의 tRNA 유전자, 및 4개의 rRNA 유전자로 구성되어 있음을 확인하였으며, 구조상으로 1개의 LSC(large single copy region), 1개의 SSC(small single copy region), 및 2개의 IR(inverted repeat region)을 가지고 있음을 확인하였다.
하기 표 2에 각 검체별 엽록체 유전체 염기서열 조립 결과를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 식물명 | ID | 총 리드 (Total reads) |
정렬된 리드 (Aligned reads) |
소기관 게놈 % (Organelle genome %) |
Cov. (x) |
유전체 길이 (bp) | 유전체 형태 |
| 1 | 맥문동 | TKMII-32-1 | 10,629,338 | 71,306 | 0.67 | 69 | 157,076 | 원형 |
| 2 | 맥문동(수입) | TKMII-32-1C | 10,281,196 | 18,845 | 0.18 | 18 | 157,054 | 원형 |
| 3 | 소엽맥문동 | TKMII-32-2 | 9,391,464 | 90,224 | 0.96 | 87 | 156,564 | 원형 |
| 4 | 무늬맥문동 | TKMII-32-3 | 7,332,938 | 81,704 | 1.11 | 79 | 157,017 | 원형 |
| 5 | 개맥문동 | TKMII-32-4 | 8,241,710 | 12,796 | 0.36 | 29 | 156,464 | 원형 |
| 6 | 맥문아재비 | TKMII-32-5 | 8,662,698 | 67,138 | 0.78 | 65 | 156,454 | 원형 |
실시예 5: 종간의 엽록체 유전체 염기서열 변이 분석 및 후보 유전자 마커 선발
엽록체(Dioscorea polystachya chloroplast, GenBank DB No. NC042227)의 염기서열 정보를 기준으로, 맥문동 및 맥문아재비 속 식물 6종의 엽록체 유전체 염기서열을 1: 1 비교하여 종 및 원산지 구분 마커로 활용 가능한 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism; SNP)과 삽입-결실(InDel) 변이를 분석하였다(표 3 참조).
하기 표 3에 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 맥문아재비의 엽록체 유전체 염기서열 변이를 정리하여 나타내었다.
| 기준 유전체 (GenBank #) |
비교대상 | 유전자 변이(개) | ||
| SNP | InDel | 계 | ||
| NC042227 | 맥문동 | 0 | 1 | 1 |
| 맥문동(수입) | 65 | 4 | 69 | |
| 소엽맥문동 | 674 | 160 | 834 | |
| 무늬맥문동 | 76 | 41 | 117 | |
| 개맥문동 | 96 | 39 | 135 | |
| 맥문아재비 | 693 | 155 | 848 | |
기준 유전체의 염기서열(GenBank DB No. NC042227)과 비교대상 별 분석 결과를 통합한 후 ㈜제노텍의 'SNP Barcode Generator'를 이용하여 9개의 SNP로 구성된 종 특이 SNP 마커 세트(SNP Barcode marker), 즉 후보 유전자 마커를 선발하였다(표 4 참조).
하기 표 4에 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 맥문아재비의 종 특이 SNP 마커 세트를 정리하여 나타내었다.
| SNP# | 유전자좌 (Locus) |
위치* (Position) |
NC042227 | 맥문동 | 맥문동(수입) | 소엽맥문동 | 무늬맥문동 | 개맥문동 | 맥문아재비 |
| SNP01 | atpA | 11606 | C | C | C | A | C | C | C |
| SNP02 | rpoC2 | 18698 | T | T | C | T | C | C | C |
| SNP03 | rpoB | 27040 | G | G | G | G | G | A | G |
| SNP04 | rps14 | 37260 | C | C | C | C | T | C | C |
| SNP05 | accD | 59030 | C | C | C | C | A | C | C |
| SNP06 | ycf1 | 126849 | A | A | A | A | A | A | C |
| SNP07 | ycf1 | 127950 | T | T | G | G | G | G | G |
| SNP08 | ycf1 | 128474 | G | G | G | T | G | G | T |
| SNP09 | ycf1 | 130117 | T | T | T | C | T | T | T |
(위치*: 참조 게놈 엽록체 염기서열 기준 위치)
실시예 6: 검증 시료 집단별 후보 유전자 마커 검증 및 최종 SNP 마커 선발
상기 실시예 3에서 수행한 NGS 분석법을 이용하여 마커 검증을 위해 준비된 26개 집단, 137점 시료(맥문동 37점, 수입 맥문동 20점, 소엽맥문동 27점, 무늬맥문동 10점, 개맥문동 20점, 맥문아재비 17점)를 대상으로 각 집단별 9개의 SNP에 대한 유전형을 분석하였으며(표 5 참조), 그 결과를 토대로 6개의 SNP 마커를 한약재 맥문동의 기원 식물과 원산지를 판별할 수 있는 마커로서 확정하였다(표 6 참조).
하기 표 5에 검증 시료 집단 별 SNP 마커 유전형 분석 결과를 정리하여 나타내었다. 또한, 하기 표 6에 최종 선발된 SNP 분자마커와 유전형을 정리하여 나타내었다.
| 종류 | 집단 ID | SNP01 | SNP02 | SNP03 | SNP04 | SNP05 | SNP06 | SNP07 | SNP08 | SNP09 |
| 맥문동 | TKMII-32-1 | C | T | G | C | C | A | T | G | T |
| TKMII-32-1-1 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| TKMII-32-1-2 | C | T | G | C | C | A | G | T | ||
| TKMII-32-1-3 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| TKMII-32-1-5 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| TKMII-32-4-1 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| NIBRGR0000599555 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| LIPL2012 | C | T | G | C | C | A | T | G | T | |
| 맥문동(수입) | TKMII-32-1C | C | T | G | C | C | C | T | G | T |
| TKMII-32-1C-1 | C | C | G | C | C | A | G | G | T | |
| TKMII-32-1C-2 | C | C | G | C | C | A | G | G | T | |
| TKMII-32-1C-3 | C | C | G | C | C | A | G | G | T | |
| 소엽맥문동 | TKMII-32-2 | C | C | G | C | C | A | G | G | T |
| OPJA2012 | A | T | G | C | C | A | G | T | C | |
| TKMII-32-2-1 | C | T | G | C | C | A | T | C | ||
| TKMII-32-2-2 | C | T | G | C | C | A | G | T | C | |
| 무니맥문동 | TKMII-32-3 | C | C | G | C | C | A | G | T | C |
| TKMII-32-3-1 | C | C | G | T | A | A | G | G | T | |
| 개맥문동1 | TKMII-32-4 | C | C | G | T | A | A | G | G | T |
| 개맥문동2 | TKMII-32-1-4 | C | C | A | C | C | A | G | G | T |
| TKMII-32-4-2 | C | C | G | C | C | A | T | G | T | |
| 맥문아재비 | TKMII-32-5 | C | C | G | C | C | A | G | G | T |
| TKMII-32-5-1 | C | C | G | C | C | C | G | T | T | |
| TKMII-32-5-2 | C | C | G | C | C | C | G | T | T | |
| NIBRGR0000381962 | C | C | G | C | C | C | G | T | T | |
| NIBRGR0000433278 | C | C | G | C | C | C | G | T | T |
| 구분 | 맥문동 | 맥문동(수입) | 소엽맥문동 | 무늬맥문동 | 개맥문동1 | 개맥문동2 | 맥문아재비 |
| SNP02 | T | C | T/C | C | C | C | C |
| SNP03 | G | G | G | G | A | G | G |
| SNP04 | C | C | C | T | C | C | C |
| SNP06 | A | A | A | A | A | A | C |
| SNP09 | T | T | C | T | T | T | T |
| SNP19 | C | A | A | C | C | C | A |
실시예 7: FenDEL-qPCR 기반의 한약재 맥문동의 기원 식물 및 원산지 판별 키트 개발
FenDEL_qPCR법을 이용하여 각 시료별 SNP 마커 유전형을 분석하고자, 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 프라이머 및 프로브 세트를 이용하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 ㈜제노텍의 올리고뉴클레오티드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다.
하기 표 7에 분자마커 분석용 프라이머 및 프로브 세트를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 마커 ID (Marker ID) |
유전자좌 (Locus) |
프라이머/프로브 서열(5'-3') [Primer/Probe Sequence(5'-3')] |
서열번호 |
| SNP 마커 세트 (SNP marker set) |
SNP#2 | rpoC2 | F: GGGTCGAACCAAAACAAAATACTT | 13 |
| R: GCATTTTGATACCACCAGGttCGA | 14 | |||
| P: Q670-TGATCCGTTGGACATAGATCCAA-BHQ3 | 15 | |||
| SNP#3 | rpoB | F: CTCTATCTTCAATTTTTGGAAACTTtTG | 16 | |
| R: GGAATGGAAATGAGGGAATGTC | 17 | |||
| P: FAM-TGATTAATGAACCTACAAAATCCTTC-BHQ1 | 18 | |||
| SNP#4 | rps14 | F: ATTTCTCGAAGTACATGTCCGG | 19 | |
| R: CAATCCCCACCACGTAATAcTG | 20 | |||
| P: Q670-TAGCTCTAGGTCTTCCAGTCAAA-BHQ3 | 21 | |||
| SNP#6 | ycf1 | F: GATACAAAATCTCCTTGACCTTG | 22 | |
| R: CTATGAAAAAAATATTAGTCAAAATGAAAAaAT | 23 | |||
| P: FAM-TGGAATTTTCTAATTCAAGATATTCTTTTTG-BHQ1 | 24 | |||
| SNP#9 | ycf1 | F: TCTCATCATCGCATAATCTcGC | 25 | |
| R: ACGACAGAAAAACTATCCCACGAA | 26 | |||
| P: JOE-TCTAAAGCAAGAGATCCCTTCTC-BHQ1 | 27 | |||
| SNP#19 | LSC | F: GTTCAAACACTTCCTAAAAGAAAAgTC | 29 | |
| R: CTACAATTATGTATTTGTTGCGACA | 29 | |||
| P: JOE-AAGGAAGAAAGCGAGTGAATCCA-BHQ1 | 30 | |||
| 내부 대조구 (Internal Control) |
IC | IC-F: CAAATCATTGATACAAATAATATCCAA | 31 | |
| IC-R: CAAGTTTTTTCCTTGACCTTTCC | 32 | |||
| IC-P: TAMRA-TACGCCTTCTAGATAACCTTCG-BHQ2 | 33 |
* 정방향 프라이머: F
* 역방향 프라이머: R
* 프로브: P
또한, FenDEL-qPCR 반응을 위해 SNP 마커 별로 하기 표 8에 나타낸 바와 같은 조건으로 반응물을 제조하고, 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. PCR은 ABI7500 실시간 PCR 시스템(ABI7500 Real-Time PCR System)을 이용하였다.
하기 표 8에 FenDEL-qPCR 분석 반응물 조성 및 반응조건을 정리하여 나타내었다.
| 반응물 조성 | PCR 반응 조건 | ||
| 구분 | 사용량 | ·95℃ - 5분 ·40 사이클: 95℃ - 30초 55℃* - 40초 |
|
| SNP# | (10 pmol/㎕) 정방향 프라이머(F primer) (10 pmol/㎕) 역방향 프라이머(R primer) (5 pmol/㎕) 프로브(Probe) |
1 ㎕ 1 ㎕ 1 ㎕ |
|
| 내부 대조구 (IC) |
(5 pmol/㎕) IC 정방향 프라이머(F primer) (5 pmol/㎕) IC 역방향 프라이머(R primer) (5 pmol/㎕) IC 프로브(Probe) |
1 ㎕ 1 ㎕ 1 ㎕ |
|
| 2ㅧ FenDEL-qPCR Master Mix (0.5 ng/㎕) gDNA PCR 등급 정제수(PCR Grade water) |
10 ㎕ 1 ㎕ 3 ㎕ |
||
| 총량(Total) | 20 ㎕ | ||
실시예 8. SNP 마커 유전형 조합을 이용한 종판별
상기 실시예 7에서 FenDEL-qPCR 방법으로 분석된 5개 SNP 마커별 유전형은 내부 대조구(IC)의 ΔRn 값(y축)을 기준으로 '-' 또는 '+'로 판정 후 '맥문동 기원 식물 판별표(표 9 참조)'와 비교하여 종을 판별하였다. 각 SNP 마커의 +, - 형질은 FenDEL-qPCR 결과 확인되는 'FAM' 형광(빨강색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)과 'TAMRA' 형광(파랑색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하였다(도 2 참조). 즉, SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하였다.
하기 표 9에 맥문동 기원 식물 판별표를 정리하여 나타내었다.
구체적으로, FenDEL-qPCR 방법에 의한 분석에 따르면, 6개의 SNP 마커(SNP2, SNP3, SNP4, SNP6, SNP9, SNP19) 중 SNP2, SNP3, SNP4, SNP6, 및 SNP19가 증폭되는 경우 맥문동(Liriope platyphylla)으로 판정되고, SNP3, SNP4, 및 SNP6이 증폭되는 경우 수입 맥문동(Liriope platyphylla)으로 판정되었다. 또한, SNP3, SNP4, SNP6, 및 SNP9가 증폭되는 경우 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus)으로 판정되고, SNP3, SNP6, 및 SNP19가 증폭되는 경우 무늬맥문동(Liriope platyphylla)으로 판정되었다. 또한, SNP4, SNP6, 및 SNP19가 증폭되거나 SNP3, SNP4, SNP6, 및 SNP19가 증폭되는 경우 개맥문동(Liriope spicata)으로 판정되고, SNP3 및 SNP4가 증폭되는 경우 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)로 판정되었다. 이를 통해, 한약재 맥문동 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하다.
<110> National Institute for Korean Medicine Development
<120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of
Liriope and Ophiopogon genus, primer set for discrimination of
Liriope and Ophiopogon genus and uses thereof
<130> PA-20-0261
<160> 33
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#2_rpoC2_C
<400> 1
ggaaaagttt tgctaaattt atcccatcag ctatttcata tgtgactacg ggtcgaacca 60
aaacaaaata cttttttttg ataggtgtga tccgttggac atagatccaa tttttcgatt 120
ttgtttttga ttccttagaa tttttttttt tcgttcctgg tggtatcaaa atgccactgt 180
gtctggatat cttatctgtc tctccaggaa aatgaatatc tccagaaaag attttcagtt 240
caatactttt tttttttctc tccactcgga ctaatccacc tactcggctt cttgtatttg 300
300
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#2_rpoC2_T
<400> 2
ggaaaagttt tgctaaattt atcccatcag ctatttcata tgtgactacg ggtcgaacca 60
aaacaaaata cttttttttg ataggtgtga tccgttggac atagatccaa tttttcgatt 120
ttgtttttga ttccttagaa tttttttttt ttgttcctgg tggtatcaaa atgccactgt 180
gtctggatat cttatctgtc tctccaggaa aatgaatatc tccagaaaag attttcagtt 240
caatactttt tttttttctc tccactcgga ctaatccacc tactcggctt cttgtatttg 300
300
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoB_G
<400> 3
atcccgcagg gacatataat tcagaagaat atgtgagtga ttcatacaca gcatctcttt 60
cctctatcaa gggctctacc aattgatatc tttccacaaa taattgaaat tccatttctt 120
gatctctatc ttcaattttt ggaaacttat gaaattcctc cgccaagccc tgattaatga 180
acctacaaaa tccttcaaat tgtatccgac taaatccagg tattgtggac attccctcat 240
ttccattccg gagcatctta atcttaagtt tcctatttat ttaatttatt gaaaaaattc 300
300
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoB_A
<400> 4
atcccgcagg gacatataat tcagaagaat atgtgagtga ttcatacaca gcatctcttt 60
cctctatcaa gggctctacc aattgatatc tttccacaaa taattgaaat tccatttctt 120
gatctctatc ttcaattttt ggaaacttat aaaattcctc cgccaagccc tgattaatga 180
acctacaaaa tccttcaaat tgtatccgac taaatccagg tattgtggac attccctcat 240
ttccattccg gagcatctta atcttaagtt tcctatttat ttaatttatt gaaaaaattc 300
300
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rps14_C
<400> 5
atttttatct ttaccaactg gatcttgttg cgcccggtaa caagcatgcg tgaactattt 60
ctcgaagtac atgtccggat aatccaaagt ctcgatagtt agctctaggt cttccagtca 120
aaaaacaacg tcgatgaaga cgtataggtg cactattacg tggtggggat tgcaattttc 180
catgaatttc ccatttttca ctcaacgacg gaaccctgct tatttctttt tttgaggatc 240
gacgaatcaa atgatatttc tgttccaatt tctgccgctt cttctccctc tgaatcaaac 300
300
<210> 6
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rps14_T
<400> 6
atttttatct ttaccaactg gatcttgttg cgcccggtaa caagcatgcg tgaactattt 60
ctcgaagtac atgtccggat aatccaaagt ctcgatagtt agctctaggt cttccagtca 120
aaaaacaacg tcgatgaaga cgtataggtg tactattacg tggtggggat tgcaattttc 180
catgaatttc ccatttttca ctcaacgacg gaaccctgct tatttctttt tttgaggatc 240
gacgaatcaa atgatatttc tgttccaatt tctgccgctt cttctccctc tgaatcaaac 300
300
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_ycf1_A
<400> 7
tcaagatttt tctttttgtt ttgttttcgt agatctgata caaaatctcc ttgaccttgt 60
tgtttgtttt ttttttggtt ggaattttct aattcaagat attctttttg attagctaat 120
atagaaagat tttttttttt atttacatcg atcttttcat tttgactaat atttttttca 180
tagaaatgaa aatgaaaaat aagtaatttg attggtatga tccacgggtt aatcttatac 240
acatcaaaaa gtagtacaaa ttctgggaaa aaccaaggtt ctaaatttga tatggtatga 300
300
<210> 8
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_ycf1_C
<400> 8
tcaagatttt tctttttgtt ttgttttcgt agatctgata caaaatctcc ttgaccttgt 60
tgtttgtttt ttttttggtt ggaattttct aattcaagat attctttttg attagctaat 120
atagaaagat tttttttttt atttacatcg ctcttttcat tttgactaat atttttttca 180
tagaaatgaa aatgaaaaat aagtaatttg attggtatga tccacgggtt aatcttatac 240
acatcaaaaa gtagtacaaa ttctgggaaa aaccaaggtt ctaaatttga tatggtatga 300
300
<210> 9
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#9_ycf1_T
<400> 9
tttttacgga atccgctgtg gaagttatta aatcgttcat gattgcacgt gaatcaaatt 60
tttttattgt tcctcgataa ggtccattca aaaaaggatc ataccttttt ggcaagtatt 120
cttgttcatt ctcatcatcg cataatctgg tccttttttc tagcatatct aaagcaagag 180
atcccttctc tttttttata atttttattc gacttatcaa ttcattgctc aagttgtatt 240
ttttttgttc attggtatga acccaataat tatataagtc ttcgtgggat agtttttctg 300
300
<210> 10
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#9_ycf1_C
<400> 10
tttttacgga atccgctgtg gaagttatta aatcgttcat gattgcacgt gaatcaaatt 60
tttttattgt tcctcgataa ggtccattca aaaaaggatc ataccttttt ggcaagtatt 120
cttgttcatt ctcatcatcg cataatctgg cccttttttc tagcatatct aaagcaagag 180
atcccttctc tttttttata atttttattc gacttatcaa ttcattgctc aagttgtatt 240
ttttttgttc attggtatga acccaataat tatataagtc ttcgtgggat agtttttctg 300
300
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#19_LSC_C
<400> 11
ttaaatctat ttattgaatt tgagattgag aattacaaaa tttcttattt ttttttgaag 60
tatccgataa gatacttatt aagttaggtc ctgggtctca tatcaattgc aaaatatctc 120
ctttgttcaa acacttccta aaagaaaaat caaaattcca tcgtactaaa ctaaggatgg 180
gaaggaagaa agcgagtgaa tccacaaatt cctcatcctc aaatcactcc ttcccggggt 240
attgtcgcaa caaatacata attgtaggaa taaagtattg atataattca cagaagcaaa 300
300
<210> 12
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#19_LSC_A
<400> 12
ttaaatctat ttattgaatt tgagattgag aattacaaaa tttcttattt ttttttgaag 60
tatccgataa gatacttatt aagttaggtc ctgggtctca tatcaattgc aaaatatctc 120
ctttgttcaa acacttccta aaagaaaaat aaaaattcca tcgtactaaa ctaaggatgg 180
gaaggaagaa agcgagtgaa tccacaaatt cctcatcctc aaatcactcc ttcccggggt 240
attgtcgcaa caaatacata attgtaggaa taaagtattg atataattca cagaagcaaa 300
300
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#2
<400> 13
gggtcgaacc aaaacaaaat actt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#2
<400> 14
gcattttgat accaccaggt tcga 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#2
<400> 15
tgatccgttg gacatagatc caa 23
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#3
<400> 16
ctctatcttc aatttttgga aacttttg 28
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#3
<400> 17
ggaatggaaa tgagggaatg tc 22
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#3
<400> 18
tgattaatga acctacaaaa tccttc 26
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#4
<400> 19
atttctcgaa gtacatgtcc gg 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#4
<400> 20
caatccccac cacgtaatac tg 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#4
<400> 21
tagctctagg tcttccagtc aaa 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#6
<400> 22
gatacaaaat ctccttgacc ttg 23
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#6
<400> 23
ctatgaaaaa aatattagtc aaaatgaaaa aat 33
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#6
<400> 24
tggaattttc taattcaaga tattcttttt g 31
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#9
<400> 25
tctcatcatc gcataatctc gc 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#9
<400> 26
acgacagaaa aactatccca cgaa 24
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#9
<400> 27
tctaaagcaa gagatccctt ctc 23
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for SNP#19
<400> 28
gttcaaacac ttcctaaaag aaaagtc 27
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for SNP#19
<400> 29
ctacaattat gtatttgttg cgaca 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SNP#19
<400> 30
aaggaagaaa gcgagtgaat cca 23
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Internal Control
<400> 31
aaatcattga tacaaataat atccaa 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Internal Control
<400> 32
caagtttttt ccttgacctt tcc 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Internal Control
<400> 33
tacgccttct agataacctt cg 22
Claims (9)
- 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동(Liriope platyphylla), 수입 맥문동(Liriope platyphylla), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus), 무늬맥문동(Liriope platyphylla), 개맥문동(Liriope spicata), 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan)를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 152번째 염기가 C인 SNP(single nucleotide polymorphism);
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 152번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;
서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP;
서열번호 11의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 및
서열번호 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함하는, 조성물. - 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 23으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
- 서열번호 15로 표시되는 프로브; 서열번호 18로 표시되는 프로브; 서열번호 21로 표시되는 프로브; 서열번호 24로 표시되는 프로브; 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트.
- 제3항의 프라이머 세트, 제4항의 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는, 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 33으로 표시되는 프로브를 더 포함하는 키트.
- 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트 및 제4항의 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법. - 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
각 SNP 위치인 151번째 또는 152번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 맥문동, 수입 맥문동, 소엽맥문동, 무늬맥문동, 개맥문동, 및 맥문아재비를 포함하는 맥문동 및 맥문아재비가 속하는 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210059307A KR102604103B1 (ko) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210059307A KR102604103B1 (ko) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220152472A true KR20220152472A (ko) | 2022-11-16 |
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ID=84235792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210059307A KR102604103B1 (ko) | 2021-05-07 | 2021-05-07 | 맥문동 및 맥문아재비 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102604103B1 (ko) |
Citations (4)
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| KR20130045636A (ko) * | 2011-10-26 | 2013-05-06 | 공주대학교 산학협력단 | 작약에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
| KR101450447B1 (ko) | 2013-04-26 | 2014-10-20 | 공주대학교 산학협력단 | 맥문아재비족 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| KR101492692B1 (ko) | 2012-09-20 | 2015-02-16 | 공주대학교 산학협력단 | 맥문동 품종 판별 방법 및 판별 프로브 |
| KR101912196B1 (ko) * | 2017-09-27 | 2018-10-26 | 충북대학교 산학협력단 | 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-05-07 KR KR1020210059307A patent/KR102604103B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR20130045636A (ko) * | 2011-10-26 | 2013-05-06 | 공주대학교 산학협력단 | 작약에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
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| KR101912196B1 (ko) * | 2017-09-27 | 2018-10-26 | 충북대학교 산학협력단 | 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 임창건, '한국산 작약속(Paeoia, Paeoniaceae)식물의 유전적 다양성', 대구대학교 대학원 석사논문, 2011. * |
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|---|---|
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