KR102672563B1 - 사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커는 사초과 식물인 좀목포사초를 정확하게 판별할 수 있으므로, 사초과 식물의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도{SNP marker composition for discriminating Cyperaceae plant 'Carex brevispicula' and uses thereof}
본 발명은 사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
사초과(Cyperaceae)의 좀목포사초(Carex brevispicula)는 한국에서 처음으로 발견되었다. 좀목포사초는 수과의 중앙부가 함몰되는 점에서 큰청사초(C. chungii Z. P. Wang) 및 목포사초(C. genkaiensis Ohwi)와 유사하다. 그러나, 좀목포사초는 식물체와 웅화서 및 자화서가 소형이고, 자인편이 연녹색인 점에서 큰청사초와 구분되며, 자인편과 웅인편에 까락(꽃차례에 붙어 있는 돌기나 털)이 있다는 점에서 목포사초와 차이를 보인다. 새로운 국명은 목포사초보다 작다는 의미로 좀목포사초로 정하였다.
사초과는 속씨식물군의 외떡잎식물군 중 벼목(Poales)에 속하는 식물군으로, 북반구와 남반구의 온대를 중심으로 널리 분포하고 있으며, 세계적으로 약 109속 5,500종이 보고되어 있다. 우리나라에는 300여 분류군이 있다고 알려져 있으며, 린네(Linne)에 의해 고랭이속(Scirpus sp.), 방동사니속(Cyperus sp.) 및 사초속(Carex sp.)으로 정리되었던 사초과 식물은 후대 학자들에 의해 속 단위로 많은 분류가 이루어졌다.
사초과는 벼과(Poaceae) 식물들과 함께 잡초로 취급되는 식물이지만 식물진화의 역사에 있어서 매우 큰 종 다양성을 가지는 발달된 식물군들 중 하나이고, 초지 생태계를 이루는 주요 식물군이다. 사초과와 벼과는 잎, 줄기 등의 형태가 비슷하고, 종을 분류하는 가장 중요한 형질인 열매가 익는 기간이 2~3주로 짧은 데다 열매가 익으면 떨어져서 잎만 남기 때문에 정확한 동정이 어렵다. 사초과는 의약용, 식용 등으로 다양하게 이용되고 있음에도 불구하고 세계적으로 체계적인 연구가 미비한 실정이다. 따라서 사초과 식물을 생물자원으로서 활용하기 위해서는 분류학적 실체를 밝히고 특성을 규명하는 일이 시급하다.
한편, 한국등록특허 제2086854호에는 '사초과 식물 추출물을 함유하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 사초과 식물 '좀목포사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 좀목포사초(Carex brevispicula)의 엽록체 게놈 서열을 조립한 후 애괭이사초(Carex laevissima)의 참조 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1)과 비교하여 ndhD 유전자에서 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 발굴하였다. 또한, 상기 SNP 마커에 기반한 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트를 제작하여, 좀목포사초를 포함한 사초과 식물 10종을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 KASP 프라이머 세트가 좀목포사초를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 좀목포사초(Carex brevispicula) 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진, 좀목포사초 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 좀목포사초 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 사초과(Cyperaceae) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 좀목포사초를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커는 사초과 식물인 좀목포사초를 정확하게 판별할 수 있으므로, 사초과 식물의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 좀목포사초(Carex brevispicula)의 엽록체 유전자 지도이다.
도 2는 본 발명의 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트(표 6)를 이용하여 사초과 식물 10종(좀목포사초, 애기반들사초, 애기흰사초, 갯청사초, 목포사초, 가지청사초, 가는흰사초, 진도사초, 양지사초, 주름청사초)에 대해 KASP 분석을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 좀목포사초(Carex brevispicula) 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 '뉴클레오티드'는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1의 염기서열에서 301번째로, 다형성 염기 정보는 표 5의 SNP 염기서열 정보에서 [/]로 표시하였으며, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열은 표 5의 사선(/) 앞에 위치한 염기를 포함하는 서열을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 사초과 식물 유래 ndhD 유전자 서열의 일부이다.
본 발명의 SNP 마커를 좀목포사초 판별에 사용할 수 있는 것은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 301번째가 C 또는 T로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 상기 SNP 위치 염기에 있어서, 서열번호 1의 염기서열 중 301번째 염기가 C일 경우 좀목포사초로, 301번째 염기가 T일 경우 사초과 식물 중 좀목포사초를 제외한 애기반들사초(C. tristachya), 애기흰사초(C. mollicula), 갯청사초(C. breviculmis var. fibrillosa), 목포사초(C. genkaiensis), 가지청사초(C. polyschoena), 가는흰사초(C. alopecuroides), 진도사초(C. taihokuensis), 양지사초(C. nervata) 또는 주름청사초(C. rugata)로 판별할 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리 L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '기판'은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 프로브를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 '프로브'는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 '혼성화(hybridization)'는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1의 301번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진, 좀목포사초 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 301번째 SNP 변이 위치를 확인할 수 있는 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 'KASP'는 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전자형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.
본 발명의 KASP 프라이머 세트는 서열번호 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드는 순서대로 FAM이 결합된 정방향 프라이머, HEX가 결합된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성되어 있으며, 구체적으로 정방향 프라이머의 5' 말단에는 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP 염기가 결합되어 있으며, 공통의 역방향 프라이머 1개로 구성되어 있다.
상기 프라이머 세트는 각 프라이머 세트의 서열 길이에 따라 서열번호 2 내지 4의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(26개의 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '프라이머'는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 혀용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정된다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 좀목포사초 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 좀목포사초 판별용 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
사초과(Cyperaceae) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 좀목포사초를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 사초과 식물은 좀목포사초(Carex brevispicula), 애기반들사초(C. tristachya), 애기흰사초(C. mollicula), 갯청사초(C. breviculmis var. fibrillosa), 목포사초(C. genkaiensis), 가지청사초(C. polyschoena), 가는흰사초(C. alopecuroides), 진도사초(C. taihokuensis), 양지사초(C. nervata) 또는 주름청사초(C. rugata)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 사초과 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 사초과 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 사초과 식물의 시료는 식물체의 종자, 잎, 열매, 뿌리 또는 줄기 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5' 말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 하기 표 6에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 좀목포사초를 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계의 산물의 분석은 SNP 유전형 분석(single nucleotide polymorphism genotyping) 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 HRM(High resolution melting) 분석 또는 염기서열 결정(sequencing)을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료 및 DNA 추출
국립백두대간수목원에서 채집 및 보유하고 있는 사초과 10종(좀목포사초, 애기흰사초, 목포사초, 양지사초, 진도사초, 애기반들사초, 주름청사초, 가는흰사초, 가지청사초, 갯청사초)의 종자를 대상으로 APrepTM Total DNA 키트(APBIO, 한국)를 사용하여 게노믹 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소 K(100 ㎍/㎖) 20 ㎕와 RNase(10 mg/㎕) 4 ㎕를 포함하는 DNA 추출용 버퍼 200 ㎕를 소량의 종자 시료에 첨가한 후 비드 비팅하여 분쇄하였다. 그 다음, 65℃로 조정된 항온 용기에서 10분 동안 배양하고, 반응액을 약 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상등액을 수득한 후 상등액을 새로운 1.5 ㎖ 마이크로 튜브로 옮겼다. 동량의 100% 에탄올을 첨가하고, 반응액을 스핀 컬럼(spin colume)에 넣어 원심분리한 후 세척 버퍼를 사용하여 2회 세척하였다. 새로운 튜브로 옮긴 스핀 컬럼에 30 ㎕의 멸균된 3차 증류수를 넣어 DNA를 추출하였다.
2. 전장유전체(Whole genome sequencing) 분석을 위한 라이브러리 제작 및 데이터 생산
상기 추출한 게노믹 DNA는 1.5% 아가로스 겔에 전기영동, nanodrop 및 Qubit을 활용하여 정량 및 품질을 확인하였다. WGS 분석을 위한 라이브러리 제작을 위한 게노믹 DNA의 권장 농도는 nanodrop 측정 기준으로 20 ng 이상/㎕, Qubit 사용 측정 기준으로 10 ng 이상/㎕, 총 부피가 30 ㎕ 이상이다.
WGS 분석을 위한 라이브러리는 QIAseq FX DNA Library Kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 제조사 지침에 따라 작성하였다. 제작한 라이브러리는 TapeStation HS D1000Screen Tape(Agilent, 미국) 장비를 활용하여 라이브러리에 삽입된 주형의 크기에 대해 품질 검사를 수행하였으며, 평균 삽입된 크기는 330~365 bp였다. NovaSeq6000 장비(Illumina Inc, 미국)를 활용하여 150 bp로 양방향(2×150 bp paired-end)으로 읽어 각 사초과 샘플 마다 10 Gb의 데이터를 생산하였다.
3. 좀목포사초의 엽록체 게놈 어셈블리(Chloroplast genome assembly)
Short reads의 전처리 과정(sequence pre-processing)은 PCR duplicate reads를 제거하고, Trimmomatic(v. 0.39)(Anthony M. Bolger et al., Bioinformatics, 2014, 30(15), 2114-2120)으로 어댑터 서열을 제거한 후 수행하였다. SLIDINGWINDOW, LEADING, TRAILING 옵션을 이용하여 트리밍(trimming) 및 QC(quality control)를 다음과 같은 조건에 따라 수행하였다. 1) window size=4, mean quality≥15; 2) LEADING, TRAILING≥3; 3) minimum length of reads≥36 bp.
엽록체 게놈 어셈블리는 현재 어셈블리 툴(assembly tool) 중에서 정확도가 높다고 평가받는 Getorganelle 프로그램을 사용하여 참조 유전체 서열없이 1차 어셈플리를 진행하였고, WGS 분석 과정에서 생성된 긴 콘티그(contig)를 NCBI에 BLAST하였을 때 정확도가 높은 NCBI GenBank NC_072263.1의 사초과 엽록체 유전체(Carex breviculmis chloroplast, complete genome)를 엽록체 유전체 어셈블을 위한 참조 유전체로 선정하였다. 참조 유전체를 이용하여 NOVOPlasty 프로그램(https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty), Fast-Plast 프로그램(https://github.com/mrmckain/Fast-Plast) 및 GetOrganelle 프로그램(https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle)을 사용하여 엽록체 게놈 어셈블리를 수행하였다. 생성된 여러 콘티그 조각들은 참조 유전체를 기준으로 조합하여 하나의 콘티그 서열로 작성하였으며, 참조 유전체 서열을 참조하여 GeSeq 프로그램(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)을 통해 엽록체 유전체 서열의 유전자 부위를 결정(chloroplast genome annotation)하였다(표 1). Chloroplast genome annotation 결과는 ODGRAW tools를 이용하여 시각화하여 엽록체 게놈 맵으로 작성하였다(도 1).
좀목포사초의 엽록체 게놈 어셈블리 결과
Sample Total size(bp) GC(%) Total genes protein-coding genes tRNA genes rRNA genes
좀목포사초 216,146 33.65 173 120 46 10
4. WGS 분석 및 SNP 탐색
4-1. 시퀀스 전처리(sequence pre-processing)
Short reads의 전처리 과정은 PCR duplicate reads를 제거하고, Trimmomatic (v. 0.39)으로 어댑터 서열을 제거한 후 수행하였다. 전처리 조건은 상기와 동일하다.
4-2. 참조 유전체 정렬(alignment to reference genome)
전처리 과정을 통과한 cleaned reads를 BWA(0.7.17-r1188) 프로그램을 사용하여 참조 유전체 서열에 맵핑하였다. SNP 분석을 위한 참조 유전체로 애괭이사초(Carex laevissima) 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1)을 이용하였다. 맵핑 과정은 참조 유전체 서열과 시퀀싱 샘플간의 raw SNP를 탐지하기 위한 선행과정으로, BAM format의 파일을 생성하였다.
4-3. Raw SNP 탐지 및 공통서열(consensus sequence) 추출
BAM format의 파일을 DeepVariant 프로그램을 사용하여 raw SNP(In/Del)를 검출하고, 공통서열을 추출하였다. 이때, SNP(In/Del)를 탐지하는 과정 전에 SEEDERS in-house script를 이용하여 SNP validation을 거친 후에 raw SNP(In/Del)를 탐지하였다.
4-4. SNP 마커 후보군 확보
사초과 10종(좀목포사초, 애기흰사초, 목포사초, 양지사초, 진도사초, 애기반들사초, 주름청사초, 가는흰사초, 가지청사초, 갯청사초)을 대상으로 한 WGS 분석을 통해 확보한 유전체 분석 결과로부터, 사초과 10종을 구별할 수 있는 마커 후보군인 SNP marker set 1에서 12가지 조합에 해당하는 37좌 변이를 확보하였고(표 2), SNP marker set 2에서 17가지 조합에 해당하는 1,168좌 변이를 확보하였다(표 3).
4-5. 좀목포사초 판별을 위한 SNP 마커 선별
SNP marker set 1 및 SNP marker set 2에 포함된 총 29개의 후보 SNP 마커 중, 사초과에서만 증폭되고, 사초과 10종을 각각 구별할 수 있는 마커들을 선별하였다. 상기 SNP 마커 중에서 좀목포사초를 특이적으로 구별할 수 있는 SNP 마커를 최종 선별하였으며, 최종 선별된 SNP 마커는 참조 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1) 기준 ndhD 유전자에 위치한다. 본 발명의 좀목포사초 특이적 SNP 마커 정보, SNP 주변부 서열(flanking sequence) 정보 및 SNP에 기반하여 제작된 KASP 프라이머 세트 정보는 각각 표 4 내지 표 6에 나타내었다.
좀목포사초 구별용 SNP 마커 정보
Marker SNP marker set Position(bp) ref. 좀목포사초 그 외 사초과 Allele
SA1 baaaaaaaaa 149,600 T C T C/T
SNP 주변부 서열(flanking sequence) 정보
- SNP C: 좀목포사초
- SNP T: 참조 유전체 및 그 외 사초과 식물
AGAAGAATATGCTATTCTCTTTTTTAAATTGCGTTGACCAAGAGAAGTTGAAGCTCCATAAATAATTTGTATCGTTCCTATTATTACCAACCAAGGAGAAAATATAGAATGAGCATGGGGTAATAATTCCATATTAATCCGAATTAATCCATATGCTCCCATTTTCAATAAAATCCCAGCTAAGAGCATACATGTACTATAATGTGCTTCTCCATGGGTATCTGGTAACCATGTATGCAAGGGTATAATTGGCAATTTGATAGCATATGCAATAAGAAAGCCGATATAAAATGTGATTTC[ C/T ]AATACGATAGGATATGATTGATTAATTAATCTTTCAAAATCTAGTACTGGCTTATTGGAAGCATACAAACCCATACCTAGAACTCCAGTTAATAAAAAGATAGATCCTCCTGCTGTGTATAAAATGAATTTAGTAGCCGAGTAAAGACGTTTCTTACCCCCCCACATGGATAAAAGTAAGTAAATGGGAATTAATTCTAGTTCCCACATGATAAAGAAAAGTAAAAGGTCTTGAGAAAAAAATAATCCCATTTGACCACTATACATTGCTAACATTAAAAAATAAAACAATTGGCAATTT (서열번호 1)
밑줄 및 굵은 글씨: SNP 위치 염기
KASP 프라이머 세트 정보
Marker Primer name Sequence(5'-3') (서열번호) Conjugated fluorescent dye
SA1 SA1_FAM GAAAGCCGATATAAAATGTGATTTCT (2) 5'-FAM
SA1_HEX AGCCGATATAAAATGTGATTTCC (3) 5'-HEX
SA1_common GGTATGGGTTTGTATGCTTCCA (4)
밑줄: SNP 위치 염기
5. KASP 분석
주형 DNA 5 ㎕, KASP-TF V4.0 2X Master Mix/Standard ROX 5 ㎕ 및 KASP Assay mix(KASP 프라이머 세트 혼합) 0.14 ㎕가 혼합된 반응액을 이용하여 PCR 반응 및 분석을 진행하였다. 유전자 증폭 조건은 LGC Biosearch Technologies에서 제공하는 'Guide to running KASP genotyping on the ABI 7900 instrument'와 동일하게 진행하였으며, 증폭 조건은 61~55℃ touchdown protocol을 사용하였다.
하기 표 7과 같이, 94℃에서 15분 동안 Hot-start activation한 후, 94℃에서 20초, 61~55℃ touchdown으로 10 cycles 증폭하고, 94℃에서 20초, 55℃에서 60초를 26 cycles 반복한 후, 30℃에서 60초를 1 cycle하였다. 음성대조군에는 증류수를 처리하였으며, 각 샘플은 3~4반복으로 실험하였다. 증폭량이 적을 경우에는 recycle을 진행하였으며, 하기 표 8과 같이 94℃에서 20초, 57℃에서 60초를 3 cycles 반복한 후, 30℃에서 60초를 1 cycle하였다.
KASP standard 조건
Protocol stage 온도 시간 사이클(횟수)
<Stage 1>
Hot-start activation
94℃
15분
1
<Stage 2>
Touchdown		 94℃ 20초 10
61℃
(61℃ decreasing 0.6℃ per cycle to activate a final annealing/extension temperature of 55℃)		 60초
<Stage 3>
Amplification		 94℃ 20초 26
55℃ 60초
<Optional Stage 4>
(Read stage for qPCR instruments only)		 30℃ 60초 1
KASP recycling 조건
Protocol stage 온도 시간 사이클(횟수)
<Stage 1>
Amplification		 94℃ 20초 3
57℃ 60초
<Optional Stage 4>
(Read stage for qPCR instruments only)		 30℃
(any temperature below 40℃ is suitable for the read stage)		 60초 1
실시예 1. 좀목포사초 판별을 위한 본 발명의 KASP 프라이머 세트의 검증
본 발명의 KASP 프라이머 세트(표 6)를 사초과 식물 10종(좀목포사초, 애기반들사초, 애기흰사초, 갯청사초, 목포사초, 가지청사초, 가는흰사초, 진도사초, 양지사초, 주름청사초)에 적용하여 KASP 분석을 수행하였다.
그 결과, 좀목포사초는 형광물질 HEX로 인해 y축에 가깝게 나타났고, 그 외 사초과 식물 9종은 형광물질 FAM으로 인해 x축에 가깝게 나타났다(도 2). 이를 통해, 본 발명의 SNP 마커 및 이에 기반하여 제작된 KASP 프라이머 세트는 다양한 사초과 식물 중에서 좀목포사초만을 정확하게 구별할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 좀목포사초(Carex brevispicula) 판별용 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 좀목포사초 판별용 SNP 마커 조성물.
  3. 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 마이크로어레이.
  4. 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 좀목포사초 판별용 프로브.
  5. 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진, 좀목포사초 판별용 프라이머 세트.
  6. 제5항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 좀목포사초 판별용 키트.
  7. 사초과(Cyperaceae) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 좀목포사초를 판별하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20230100949A (ko) * 2021-12-29 2023-07-06 주식회사 한국인삼공사 작약의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커

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