JP2004532034A - 遺伝子発現分析システムでコントロールとして使用するための人工遺伝子のデザイン - Google Patents
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Abstract
マクロアレイ、リアル−タイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥおよびミクロアレイのような遺伝子発現分析システムで使用のためのコントロールを作成する方法。当該コントロールは、ＤＮＡのニア−ランダム配列から、またはゲノムの遺伝子間または遺伝子内領域から、何れかから作成する。１０の特定コントロール配列も開示する。遺伝子発現分析システムのネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびキャリブレーターとして含む、これらのコントロールを使用する方法も示す。
Description
【０００１】
関連出願との相互引用
本願出願は、２００１年５月７日出願の米国仮特許出願番号６０／２８９，２０２、２００１年８月１５日出願の６０／３１２，４２０の優先権を主張する。その開示は、引用により全て本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
コンパクトディスクで提出したデータの引用による組み込み
本出願は、４つ提供した、ボリュームラベルＰＢ０１２０を有する単一の(ＣＤ−Ｒ)コンパクトディスクで、PCT Administrative Instructions Section 801(a)の下、本願明細書とともに提出した配列表を含む。当該配列表は、最後に２００２年５月６日に更新し、２００２年５月６日に記録した、３２キロバイトの単一のファイル名PB0120.ST25.txtに表されている。当該ディスクの当該ファイル中に含まれる配列表は、本願明細書に全て引用により組み込まれる。
【０００３】
本発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、遺伝子発現分析システムでコントロールとして人工遺伝子を使用する方法に関連する。より特に、本発明は、マクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥおよびMicroarray ScoreCardシステムで提供されるもののようなマイクロアレイのような遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールを作成する方法に関連する。
【０００４】
関連技術の説明
遺伝子発現プロファイリングは、細胞性機能および増加を支配する分子機構をより理解するために使用する重要な生物学的アプローチである。ミクロアレイ分析は、異なる条件下でのそれぞれの遺伝子の相対的発現レベルの測定に適用し得るツールの１つである。しかし、ミクロアレイ測定は、システム的に偏っているとしばしば思われ、この偏りの原因となる因子は、多く、不明確である(Bowtell, D.L., Nature Genetics 21, 25-32(1999); Brown, P.P. and Botstein, D., Nature Genetics 21, 33-37 (1999))。他のものは、ミクロアレイ実験でのコントロールとして既知濃度の精製ｍＲＮＡの「スパイク」の使用を推奨する。Affymetrixは、それらのGeneChip製品で使用するための幾つかのものを含む。当分野の現在の状態では、これら選択された遺伝子は、非常に遠縁の関係の生物から選択した実際の遺伝子である。例えば、ヒトチップ(ヒトｍＲＮＡで使用するためにデザインした)は、細菌および植物の起源由来のコントロール遺伝子を含む。Affymetrixは、標識反応にスパイクするためのこれらの遺伝子に相当するｍＲＮＡおよびハイブリダイゼーション反応での含有物を販売している。
【０００５】
従来技術のそれぞれのコントロールは、幾つかの起源由来のＤＮＡの転写配列を含む。結果として、その起源は、その起源に対する当該コントロールの本来的なハイブリダイゼーションにより、コントロールを用いるハイブリダイゼーション実験の主体とはなり得ない。そのため、必要であるものは、実験の当該実体となり得る任意の起源のＤＮＡとハイブリダイズしないコントロールのセットである。より望ましくは、任意の既知の起源とはハイブリダイズしない遺伝子発現分析のためのコントロールの必要性がある。
【０００６】
本発明の要旨
したがって、本発明は、任意の種用にデザインした遺伝子発現分析システムに有用であり、コントロールＤＮＡ自体以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないことを試験し得るコントロールを作成するプロセスを提供する。
【０００７】
第一の実施態様の本発明は、遺伝子発現分析システムに使用するための少なくとも１つのコントロールを作成するためのプロセスに関連する。当該プロセスは、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写(遺伝子間または遺伝子内)領域を選択すること、当該少なくとも１つの非転写領域用のプライマー対をデザインすること、およびゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域を増幅し、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを含む。
【０００８】
第二の実施態様の本発明は、遺伝子発現分析システムでの使用のための少なくとも１つのコントロールを作成するプロセスであって、ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域以外の起源由来のｍＲＮＡと確実にハイブリダイズしない当該少なくとも１つの非転写領域の試験を行う当該プロセスに関連する。
【０００９】
第三の実施態様の本発明は、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を決定すること、および選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを更に含む当該プロセスに関連する。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡを含むか、または既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成したＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む当該コントロールである。本発明は、当該ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成すること、ならびに所望により当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を決定すること、および選択した濃度および割合で当該ＤＮＡを含むかまたはｍＲＮＡの少なくとも１つのコントロールを調製することにより当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを所望により含み得る。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡ配列、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成したＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡが含まれる当該コントロールであり、ここで上記コントロールにおいて、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない。
【００１２】
本発明は、遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとして当該コントロールを使用する方法であって、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、およびシグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査することによる、当該方法に関連する。
【００１３】
更に、当該コントロールは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールをコントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および既知量の標識相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下で当該サンプルをハイブリダイゼーション条件におくこと、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよび標識ｍＲＮＡのシグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定すること、により遺伝子発現分析システムで使用することができる。
【００１４】
更に、当該コントロールは、既知量の幾つかのＤＮＡ配列を含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、当該サンプルを、既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成すること、により遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして使用し得る。
【００１５】
また、本発明は、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えることおよび当該サンプルを、既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対して)、２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること、により二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法に関連する。
【００１６】
本発明の更なる実施態様は、任意の種用にデザインした遺伝子発現分析システムに有用であり、コントロールを作成するＤＮＡの合成配列以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないことを試験し得るコントロールを作成するプロセスである。
【００１７】
１つまたはそれより多いコントロールは、非転写ＤＮＡのニアランダム(near-random)配列を合成すること、当該少なくとも１つのニアランダム配列用にプライマー対をデザインすることおよび当該非転写ＤＮＡを増幅させ、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、を含むプロセスにより作成し得る。
【００１８】
当該プロセスはまた、非転写ＤＮＡの当該配列以外の起源由来のｍＲＮＡと確実にハイブリダイズしない非転写合成ＤＮＡの当該配列の試験を行う、遺伝子発現分析システムで使用のための少なくとも１つのコントロールの作成に使用し得る。
【００１９】
更に、合成ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成および調製し、当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを作成し得る。
【００２０】
ＤＮＡおよびｍＲＮＡは実質的に精製され得、その濃度は決定され、そして選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたは当該ｍＲＮＡを含む１つまたはそれより多いコントロールを調製し得る。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、ＤＮＡのニアランダム(near-random)配列を合成すること、当該合成ＤＮＡ用にプライマー対をデザインすることおよび当該ＤＮＡを増幅させ、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ることおよび既知量の少なくとも１つの当該二本鎖ＤＮＡまたは当該ＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを含み、所望により、ここで、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、非転写ＤＮＡの当該ＤＮＡ配列以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない、プロセスにより作成される遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールである。
【００２２】
本発明は、更に、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付することおよびシグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査することを含む遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとして、既知量のＤＮＡを含む当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２３】
更に、当該コントロールは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加え、および当該サンプルを、既知量の標識相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付する、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定し、および標識ｍＲＮＡのシグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定する、遺伝子発現分析システムに使用し得る。
【００２４】
本発明はまた、既知量の幾つかのＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えることおよび当該サンプルを、既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付することおよび標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成することを含む遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２５】
本発明は、更に、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、当該サンプルを、既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(それぞれのＤＮＡサンプルが存在する)および２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定することおよび当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較することを含む二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとして当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２６】
本発明の更なる実施態様および使用は、次の詳細な説明の考慮により明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の上記および他の目的および利点は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を考慮することにより明らかとなる。図面において、類似の文字は全体として類似の部分に関係する。図面において：
【図１】図１は、ＹＩＲ１のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、ＹＩＲ２のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、ＹＩＲ３のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、ＹＩＲ４のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図５】図５は、ＹＩＲ５のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、ＹＩＲ６のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は、ＹＩＲ７のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、ＹＩＲ８のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、ＹＩＲ１１のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、ＹＩＲ１９のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ２ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ３ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ４ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１５】図１５は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ５ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１６】図１６は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ６ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ７ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１８】図１８は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ８ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１９】図１９は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１１ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図２０】図２０は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１９ｓのヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
本発明の詳細な説明
本発明は、マイクロアレイのような遺伝子発現分析システムで使用のためのコントロールを開示する。多くの者が、そのアレイに含めるためのコントロールとして適当な遺伝子およびスパイクを得ることに興味を示す。
【００２９】
本発明のコントロールの利点は、単一のセットが、作為的に加えない限りこれらのコントロールは存在しないため、任意の種用にデザインしたアッセイシステムで使用され得ることである。これは、「遠縁の関係の種」由来の遺伝子の使用の概念とは対照的である。例えば、ヒト遺伝子発現の検出を目的とする分析システムは、ヒト遺伝学的物質中には存在し得ない、コントロールとしてBacillus subtilis遺伝子を用い得る。しかし、このコントロールは、細菌性遺伝学的物質中に存在し得(または少なくともクロスハイブリダイズする)、そのため、細菌性遺伝子発現の実験で良好なコントロールとはなり得ない。本願明細書で示す新規コントロールは、同セットのコントロールが試験サンプルＲＮＡの種にかかわらず使用され得るという従来技術の状況を超える利点を提供する。
【００３０】
本発明は、鋳型として非転写ゲノム配列または全体的にランダムの合成配列の何れかを用い、そしてコントロールとしての使用のための、その配列由来のＤＮＡおよび相補性「ｍＲＮＡ」の両方を作成する新規アプローチを用いる。当該コントロールは、ニアランダム配列をデザインしそれらを合成し普遍的なコントロールとして合成高分子を生ずることにより新たに編み出され得る。全体的に合成のランダムＤＮＡフラグメントを、それらが、お互いにまたは任意の生物学的関連の種(ＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝子発現分析システム中に存在し得る種を意味する)由来のＲＮＡとクロスハイブリダイゼーションしないように、デザインする。そのような大きな合成ＤＮＡ分子の作成の費用は高くなり得る。しかし、それらは一度に作成する必要があるのみである。更に、フラグメントの大きさは、既知の方法により、より小さな合成フラグメントを一緒にライゲーションすることにより増大し得る。この方法では、容易にクローニングするに十分な大きさのフラグメントが作成し得る。クローニングおよびＰＣＲを通して、コントロールとしての使用のための十分量のＤＮＡを作成し得、ｍＲＮＡは、コントロール中での使用のためのインビトロ転写により作成し得る。
【００３１】
より簡単なアプローチは、生物由来のゲノムＤＮＡの非転写領域由来の配列を同定することであり、そしてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)を介する合成のための鋳型としてのこれらの使用である。理想的には、１０００塩基あたり(５００から２０００塩基の範囲となり得る)の配列を、公然としてアクセス可能な配列データのコンピューターサーチに基づき、選択する。選択のための基準には、
１．当該配列は非転写領域(遺伝子間または遺伝子内領域)由来でなければならず、そして
２．当該配列は、任意の既知／公開された遺伝子または発現配列タグ(ＥＳＴ)とは相同性があってはならず、ハイブリダイズすると予想されてもならない。
【００３２】
ＰＣＲプライマー対は、選択配列でデザインされ、ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ(鋳型として)を用い行い、コントロールＤＮＡとして非転写配列に相当するＰＣＲフラグメント(ｄｓＤＮＡ)を作成する。更なるコントロールＤＮＡは、ベクターおよび標準の技術を用いクローニングされ得る。その後、インビトロ転写のような標準技術を用い、コントロールｍＲＮＡとしてｍＲＮＡ(ｃＤＮＡに相補的であり、ポリＡテイルを含む)を作成する。標準技術は、コントロールＤＮＡおよびコントロールｍＲＮＡ産物を精製するため、およびその濃度を算出するため、使用する。
【００３３】
経験的な試験をまた、アレイ上のコントロールＤＮＡと他のｍＲＮＡおよび重要な遺伝子発現系(例えば、ヒト、マウス、アラビドピシスなど)由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないように行う。
【００３４】
上記アプローチを用い、酵母Saccharomyces cerevisiaeゲノムの遺伝子間領域由来の１０のコントロール配列を作成した。特に、公然として利用可能な酵母ゲノム配列データ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)を用い、おおよそ１ｋｂの大きさの遺伝子間領域を同定した。これらの配列は、ＢＬＡＳＴ’ｄであり、他の配列とは相同性のないものは、人工遺伝子コントロールの候補として同定された。候補を、ＧＣ含有率について分析し、３６％以上のＧＣ含有率を有するサブセットを同定した。特定プライマー配列を同定し、合成した。特定プライマーで増幅したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ(商標)−Ｔ Ｅａｓｙベクター(Promega Corp., Madison, WI)に直接クローニングした。アレイ標的およびスパイクｍＲＮＡのための鋳型の両方を、明確で特定のプライマーを用いこれらのクローンから増幅した。
【００３５】
１０のコントロール配列を同定する機会を最大とするため、より多くの遺伝子間領域を試験のためにクローニングした。すべての候補配列をガラスミクロアレイスライド上にスポットし、各候補スパイクｍＲＮＡと独立してハイブリダイズさせ、クロスハイブリダイズするものを同定した。１０の候補明示特異的ハイブリダイゼーションを選択し、特定のセットのコントロールを形成した。コントロールとして使用するとき、１０すべての酵母遺伝子間領域(ＹＩＲ)を、特定プライマー(表１)によるＰＣＲにより、クローン化鋳型(プラスミドＤＮＡ)５ｎｇおよび１００μｌ反応体積中０．５μＭの濃度のプライマーを用い、以下のようなサイクル：
９４℃２０秒、５２℃２０秒、７２℃２分間を３５サイクル、その後に７２℃で５分間の伸張で、作成した。
【００３６】
表１．コントロールの増幅のために使用したプライマー
【表１】
【００３７】
スパイクミックスのための全てのＹＩＲコントロールｍＲＮＡを、インビトロ転写により作成する。インビトロ転写(ＩＶＴ)のための鋳型を、ＰＣＲ産物の５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび３’末端にポリＴ(Ｔ２１)テイルを導入するようにデザインする特定プライマー(表２参照)による増幅により、作成する。ラン−オフ(run-off)ｍＲＮＡを、AmpliScribe system(Epicentre, Madison, WI)による反応あたり１μｌのこれらＰＣＲ産物を用い、作成する。ＩＶＴ産物を、RNAEasy system(Qiagen Inc., Valencia, CA)を用い精製し、スペクトロフォトメトリーにより定量する。
【００３８】
図１から図１０は、１０のＹＩＲコントロールのヌクレオチド配列を示すが、図１１から２０は、スパイクミックス中で使用するときの１０ＹＩＲｓ(「ｓ」は、スパイクミックスを表す)のヌクレオチド配列を示す。当該コントロールを増幅するために使用するプライマー配列を表１に列挙しており、スパイクミックス鋳型を増幅するために使用する当該プライマー配列を表２に列挙した。これらの配列は、以下の通り、更に配列表(それは、引用により本願明細書すべて組み込まれる)中に示されている：
配列番号１−８ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１からＹＩＲ８、
配列番号９ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１１、
配列番号１０ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１９。
【００３９】
表２．インビトロ転写標的の増幅に使用したプライマー
【表２】
【００４０】
配列番号１１−１８ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓ、
配列番号１９ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１１ｓ、
配列番号２０ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１９ｓ、
配列番号２１−２８ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１からＹＩＲ８の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号２９ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１１の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号３０ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１９の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号３１−３８ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１からＹＩＲ８の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号３９ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１１の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号４０ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１９の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号４１−４８ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号４９ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１１ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号５０ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１９ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号５１−５８ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓの増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号５９ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１１ｓの増幅のためのリバースプライマー配列、および
配列番号６０ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１９ｓの増幅のためのリバースプライマー配列。
【実施例】
【００４１】
次いで、以下の実施例は、これらコントロールＤＮＡおよびコントロールｍＲＮＡが、ミクロアレイ遺伝子発現実験においてコントロールとしてどのように使用されるかを説明する：
１．コントロールＤＮＡはアレイ中に含まれ、非相補的人工ｍＲＮＡは、ＲＮＡサンプル中にスパイクされ、ネガティブコントロールとしての役割をし、
２．幾つかの異なるコントロールＤＮＡサンプルは、アレイ中に含まれ得、それぞれの相補性コントロールｍＲＮＡは既知濃度で含まれ、それぞれ異なる濃度のｍＲＮＡを含む。これらのコントロールまたはキャリブレーターに相当するアレイの特徴からのシグナルは、サンプル由来のｍＲＮＡのシグナルと量との間の関係を算出する用量反応曲線または較正曲線の構成に使用され得、
３．二色マイクロアレイ遺伝子発現の研究では、それぞれのチャンネルの標識反応におけるコントロールＤＮＡに相補的なコントロールｍＲＮＡの異なる既知のレベルを含むことが可能である。その遺伝子からの２つの色素のシグナルの比の比較は、２つのコントロールｍＲＮＡ分子の濃度の比に比較され得る。これは、遺伝子発現比を決定するためのシステムの精度の試験として役割をし得る。
４．幾つかの異なるコントロールｍＲＮＡ種の混合物は、実験プロトコールを簡単にするために既知濃度および比で調製(スパイクミックス)され得、その一方、正確で精度のある情報の包括的なセットを提供する。表３は、この概念の１つの実施態様を解説する。動力学的な範囲のコントロール(それらは、１：１の比で標識反応中に含まれる)により、ユーザーは、システムの感度を決定し得る。それらはまた、使用する正規化法(normalization method)の正確さの証明に有用である。比コントロールの場合、それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度で２つの標識反応中にスパイクされ、それによって、特定配列は、それぞれの色で異なるレベルで表示される。
【００４２】
上記実施例は、本発明の特定の態様を示し、任意の点でその範囲を制限することを目的とするものではなく、それを構成するものでもない。
【００４３】
上記開示のような本発明の技術の利点を有する当業者は、それらの多くの修飾を行うことができる。これらの修飾は、添付の請求の範囲に開示のように本願発明の範囲内に含まれるように構成される。
【００４４】
表３．二色遺伝子発現比実験のための提唱コントロールｍＲＮＡスパイクミックス組成物
【表３】
関連出願との相互引用
本願出願は、２００１年５月７日出願の米国仮特許出願番号６０／２８９，２０２、２００１年８月１５日出願の６０／３１２，４２０の優先権を主張する。その開示は、引用により全て本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
コンパクトディスクで提出したデータの引用による組み込み
本出願は、４つ提供した、ボリュームラベルＰＢ０１２０を有する単一の(ＣＤ−Ｒ)コンパクトディスクで、PCT Administrative Instructions Section 801(a)の下、本願明細書とともに提出した配列表を含む。当該配列表は、最後に２００２年５月６日に更新し、２００２年５月６日に記録した、３２キロバイトの単一のファイル名PB0120.ST25.txtに表されている。当該ディスクの当該ファイル中に含まれる配列表は、本願明細書に全て引用により組み込まれる。
【０００３】
本発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、遺伝子発現分析システムでコントロールとして人工遺伝子を使用する方法に関連する。より特に、本発明は、マクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥおよびMicroarray ScoreCardシステムで提供されるもののようなマイクロアレイのような遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールを作成する方法に関連する。
【０００４】
関連技術の説明
遺伝子発現プロファイリングは、細胞性機能および増加を支配する分子機構をより理解するために使用する重要な生物学的アプローチである。ミクロアレイ分析は、異なる条件下でのそれぞれの遺伝子の相対的発現レベルの測定に適用し得るツールの１つである。しかし、ミクロアレイ測定は、システム的に偏っているとしばしば思われ、この偏りの原因となる因子は、多く、不明確である(Bowtell, D.L., Nature Genetics 21, 25-32(1999); Brown, P.P. and Botstein, D., Nature Genetics 21, 33-37 (1999))。他のものは、ミクロアレイ実験でのコントロールとして既知濃度の精製ｍＲＮＡの「スパイク」の使用を推奨する。Affymetrixは、それらのGeneChip製品で使用するための幾つかのものを含む。当分野の現在の状態では、これら選択された遺伝子は、非常に遠縁の関係の生物から選択した実際の遺伝子である。例えば、ヒトチップ(ヒトｍＲＮＡで使用するためにデザインした)は、細菌および植物の起源由来のコントロール遺伝子を含む。Affymetrixは、標識反応にスパイクするためのこれらの遺伝子に相当するｍＲＮＡおよびハイブリダイゼーション反応での含有物を販売している。
【０００５】
従来技術のそれぞれのコントロールは、幾つかの起源由来のＤＮＡの転写配列を含む。結果として、その起源は、その起源に対する当該コントロールの本来的なハイブリダイゼーションにより、コントロールを用いるハイブリダイゼーション実験の主体とはなり得ない。そのため、必要であるものは、実験の当該実体となり得る任意の起源のＤＮＡとハイブリダイズしないコントロールのセットである。より望ましくは、任意の既知の起源とはハイブリダイズしない遺伝子発現分析のためのコントロールの必要性がある。
【０００６】
本発明の要旨
したがって、本発明は、任意の種用にデザインした遺伝子発現分析システムに有用であり、コントロールＤＮＡ自体以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないことを試験し得るコントロールを作成するプロセスを提供する。
【０００７】
第一の実施態様の本発明は、遺伝子発現分析システムに使用するための少なくとも１つのコントロールを作成するためのプロセスに関連する。当該プロセスは、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写(遺伝子間または遺伝子内)領域を選択すること、当該少なくとも１つの非転写領域用のプライマー対をデザインすること、およびゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域を増幅し、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを含む。
【０００８】
第二の実施態様の本発明は、遺伝子発現分析システムでの使用のための少なくとも１つのコントロールを作成するプロセスであって、ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域以外の起源由来のｍＲＮＡと確実にハイブリダイズしない当該少なくとも１つの非転写領域の試験を行う当該プロセスに関連する。
【０００９】
第三の実施態様の本発明は、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を決定すること、および選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを更に含む当該プロセスに関連する。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡを含むか、または既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成したＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む当該コントロールである。本発明は、当該ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成すること、ならびに所望により当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を決定すること、および選択した濃度および割合で当該ＤＮＡを含むかまたはｍＲＮＡの少なくとも１つのコントロールを調製することにより当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを所望により含み得る。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡ配列、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成したＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡが含まれる当該コントロールであり、ここで上記コントロールにおいて、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない。
【００１２】
本発明は、遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとして当該コントロールを使用する方法であって、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、およびシグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査することによる、当該方法に関連する。
【００１３】
更に、当該コントロールは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールをコントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および既知量の標識相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下で当該サンプルをハイブリダイゼーション条件におくこと、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよび標識ｍＲＮＡのシグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定すること、により遺伝子発現分析システムで使用することができる。
【００１４】
更に、当該コントロールは、既知量の幾つかのＤＮＡ配列を含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、当該サンプルを、既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成すること、により遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして使用し得る。
【００１５】
また、本発明は、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えることおよび当該サンプルを、既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対して)、２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること、により二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法に関連する。
【００１６】
本発明の更なる実施態様は、任意の種用にデザインした遺伝子発現分析システムに有用であり、コントロールを作成するＤＮＡの合成配列以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないことを試験し得るコントロールを作成するプロセスである。
【００１７】
１つまたはそれより多いコントロールは、非転写ＤＮＡのニアランダム(near-random)配列を合成すること、当該少なくとも１つのニアランダム配列用にプライマー対をデザインすることおよび当該非転写ＤＮＡを増幅させ、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、を含むプロセスにより作成し得る。
【００１８】
当該プロセスはまた、非転写ＤＮＡの当該配列以外の起源由来のｍＲＮＡと確実にハイブリダイズしない非転写合成ＤＮＡの当該配列の試験を行う、遺伝子発現分析システムで使用のための少なくとも１つのコントロールの作成に使用し得る。
【００１９】
更に、合成ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成および調製し、当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを作成し得る。
【００２０】
ＤＮＡおよびｍＲＮＡは実質的に精製され得、その濃度は決定され、そして選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたは当該ｍＲＮＡを含む１つまたはそれより多いコントロールを調製し得る。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、ＤＮＡのニアランダム(near-random)配列を合成すること、当該合成ＤＮＡ用にプライマー対をデザインすることおよび当該ＤＮＡを増幅させ、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いでベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ることおよび既知量の少なくとも１つの当該二本鎖ＤＮＡまたは当該ＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製することを含み、所望により、ここで、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、非転写ＤＮＡの当該ＤＮＡ配列以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない、プロセスにより作成される遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールである。
【００２２】
本発明は、更に、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付することおよびシグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査することを含む遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとして、既知量のＤＮＡを含む当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２３】
更に、当該コントロールは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加え、および当該サンプルを、既知量の標識相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付する、および標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定し、および標識ｍＲＮＡのシグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定する、遺伝子発現分析システムに使用し得る。
【００２４】
本発明はまた、既知量の幾つかのＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えることおよび当該サンプルを、既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付することおよび標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定することおよびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成することを含む遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２５】
本発明は、更に、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、当該サンプルを、既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(それぞれのＤＮＡサンプルが存在する)および２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定することおよび当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較することを含む二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとして当該コントロールを使用する方法に関連する。
【００２６】
本発明の更なる実施態様および使用は、次の詳細な説明の考慮により明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の上記および他の目的および利点は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を考慮することにより明らかとなる。図面において、類似の文字は全体として類似の部分に関係する。図面において：
【図１】図１は、ＹＩＲ１のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、ＹＩＲ２のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、ＹＩＲ３のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、ＹＩＲ４のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図５】図５は、ＹＩＲ５のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、ＹＩＲ６のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は、ＹＩＲ７のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、ＹＩＲ８のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、ＹＩＲ１１のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、ＹＩＲ１９のコントロールヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ２ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ３ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ４ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１５】図１５は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ５ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１６】図１６は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ６ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ７ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１８】図１８は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ８ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図１９】図１９は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１１ｓのヌクレオチド配列を示す。
【図２０】図２０は、スパイクミックス中で使用するＹＩＲ１９ｓのヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
本発明の詳細な説明
本発明は、マイクロアレイのような遺伝子発現分析システムで使用のためのコントロールを開示する。多くの者が、そのアレイに含めるためのコントロールとして適当な遺伝子およびスパイクを得ることに興味を示す。
【００２９】
本発明のコントロールの利点は、単一のセットが、作為的に加えない限りこれらのコントロールは存在しないため、任意の種用にデザインしたアッセイシステムで使用され得ることである。これは、「遠縁の関係の種」由来の遺伝子の使用の概念とは対照的である。例えば、ヒト遺伝子発現の検出を目的とする分析システムは、ヒト遺伝学的物質中には存在し得ない、コントロールとしてBacillus subtilis遺伝子を用い得る。しかし、このコントロールは、細菌性遺伝学的物質中に存在し得(または少なくともクロスハイブリダイズする)、そのため、細菌性遺伝子発現の実験で良好なコントロールとはなり得ない。本願明細書で示す新規コントロールは、同セットのコントロールが試験サンプルＲＮＡの種にかかわらず使用され得るという従来技術の状況を超える利点を提供する。
【００３０】
本発明は、鋳型として非転写ゲノム配列または全体的にランダムの合成配列の何れかを用い、そしてコントロールとしての使用のための、その配列由来のＤＮＡおよび相補性「ｍＲＮＡ」の両方を作成する新規アプローチを用いる。当該コントロールは、ニアランダム配列をデザインしそれらを合成し普遍的なコントロールとして合成高分子を生ずることにより新たに編み出され得る。全体的に合成のランダムＤＮＡフラグメントを、それらが、お互いにまたは任意の生物学的関連の種(ＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝子発現分析システム中に存在し得る種を意味する)由来のＲＮＡとクロスハイブリダイゼーションしないように、デザインする。そのような大きな合成ＤＮＡ分子の作成の費用は高くなり得る。しかし、それらは一度に作成する必要があるのみである。更に、フラグメントの大きさは、既知の方法により、より小さな合成フラグメントを一緒にライゲーションすることにより増大し得る。この方法では、容易にクローニングするに十分な大きさのフラグメントが作成し得る。クローニングおよびＰＣＲを通して、コントロールとしての使用のための十分量のＤＮＡを作成し得、ｍＲＮＡは、コントロール中での使用のためのインビトロ転写により作成し得る。
【００３１】
より簡単なアプローチは、生物由来のゲノムＤＮＡの非転写領域由来の配列を同定することであり、そしてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)を介する合成のための鋳型としてのこれらの使用である。理想的には、１０００塩基あたり(５００から２０００塩基の範囲となり得る)の配列を、公然としてアクセス可能な配列データのコンピューターサーチに基づき、選択する。選択のための基準には、
１．当該配列は非転写領域(遺伝子間または遺伝子内領域)由来でなければならず、そして
２．当該配列は、任意の既知／公開された遺伝子または発現配列タグ(ＥＳＴ)とは相同性があってはならず、ハイブリダイズすると予想されてもならない。
【００３２】
ＰＣＲプライマー対は、選択配列でデザインされ、ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ(鋳型として)を用い行い、コントロールＤＮＡとして非転写配列に相当するＰＣＲフラグメント(ｄｓＤＮＡ)を作成する。更なるコントロールＤＮＡは、ベクターおよび標準の技術を用いクローニングされ得る。その後、インビトロ転写のような標準技術を用い、コントロールｍＲＮＡとしてｍＲＮＡ(ｃＤＮＡに相補的であり、ポリＡテイルを含む)を作成する。標準技術は、コントロールＤＮＡおよびコントロールｍＲＮＡ産物を精製するため、およびその濃度を算出するため、使用する。
【００３３】
経験的な試験をまた、アレイ上のコントロールＤＮＡと他のｍＲＮＡおよび重要な遺伝子発現系(例えば、ヒト、マウス、アラビドピシスなど)由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしないように行う。
【００３４】
上記アプローチを用い、酵母Saccharomyces cerevisiaeゲノムの遺伝子間領域由来の１０のコントロール配列を作成した。特に、公然として利用可能な酵母ゲノム配列データ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)を用い、おおよそ１ｋｂの大きさの遺伝子間領域を同定した。これらの配列は、ＢＬＡＳＴ’ｄであり、他の配列とは相同性のないものは、人工遺伝子コントロールの候補として同定された。候補を、ＧＣ含有率について分析し、３６％以上のＧＣ含有率を有するサブセットを同定した。特定プライマー配列を同定し、合成した。特定プライマーで増幅したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ(商標)−Ｔ Ｅａｓｙベクター(Promega Corp., Madison, WI)に直接クローニングした。アレイ標的およびスパイクｍＲＮＡのための鋳型の両方を、明確で特定のプライマーを用いこれらのクローンから増幅した。
【００３５】
１０のコントロール配列を同定する機会を最大とするため、より多くの遺伝子間領域を試験のためにクローニングした。すべての候補配列をガラスミクロアレイスライド上にスポットし、各候補スパイクｍＲＮＡと独立してハイブリダイズさせ、クロスハイブリダイズするものを同定した。１０の候補明示特異的ハイブリダイゼーションを選択し、特定のセットのコントロールを形成した。コントロールとして使用するとき、１０すべての酵母遺伝子間領域(ＹＩＲ)を、特定プライマー(表１)によるＰＣＲにより、クローン化鋳型(プラスミドＤＮＡ)５ｎｇおよび１００μｌ反応体積中０．５μＭの濃度のプライマーを用い、以下のようなサイクル：
９４℃２０秒、５２℃２０秒、７２℃２分間を３５サイクル、その後に７２℃で５分間の伸張で、作成した。
【００３６】
表１．コントロールの増幅のために使用したプライマー
【表１】
スパイクミックスのための全てのＹＩＲコントロールｍＲＮＡを、インビトロ転写により作成する。インビトロ転写(ＩＶＴ)のための鋳型を、ＰＣＲ産物の５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび３’末端にポリＴ(Ｔ２１)テイルを導入するようにデザインする特定プライマー(表２参照)による増幅により、作成する。ラン−オフ(run-off)ｍＲＮＡを、AmpliScribe system(Epicentre, Madison, WI)による反応あたり１μｌのこれらＰＣＲ産物を用い、作成する。ＩＶＴ産物を、RNAEasy system(Qiagen Inc., Valencia, CA)を用い精製し、スペクトロフォトメトリーにより定量する。
【００３８】
図１から図１０は、１０のＹＩＲコントロールのヌクレオチド配列を示すが、図１１から２０は、スパイクミックス中で使用するときの１０ＹＩＲｓ(「ｓ」は、スパイクミックスを表す)のヌクレオチド配列を示す。当該コントロールを増幅するために使用するプライマー配列を表１に列挙しており、スパイクミックス鋳型を増幅するために使用する当該プライマー配列を表２に列挙した。これらの配列は、以下の通り、更に配列表(それは、引用により本願明細書すべて組み込まれる)中に示されている：
配列番号１−８ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１からＹＩＲ８、
配列番号９ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１１、
配列番号１０ ｎｔ、コントロールヌクレオチド配列ＹＩＲ１９。
【００３９】
表２．インビトロ転写標的の増幅に使用したプライマー
【表２】
配列番号１１−１８ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓ、
配列番号１９ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１１ｓ、
配列番号２０ ｎｔ、スパイクミックスヌクレオチド配列ＹＩＲ１９ｓ、
配列番号２１−２８ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１からＹＩＲ８の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号２９ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１１の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号３０ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１９の増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号３１−３８ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１からＹＩＲ８の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号３９ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１１の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号４０ ｎｔ、コントロールＹＩＲ１９の増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号４１−４８ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号４９ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１１ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号５０ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１９ｓの増幅のためのフォワードプライマー配列、
配列番号５１−５８ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１ｓからＹＩＲ８ｓの増幅のためのリバースプライマー配列、
配列番号５９ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１１ｓの増幅のためのリバースプライマー配列、および
配列番号６０ ｎｔ、インビトロ転写鋳型ＹＩＲ１９ｓの増幅のためのリバースプライマー配列。
【実施例】
【００４１】
次いで、以下の実施例は、これらコントロールＤＮＡおよびコントロールｍＲＮＡが、ミクロアレイ遺伝子発現実験においてコントロールとしてどのように使用されるかを説明する：
１．コントロールＤＮＡはアレイ中に含まれ、非相補的人工ｍＲＮＡは、ＲＮＡサンプル中にスパイクされ、ネガティブコントロールとしての役割をし、
２．幾つかの異なるコントロールＤＮＡサンプルは、アレイ中に含まれ得、それぞれの相補性コントロールｍＲＮＡは既知濃度で含まれ、それぞれ異なる濃度のｍＲＮＡを含む。これらのコントロールまたはキャリブレーターに相当するアレイの特徴からのシグナルは、サンプル由来のｍＲＮＡのシグナルと量との間の関係を算出する用量反応曲線または較正曲線の構成に使用され得、
３．二色マイクロアレイ遺伝子発現の研究では、それぞれのチャンネルの標識反応におけるコントロールＤＮＡに相補的なコントロールｍＲＮＡの異なる既知のレベルを含むことが可能である。その遺伝子からの２つの色素のシグナルの比の比較は、２つのコントロールｍＲＮＡ分子の濃度の比に比較され得る。これは、遺伝子発現比を決定するためのシステムの精度の試験として役割をし得る。
４．幾つかの異なるコントロールｍＲＮＡ種の混合物は、実験プロトコールを簡単にするために既知濃度および比で調製(スパイクミックス)され得、その一方、正確で精度のある情報の包括的なセットを提供する。表３は、この概念の１つの実施態様を解説する。動力学的な範囲のコントロール(それらは、１：１の比で標識反応中に含まれる)により、ユーザーは、システムの感度を決定し得る。それらはまた、使用する正規化法(normalization method)の正確さの証明に有用である。比コントロールの場合、それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度で２つの標識反応中にスパイクされ、それによって、特定配列は、それぞれの色で異なるレベルで表示される。
【００４２】
上記実施例は、本発明の特定の態様を示し、任意の点でその範囲を制限することを目的とするものではなく、それを構成するものでもない。
【００４３】
上記開示のような本発明の技術の利点を有する当業者は、それらの多くの修飾を行うことができる。これらの修飾は、添付の請求の範囲に開示のように本願発明の範囲内に含まれるように構成される。
【００４４】
表３．二色遺伝子発現比実験のための提唱コントロールｍＲＮＡスパイクミックス組成物
【表３】
Claims (25)
- 遺伝子発現分析システムでの使用のための少なくとも１つのコントロールを作成するプロセスであって、
既知配列から、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域を選択すること、
当該少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域用にプライマー対をデザインすること、
ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域を増幅し、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、
ベクターを用い当該二本鎖コントロールＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、そして
当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を含む当該プロセス。 - ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしない当該少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域を試験すること、
を更に含む請求項１のプロセス。 - 当該二本鎖コントロールＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成すること、および
当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を更に含む請求項１のプロセス。 - 当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、
その濃度を決定すること、および
選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を更に含む請求項３のプロセス。 - 遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、
既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡ、または
既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域から作成した、既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡ
を含む当該コントロール。 - 当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの遺伝子間または遺伝子内領域以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない、請求項５のコントロール。
- 遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項５の既知量の当該コントロールＤＮＡを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
シグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査すること、
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでのコントロールの使用の方法であって、
請求項５の既知量の当該コントロールＤＮＡを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項５の既知量の標識相補性ｍＲＮＡの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および測定シグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定すること
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項５の既知量の幾つかのＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項５の既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成すること
を含む当該方法。 - 二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項５の既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項５の既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対して)、
２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること、
を含む当該方法。 - (ａ)当該少なくとも１つのＤＮＡが、
(ｉ)配列番号１−１０、
(ii)(ｉ)で開示の配列のディジェネレイト変異体、および
(iii)(ｉ)および(ii)に開示の配列の相補体
からなる群からから選択されるか、または
(ｂ)当該少なくとも１つのｍＲＮＡが、
(ｉ)配列番号１１−２０、
(ii)(ｉ)で開示の配列のディジェネレイト変異体、および
(iii)(ｉ)および(ii)に開示の配列の相補体
からなる群から転写される、
請求項５のコントロール。 - 遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項１１の既知量の当該コントロールＤＮＡを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
シグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査すること、
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでコントロールを使用する方法であって、
請求項１１の既知量の当該コントロールＤＮＡを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１１の既知量の標識相補性ｍＲＮＡの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および測定シグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定すること
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項１１の既知量の幾つかのＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１１の既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成すること
を含む当該方法。 - 二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項１１の既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１１の既知量の２種類標識した相当する相補性標識ｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対して)、
２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること、
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでの使用のための少なくとも１つコントロールを作成するプロセスであって、
ＤＮＡのニアランダム配列を合成すること、
ＤＮＡの当該配列用にプライマー対をデザインすること、
当該ＤＮＡを増幅させ、相当する二本鎖ＤＮＡを作成すること、
ベクターを用い当該二本鎖コントロールＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、そして
当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を含む当該プロセス。 - 当該ＤＮＡ以外の起源由来のｍＲＮＡとは確実にハイブリダイゼーションしない当該ＤＮＡを試験すること、
を更に含む請求項１６のプロセス。 - 当該ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成すること、および
当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を更に含む請求項１６のプロセス。 - 当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、
その濃度を決定すること、および
選択した濃度および割合で当該ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロールを調製すること、
を更に含む請求項１８のプロセス。 - 遺伝子発現分析システムでの使用のためのコントロールであって、
請求項１６のＤＮＡの配列から作成した、既知量の少なくとも１つのＤＮＡ、または
ＤＮＡの当該配列から作成した、既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡ
を含む当該コントロール。 - 当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、ＤＮＡの当該配列以外の起源由来の任意のＤＮＡまたはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない、請求項２０のコントロール。
- 遺伝子発現分析システムでネガティブコントロールとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項２０の既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、相補性標識ｍＲＮＡの非存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
シグナルの非存在または存在に関しコントロールサンプルを検査すること、
をふくむ当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでコントロールを使用する方法であって、
請求項２０の既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項２０の既知量の標識相補性ｍＲＮＡの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
標識ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および測定シグナル値に基づくＤＮＡの発現レベルを決定すること
を含む当該方法。 - 遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項２０の既知量の幾つかのＤＮＡを含む既知量の当該コントロールを、コントロールサンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項２０の既知量の相当する相補性標識ｍＲＮＡ(それぞれのｍＲＮＡは、異なる濃度である)を含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること、
当該標識コントロールｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびそれぞれのｍＲＮＡのシグナルの値と濃度との間の関係に基づく用量反応または較正曲線を構成すること
を含む当該方法。 - 二色遺伝子発現分析システムで遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロールを使用する方法であって、
請求項２０の既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロールを、コントロールサンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項２０の既知量の２種類標識した相当する相補性標識コントロールｍＲＮＡを含む当該コントロールの存在下でハイブリダイゼーション条件に付すること(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対して)、
２種類の標識ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、２種類またはそれより多い種類の標識ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること、
を含む当該方法。
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