KR20230100949A - 작약의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 작약 품종을 판별하는데 유용하게 사용될 수 있는 단일염기다형성(SNP)을 갖는 유전자 마커, 상기 마커를 이용한 작약 품종의 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 PCR 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 작약 품종의 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 매우 유사한 유전적 특징을 갖는 작약 품종을 용이하게 구별할 수 있다.
Description
본 발명은 작약의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 및 이를 이용한 작약 품종의 판별용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 판별 방법에 관한 것이다.
작약 속(屬)에는 약 38 종의 다양한 식물이 포함되어 있으며, 이 중 작약(Paeonia lactiflora)은 미나리아재비과의 여러해살이풀로 주로 산기슭이나 골짜기에서 자란다. 줄기는 여러 개가 한 포기에서 나와 곧게 서고 높이 60 ㎝ 정도이며 잎과 줄기에 털이 없다. 뿌리는 여러 개가 나오지만 가늘고 양끝이 긴 뾰족한 원기둥 모양으로 굵다. 꽃은 5~6월에 줄기 끝에 1개가 피는데 크고 아름다우며 재배한 것은 지름 10 ㎝ 정도이다. 꽃색은 붉은색, 흰색 등 다양하고, 뿌리는 진통, 복통, 월경통, 무월경, 토혈, 빈혈, 타박상 등의 약재로 쓰인다. 또한, 작약 뿌리를 약제로 사용할 경우 선가공 방법에 따라 적작약과 백작약으로 구분할 수 있다. 적작약은 수염뿌리를 제거해서 말린 것이고, 백작약은 수염 뿌리를 제거하고 끓는 물에 삶은 후 외피를 제거하거나 다시 삶아 말린 것이다(특허문헌 1).
작약은 화훼 품종으로 많이 육성되어 여러 품종이 등록되어 있으나, 약용작물로 개발되어 보급되고 있는 품종은 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개 품종이 대표적이다(도 1 참조). 현재 상기 작약의 4개 품종을 구별할 수 있는 수준의 유전자 데이터베이스는 아직까지 구축되어 있지 않으며, 전장 유전체에 대한 정보도 없는 상태이다. 또한, ITS(Internal Transcribed Spacer) 유전자를 이용한 분석에서도 작약과 유연관계가 높지만 종이 다른 모란과는 구분이 가능하지만, 동일 종내에서 품종 구별은 불가능한 것으로 나타나 있다(도 2a 및 도 2b 참조).
본 발명자는 약용작물로 개발되어 보급되고 있는 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개의 작약 품종을 구별할 수 있는 방법에 대해 연구하였고, 이들을 서로 구별할 수 있는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 부위를 찾아내었으며, 이로부터 각 품종에 특이적인 8종의 프라이머 및 프로브의 조합으로 작약의 4개 품종을 용이하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개의 작약 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커, 조성물, 프라이머 세트, 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개의 작약 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커, 조성물, 프라이머 세트, 또는 키트를 사용하여 상기 4개의 작약 품종을 판별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 단일염기다형성(SNP) 위치, 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치, 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치, 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치, 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치, 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 작약 품종의 판별용 유전자 마커를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 의성, 거풍, 태백, 및 대청의 4개의 작약 품종을 구별하기 위한 것이지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 유전자 마커는 재래종인 사곡 품종을 구별하기 위해서도 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 95개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 78개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 115개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 74개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 101개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 121개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 SNP 위치인 60번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 89개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 144개의 연속된 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 SNP 위치인 60번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 서열번호 1의 염기 서열의 22 내지 116번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 39 내지 116번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 50 내지 164번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 5 내지 78번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 78 내지 135번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 34 내지 154번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 14 내지 102번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 220 내지 363번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 염기가 의성 품종은 T이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 2의 염기 서열의 SNP 위치인 72번째 염기가 거풍 품종은 A이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G이며, 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G이며, 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 염기가 의성 품종은 C이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 T이며, 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 A이고 태백 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 7의 염기 서열 중 SNP 위치인 60번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 C이고 태백 및 대청 품종은 T이며, 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 염기가 태백 품종은 C이고 의성, 거풍, 및 대청 품종은 T일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 것과 같은 유전자 마커에 결합하여 이를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 작약 품종의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 그 상보적인 염기 서열에 결합하여 상기 유전자 마커를 증폭할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 제1 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열로 구성된 제2 프라이머의 쌍; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 11의 염기 서열로 구성된 제3 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열로 구성된 제4 프라이머의 쌍; 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 13의 염기 서열로 구성된 제5 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열로 구성된 제6 프라이머의 쌍; 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 15의 염기 서열로 구성된 제7 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열로 구성된 제8 프라이머의 쌍; 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 17의 염기 서열로 구성된 제9 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열로 구성된 제10 프라이머의 쌍; 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 19의 염기 서열로 구성된 제11 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열로 구성된 제12 프라이머의 쌍; 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 21의 염기 서열로 구성된 제13 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열로 구성된 제14 프라이머의 쌍; 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 23의 염기 서열로 구성된 제15 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열로 구성된 제16 프라이머의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 프라이머 세트는 전술한 제1 프라이머 내지 제16 프라이머를 모두 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 작약 품종의 판별용 PCR 조성물, 또는 본 발명의 프라이머 세트 또는 PCR 조성물을 포함하는 작약 품종의 판별용 키트를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명의 PCR 조성물 및 키트는 작약 품종의 판별용 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터(Reporter)가 부착되어 있거나, 3' 말단에 퀀쳐(Quencher)가 부착되어 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 키트는 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 25의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 26의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 27의 염기 서열로 구성된 제3 프로브 및 서열번호 28의 염기 서열로 구성된 제4 프로브의 쌍; 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 29의 염기 서열로 구성된 제5 프로브 및 서열번호 30의 염기 서열로 구성된 제6 프로브의 쌍; 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 31의 염기 서열로 구성된 제7 프로브 및 서열번호 32의 염기 서열로 구성된 제8 프로브의 쌍; 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 33의 염기 서열로 구성된 제9 프로브 및 서열번호 34의 염기 서열로 구성된 제10 프로브의 쌍; 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 35의 염기 서열로 구성된 제11 프로브 및 서열번호 36의 염기 서열로 구성된 제12 프로브의 쌍; 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 37의 염기 서열로 구성된 제13 프로브 및 서열번호 38의 염기 서열로 구성된 제14 프로브의 쌍; 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 39의 염기 서열로 구성된 제15 프로브 및 서열번호 40의 염기 서열로 구성된 제16 프로브의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브 쌍의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직한 구현예에서, 각각의 유전자 마커에 대한 프로브의 쌍에는 서로 다른 리포터가 결합되어 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 리포터는 Hex, Joe, Fam, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa Fluor), ROX, 텍사스 레드(texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(cyanine) 계열 염료, 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료, 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 전술한 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하고, 선택적으로 3) 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함하는 작약 품종의 판별 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 작약 품종은 의성, 거풍, 태백, 및 대청으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커, 상기 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 사용한 판별 방법에 따르면 매우 유사한 유전적 특징을 갖는 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개 작약 품종을 용이하게 구별할 수 있다.
도 1은 작약의 대표적인 품종을 보여주는 농업유전자원센터의 홈페이지의 검색 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 작약과 모란 및 작약의 4개 품종을 구별할 수 있는지 확인한 ITS 염기 서열 분석 결과이다.
도 3은 작약 품종에 대한 드래프트 게놈(draft genome) 작성 및 GBS(Genotyping by Sequencing) 분석에 대한 모식도이다.
도 4는 작약의 SNP를 이용하여 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종에 대해 작성한 계통수이다.
도 5는 본 발명에서 확인한 8개 SNP 위치에 대한 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종의 염기의 종류를 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 13은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 8의 유전자 마커에 대한 프라이머 및 프로브의 쌍을 이용하여 실시간(real time) PCR 분석한 결과 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종을 구별할 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 의성, 거풍, 태백, 대청, 및 사곡의 5개 작약 품종을 구별할 수 있는 SNP 조합과 형광 신호를 정리한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 작약과 모란 및 작약의 4개 품종을 구별할 수 있는지 확인한 ITS 염기 서열 분석 결과이다.
도 3은 작약 품종에 대한 드래프트 게놈(draft genome) 작성 및 GBS(Genotyping by Sequencing) 분석에 대한 모식도이다.
도 4는 작약의 SNP를 이용하여 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종에 대해 작성한 계통수이다.
도 5는 본 발명에서 확인한 8개 SNP 위치에 대한 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종의 염기의 종류를 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 13은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 8의 유전자 마커에 대한 프라이머 및 프로브의 쌍을 이용하여 실시간(real time) PCR 분석한 결과 의성, 거풍, 태백, 및 대청 품종을 구별할 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 의성, 거풍, 태백, 대청, 및 사곡의 5개 작약 품종을 구별할 수 있는 SNP 조합과 형광 신호를 정리한 것이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.
본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 달리 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 비제한적으로 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 표적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로(substantially) 상보적 및 완전히(perfectly) 상보적인 것을 모두 포괄하는 의미를 갖고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적"은 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 다양한 작약 품종들 중에서 어느 하나 또는 일부의 품종에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하는 것을 허용하도록 설계된다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 단일염기다형성(SNP) 위치, 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치, 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치, 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치, 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치, 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 작약 품종의 판별용 유전자 마커를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 다양한 품종의 작약으로부터 의성, 거풍, 태백, 대청, 및 사곡의 5개 품종, 바람직하게는 의성, 거풍, 태백, 및 대청의 4개 품종을 구별할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 본 발명의 유전자 마커는 서열번호 1의 염기 서열의 1 내지 195번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 22 내지 116번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 150개, 예컨대 8개 내지 120개, 바람직하게는 8개 내지 95개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 1 내지 167번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 39 내지 116번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 72번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 167개, 예컨대 8개 내지 120개, 바람직하게는 8개 내지 78개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 1 내지 176번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 50 내지 164번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 81번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 176개, 예컨대 8개 내지 120개, 바람직하게는 8개 내지 115개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 1 내지 80번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 78번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 52번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 80개, 예컨대 8개 내지 77개, 바람직하게는 8개 내지 74개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 1 내지 152번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 78 내지 135번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 152개, 예컨대 8개 내지 120개, 바람직하게는 8개 내지 101개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 1 내지 158번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 34 내지 154번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 158개, 예컨대 8개 내지 140개, 바람직하게는 8개 내지 121개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 1 내지 107번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 14 내지 102번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 60번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 107개, 예컨대 8개 내지 100개, 바람직하게는 8개 내지 89개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 1 내지 522번째 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 220 내지 363번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 255번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 522개, 예컨대 8개 내지 144개, 바람직하게는 8개 내지 100개, 8개 내지 60개, 18개 내지 50개, 18개 내지 30개, 또는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 유전자 마커는 서열번호 1의 염기 서열의 22 내지 116번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 39 내지 116번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 50 내지 164번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 5 내지 78번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 78 내지 135번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 34 내지 154번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 14 내지 102번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 220 내지 363번째 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 유전자 마커는 이들 8종의 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 SNP는 유사한 외형을 갖는 서로 다른 작약 품종의 판별에 직접적으로 사용될 수 있는 매우 안정적인 유전자 마커이다. 본 발명의 SNP 마커를 매우 유사한 유전자 구조를 갖는 서로 다른 작약 품종을 판별하는데 사용할 수 있는 것은 작약의 품종에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 62번째 염기가 C 또는 T로 상이하고, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 72번째 염기가 A 또는 G로 상이하고, 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 81번째 염기가 T 또는 C로 상이하고, 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 52번째 염기가 G 또는 T로 상이하고, 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 91번째 염기가 C 또는 T로 상이하고, 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 91번째 염기가 C 또는 A로 상이하고, 서열번호 7로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 60번째 염기가 C 또는 T로 상이하고, 서열번호 8로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 255번째 염기가 C 또는 T로 상이하게 나타나는 것에 근거한 것이다.
예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 62번째 염기가 의성 품종은 T이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 C로 상이하고, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 72번째 염기가 거풍 품종은 A이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G로 상이하고, 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 81번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 C로 상이하고, 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 52번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G로 상이하고, 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 91번째 염기가 의성 품종은 C이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 T로 상이하고, 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 91번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 A이고 태백 및 대청 품종은 C로 상이하고, 서열번호 7로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 60번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 C이고 태백 및 대청 품종은 T로 상이하고, 서열번호 8로 표시되는 염기 서열 중 SNP 변이 위치인 255번째 염기가 태백 품종은 C이고 의성, 거풍, 및 대청 품종은 T로 상이한 염기다형성을 나타내므로, 상기 SNP 변이 위치들에서의 염기 서열들을 확인함으로써 의성, 거풍, 태백, 대청의 4개 작약 품종을 명확하게 판단할 수 있다. 또한, 순종이 아니라 혼계되어 있는 재래종인 사곡의 경우, 서열번호 1, 6, 7의 마커에 있어서 2가지 염기다형성이 동시에 나타나므로, 상기와 같은 특징을 이용함으로써 재래종인 사곡 품종도 판단할 수 있다(도 14 참조).
본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 서열 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부에서 해당 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
또한, 본 발명은 단일염기다형성을 갖는 상기 유전자 마커를 이용하여 서로 다른 작약 품종을 판별할 수 있는 단일염기다형성 마커 조성물, 프라이머 세트, 프로브, 및 키트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 전술한 것과 같은 서로 다른 작약 품종의 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 작약 품종의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 그 상보적인 염기 서열에 결합하여 작약 품종의 판별용 유전자 마커를 증폭할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 비제한적으로 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 프라이머 쌍은 서열번호 1 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 제1 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열로 구성된 제2 프라이머의 쌍; 서열번호 2 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 11의 염기 서열로 구성된 제3 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열로 구성된 제4 프라이머의 쌍; 서열번호 3 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 13의 염기 서열로 구성된 제5 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열로 구성된 제6 프라이머의 쌍; 서열번호 4 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 15의 염기 서열로 구성된 제7 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열로 구성된 제8 프라이머의 쌍; 서열번호 5 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 17의 염기 서열로 구성된 제9 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열로 구성된 제10 프라이머의 쌍; 서열번호 6 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 19의 염기 서열로 구성된 제11 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열로 구성된 제12 프라이머의 쌍; 서열번호 7 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 21의 염기 서열로 구성된 제13 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열로 구성된 제14 프라이머의 쌍; 및 서열번호 8 또는 그의 일부인 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 23의 염기 서열로 구성된 제15 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열로 구성된 제16 프라이머의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 8 종의 조합을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 표적 유전자 마커에 인접한 영역의 DNA 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프라이머는 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 충분한 상보성을 가질 수 있는 것이면 본 발명에 적용할 수 있으므로, 프라이머는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없다. 또한 본 발명의 프라이머는 작약 품종의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 작약 품종의 판별용 프라이머 세트를 포함하는 작약 품종의 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 작약 품종의 판별용 프라이머 세트 또는 상기 작약 품종의 판별용 조성물을 포함하는 작약 품종의 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 작약 품종의 판별용 조성물 또는 상기 키트는 본 발명의 작약 품종의 판별용 유전자 마커를 검출하기 위한 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
한 구현예에서, 본 발명의 프로브는 서열번호 1 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 25의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 26의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍; 서열번호 2 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 27의 염기 서열로 구성된 제3 프로브 및 서열번호 28의 염기 서열로 구성된 제4 프로브의 쌍; 서열번호 3 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 29의 염기 서열로 구성된 제5 프로브 및 서열번호 30의 염기 서열로 구성된 제6 프로브의 쌍; 서열번호 4 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 31의 염기 서열로 구성된 제7 프로브 및 서열번호 31의 염기 서열로 구성된 제8 프로브의 쌍; 서열번호 5 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 33의 염기 서열로 구성된 제9 프로브 및 서열번호 34의 염기 서열로 구성된 제10 프로브의 쌍; 서열번호 6 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 35의 염기 서열로 구성된 제11 프로브 및 서열번호 36의 염기 서열로 구성된 제12 프로브의 쌍; 서열번호 7 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 37의 염기 서열로 구성된 제13 프로브 및 서열번호 38의 염기 서열로 구성된 제14 프로브의 쌍; 및 서열번호 8 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 39의 염기 서열로 구성된 제15 프로브 및 서열번호 40의 염기 서열로 구성된 제16 프로브의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다.
상기 프로브의 쌍은 해당 유전자 마커의 SNP 위치에서 작약 품종에 따른 서로 다른 염기를 특이적으로 검출하기 위한 것이다. 예컨대, 상기 제1 프로브는 그 서열 내에 서열번호 1의 SNP 위치인 62번째 염기에 대응하는 염기로서 거풍, 태백, 및 대청 품종을 검출하기 위한 "C"를 포함하고, 상기 제2 프로브는 그 서열 내에 서열번호 1의 SNP 위치인 62번째 염기에 대응하는 염기로서 의성 품종을 검출하기 위한 "T"를 포함한다. 따라서, 본 기술분야의 통상의 기술자라면, 서열번호 1의 SNP 위치인 62번째 염기에 대응하는 서로 다른 염기(즉, "C" 및 "T")를 각각 포함하는 한, 서열번호 1의 유전자 마커에 대한 프로브 쌍은 제1 및 제2 프로브의 염기 서열, 즉 서열번호 25 및 서열번호 26과 상이할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이는 서열번호 2 내지 서열번호 8 또는 그의 일부인 유전자 마커의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 적절히 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 또는 퀀쳐가 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 리포터로서 Fam이 부착되어 있을 수 있고, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 Hex, Joe, Fam, 플루오레신, 플루오레신 클로로트리아지닐, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민, FITC, 오레곤 그린, 알렉사 플루오로, ROX, 텍사스 레드, TET, TRITC, TAMRA, 시아닌 계열 염료, 및 씨아디카르보시아닌 염료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 BHQ-2, BH3-3, ROX(carboxy-X-rhodamine), 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
한 구현예에서, 특정 유전자 마커에 대한 프로브 쌍은 서로 다른 리포터가 각각의 프로브의 말단에 부착될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 유전자 마커에 대한 서열번호 25 및 서열번호 26의 프로브 쌍은 그 5'-말단에 각각 Fam 및 Hex(또는 Joe)가 부착될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 유전자 마커에 대한 서열번호 25 및 서열번호 26의 프로브 쌍은 그 5'-말단에 각각 Hex(또는 Joe) 및 Fam이 부착될 수 있다. 이는 서열번호 2 내지 서열번호 8 또는 그의 일부인 유전자 마커의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징으로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하는 작약 품종의 판별 방법을 제공한다.
상기 PCR은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미하는 것으로, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법이다. 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있으며, 예를 들면 PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR 등이 있다. 또한, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction, IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 사용될 수 있다.
상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들이 과량으로 제공될 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다.
상기 방법은 상기 단계 2) 후에 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출 또는 정량은 HRM 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 특히 HRM 분석을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 서열번호 9 내지 서열번호 24의 프라이머 및 서열번호 25 내지 서열번호 40의 프로브를 이용하고, 의성, 거풍, 태백, 대청, 및 사곡의 5개 작약 품종, 바람직하게는 의성, 거풍, 태백, 및 대청의 4개 작약 품종에서 각각 분리된 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR로 상기 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인하였을 때, 각 프라이머 및 프로브 쌍들은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 유전자 마커들에 대해 작약 품종에 특이적으로 고유한 증폭 및 검출 패턴을 나타냄을 확인하였다(도 6 내지 도 13 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료로부터 DNA 추출
농촌진흥청을 통해 분양받은 96개 작약 품종을 이용하여 의성, 거풍, 태백, 대청, 및 사곡의 5개 작약 품종의 시료를 입수하였고, 상기 시료로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)을 이용해 DNA를 분리하였다.
이를 위하여, 1 ㎝ × 0.5 ㎝ 크기의 시료를 액체 질소에 얼린 후 균질기를 이용하여 분쇄하였다. CTAB 500 ㎕를 넣어 섞은 후 65℃ 항온조에 1시간 동안 인큐베이션하였고, PCI(phenol chloroform alcohol) 500 ㎕를 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겼고, CI 500 ㎕를 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겼고, 이소프로판올을 상등액의 70% 부피로 놓고 상온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 상등액을 버렸고, 70% EtOH 1 ㎖를 첨가한 후 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 10분 동안 공기 건조시킨 후, 20 ㎕의 증류수에 용출하였다.
실시예 2. 상이한 작약 품종을 구별할 수 있는 유전자 마커의 확인
농촌진흥청에서 분양받은 96개의 작약 품종에 대해 차세대 염기 서열 분석(NGS, Next Generation Sequencing) 방법을 통해 작약에 대한 드래프트 게놈을 작성하고, GBS 방법에 의해 총 3,161개의 SNP 부위를 확보하였다(도 3). 상기 확보된 3,161개의 SNP를 이용해 계통수를 그려본 결과, 분석에 사용된 의성, 거풍, 태백, 및 대청의 4가지 작약 품종이 분명하게 구분되는 것을 확인하였다(도 4).
SNP 필터링을 통해 상기 4개 품종에서 서로 다른 염기 서열을 갖는 29개의 SNP 위치를 확인하였고, 이 중 8개의 SNP를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 8종의 폴리뉴클레오티드를 작약 품종을 판별하기 위한 적합한 유전자 마커로서 선택하였다.
실시예 3. 프라이머 및 프로브 제작
실시예 2의 유전자 염기 서열 분석을 통해 선정된 작약의 8종의 SNP 위치를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 유전자 마커를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 쌍과 이를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브 쌍을 설계하였다. 상기 유전자 마커와, 각 유전자 마커에 대한 프라이머 및 프로브의 쌍의 염기 서열을 아래에 나타내었다.
1. 의성(T)/거풍, 태백, 대청(C) 01PL08795392_113
CGGCAGTTTGGAGCCAAGATGCAACCCTCGACCACTCGGTAAGCAAACAAGAAAGAAAGGT
[C/T]
GCATTTTTGAGCAGGTTTGGCAAATTAAAAGTGACTTCAAAGCCACTCATGGCCATTTAGAAAGCCTGGTGGAGGAGGTTAGAAAGGCACTTACAAAAGGTAAATCTATCCAAATAGACCTTAGTCACACTGC [서열번호 1]
정방향 프라이머 CAACCCTCGACCACTCGGTAAG [서열번호 9]
역방향 프라이머 GGCCATGAGTGGCTTTGAAG [서열번호 10]
대립형질 1 프로브 FAM - CAAGAAAGAAAGGT C GCATT - ZNA [서열번호 25]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - AAACAAGAAAGAAAGGT T GCATTT - ZNA [서열번호 26]
2. 거풍(A)/의성, 태백, 대청(G) 02PL09135653_266
CGGAGATACCATAAGCTTTGTTGATATGCTTTCCAGGCCACCTACCCATTCCGCACTAATTGTGGCTATGC
[A/G]
AATTCAGCCCTTGGAGCTTACTGAATATGCCAAAGACCATGACAATAATGCTGATTTCAGGGAAGATTACTTAAAGCTAACACAAGGGAAGGGAA [서열번호 2]
정방향 프라이머 CACCTACCCATTCCGCACTA [서열번호 11]
역방향 프라이머 TGTCATGGTCTTTGGCATATTCAG [서열번호 12]
대립형질 1 프로브 FAM - TTGTGGCTATGC A AATTCAG - ZNA [서열번호 27]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - ATTGTGGCTATGC G AATTCAG - ZNA [서열번호 28]
3. 거풍(T)/의성, 태백, 대청(C) 03PL09135653_362
TGCAGTCGATCTCCTGCTTCGGAAATGCCCAACAACTCCCTTTTATACTTCAAAGCATCCTTCAATTGTTGCTCACTCAG
[C/T]
TTCCCTTCCCTTGTGTTAGCTTTAAGTAATCTTCCCTGAAATCAGCATTATTGTCATGGTCTTTGGCATATTCAGTAAGCTCCAAGGGCTGAATT
[서열번호 3]
정방향 프라이머 TCAAAGCATCCTTCAATTGTTGC [서열번호 13]
역방향 프라이머 GGAGCTTACTGAATATGCCAAAGAC [서열번호 14]
대립형질 1 프로브 FAM - CACTCAG C TTCCCTT - ZNA [서열번호 29]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - TCACTCAG T TTCCCT - ZNA [서열번호 30]
4. 거풍(T)/의성, 태백, 대청(G) 04PL09135653_414
CTGAGTGAGCAACAATTGAAGGATGCTTTGAAGTATAAAAGGGAGTTGTTG
[G/T]
GCATTTCCGAAGCAGGAGATCGACTGCA [서열번호 4]
정방향 프라이머 GTGAGCAACAATTGAAGGATGC [서열번호 15]
역방향 프라이머 CAGTCGATCTCCTGCTTCGG [서열번호 16]
대립형질 1 프로브 FAM - AAGGGAGTTGTTG G GCATT - ZNA [서열번호 31]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - AAAGGGAGTTGTTG T GCATTT - ZNA [서열번호 32]
5. 의성(C)/거풍, 태백, 대청(T) 05PL09333179_35
TGCAGTTTCAGCCAATCTTGCATAAGCAGTTGCTTGGCTGTGCAAATTGGTTGAACCAGATGTTTGGAAACTATAGTTCTGCAAAAGATG
[C/T]
GTAGGCATACAAAAATTAAGATGATGCAAAGTTGGTATTCCATGAAAAAAATTGTAGACCG
정방향 프라이머 TGGCTGTGCAAATTGGTTGAA [서열번호 17]
역방향 프라이머 CATGGAATACCAACTTTGCATCATC [서열번호 18]
대립형질 1 프로브 FAM - TCTGCAAAAGATG C GTAGG - ZNA [서열번호 33]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - TGCAAAAGATG T GTAGGCA - ZNA [서열번호 34]
6. 태백&대청(C)/의성&거풍(A) 06PL09789905_294
TATCTGCCATCCTAGTGAATGAGTATCTTATCAGAAGGACCAGTTTGGGTAAAGAAATTAAATTCATGACCCTATTGCACCTGAAAGATC
[C/A]
TAAGAGCAACCACAAAGATTATAGATGTTATAAAGATGTAGAAGATTGTATGGGAGAGTGGCCACCG [서열번호 6]
정방향 프라이머 GAAGGACCAGTTTGGGTAAAGAA [서열번호 19]
역방향 프라이머 GGCCACTCTCCCATACAATC [서열번호 20]
대립형질 1 프로브 FAM - CCTGAAAGATC A TAAGAGCA - ZNA [서열번호 35]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - CCTGAAAGATC C TAAGAGC - ZNA [서열번호 36]
7. 태백&대청(T)/의성&거풍(C) 07PL09789905_314
AAGAAATTAAATTCATGACCCTATTGCACCTGAAAGATCCTAAGAGCAACCACAAAGAT
[T/C]
ATAGATGTTATAAAGATGTAGAAGATTGTATGGGAGAGTGGCCACCG [서열번호 7]
정방향 프라이머 CATGACCCTATTGCACCTGAAAG [서열번호 21]
역방향 프라이머 GCCACTCTCCCATACAATCTTC [서열번호 22]
대립형질 1 프로브 FAM - AGCAACCACAAAGAT C ATAGAT - ZNA [서열번호 37]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - AGAGCAACCACAAAGAT T ATAGA - ZNA [서열번호 38]
8. 태백(C)/의성, 거풍, 대청(T) 08PL09435559_255
AGTGCTTTTAGTGGAACTGCTAAGATATGGAGCATGCCTAAAGTTAAAAAGCTTTCTACGTCAAAGGGACACACAGAACGCACTAGTGACGTTGCATTTTCTCCCGTGGACAATTATTTAGCAACTGCCTCTGCAGACAGAACAGCAAAGTTATGGAACAGTGAAGGGACACTGCTGAGGACATTTGAGGGACATCTGGATCGCCTTGCTCGTATTGCATTCCATCCATTGGGGAAGTACTTGGGCACAACTAG
[T/C]
TTTGACAAAACTTGGAGATTATGGGATATCGATACTGGTGTGGAGTTGCTTCTTCAAGAGGGTCACAGTAGGAGTGTTTATGGGTTATCTTTCCACCGTGATGGATCTTTAGCTGCATCTTGTGGTTTGGATTCACTTGCTCGTGTGTGGGACCTTCGGACTGGTAGAAGTATTCTTGCTTTGGAAGGCCATGTTAAGCCGGTGAGACTCCAAACTTATCTGATCCTTCTTTTTATTTAGGAAAAATATATTAATGTGTTTTTTCAG [서열번호 8]
정방향 프라이머 TTCCATCCATTGGGGAAGTA [서열번호 23]
역방향 프라이머 AGATCCATCACGGTGGAAAG [서열번호 24]
대립형질 1 프로브 FAM - CACAACTAG T TTTGACAAAACTT - ZNA [서열번호 39]
대립형질 2 프로브 HEX(Joe) - AACTAG C TTTGACAAAACTTGG - ZNA [서열번호 40]
실시예 4. 실시간 PCR에 의한 작약 품종의 판별 방법
상기 실시예 1에서 수득된 작약 품종 시료의 DNA를 실시간 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 상기 실시예 3에서 설계한 프라이머 및 프로브의 쌍을 이용해 PCR 산물을 수득하였다.
그 결과, 실시예 3에서 설계한 서열번호 1 내지 서열번호 8에 특이적인 프라이머 및 프로브의 쌍들은 각 SNP 위치에 해당하는 작약 품종만을 특이적으로 증폭 및 검출할 수 있음을 확인하였다(도 6 내지 도 13).
본 실시예에서 사용된 5종의 작약 품종의 구별 가능 조합과 형광 신호를 정리하여 도 14에 나타내었다.
<110> KOREA GINSENG CORP.
<120> Genetic Marker Having Single Nucleotide Polymorphism For
Distinguishing Varieties Of Peony
<130> 2020-DPA-3946
<160> 40
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (62)
<223> y is t or c
<400> 1
cggcagtttg gagccaagat gcaaccctcg accactcggt aagcaaacaa gaaagaaagg 60
tygcattttt gagcaggttt ggcaaattaa aagtgacttc aaagccactc atggccattt 120
agaaagcctg gtggaggagg ttagaaaggc acttacaaaa ggtaaatcta tccaaataga 180
ccttagtcac actgc 195
<210> 2
<211> 167
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (72)
<223> r is g or a
<400> 2
cggagatacc ataagctttg ttgatatgct ttccaggcca cctacccatt ccgcactaat 60
tgtggctatg craattcagc ccttggagct tactgaatat gccaaagacc atgacaataa 120
tgctgatttc agggaagatt acttaaagct aacacaaggg aagggaa 167
<210> 3
<211> 176
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (81)
<223> y is t or c
<400> 3
tgcagtcgat ctcctgcttc ggaaatgccc aacaactccc ttttatactt caaagcatcc 60
ttcaattgtt gctcactcag yttcccttcc cttgtgttag ctttaagtaa tcttccctga 120
aatcagcatt attgtcatgg tctttggcat attcagtaag ctccaagggc tgaatt 176
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (52)
<223> k is g or t
<400> 4
ctgagtgagc aacaattgaa ggatgctttg aagtataaaa gggagttgtt gkgcatttcc 60
gaagcaggag atcgactgca 80
<210> 5
<211> 152
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (91)
<223> y is t or c
<400> 5
tgcagtttca gccaatcttg cataagcagt tgcttggctg tgcaaattgg ttgaaccaga 60
tgtttggaaa ctatagttct gcaaaagatg ygtaggcata caaaaattaa gatgatgcaa 120
agttggtatt ccatgaaaaa aattgtagac cg 152
<210> 6
<211> 158
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (91)
<223> m is a or c
<400> 6
tatctgccat cctagtgaat gagtatctta tcagaaggac cagtttgggt aaagaaatta 60
aattcatgac cctattgcac ctgaaagatc mtaagagcaa ccacaaagat tatagatgtt 120
ataaagatgt agaagattgt atgggagagt ggccaccg 158
<210> 7
<211> 107
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (60)
<223> y is t or c
<400> 7
aagaaattaa attcatgacc ctattgcacc tgaaagatcc taagagcaac cacaaagaty 60
atagatgtta taaagatgta gaagattgta tgggagagtg gccaccg 107
<210> 8
<211> 522
<212> DNA
<213> Paeonia lactiflora
<220>
<221> allele
<222> (255)
<223> y is t or c
<400> 8
agtgctttta gtggaactgc taagatatgg agcatgccta aagttaaaaa gctttctacg 60
tcaaagggac acacagaacg cactagtgac gttgcatttt ctcccgtgga caattattta 120
gcaactgcct ctgcagacag aacagcaaag ttatggaaca gtgaagggac actgctgagg 180
acatttgagg gacatctgga tcgccttgct cgtattgcat tccatccatt ggggaagtac 240
ttgggcacaa ctagytttga caaaacttgg agattatggg atatcgatac tggtgtggag 300
ttgcttcttc aagagggtca cagtaggagt gtttatgggt tatctttcca ccgtgatgga 360
tctttagctg catcttgtgg tttggattca cttgctcgtg tgtgggacct tcggactggt 420
agaagtattc ttgctttgga aggccatgtt aagccggtga gactccaaac ttatctgatc 480
cttcttttta tttaggaaaa atatattaat gtgttttttc ag 522
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 1
<400> 9
caaccctcga ccactcggta ag 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 1
<400> 10
ggccatgagt ggctttgaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 2
<400> 11
cacctaccca ttccgcacta 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 2
<400> 12
tgtcatggtc tttggcatat tcag 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 3
<400> 13
tcaaagcatc cttcaattgt tgc 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 3
<400> 14
ggagcttact gaatatgcca aagac 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 4
<400> 15
gtgagcaaca attgaaggat gc 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 4
<400> 16
cagtcgatct cctgcttcgg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 5
<400> 17
tggctgtgca aattggttga a 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 5
<400> 18
catggaatac caactttgca tcatc 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 6
<400> 19
gaaggaccag tttgggtaaa gaa 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 6
<400> 20
ggccactctc ccatacaatc 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 7
<400> 21
catgacccta ttgcacctga aag 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 7
<400> 22
gccactctcc catacaatct tc 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for SEQ ID NO: 8
<400> 23
ttccatccat tggggaagta 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for SEQ ID NO: 8
<400> 24
agatccatca cggtggaaag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 1
<400> 25
caagaaagaa aggtcgcatt 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 1
<400> 26
aaacaagaaa gaaaggttgc attt 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 2
<400> 27
ttgtggctat gcaaattcag 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 2
<400> 28
attgtggcta tgcgaattca g 21
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 3
<400> 29
cactcagctt ccctt 15
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 3
<400> 30
tcactcagtt tccct 15
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 4
<400> 31
aagggagttg ttgggcatt 19
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 4
<400> 32
aaagggagtt gttgtgcatt t 21
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 5
<400> 33
tctgcaaaag atgcgtagg 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 5
<400> 34
tgcaaaagat gtgtaggca 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 6
<400> 35
cctgaaagat cataagagca 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 6
<400> 36
cctgaaagat cctaagagc 19
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 7
<400> 37
agcaaccaca aagatcatag at 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 7
<400> 38
agagcaacca caaagattat aga 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 1 probe for SEQ ID NO: 8
<400> 39
cacaactagt tttgacaaaa ctt 23
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> allele 2 probe for SEQ ID NO: 8
<400> 40
aactagcttt gacaaaactt gg 22
Claims (20)
- 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 단일염기다형성(SNP) 위치, 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치, 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치, 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치, 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치, 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치, 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 작약 품종의 판별용 유전자 마커.
- 청구항 1에 있어서,
상기 유전자 마커는 의성, 거풍, 태백, 및 대청의 4개의 작약 품종을 구별하기 위한 것인 유전자 마커. - 청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 95개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 78개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 115개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 74개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 101개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 121개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 SNP 위치인 60번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 89개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 144개의 연속된 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커. - 청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 SNP 위치인 60번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 뉴클레오티드를 포함하는 18개 내지 24개의 연속된 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커. - 청구항 2에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 22 내지 116번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기 서열의 39 내지 116번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 염기 서열의 50 내지 164번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 염기 서열의 5 내지 78번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5의 염기 서열의 78 내지 135번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기 서열의 34 내지 154번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7의 염기 서열의 14 내지 102번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기 서열의 220 내지 363번째 위치의 연속된 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커. - 청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 SNP 위치인 62번째 염기가 의성 품종은 T이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 2의 염기 서열의 SNP 위치인 72번째 염기가 거풍 품종은 A이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G이며, 서열번호 3의 염기 서열의 SNP 위치인 81번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 4의 염기 서열의 SNP 위치인 52번째 염기가 거풍 품종은 T이고 의성, 태백, 및 대청 품종은 G이며, 서열번호 5의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 염기가 의성 품종은 C이고 거풍, 태백, 및 대청 품종은 T이며, 서열번호 6의 염기 서열의 SNP 위치인 91번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 A이고 태백 및 대청 품종은 C이며, 서열번호 7의 염기 서열 중 SNP 위치인 60번째 염기가 의성 및 거풍 품종은 C이고 태백 및 대청 품종은 T이며, 서열번호 8의 염기 서열의 SNP 위치인 255번째 염기가 태백 품종은 C이고 의성, 거풍, 및 대청 품종은 T인 유전자 마커. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 작약 품종의 판별용 프라이머 세트.
- 청구항 7에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 그 상보적인 염기 서열에 결합하여 상기 유전자 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트. - 청구항 8에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기 서열의 62번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 제1 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열로 구성된 제2 프라이머의 쌍; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 11의 염기 서열로 구성된 제3 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열로 구성된 제4 프라이머의 쌍; 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 13의 염기 서열로 구성된 제5 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열로 구성된 제6 프라이머의 쌍; 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 15의 염기 서열로 구성된 제7 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열로 구성된 제8 프라이머의 쌍; 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 17의 염기 서열로 구성된 제9 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열로 구성된 제10 프라이머의 쌍; 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 19의 염기 서열로 구성된 제11 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열로 구성된 제12 프라이머의 쌍; 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 21의 염기 서열로 구성된 제13 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열로 구성된 제14 프라이머의 쌍; 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 23의 염기 서열로 구성된 제15 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열로 구성된 제16 프라이머의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍의 조합을 포함하는 프라이머 세트. - 청구항 9에 있어서,
제1 프라이머 내지 제16 프라이머를 모두 포함하는 프라이머 세트. - 청구항 7의 프라이머 세트를 포함하는 작약 품종의 판별용 PCR 조성물.
- 청구항 7의 프라이머 세트 또는 청구항 11의 PCR 조성물을 포함하는 작약 품종의 판별용 키트.
- 청구항 12에 있어서,
작약 품종의 판별용 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 키트. - 청구항 13에 있어서,
상기 프로브의 5' 말단에 리포터(Reporter)가 부착되어 있거나, 상기 프로브의 3' 말단에 퀀쳐(Quencher)가 부착되어 있는 키트. - 청구항 13에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 62번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 25의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 26의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍; 서열번호 2의 염기 서열의 72번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 27의 염기 서열로 구성된 제3 프로브 및 서열번호 28의 염기 서열로 구성된 제4 프로브의 쌍; 서열번호 3의 염기 서열의 81번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 29의 염기 서열로 구성된 제5 프로브 및 서열번호 30의 염기 서열로 구성된 제6 프로브의 쌍; 서열번호 4의 염기 서열의 52번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 31의 염기 서열로 구성된 제7 프로브 및 서열번호 32의 염기 서열로 구성된 제8 프로브의 쌍; 서열번호 5의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 33의 염기 서열로 구성된 제9 프로브 및 서열번호 34의 염기 서열로 구성된 제10 프로브의 쌍; 서열번호 6의 염기 서열의 91번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 35의 염기 서열로 구성된 제11 프로브 및 서열번호 36의 염기 서열로 구성된 제12 프로브의 쌍; 서열번호 7의 염기 서열의 60번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 37의 염기 서열로 구성된 제13 프로브 및 서열번호 38의 염기 서열로 구성된 제14 프로브의 쌍; 및 서열번호 8의 염기 서열의 255번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 39의 염기 서열로 구성된 제15 프로브 및 서열번호 40의 염기 서열로 구성된 제16 프로브의 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브 쌍의 조합을 포함하는 키트. - 청구항 15에 있어서,
각각의 유전자 마커에 대한 프로브의 쌍에는 서로 다른 리포터가 결합되어 있는 키트. - 청구항 16에 있어서,
상기 리포터는 Hex, Joe, Fam, 플루오레신, 플루오레신 클로로트리아지닐, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민, FITC, 오레곤 그린, 알렉사 플루오로, ROX, 텍사스 레드, TET, TRITC, TAMRA, 시아닌 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌 염료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트. - 1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 7의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하는 작약 품종의 판별 방법. - 청구항 18에 있어서,
3) 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함하는 방법. - 청구항 18에 있어서,
상기 작약 품종은 의성, 거풍, 태백, 및 대청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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| KR1020210190647A KR20230100949A (ko) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 작약의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 |
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| KR20200069249A (ko) | 2018-12-06 | 2020-06-16 | 한국생명공학연구원 | 작약 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
-
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