KR20220152470A - 마 속 식물의 엽록체 유전체 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마(산약) 속 식물 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 5종의 마 속 식물 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 마 속 식물 5종의 판별 방법, 및 마 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 산약의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 산약의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 산약의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 산약의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
Description
본 발명은 마(산약) 속 식물 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 5종의 마 속 식물 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 마 속 식물 5종의 판별 방법, 및 마 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
마는 다년성 초본으로 덩굴성이고 지하경(tuber)을 가지며, 자웅이주 식물로 마과에 속한다. 마는 산에서 나는 약이라 하여 '산약'으로도 불리운다. 마는 형태적 가소성이 높아, 동일 품종도 재배 환경에 따라서 덩이줄기의 모양이 다양하게 나타나 다른 종류의 마를 식별하는 데 어려움이 가중된다. 따라서, 지상부의 형태적 특성과 땅속 줄기의 육질이 비슷하고 모양이 크게 다르지 않으면, 동일 품종일 가능성이 상당히 높다. 그러나 토착 품종을 재배하는 경우도 있고, 우량 종서를 자력으로 확보하는 경우도 있어서, 실제로 품종이 달라 부르는 이름이 다를 수도 있다. 더욱이, 최근에는 국가간의 왕래가 활발해짐에 따라 다양한 종류의 마가 외국으로부터 도입되고 있다. 이러한 상황은 상품의 유통에도 혼란이 있을 수 있을 뿐만 아니라, 마 유전자원의 확보와 관리는 물론 새로운 품종의 육종에도 상당한 혼동을 초래할 수 있다. 그러므로, 유전체 특성을 파악하여 품종 간의 차이를 확인할 필요가 있고, 더 나아가 유전자원 관리의 효율화와 신품종 개발을 위해 더 효율적이고 객관적인 구별 수단이 필요하다.
일반적으로 절편 형태로 유통되는 약용 식물의 특성상 외형적인 특징으로 기원식물을 구분하기가 매우 어렵기 때문에 위품 또는 다른 종과의 혼용 문제가 일어나고 있다. 이를 해결하기 위해 보다 체계적이고 과학적인 종(species) 판별 기술이 요구되고 있으며, 이에 가장 적합한 방법은 DNA 수준에서 종(species)을 식별할 수 있는 분자마커를 활용하는 것이다.
기존의 분자마커를 이용한 식물 DNA 바코딩의 경우 엽록체 유전체에서 변이가 많다고 알려진 rbcL, matK, trnH-GUG-pabA와 같은 특정 유전자나 유전자간 부위(intergenic region) 서열의 일부만을 대상으로 개발되어 왔다. 그러나 이들 지역을 증폭하기 위해서 사용되는 보편적인 바코딩 프라이머(universal barcoding primer)는 식물 종에 따라 PCR 증폭 효율이 떨어지거나 증폭이 되지 않는 문제점이 있으며, 증폭이 되었다 할지라도 염기서열의 다형성이 존재하지 않을 수 있는 문제점이 있다. 또한 이들 고변이 지역은 식물에 따라서는 동일한 종내에서도 변이가 발견되는 경우가 있어 동일종을 다른 종으로 구분할 수 있는 가능성을 내포하고 있다.
현재까지 DNA 수준에서 한약재로 널리 사용되고 있는 산약(마)의 기원종을 대상으로 한 판별법은 보고된 바 없으며, 이에, 본 발명자들은 엽록체 유전체의 일부 지역이 아닌 엽록체 전장 유전체 서열을 분석하여 마 속 주요 5종간의 다형성이면서 보다 신뢰할 수 있는 변이 지역을 탐색하여 기원종을 구별하는 분자마커를 개발하고, 좀 더 실용적인 산약(마)의 기원종 판별 기법을 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 마 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.
상세하게는, 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 5종의 마 속(genus) 식물의 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 마 속 식물 5종의 판별 방법, 및 마 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 마 속(Dioscorea) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica)를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 15로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 21로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 프로브; 서열번호 16으로 표시되는 프로브; 서열번호 19로 표시되는 프로브; 서열번호 22로 표시되는 프로브; 및 서열번호 25로 표시되는 프로브;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 150번째 또는 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 산약(마)의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 산약의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.
도 1은 마의 완전한 엽록체 유전체를 보여주는 도면이다. 여기에서, 유색 박스는 유전자 산물의 기능에 근거하여 분류된 보존된 엽록체 유전자를 나타낸 것이다. 또한, 원의 안쪽에 위치한 유전자는 반시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이며, 원의 바깥에 위치한 유전자는 시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이다. 한편, 안쪽 원의 점선 지역은 엽록체 게놈의 GC 함량을 의미한다.
도 2는 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 5종을 대상으로 FenDEL-qPCR 방법으로 분석한 5개 분자마커 별 증폭곡선 및 +, - 형질 판단 결과를 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭 곡선 중에서 파랑색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색 선은 각 마커의 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, 각 마커별 +, - 형질 판단은 내부 대조구(파랑색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)과 SNP 마커(빨강색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하는 것으로서, 이는 즉 SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 5종에 대한 5개의 SNP 마커의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 2는 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 5종을 대상으로 FenDEL-qPCR 방법으로 분석한 5개 분자마커 별 증폭곡선 및 +, - 형질 판단 결과를 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭 곡선 중에서 파랑색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색 선은 각 마커의 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, 각 마커별 +, - 형질 판단은 내부 대조구(파랑색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)과 SNP 마커(빨강색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하는 것으로서, 이는 즉 SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 5종에 대한 5개의 SNP 마커의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
본 발명은 5종의 마(산약) 속 식물, 즉 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica)의 엽록체 유전체 서열을 완전 해독하고, 이를 기반으로 한 종간 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 마 속 식물 5종의 판별 방법, 및 마 속의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 마 속(Dioscorea) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica)를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드는 각 염기서열 내에서 150번째 또는 151번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 다형성 뉴클레오티드로, 상기 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 대한 SNP 다형성 염기 정보는 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP; 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 T인 SNP; 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 C인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물에 있어서, SNP 다형성을 포함하는 서열번호 3, 4, 5, 6, 9 및 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 마 속 식물 5종 중에서 마(Dioscorea batatas)를 구별할 수 있고; 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 마 속 식물 5종 중에서 중국산 마(Dioscorea opposita)를 구별할 수 있으며; 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 마 속 식물 5종 중에서 참마(Dioscorea japonica)를 구별할 수 있으며; 서열번호 1, 2, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 마 속 식물 5종 중에서 단풍마(Dioscorea quinqueloba)를 구별할 수 있으며; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 마 속 식물 5종 중에서 부채마(Dioscorea nipponica)를 구별할 수 있다(도 2 및 도 3 참조).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 15로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 21로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "구별"은 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 5종의 마 속 식물 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 품종의 다양성을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '판별'과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX이다. 표적 서열의 증폭 시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 프로브; 서열번호 16으로 표시되는 프로브; 서열번호 19로 표시되는 프로브; 서열번호 22로 표시되는 프로브; 및 서열번호 25로 표시되는 프로브;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로브(probe)"란 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프로브는 DNA 폴리머레이즈의 FEN (Flap endonuclease) 특이도를 이용하는 RT-PCR 기반의 대립유전자 특이 프로브로서, 프로브는 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다.
전술한 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10개 이상, 바람직하게는 10-100개의 연속 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, "실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 일치되는 서열 뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
전술한 프라이머 세트 및 프로브 세트 중 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 13으로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 1 또는 2 (ID: SNP#1)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) A와 C를, 서열번호 14 및 15로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 16으로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 3 또는 4 (ID: SNP#3)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) A와 G를, 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 19로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 5 또는 6 (ID: SNP#4)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) C와 T를, 서열번호 20 및 21로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 22로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 7 또는 8 (ID: SNP#5)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) C와 T를, 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 9 또는 10 (ID: SNP#6)의 150번째 염기인 단일염기다형성(SNP) T와 C를 구별하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 키트는 내부 대조구인 rbcL 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 26 및 27로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 28로 표시되는 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트로서, 전술한 내부 대조구와 함께 증폭되는 것을 특징으로 하는 한약재 산약 기원 식물 및 원산지 구별용 키트일 수 있다.
상기 키트는 5개의 SNP 마커(SNP#1, SNP#3, SNP#4, SNP#5, SNP#6)를 분석하기 위한 중합효소의 플랩 엔도뉴클레아제(flap endonuclease) 활성 억제 원리가 적용된 대립유전자 특이 실시간중합효소연쇄반응(FenDEL-qPCR)법을 이용하여, 5개의 SNP 마커의 증폭 유무 조합으로 한약재 산약 기원 식물 및 원산지를 판정할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 마 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상술한 프라이머 세트 및 상술한 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 마 속 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 분리된 마 속 식물 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 마 속 식물 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 150번째 또는 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 식물 재료 준비
한약재 산약(마)의 기원 식물종 및 원산지 구별 마커를 개발하고자, 식물 재료로서 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica) 각 1점씩을 한국한의약진흥원으로부터 수집하고, 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)을 통해 상기 5종의 마 속에 대한 엽록체 유전체의 염기서열을 분석하였다.
마커 검증을 위한 검증 시료로서 마는 1개 집단(국립생물자원관 분양) 5점, 중국산 마는 5개 집단(시중 유통 한약재) 19점, 참마는 5개 집단(국내 채집) 26점, 단풍마는 2개 집단(국립생물자원관 분양/국내 채집) 20점, 부채마는 5개 집단(국내 채집) 40점, 총 22개 집단, 115개체를 이용하였다(표 1 참조).
하기 표 1에 마커 개발에 사용된 시료를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 종류 | 출처(집단) | 시료 성상 |
수량 | ID | |
| 1 | 기준시료 | 단풍마 | 한국한의약진흥원 | 종자 | 1 | TKMII-11-4 |
| 2 | 검증시료 | 단풍마 | 생물자원관(9~23) | 잎(생체) | 15 | TKMII-11-4-2 |
| 3 | 검증시료 | 단풍마 | 신안(31~35) | 잎(생체) | 5 | TKMII-11-4-4 |
| 4 | 기준시료 | 마 | 한국한의약진흥원 | 종자 | 1 | TKMII-11-1 |
| 5 | 검증시료 | 마 | 국립생물자원관(6~10) | 잎(생체) | 5 | TKMII-11-1-2 |
| 6 | 기준시료 | 마(중국산) | 한국한의약진흥원 | 한약재 | 1 | TKMII-11-1C |
| 7 | 검증시료 | 마(중국산) | 한국한의약진흥원 | 뿌리 | 1 | TKMII-11-2 |
| 8 | 검증시료 | 마(중국산) | 한약재(국내)(11~14) | 한약재 | 4 | TKMII-11-1-3 |
| 9 | 검증시료 | 마(중국산) | 한약재(중국) (동광종합물산) (1~5) |
한약재 | 5 | TKMII-11-1C-1 |
| 10 | 검증시료 | 마(중국산) | 한약재(중국) (영창약업사)(6~10) |
한약재 | 5 | TKMII-11-1C-2 |
| 11 | 검증시료 | 마(중국산) | 한약재(중국) (우성생약) (11~15) |
한약재 | 5 | TKMII-11-1C-3 |
| 12 | 기준시료 | 부채마 | 장흥(1~8) | 잎(생체) | 8 | TKMII-11-4-1 |
| 13 | 검증시료 | 부채마 | 평창(24~30) | 잎(생체) | 7 | TKMII-11-4-3 |
| 14 | 검증시료 | 부채마 | 정선(1~11) | 잎(생체) | 11 | TKMII-11-5-1 |
| 15 | 검증시료 | 부채마 | 제천(12~21) | 잎(생체) | 10 | TKMII-11-5-2 |
| 16 | 검증시료 | 부채마 | 양평(22~25) | 잎(생체) | 4 | TKMII-11-5-3 |
| 17 | 기준시료 | 참마 | 한국한의약진흥원 | 뿌리 | 1 | TKMII-11-5 |
| 18 | 검증시료 | 참마 | 장흥(1~5) | 잎(생체) | 5 | TKMII-11-1-1 |
| 19 | 검증시료 | 참마 | 황전(15~18) | 잎(생체) | 4 | TKMII-11-1-4 |
| 20 | 검증시료 | 참마 | 단양(1~3) | 잎(생체) | 3 | TKMII-11-2-1 |
| 21 | 검증시료 | 참마 | 장흥(4~10) | 잎(생체) | 7 | TKMII-11-2-2 |
| 22 | 검증시료 | 참마 | 신안(11~17) | 잎(생체) | 7 | TKMII-11-2-3 |
실시예 2: 게놈 DNA 추출
상기 실시예 1에서 준비된 각 검체의 게놈 DNA는 NucleoSpin Plant Ⅱ(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 게놈 DNA의 양은 Qubit dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen)을 사용하여 측정하였다. 차세대염기서열분석(NGS)용 검체의 DNA 농도는 총 200ng 이상, 마커 검증용 시료는 최소 0.5ng/㎕씩을 준비하였다.
실시예 3: 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)
NEBNext Ultra™ Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina (NEBNext-NGS Kit)를 이용하여 상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 NGS 분석 라이브러리를 제작하였다. NGS 분석 대상 검체별로 구분되는 색인 어댑터를 사용하였고, 세부적인 라이브러리 제작 과정은 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다. 제작된 각 라이브러리는 TapStation HSD5000(Agilent)을 이용하여 상태를 분석하고, NGS 분석 적합성을 판정하였다.
NGS를 이용한 대량의 유전체 염기서열 데이터 생산은 일루미나(Illumina) 플랫폼을 이용하였고, 분석 리드 형태와 길이는 Pair-end, 151 방식으로 분석하였다. 검체 당 1 Gb의 데이터양을 생성하였다.
실시예 4: 5종의 마 속 식물 검체의 엽록체 유전체 염기서열의 조립 및 유전자 예측
상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 분석된, 각 검체의 엽록체 전체 유전체 염기서열은 ㈜제노텍의 '세포소기관 유전체 염기서열 조립 및 검증 시스템'을 이용하여 완성하였다(도 1 참조). 조립 및 검증이 완료된 각 시료의 엽록체 유전체 염기서열의 길이는 마는 153,257bp, 중국산 마는 153,293bp, 참마는 153,255bp, 단풍마는 153,945bp, 부채마는 153,917bp이며(표 2 참조), 각 엽록체 유전체의 유전자 예측 분석 결과 유전자들의 순서와 방향 등이 종간에 매우 잘 보존되어 있음을 확인하였다(도 1 참조). 마 속 식물의 엽록체 유전체는 82~85개의 단백질을 만드는 유전자(CDS), 30~33개의 tRNA 유전자, 및 4개의 rRNA 유전자로 구성되어 있음을 확인하였으며, 구조상으로 1개의 LSC(large single copy region), 1개의 SSC(small single copy region), 및 2개의 IR(inverted repeat region)을 가지고 있음을 확인하였다.
하기 표 2에 각 검체별 엽록체 유전체 염기서열 조립 결과를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 식물명 | ID | 총 리드 (Total reads) |
정렬된 리드 (Aligned reads) |
소기관 게놈 % (Organelle genome %) |
Cov. (x) |
유전체 길이 (bp) | 유전체 형태 |
| 1 | 마 | TKMII-11-1 | 10,318,648 | 254,434 | 2.48 | 253 | 153,257 | 원형 |
| 2 | 마(중국) | TKMII-11-1C | 8,957,362 | 225,704 | 2.55 | 225 | 153,293 | 원형 |
| 3 | 참마 | TKMII-11-5 | 25,634,480 | 187,176 | 0.77 | 184 | 153,255 | 원형 |
| 4 | 단풍마 | TKMII-11-4 | 10,407,038 | 213,946 | 3.56 | 364 | 153,945 | 원형 |
| 5 | 부채마 | TKMII-11-4-1 | 2,684,158 | 379,856 | 14.15 | 373 | 153,917 | 원형 |
실시예 5: 종간의 엽록체 유전체 염기서열 변이 분석 및 후보 유전자 마커 선발
마 엽록체(Dioscorea polystachya chloroplast, GenBank DB No. NC037716)의 염기서열 정보를 기준으로, 마 속 식물 5종의 엽록체 유전체 염기서열을 1:1 비교하여 종 및 원산지 구분 마커로 활용 가능한 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism; SNP)과 삽입-결실(InDel) 변이를 분석하였다(표 3 참조).
하기 표 3에 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마의 엽록체 유전체 염기서열 변이를 정리하여 나타내었다.
| 기준 유전체 (GenBank #) |
비교대상 | 유전자 변이(개) | ||
| SNP | InDel | 계 | ||
| NC037716 | 마 | 42 | 32 | 74 |
| 마(중국) | 23 | 14 | 37 | |
| 참마 | 42 | 29 | 71 | |
| 단풍마 | 3,244 | 654 | 3,898 | |
| 부채마 | 3,000 | 524 | 3,524 | |
기준 유전체의 염기서열(GenBank DB No. NC037716)과 비교대상 별 분석 결과를 통합한 후 ㈜제노텍의 'SNP Barcode Generator'를 이용하여 9개의 SNP로 구성된 종 특이 SNP 마커 세트(SNP Barcode marker), 즉 후보 유전자 마커를 선발하였다(표 4 참조).
하기 표 4에 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마 종 특이 SNP 마커 세트를 정리하여 나타내었다.
| SNP# | 유전자좌 (Locus) |
위치* (Position) |
NC037716 | 마 | 중국산 마 | 참마 | 단풍마 | 부채마 |
| SNP1 | matK | 2134 | A | A | A | A | C | A |
| SNP2 | psbK | 6387 | C | C | C | C | T | C |
| SNP3 | rpoC2 | 18602 | A | A | A | A | G | A |
| SNP4 | rpoC1 | 20370 | C | C | T | T | C | C |
| SNP5 | ndhK | 48933 | C | T | C | C | C | C |
| SNP6 | clpP | 70039 | T | C | T | T | T | C |
| SNP7 | ycf1 | 108647 | G | A | A | A | A | A |
| SNP8 | ycf1 | 108659 | G | T | T | T | G | T |
| SNP9 | ycf1 | 112599 | T | G | T | T | T | G |
(위치*: 참조 게놈 엽록체 염기서열 기준 위치)
실시예 6: 검증 시료 집단별 후보 유전자 마커 검증 및 최종 SNP 마커 선발
상기 실시예 3에서 수행한 NGS 분석법을 이용하여 마커 검증을 위해 준비된 22개 집단, 115점 시료(마 5점, 중국산 마 19점, 참마 26점, 단풍마 20점, 부채마 40점)를 대상으로 각 집단별 9개의 SNP에 대한 유전형을 분석하였으며(표 5 참조), 그 결과를 토대로 5개의 SNP 마커를 한약재 산약의 기원 식물과 원산지를 판별할 수 있는 마커로서 확정하였다(표 6 참조).
하기 표 5에 검증 시료 집단 별 SNP 마커 유전형 분석 결과를 정리하여 나타내었다. 또한, 하기 표 6에 최종 선발된 SNP 분자마커와 유전형을 정리하여 나타내었다.
| 종류 | 집단 ID | SNP01 | SNP02 | SNP03 | SNP04 | SNP05 | SNP06 | SNP07 | SNP08 | SNP09 |
| 마 | TKMII-11-1 | A | C | A | C | T | C | A | T | G |
| TKMII-11-1-2 | A | C | A | C | T | C | A | T | G | |
| 마 (중국산) |
TKMII-11-1-3 | A | C | A | T | C | T | A | T | T |
| TKMII-11-1C | A | C | A | T | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-1C-1 | A | C | A | T | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-1C-2 | A | C | A | T | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-1C-3 | A | C | A | T | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-2 | A | C | A | T | C | T | A | T | T | |
| 참마 | TKMII-11-1-1 | A | C | A | C | C | C | A | T | G |
| TKMII-11-1-4 | A | C | A | C | C | C | A | T | G | |
| TKMII-11-5 | A | C | A | C | C | C | A | T | G | |
| TKMII-11-2-1 | A | C | A | C | C | C | A | T | G | |
| TKMII-11-2-2 | A | C | A | C | C | C | A | T | G | |
| TKMII-11-2-3 | A | C | A | C | C | C | A | T | G | |
| 단풍마 | TKMII-11-4 | C | T | G | C | C | T | A | G | T |
| TKMII-11-4-2 | C | T | G | C | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-4-4 | C | T | G | C | C | T | A | T | T | |
| 부채마 | TKMII-11-4-1 | A | T | G | C | C | T | A | T | T |
| TKMII-11-4-3 | A | T | G | C | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-5-1 | A | T | G | C | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-5-2 | A | T | G | C | C | T | A | T | T | |
| TKMII-11-5-3 | A | T | G | C | C | T | A | T | T |
| 구분 | 마 | 중국 마 | 참마 | 단풍마 | 부채마 |
| SNP1 | A | A | A | C | A |
| SNP3 | A | A | A | G | G |
| SNP4 | C | T | C | C(del) | C(del) |
| SNP5 | T | C | C | C | C |
| SNP6 | C | T | C | T | T |
실시예 7: FenDEL-qPCR 기반의 한약재 산약의 기원 식물 및 원산지 판별 키트 개발
FenDEL_qPCR법을 이용하여 각 시료별 SNP 마커 유전형을 분석하고자, 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 프라이머 및 프로브 세트를 이용하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 ㈜제노텍의 올리고뉴클레오티드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다.
하기 표 7에 분자마커 분석용 프라이머 및 프로브 세트를 정리하여 나타내었다.
| 구분 | 마커 ID (Marker ID) |
유전자좌 (Locus) |
프라이머/프로브 서열(5'-3') [Primer/Probe Sequence(5'-3')] |
서열 번호 |
| SNP 마커 세트 (SNP marker set) |
SNP#1 | matK | F: ACTATGGTATCGAATTTCTTAGgAC | 11 |
| R: CTCACCCGCATAGGATTCAG | 12 | |||
| P: FAM-TCTAGCATTTGACTCCTTACCAC-BHQ1 | 13 | |||
| SNP#3 | rpoC2 | F: GAGATTCGTGCCGGAGCtTT | 14 | |
| R: CGGGTGCATGGTATACATTGAT | 15 | |||
| P: FAM-TTAAAGAGAGGGTCCGAAAGCAT-BHQ1 | 16 | |||
| SNP#4 | rpoC1 | F: GGAACTGCAACAATACGTgGC | 17 | |
| R: GGGCTCTATGTATTAACGATCG | 18 | |||
| P: FAM-CTTATTATTGTTAACTATTTTATTTTGCGA-BHQ1 | 19 | |||
| SNP#5 | ndhK | F: TTCCAGTATGAGTACTGCtTC | 20 | |
| R: GCAGTTATAGATGCTATAACGAAAC | 21 | |||
| P: FAM-AGATCGATTTTCCCGTTGAGACA-BHQ1 | 22 | |||
| SNP#6 | clpP | F: TGAGACCAACAAGTTGATTTGAtAC | 23 | |
| R: TGAACCGTATGCATCCAAAGGT | 24 | |||
| P: FAM-TCTTTCTCGATGAAGTCGGTTGA-BHQ1 | 25 | |||
| 내부 대조구 (Internal Control) |
IC | IC-F: CAAATCATTGATACAAATAATATCCAA | 26 | |
| IC-R: CAAGTTTTTTCCTTGACCTTTCC | 27 | |||
| IC-P: TAMRA-TACGCCTTCTAGATAACCTTCG-BHQ2 | 28 |
* 정방향 프라이머: F
* 역방향 프라이머: R
* 프로브: P
또한, FenDEL-qPCR 반응을 위해 SNP 마커 별로 하기 표 8에 나타낸 바와 같은 조건으로 반응물을 제조하고, 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. PCR은 ABI7500 실시간 PCR 시스템(ABI7500 Real-Time PCR System)을 이용하였다.
하기 표 8에 FenDEL-qPCR 분석 반응물 조성 및 반응조건을 정리하여 나타내었다.
| 반응물 조성 | PCR 반응 조건 | ||
| 구분 | 사용량 | ·95℃ - 5분 ·40 사이클: 95℃ - 30초 55℃* - 40초 |
|
| SNP# | (10 pmol/㎕) 정방향 프라이머(F primer) (10 pmol/㎕) 역방향 프라이머(R primer) (5 pmol/㎕) 프로브(Probe) |
1 ㎕ 1 ㎕ 1 ㎕ |
|
| 내부 대조구 (IC) |
(5 pmol/㎕) IC 정방향 프라이머(F primer) (5 pmol/㎕) IC 역방향 프라이머(R primer) (5 pmol/㎕) IC 프로브(Probe) |
1 ㎕ 1 ㎕ 1 ㎕ |
|
| 2ㅧ FenDEL-qPCR Master Mix (0.5 ng/㎕) gDNA PCR 등급 정제수(PCR Grade water) |
10 ㎕ 1 ㎕ 3 ㎕ |
||
| 총량(Total) | 20 ㎕ | ||
실시예 8. SNP 마커 유전형 조합을 이용한 종판별
상기 실시예 7에서 FenDEL-qPCR 방법으로 분석된 5개 SNP 마커별 유전형은 내부 대조구(IC)의 ΔRn 값(y축)을 기준으로 '-' 또는 '+'로 판정 후 '산약 기원 식물 판별표(표 9 참조)'와 비교하여 종을 판별하였다. 각 SNP 마커의 +, - 형질은 FenDEL-qPCR 결과 확인되는 'FAM' 형광(빨강색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)과 'TAMRA' 형광(파랑색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하였다(도 2 참조). 즉, SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하였다.
하기 표 9에 산약(마) 기원 식물 판별표를 정리하여 나타내었다.
구체적으로, FenDEL-qPCR 방법에 의한 분석에 따르면, 5개의 SNP 마커(SNP1, SNP3, SNP4, SNP5, SNP6) 중 SNP3, SNP4, SNP6가 증폭되는 경우 마(Dioscorea batatas)로 판정되고, SNP3, SNP4, SNP5가 증폭되는 경우 중국산 마(Dioscorea opposita)로 판정되었다. 또한, SNP3, SNP4, SNP5, SNP6이 증폭되는 경우 참마(Dioscorea japonica)로 판정되고, SNP1, SNP5가 증폭되는 경우 단풍마(Dioscorea quinqueloba)로 판정되었으며, SNP5가 증폭되는 경우 부채마(Dioscorea nipponica)로 판정되었다. 이를 통해, 한약재 산약 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하다.
<110> National Institute for Korean Medicine Development
<120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of
Dioscorea genus, primer set for discrimination of Dioscorea genus
and uses thereof
<130> PA-20-0259
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#1_matK_A
<400> 1
atccgaccaa atcgatgaat aatatccaaa tctgataaat ttgtccatat tgacttacta 60
atgggatgac cagatacggt acaaaatttc gctttagaca atgatcgaat aagagcaata 120
actgaaacta tggtatcgaa tttcttagta agagtatcta ttaaaaataa attttctagc 180
atttgactcc ttaccacgga aagatttatt agtacatttg aaagataacc cagaaaacag 240
aaagaataat ttgataattg gtttatctga atcctatgcg ggtgagacca aaattgaaaa 300
300
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#1_matK_C
<400> 2
atccgaccaa atcgatgaat aatatccaaa tctgataaat ttgtccatat tgacttacta 60
atgggatgac cagatacggt acaaaatttc gctttagaca atgatcgaat aagagcaata 120
actgaaacta tggtatcgaa tttcttagta cgagtatcta ttaaaaataa attttctagc 180
atttgactcc ttaccacgga aagatttatt agtacatttg aaagataacc cagaaaacag 240
aaagaataat ttgataattg gtttatctga atcctatgcg ggtgagacca aaattgaaaa 300
300
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoC2_A
<400> 3
gctaatatcc ataaatgact tgtttttggt aataaatgaa tattaccata tgagtattcg 60
ggtgcatggt atacattgat actccagtgc atttctccct ctgattcaga ataaatatgc 120
tttcggaccc tctctttaaa atttaaagtg aatgctccgg cacgaatctc ggcaatcaat 180
tgttctgatt ccacatattg accattttga actaaaatca aaccttttgg cggaatattc 240
agattatgta taatatcccg accctcaaga gttacataca agtctataga gcataaaaaa 300
300
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoC2_G
<400> 4
gctaatatcc ataaatgact tgtttttggt aataaatgaa tattaccata tgagtattcg 60
ggtgcatggt atacattgat actccagtgc atttctccct ctgattcaga ataaatatgc 120
tttcggaccc tctctttaaa atttaaagtg gatgctccgg cacgaatctc ggcaatcaat 180
tgttctgatt ccacatattg accattttga actaaaatca aaccttttgg cggaatattc 240
agattatgta taatatcccg accctcaaga gttacataca agtctataga gcataaaaaa 300
300
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rpoC1_C
<400> 5
ccaaagattc atattgaatt tcgatgggaa cttctcttga gccaatgaca cgttgatcta 60
gtcgccaccg gagccacaaa ggactatcta aatcgattcg tttttgccga taagctccaa 120
gtgcatcata ggaactgcaa caatacgtcg ctttcatttt catatagtta tacttattat 180
tgttaactat tttattttgc gaatttctgc aattatatgt attataccta tttgcacaaa 240
tacctcgacg attcccgatc gttaatacat agagcccaat aagcatatct tgggttggta 300
300
<210> 6
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rpoC1_T
<400> 6
ccaaagattc atattgaatt tcgatgggaa cttctcttga gccaatgaca cgttgatcta 60
gtcgccaccg gagccacaaa ggactatcta aatcgattcg tttttgccga taagctccaa 120
gtgcatcata ggaactgcaa caatacgtcg ttttcatttt catatagtta tacttattat 180
tgttaactat tttattttgc gaatttctgc aattatatgt attataccta tttgcacaaa 240
tacctcgacg attcccgatc gttaatacat agagcccaat aagcatatct tgggttggta 300
300
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#5_ndhK_C
<400> 7
tattctatac aacaggaccc tgcctaattc actaattcgc gggaagatac tgaatttttg 60
gatttgaaaa atcttttaga agatatctct gaagtatatg atgattgata gaacaatcct 120
tgatcataat ttccagtatg agtactgcgt cgaacatcaa acttgtgatt ggtagtaaaa 180
gatcgatttt cccgttgaga catagcccta tcttcagaga tttctcgaga tatcttctta 240
cgaagtttcg ttatagcatc tataactgcc tctggtttag gggggcagcc cggcaaatag 300
300
<210> 8
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#5_ndhK_T
<400> 8
tattctatac aacaggaccc tgcctaattc actaattcgc gggaagatac tgaatttttg 60
gatttgaaaa atcttttaga agatatctct gaagtatatg atgattgata gaacaatcct 120
tgatcataat ttccagtatg agtactgcgt tgaacatcaa acttgtgatt ggtagtaaaa 180
gatcgatttt cccgttgaga catagcccta tcttcagaga tttctcgaga tatcttctta 240
cgaagtttcg ttatagcatc tataactgcc tctggtttag gggggcagcc cggcaaatag 300
300
<210> 9
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_clpP_T
<400> 9
atgcacatcg ggtggcacaa attgcatagt atcataaatg gccattcctg ggattaccca 60
tccgccggga gagtttataa acaaataaag atccctagta gcatcttcta tactgagata 120
taccatgaga ccaacaagtt gatttgagat ctcattatca acctcttggc ccaaaaaaag 180
taatctttct cgatgaagtc ggttgattag gacaaaattc tatctcccag aaaccgtacg 240
tgcacctttg gatgcatacg gttcaaaaaa aaaattgcga aataaagaat caatgtgtcg 300
300
<210> 10
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_clpP_C
<400> 10
atgcacatcg ggtggcacaa attgcatagt atcataaatg gccattcctg ggattaccca 60
tccgccggga gagtttataa acaaataaag atccctagta gcatcttcta tactgagata 120
taccatgaga ccaacaagtt gatttgagac ctcattatca acctcttggc ccaaaaaaag 180
taatctttct cgatgaagtc ggttgattag gacaaaattc tatctcccag aaaccgtacg 240
tgcacctttg gatgcatacg gttcaaaaaa aaaattgcga aataaagaat caatgtgtcg 300
300
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#1_matK_F
<400> 11
actatggtat cgaatttctt aggac 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#1_matK_R
<400> 12
ctcacccgca taggattcag 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#1_matK_P
<400> 13
tctagcattt gactccttac cac 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoC2_F
<400> 14
gagattcgtg ccggagcttt 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoC2_R
<400> 15
cgggtgcatg gtatacattg at 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#3_rpoC2_P
<400> 16
ttaaagagag ggtccgaaag cat 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rpoC1_F
<400> 17
ggaactgcaa caatacgtgg c 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rpoC1_R
<400> 18
gggctctatg tattaacgat cg 22
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#4_rpoC1_P
<400> 19
cttattattg ttaactattt tattttgcga 30
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#5_ndhK_F
<400> 20
ttccagtatg agtactgctt c 21
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#5_ndhK_R
<400> 21
gcagttatag atgctataac gaaac 25
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#5_ndhK_P
<400> 22
agatcgattt tcccgttgag aca 23
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_clpP_F
<400> 23
tgagaccaac aagttgattt gatac 25
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_clpP_R
<400> 24
tgaaccgtat gcatccaaag gt 22
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP#6_clpP_P
<400> 25
tctttctcga tgaagtcggt tga 23
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Control_IC-F
<400> 26
caaatcattg atacaaataa tatccaa 27
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Control_IC-R
<400> 27
caagtttttt ccttgacctt tcc 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Control_IC-P
<400> 28
tacgccttct agataacctt cg 22
Claims (9)
- 마 속(Dioscorea) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마(Dioscorea batatas), 중국산 마(Dioscorea opposita), 참마(Dioscorea japonica), 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 부채마(Dioscorea nipponica)를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP(single nucleotide polymorphism);
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 C인 SNP;
서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 T인 SNP; 및
서열번호 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 150번째 염기가 C인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함하는, 조성물. - 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 15로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 21로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
- 서열번호 13으로 표시되는 프로브; 서열번호 16으로 표시되는 프로브; 서열번호 19로 표시되는 프로브; 서열번호 22로 표시되는 프로브; 및 서열번호 25로 표시되는 프로브;를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트.
- 제3항의 프라이머 세트, 제4항의 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는, 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 26 및 27로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 28로 표시되는 프로브를 더 포함하는 키트.
- 마 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트 및 제4항의 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법. - 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
각 SNP 위치인 150번째 또는 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 마, 중국산 마, 참마, 단풍마 및 부채마를 포함하는 마 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130045636A (ko) * | 2011-10-26 | 2013-05-06 | 공주대학교 산학협력단 | 작약에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20140106892A (ko) * | 2013-02-27 | 2014-09-04 | 경상북도(농업기술원생물자원연구소장) | Ssr 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법 |
| KR101912196B1 (ko) * | 2017-09-27 | 2018-10-26 | 충북대학교 산학협력단 | 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-05-07 KR KR1020210059305A patent/KR102604100B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130045636A (ko) * | 2011-10-26 | 2013-05-06 | 공주대학교 산학협력단 | 작약에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20140106892A (ko) * | 2013-02-27 | 2014-09-04 | 경상북도(농업기술원생물자원연구소장) | Ssr 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법 |
| KR101543365B1 (ko) | 2013-02-27 | 2015-11-23 | 경상북도(농업기술원생물자원연구소장) | Ssr 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법 |
| KR101912196B1 (ko) * | 2017-09-27 | 2018-10-26 | 충북대학교 산학협력단 | 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 임창건, '한국산 작약속(Paeoia, Paeoniaceae)식물의 유전적 다양성', 대구대학교 대학원 석사논문, 2011. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102604100B1 (ko) | 2023-11-22 |
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