CN116536447B - 一种拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌的微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。利用本发明提供的拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法和特异性引物组对拟平滑念珠菌的型别进行检测，多态性高、特异型好，在拟平滑念珠菌分子流行病学、群体遗传研究等方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。
背景技术
目前，用于拟平滑念珠菌主要分子标记为ITS和扩增片段长度多态性（AFLP）标记等。但这些分子标记的种内多态性较低，无法满足对拟平滑念珠菌的菌株间亲缘关系鉴定、分子溯源、院感监测、群体遗传学等需要。
微卫星（Microsatellite），又称简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）或短串联重复序列（Short tandem repeats，STR），指基因组DNA上的短的串联重复序列，重复单元一般为1-5bp，重复次数为5-40次。通过PCR检测重复区域的长度，可以进行遗传多态性分析。由于微卫星等位基因具有突变速率快的特点，因此该检测方法具有多态性高、特异性好、通量高、成本低等优点，并且在生物遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定等方面已得到广泛应用。然而，目前在病原体方面应用较少。
因此，提出种内高度多态性的微卫星位点分子标记及其检测方法具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度多态性的拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌的微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种拟平滑念珠菌微卫星位点，该拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合。
另一方面，本发明提供了一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、提取拟平滑念珠菌的总DNA；
S2、以所述总DNA为模板，利用荧光标记的引物组在PCR反应体系中进行PCR扩增反应；
S3、对PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段进行多态性检测；
所述拟平滑念珠菌微卫星位点为本公开第一方面所述的拟平滑念珠菌微卫星位点；
所述引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示的反向引物。
可选地，每20μL的PCR反应体系中含有8-12μL的DNA聚合酶、1-3μL的gDNA、0.2-0.4μL的正向引物和0.2-0.4μL的反向引物；
所述正向引物的浓度为18-22μM，所述反向引物的浓度为18-22μM；
其中，所述正向引物的5’端通过荧光染料进行FAM和/或HEX标记。
可选地，步骤S2中，所述PCR扩增反应的反应程序包括：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃40s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃ 10min。
可选地，所述多态性检测包括：利用毛细管电泳检测PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段，通过分子量内标确定所述PCR扩增产物的等位片段的位置和相对分子量。
具体过程包括：将分子量内标与甲酰胺以1：（90-110）的体积比混匀后，取15μL的混合物加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标与各PCR扩增产物峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
另一方面，本发明提供了一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示的反向引物。
另一方面，本发明提供了一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒，所述试剂盒中包含上述用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组。
另一方面，本发明提供了上述拟平滑念珠菌的微卫星位点以及拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。
通过上述技术方案，本发明首次提供了拟平滑念珠菌微卫星位点、该拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法和特异性引物组，利用上述拟平滑念珠菌微卫星位点、检测方法以及特异性引物组进行拟平滑念珠菌的检测，具有多态性高、特异型好、通量高、成本低等优点，在拟平滑念珠菌分子流行病学、群体遗传研究等方面具有重要意义。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是毛细管电泳检测样本CO4位点峰值图。
图2是毛细管电泳检测样本CO11位点峰值图。
图3是毛细管电泳检测样本CO32位点峰值图。
图4是毛细管电泳检测样本CO49位点峰值图。
图5是本公开测定的部分拟平滑念珠菌微卫星位点的基本信息。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明第一方面提供了拟平滑念珠菌微卫星位点，所述拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合。
另一方面，本发明提供了一种拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、提取拟平滑念珠菌的总DNA；
S2、以所述总DNA为模板，利用荧光标记的引物组在PCR反应体系中进行PCR扩增反应；
S3、对PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段进行多态性检测；
所述拟平滑念珠菌微卫星位点为本发明第一方面所述的拟平滑念珠菌微卫星位点；
所述引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示的反向引物。
根据本发明，每20μL的PCR反应体系中含有8-12μL的DNA聚合酶、1-3μL的gDNA、0.2-0.4μL的正向引物和0.2-0.4μL的反向引物；
所述正向引物的浓度为18-22μM，所述反向引物的浓度为18-22μM；
其中，所述正向引物的5’端通过荧光染料进行FAM和/或HEX标记。
根据本发明，所述PCR扩增反应的反应程序包括：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃ 10min；
所述多态性检测包括：利用毛细管电泳检测PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段，通过分子量内标确定所述PCR扩增产物的等位片段的位置和相对分子量。
具体过程包括：将分子量内标与甲酰胺以1：（90-110）的体积比混匀后，取15μL的混合物加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标与各PCR扩增产物峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
另一方面，本发明提供了一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组，该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示的反向引物。
另一方面，本发明提供了一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒，该试剂盒包含上述用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组。
另一方面，本发明提供了所述拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。
下面通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。本发明实施例中涉及的原料、试剂、仪器及设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
实施例1
本实施例用于说明拟平滑念珠菌的种群遗传多样性检测。
1、拟平滑念珠菌的总DNA提取
使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒对48株拟平滑念珠菌进行拟平滑念珠菌总DNA提取，操作流程参照试剂盒说明书进行。拟平滑念珠菌由北京协和医院检验科提供。
2、拟平滑念珠菌的微卫星位点的PCR扩增
利用本发明的特异性引物组对上述提取的48株拟平滑念珠菌的总DNA进行扩增。特异性引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.9-12所示的反向引物，具体如表1所示；使用荧光染料对正向引物的5’端进行FAM或HEX标记。
PCR反应体系为20μL，其中含有ddH2O 7.4μL，DNA聚合酶10μL，正向引物0.3μL（20uM），反向引物0.3μL（20μM），DNA模板2μL；
SSR PCR扩增程序：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 50s，10个循环；94℃30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃10min。
3、毛细管电泳方法进行多态性检测：将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小，举例结果如图1-4所示，确定4个STR位点为真实存在的多态性位点。
DNA序列测序鉴定：将所测得序列与NCBI基因组序列进行比对，测序结果与STR位点序列SEQ ID NO.1-4一致，确定4个STR位点为真实存在的多态性位点。
表1 拟平滑念珠菌的微卫星位点分子标记的基本信息
4、检测结果
利用所选拟平滑念珠菌4个微卫星位点分子标记对中国医院侵袭性真菌监测网（CHIF-NET）项目2017-2019年收集到的48株拟平滑念珠菌以及标准菌株ATCC96139进行分型，成功将49株菌分为12个型别，其结果如下（如图5所示）：COMT1型1株，COMT2型1株，COMT3型1株，COMT4型1株，COMT5型13株，COMT6型3株，COMT7型3株，COMT8型2株，COMT9型1株，COMT10型1株，COMT11型1株，COMT12型21株。利用此分型方法，检测到两家医院存在暴发现象，分别为H09医院COMT5型的暴发，检出10株，H18医院COMT12型的暴发，检出3株。该检测结果表明，本发明的4个微卫星位点是真实有效的，能够用于拟平滑念珠菌的分子分型，并且获得了较好的分型效果，对于拟平滑念珠菌临床流行病学及院感监测具有重要意义。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1、提取拟平滑念珠菌的总DNA；
S2、以所述总DNA为模板，利用荧光标记的引物组在PCR反应体系中进行PCR扩增反应；
S3、对PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段进行多态性检测；
所述拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合；
所述引物组为核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.9-12所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每20μL的PCR反应体系中含有8-12μL的DNA聚合酶、1-3μL的gDNA、0.2-0.4μL的正向引物和0.2-0.4μL的反向引物；
所述正向引物的浓度为18-22μM，所述反向引物的浓度为18-22μM；
其中，所述正向引物的5’端通过荧光染料进行FAM和/或HEX标记。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应程序包括：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃ 10min；
所述多态性检测包括：利用毛细管电泳检测PCR扩增产物中的荧光标记DNA片段，通过分子量内标确定所述PCR扩增产物的等位片段的位置和相对分子量。
4.一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组，其特征在于，所述引物组为核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9-12所示的反向引物；
所述拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合。
5.一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求4所述的用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组。
6.权利要求1-3中任一项所述的检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。
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