CN115735902A - 一种细胞保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法和应用，涉及细胞生物学和医学检测技术领域。该细胞保存液包括缓冲液、抗凝剂、非离子型表面活性剂、离子型去垢剂、渗透压维持剂和防腐剂，本发明还提供了一种细胞保存液的制备方法及其在细胞保存中的应用，细胞经该细胞保存液保存后进行核酸提取，能够有效获得高质量的核酸产物，为低样本量的核酸检测提供更高的检测灵敏度，同时该细胞保存液在室温下性能稳定，有效延长了样本的保存周期。

Description

一种细胞保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学和医学检测技术领域，具体涉及一种细胞保存液及其制备方法和应用。

背景技术

核酸的分离是现代科学的重要成果之一，它给人类生活带来了巨大的进步。随着高通量和自动化提取技术的应用，大大简化了核酸的分离过程。当前的核酸检测技术在环境监测、疾病的筛查或诊断方面有着广泛的应用，并可以对癌症患者的术后复发情况进行监测，为临床医生及时做出诊断并在指导用药方面提供重要的参考。如HPV核酸检测在宫颈癌筛查中发挥着很大的作用，并在宫颈癌预防的各个领域均已得到证实。同时，Hp的核酸检测在胃病诊断方面也发挥着重要的作用，在诊断患者感染Hp的同时,根据患者基因突变情况指导临床医生合理进行用药。

在现有市场上，检测病原体、组织及血液等样本核酸的方法主要有聚合酶链式反应技术、基因芯片、原位杂交和各种测序等技术手段。无论运用哪种技术方法进行核酸检测，需尽可能获得高质量的核酸产物，尤其在样本量较低的情况下对核酸回收显得尤为重要。但当前市场对核酸回收的影响主要是从提取试剂的角度进行考量，却经常忽视不同的保存方法对同一样本回收效率的影响。

因此，在核酸检测领域中细胞的保存是至关重要的，因为它将直接影响核酸的质量和后续的检查结果。目前国内外许多厂家已经研发出多种细胞保存液来保证细胞的活性及细胞中DNA的完整性。但大多数的细胞保存液用于细胞学检测，能够很好地保存细胞结构，却对于核酸的保存质量存在一定的不足。并且现有大多数细胞保存液样本保存时间较短，核酸降解严重，导致检出率较低而影响检测结果的判断。

在公开号为CN101999343A的专利申请中，提供了一种细胞保存液，包括固定剂、固定剂辅助剂、抗凝剂、缓冲液、以及离子维持剂，其中：固定剂为甲醇、乙醇或异丙醇(45％-60％，v/v)、固定剂辅助剂为醋酸或醋酸盐(0.1％-15％，w/w)、抗凝剂为EDTA或EDTA的水溶性盐(0.01％-1.5％，w/w)、缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等、以及离子维持剂为NaCl或KCl(0.01％-1％，w/w)，虽然能够有效地保存DNA，但保存时间不够长，核酸回收质量较低。

在公开号为CN114097771A的专利申请中，提供了一种细胞保存液，包括质量浓度为0.002％-0.01％的热休克蛋白、体积分数为0.2％-3％的200mM的谷氨酰胺、质量浓度为1％-5％的依达拉奉、质量浓度为1％-3％的海藻糖含量为和体积分数为93％-98％的磷酸盐缓冲液，可以有效地保护细胞活性，但在2-8℃下保存时间较短，核酸回收质量偏低。

基于上述问题，本发明提供了一种细胞保存液，该细胞保存液能够有效的获得高质量的核酸产物，为低样本量的核酸检测提供更高的检测灵敏度。同时该试剂在室温下性能稳定，有效延长了样本的保存周期。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种细胞保存液及其制备方法和应用。本发明提供的细胞保存液在相同条件下能够有效保护细胞内核酸功能完整性，并获得较高的核酸质量，在室温条件下可稳定保存细胞核酸长达9个月。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种细胞保存液。

具体地，所述的细胞保存液包括缓冲液、抗凝剂、非离子型表面活性剂、离子型去垢剂、渗透压维持剂和防腐剂。

优选地，所述的细胞保存液包括3％-7％的缓冲液，3％-7％的抗凝剂，0.5％-2％的非离子型表面活性剂，0.15％-0.3％的防腐剂，1.5-3.5g/L的脱氧胆酸钠和8-10g/L的氯化钠或氯化钾。

优选地，所述的细胞保存液的pH为7.8-8.2。

优选地，所述的非离子型表面活性剂包括NP-40、辛基酚聚氧乙烯醚、甘油或聚乙二醇中的任意一种或几种；

所述的离子型去垢剂包括山梨醇、十二烷基璜酸钠、脱氧胆酸钠或吐温20中的任意一种或几种；

所述的缓冲液包括硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或Tris-HCl中的任意一种或几种；

所述的抗凝剂包括肝素、枸橼酸盐、草酸钾或EDTA中的任意一种或多种；

所述的渗透压维持剂包括葡萄糖、氯离子、磷酸盐或枸橼酸盐中的任意一种或几种；

所述的防腐剂包括Proclin950或Proclin300中的任意一种或多种。

进一步优选地，所述的缓冲液包括Tris-HCl，所述的抗凝剂包括EDTA，所述的非离子型表面活性剂为NP-40，所述的离子型去垢剂为脱氧胆酸钠，所述的渗透压维持剂为氯离子，所述的防腐剂为Proclin950或Proclin300。

更进一步优选地，所述的Tris-HCl的浓度为1mol/L，pH为7.5；所述的EDTA的浓度为0.5mol/L，pH为8.0。

又一方面，本发明提供一种细胞保存液的制备方法。

具体地，所述的制备方法包括以下步骤：混合离子型去垢剂、渗透压维持剂、缓冲液、抗凝剂、非离子型表面活性剂和防腐剂，定容，混匀，测定pH。

优选地，所述的定容使用超纯水进行定容，所述的混匀使用垂直旋转混匀仪进项混匀，所述的混匀的条件为：转速20rpm/min，时间为30min。

优选地，所述的pH为7.8-8.2。

又一方面，本发明提供了一种从细胞中提取核酸的方法。

具体地，所述的细胞包括人源细胞系或人源组织脱落细胞，所述的细胞使用上述任一技术方案所述的细胞保存液或上述任一技术方案的制备方法制得的细胞保存液进行保存。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

S1：对细胞进行前处理，得细胞混悬液；

S2：对细胞混悬液进行半自动化提取，得洗脱核酸；

S3：对洗脱核酸进行质量检测。

优选地，所述的步骤S1中前处理包括收集细胞，加入细胞保存液，混悬后保存；所述的前处理包括人源细胞系前处理和组织脱落细胞前处理。

进一步优选地，所述的人源细胞系前处理的方法为：胰酶消化离心收集贴壁细胞，上清离心收集悬浮细胞，合并，DPBS溶液离心清洗，加入细胞保存液，混悬。

进一步优选地，所述的组织脱落细胞前处理的方法为：采集人源组织脱落细胞，加入细胞保存液，混悬。

优选地，所述的步骤S2中半自动化提取的步骤为：

S21：取细胞混悬液依次加入裂解液和蛋白酶K，涡旋混匀15秒后，恒温混匀仪300rpm转速，75℃恒温孵育15分钟，孵育结束后瞬时离心3秒，得待测样本；

S22：在半自动仪器配套深孔板中加入对应试剂，按程序运行仪器；

S23：运行结束，得洗脱核酸。

进一步优选地，所述的S21中，以体积百分比计，细胞混悬液：裂解液：蛋白酶K＝5:15:1。

进一步优选地，所述的S22中对应试剂的加入量为：槽位1：异丙醇300μL+磁珠悬浮液20μL+待测样本570μL；槽位2：结合液600μL；槽位3：漂洗液600μL；槽位4：漂洗液600μL；槽位5：洗脱液40μL。

更进一步优选地，所述的裂解液为异硫氰酸胍、三羟基氨基甲烷、EDTA、TritonX-100和吐温20的混合液；所述的结合液为盐酸胍、三羟基氨基甲烷、EDTA和月桂酰基氨酸钠的混合液；所述的漂洗液为三羟甲基氨基甲烷和无水乙醇的混合液；所述的洗脱液为三羟甲基氨基甲烷和EDTA的混合液。

进一步优选地，所述的S22中程序为：

表1

优选地，所述的步骤S3中质量检测采用实时荧光定量PCR法。

进一步优选地，所述的实时荧光定量PCR法的β-actin PCR扩增体系为：

表2

试剂	起始浓度	反应(μL)
			5×PCR buffer	5×	5
Actin Forward primer(内参上游引物)	10μM	0.5
			Actin reverse primer(内参下游引物)	10μM	0.5
EvaGreen荧光染料	10×	1
			Taq DNA聚合酶	5U/μL	0.2
Mg<sub>2</sub>Cl	25mM	4
			H<sub>2</sub>O	NA	补足25
Template(核酸模板)	NA	5

进一步优选地，所述的实时荧光定量PCR法的反应程序为：95℃，10min运行1cycle；94℃，20s，60℃，50s运行45cycle；4℃，∞运行1cycle。

进一步优选地，所述的实时荧光定量PCR法的上游引物序列为5’-AGAGACCTGACGGACTATCTGATGA-3’，下游引物序列为5’-ATCATATTCCTGCTTGCTGAT-3’。

本发明还提供了一种上述细胞保存液或上述制备方法制备得到的细胞保存液在细胞保存中的应用。

本发明中，术语“Tris-HCl”表示“”；

术语“DPBS”表示“三羟甲基氨基甲烷盐酸盐”；

术语“EDTA”表示“乙二胺四乙酸”；

术语“NP-40”表示“乙基苯基聚乙二醇”；

术语“Proclin”表示“Proclin系列防腐剂”；

本发明中，除特殊说明，百分数均为体积百分比。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

有益效果：与当前已有技术相比具有：

1、本发明提供的细胞保存液在核酸提取时所用样本量较少，半自动化操作简单高效；

2、本发明提供的细胞保存液能够有效的获得高质量的核酸产物，能够有效保护细胞内核酸功能完整性，在低样本量的核酸检测时实现更高的检测灵敏度，而且核酸回收率高；

3、本发明提供的细胞保存液在室温下性能稳定，有效延长了样本的保存周期，在室温条件下可稳定保存细胞核酸长达9个月。

附图说明

图1是实施例1细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图2是实施例2细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图3是实施例3细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图4是对比例1细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图5是对比例2细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图6是对比例3细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图7是对比例4细胞保存液在不同保存时间下细胞样品的核酸检测结果图；

图8是实施例1-3与对比例1-4细胞保存液在不同保存时间下核酸检测的均值结果图，其中example1-3分别表示实施例1-3，HC2表示对比例1，TCT表示对比例2，control 3表示对比例3，control 4表示对比例4。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种有效保护核酸的细胞保存液及其制备方法和应用。本领域技术人员可以参考本文内容通过适当改进部分工艺参数完成实现。

实施例1

100ml细胞保存液组成如下：

表3

序号	名称	单位用量(100mL)工艺参数	功能用途
				1	1M Tris-HCl(pH7.5)	4.5mL	缓冲体系
2	0.5M EDTA(pH8.0)	4.5mL	抗凝剂
				3	NP-40	1.0mL	非离子型表面活性剂
4	脱氧胆酸钠	0.25g	离子型去垢剂
				5	NaCl	0.86g	渗透压维持剂
6	Proclin950	0.2mL	防腐剂
				7	超纯水	定容至100mL	溶剂

配制方法：

(1)用天平称取所需脱氧胆酸钠、NaCl加入到配制容器中(因脱氧胆酸钠极易散发到空气中，切勿让脱氧胆酸钠吸入体内，取用的药勺必须干燥，尽量减少晶体粘附)；

(2)用移液器依次取所需1M Tris-HCl(pH7.5)、0.5M EDTA(pH8.0)、NP-40、Proclin300加入到配制容器中；

(3)称取所需超纯水加入到配制容器中，定容至100mL，盖上盖子，放置垂直旋转混匀仪上，调节转速20rpm/min，混匀30分钟。

(4)用pH计测量溶液pH值为7.6，符合要求。

实施例2

100ml细胞保存液组成如下：

表4

配制方法与实施例1相同。用pH计测量溶液pH值为8.0，符合要求。

实施例3

100ml细胞保存液组成如下：

表5

序号	名称	单位用量(100mL)工艺参数	功能用途
				1	1M Tris-HCl pH7.5	7.0mL	缓冲体系
2	0.5M EDTA pH8.0	7.0mL	抗凝剂
				3	NP-40	0.85mL	非离子型表面活性剂
4	脱氧胆酸钠	0.24g	离子型去垢剂
				5	KCl	0.876g	渗透压维持剂
6	Proclin950	0.20mL	防腐剂
				7	超纯水	定容至100mL	溶剂

配制方法与实施例1相同。用pH计测量溶液pH值为8.0，符合要求。

对比例1

采用德国凯杰HC2细胞保存液：购买厂家为德国凯杰，货号163017123。

对比例2

采用新柏氏液基细胞保存液(TCT)：购买厂家为豪洛捷，货号67561。

对比例3

100ml细胞保存液组成如下：

表6

配制方法与实施例1相同。用pH计测量溶液pH值为7.6，符合要求。

对比例4

100ml细胞保存液组成如下：

表7

序号	名称	单位用量(100mL)工艺参数	功能用途
				1	0.5M Tris-HCl pH7.5	7.0mL	缓冲体系
2	1M EDTA pH8.0	7.0mL	抗凝剂
				3	TX-10	0.85mL	非离子型表面活性剂
4	环糊精	0.24g	离子型去垢剂
				5	KCl	0.876g	渗透压维持剂
6	Proclin950	0.20mL	防腐剂
				7	超纯水	定容至100mL	溶剂

配制方法与实施例1相同。用pH计测量溶液pH值为8，符合要求。

实施例4：核酸提取

采用实施例1-3及对比例1-4的细胞保存液对同一批宫颈脱落细胞进行保存。

操作方法：

(1)细胞处理：用刷子或棉拭子等采集人源脱落细胞；打开采集管盖子，将采集到的脱落细胞分别放进400μL实施例1-3及对比例1-4的细胞保存液中；旋紧管盖，使用移液器重悬5-10次，瞬时离心后室温储存。

(2)核酸提取：取出保存在不同细胞保存液中的细胞样本，取100μL细胞样本加入干净的1.5mL离心管中，在离心管上标注对应的样本信息；向1.5mL离心管中加入300μL裂解液，20μL蛋白酶K，涡旋混匀15秒；恒温混匀仪300rpm转速，75℃恒温孵育15分钟；孵育结束后瞬时离心3秒，得待测样本。

准备半自动仪器配套2mL深孔板，在对应位置加入试剂：槽位1：异丙醇300μL+磁珠悬浮液20μL+待测样本420μL；槽位2：结合液600μL；槽位3：漂洗液600μL；槽位4：漂洗液600μL；槽位5：洗脱液40μL，按表1所述程序运行半自动化提取仪器。

待程序运行结束后，将所得洗脱核酸转移至对应的离心管中。

实施例5：核酸质量检测

检测方法：

在室温条件下进行稳定性实验研究，采用β-Actin检测体系(qPCR法)进行DNA检测按照表2制备实时荧光定量PCR法的β-actin PCR扩增体系，采用上海宏石SLAN96P医用荧光定量PCR仪，设定反应程序为：95℃，10min运行1cycle；94℃，20s，60℃，50s运行45cycle；4℃，∞运行1cycle。

检测结果：

下表为采用实施例1-3及对比例1-4的细胞保存液保存宫颈脱落细胞的中核酸稳定性实验，在不同时间检验点进行样本提取扩增，根据Ct值检测样本稳定性：

表8

结果分析：

表8与图1-3表明，三个实施例的细胞保存液均能有效保护细胞中核酸的完整性，其中以实施例2保护效果最优；

表8与图1-8表明，实施例组的细胞保存液对细胞中核酸的保护效果显著优于对比例；

表8与图1-8表明，除对比例2在第9个月时核酸产物出现明显下降，其余保存液的核酸保存有效期均能达到9个月效期。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种细胞保存液，其特征在于，包括缓冲液、抗凝剂、非离子型表面活性剂、离子型去垢剂、渗透压维持剂和防腐剂；

所述的非离子型表面活性剂包括NP-40、辛基酚聚氧乙烯醚、甘油或聚乙二醇中的任意一种或几种；

所述的离子型去垢剂包括山梨醇、十二烷基璜酸钠、脱氧胆酸钠或吐温20中的任意一种或几种。

2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述的细胞保存液包括3％-7％的缓冲液，3％-7％的抗凝剂，0.5％-2％的非离子型表面活性剂，0.15％-0.3％的防腐剂，1.5-3.5g/L的离子型去垢剂和8-10g/L的渗透压维持剂。

3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述的细胞保存液的pH为7.8-8.2。

4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述的缓冲液包括硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或Tris-HCl中的任意一种或几种；所述的抗凝剂包括肝素、枸橼酸盐、草酸钾或EDTA中的任意一种或多种。

5.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述的渗透压维持剂包括葡萄糖、氯离子、磷酸盐或枸橼酸盐中的任意一种或几种；所述的防腐剂包括叠氮化钠、Proclin950或Proclin300中的任意一种或多种。

6.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述的非离子型表面活性剂为NP-40，所述的离子型去垢剂为脱氧胆酸钠。

7.根据权利要求4所述的细胞保存液，其特征在于，所述的缓冲液为Tris-HCl，所述的抗凝剂为EDTA。

8.根据权利要求5所述的细胞保存液，其特征在于，所述的渗透压维持剂为氯离子，所述的防腐剂为Proclin950或Proclin300。

9.一种权利要求1-8任一项所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：混合离子型去垢剂、渗透压维持剂、缓冲液、抗凝剂、非离子型表面活性剂和防腐剂，定容，混匀，测定pH。

10.一种权利要求1-8任一项所述的细胞保存液或权利要求9所述的细胞保存液的制备方法制备得到的细胞保存液在细胞保存中的应用。

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