CN109762809B - 痰液标本中cfDNA的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA的提取方法领域，提供一种痰液标本中cfDNA的提取方法，其包括制备痰液中的cfDNA的提取样本和将提取样本使用提取cfDNA的试剂盒进行cfDNA的提取，所述痰液中cfDNA的提取样本的制备方法包括如下步骤：1)痰液收集；2)痰液标本质控；3)将痰液标本与化痰液混合，震摇至化痰完全，得到化痰混合液；4)将化痰混合液进行离心处理，分离上清液和底部沉淀，所述上清液即为无细胞上清液；5)将无细胞上清液进离心处理，收集上清液，得到提取样本。本发明的痰液标本中cfDNA的提取方法，提供了一种规范化的痰液标本中cfDNA的提取流程，能够从痰液标本中获取足量的cfDNA为后续基因改变检测提供基础。

Description

痰液标本中cfDNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取方法，具体地说，涉及一种痰液标本无细胞上清中游离DNA(Cell Free DNA，cfDNA)的提取方法。

背景技术

近年来，应用靶向药物治疗非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)已经是临床肿瘤治疗中的标准治疗方法，即所谓的“精准治疗”。应用靶向药物治疗均需进行不同的基因改变检测，针对携带的不同基因改变，进行相应的药物选择。靶向药物治疗耐药患者肿瘤进展后，仍需进行基因改变检测，用于指导后续治疗，所以基因改变检测贯穿NSCLC治疗的全过程。国内及国外NSCLC诊疗指南均推荐患者常规进行一组驱动基因改变检测，包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、Her-2、C-MET等基因。

以下涉及本文中几个重要的专业术语的定义：1)驱动基因：是指对肿瘤发生及发展起到关键作用的基因，驱动基因的突变是肿瘤发展或者发展的重要原因，所谓“驱动”了正常细胞恶变的过程。在中国NSCLC患者最常见的驱动基因为EGFR基因突变；2)靶向治疗：是针对一个肿瘤驱动基因改变或者蛋白水平的改变，设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡和肿瘤发展得到控制的治疗手段；3)基因改变检测：指肿瘤患者携带的驱动基因改变检测，目的应用于临床肿瘤基因靶向治疗；4)液体活检：是指应用血液血浆、血清标本或者非血液标本(细胞学标本无细胞上清液)进行基因改变检测的技术。

传统上认为进行相关驱动基因检测所需标本为肿瘤组织或肿瘤细胞学标本。但是2/3的NSCLC发现是均为晚期，部分患者无法获得肿瘤标本完成检测，目前液体活检技术，即利用血液标本检测基因改变结果，也为临床所接受。

应用痰液标本进行基因改变检测比肿瘤组织标本、血液标本更有优势，1)获取方便、无创；2)肿瘤原位产生的分泌物，可能比血液标本的检测灵敏度更高；3)晚期NSCLC患者可出现贫血现象，痰液标本收集无需考虑贫血问题。

但是应用痰液标本中肿瘤细胞进行基因改变检测也存在问题，所以一直被业界认为是基因检测的困难标本，第一，痰标本找到癌细胞比例不高(仅占30％)，诊断灵敏度低；第二，即使查见癌细胞也几乎均为低肿瘤细胞含量标本，仅有少数痰液标本可以通过富集痰涂片中癌细胞进行基因改变检测。由此，如何建立痰液标本中cfDNA的规范化的提取流程，稳定地从痰液标本中提取获得足够量的cfDNA以保证后续基因改变检测结果的准确性，是十分必要解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明提供了一种痰液标本中cfDNA的提取方法。

本发明中涉及的各术语的定义：

基因突变检测技术：从肿瘤患者标本中检测基因改变的技术。本项目中主要涉及的基因突变检测技术为Super-突变扩增系统(Amplification Refractory MutationSystem,ARMS)技术及二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术；

化痰液：将痰液标本中粘液去除，以方便进行痰液标本中细胞的形态学观察及痰液无细胞上清中cfDNA提取的试剂配方。

本发明提供一种痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，包括如下步骤：

1)将痰液标本与化痰液混合，至化痰完全，得到化痰混合液；

2)将化痰混合液进行离心处理，分离上清液和底部沉淀，所述上清液即为无细胞上清液；

3)将无细胞上清液进离心处理，收集上清液，得到提取样本。

其中，所述步骤1)中的化痰液为生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的混合液。

进一步，所述步骤1)中，所述痰液标本、生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的体积比为1～2:7～11:1。

进一步，所述痰液标本、生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的体积比为1:9:1。

进一步，所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为0.1-0.7mol/L。

进一步，所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为0.5mol/L。

进一步，所述痰液标本选自非小细胞肺癌晚期患者的可自然排出的痰液。

其中，所述步骤2)中的离心转速为1500g/min；离心时间为5min，离心温度为室温。

其中，所述步骤3)中的离心转速为13000g/min；离心时间为10min，离心温度为4℃。

本发明提供一种痰液标本中cfDNA的提取方法，将所述的痰液中的cfDNA提取样本的制备方法中得到的样本通过DNA提取试剂盒进行cfDNA的提取，得到cfDNA。

本发明还提供一种所述的痰液标本中cfDNA的提取方法在基因检测领域的应用。

本发明的有益效果在于：痰液标本被业界认为是基因检测的困难标本，因为即使是NSCLC晚期也仅有1/3患者的痰液标本中可以在查见癌细胞，且绝大部分为低肿瘤细胞含量标本，如果刮取涂片上的癌细胞提取基因组DNA检测基因改变，可能仅有极少量的患者能应用痰液标本进行基因改变检测。所以此技术是应用痰液标本的无细胞上清cfDNA基因检测与目前应用痰液标本癌细胞的基因组DNA检测存在不同；

目前临床使用的化痰液配方，化痰目的是保证的痰液标本中细胞形态完好，保证病理诊断结果的准确性，所以多含有甲醇等物质。而本方法采用生理盐水和二硫苏糖醇溶液作为化痰液，不仅在保证化痰效果及细胞形态的基础之上，同时提高了从痰液标本无细胞上清中提取获得的cfDNA的浓度，进而保证后续基因改变检测结果的准确性；通过实验检验发现应用本流程，提取获得cfDNA不仅可以使用SuperARMS方法检测NSCLC患者最重要的驱动基因EGFR突变，尚可以应用NGS方法检测一组驱动基因的突变；明确了适合应用痰液标本无细胞上清cfDNA检测的NSCLC患者群，并且明确了那一类患者不适合进行此项检测；本发明的提取方法，是在进行了实验并获得了可靠数据的基础之上建立，此方法可以为后续的临床NSCLC分子检测工作提供基础。

附图说明

图1a为通过目前临床使用的痰液标本细胞清洗液(新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，ThinprepCytoLyt solution)，提取其无细胞上清cfDNA进行EGFR基因突变检测结果，显示EGFR基因19号外显子缺失突变阳性结果曲线判读阳性困难，为可疑阳性标本；

图1b为通过本发明使用的化痰液配方提取cfDNA检测EGFR基因19缺失突变为典型的阳性病例，提高了检测结果准确性；

图2表明通过显微镜下观察显示使用本发明使用的化痰液配方对痰液标本进行化痰处理，对细胞形态及细胞病理诊断结果无影响(图中箭头指示痰液中鳞状细胞)；

图3A表明不同化痰液配方处理DNA提取总量，同一个痰样本，分别使用不同的化痰液进行处理，本发明使用的化痰液配方进行痰液处理后DNA的提取总量平均约为新柏氏细胞清洗液化痰液处理的16.4倍；

图3B表明不同的化痰液配方处理后的文库GC含量，相比于新柏氏细胞清洗液化痰液。经本发明化痰液处理后的样本其文库GC偏好性更低，文库均一性(指测序深度达到平均深度20％以上的目标区域占总目标区域的比例)更好；

图3C表明不同的化痰液配方处理后的文库的测序覆盖度，本发明化痰液处理的样本，文库的测序覆盖度(指目标区域被测序数据覆盖的比例)均为100％；新柏氏细胞清洗液化痰液处理的样本，不同样本的文库间的测序覆盖度波动较大；

图3D表明不同的化痰液配方处理后的平均原始深度，在给定相同数据量的条件下，本发明化痰液处理样本的文库平均原始深度(指测序得到的目标区域中碱基平均深度)普遍较高，且不同样本间的平均原始深度相差小；

图3E、F表明不同的化痰液配方处理后的NGS检测的有效深度，采用本发明化痰液处理，样本DNA提取总量高，模板原始拷贝数多，NGS检测表现为有效深度SSBCDepth(指经过校正后得到的单链DNA模板数目)和有效深度DSBCDepth(指经过校正后得到的双链DNA模板数目)均显著高于新柏氏细胞清洗液化痰液处理条件的样本，有效深度高有利于突变的检出。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明技术方案解决现有技术中的问题的原理如下：

1)痰液标本提取cfDNA前标本处理的原理：临床收集的痰液标本形状比较粘稠，需进行化痰处理将痰液标本中粘液变性、溶解，制备成稀薄液体，同时不能影响痰液标本中细胞形态及上清中的DNA的量。因为需要从痰液标本上清中提取获得cfDNA进行后续基因改变检测，而且需要利用痰液标本上清cfDNA进行一组驱动基因突变检测，所以需要提高痰液标本无细胞上清中所获取的cfDNA的量。

目前病理科所使用的化痰液均为进行细胞学诊断为目的的细胞清洗液加变性剂，比如如新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，Thinprep CytoLyt solution，含甲醇产品，因为是专利产品，其中含有甲醇及未知盐类物质，利用此化痰液获得的上清提取cfDNA存在浓度低的问题，可能影响驱动基因检测结果的准确性。

本申请使用的化痰液配方去除目前应用的化痰液中的甲醇等物质，使用等渗、无甲醇的化痰液加变性剂二硫苏糖醇，实验结果显示本流程使用的化痰效果较目前临床使用的细胞清洗液好，而且显著提高了同等体积痰液标本中提取的cfDNA浓度，为后续进行基因检测得到更准确的结果提供可能。同时不影响痰液内细胞形态，为痰液内细胞进行后续形态学诊断提供可能。

2)痰液标本无细胞上清提取cfDNA过程的改进原理：本研究尝试使用提取血浆cfDNA提取试剂盒，完成痰液标本无细胞上清cfDNA的提取，实验结果发现应用本研究改良的无甲醇化痰液配方可从痰液标本上清中提取丰富的cfDNA，用于检测基因改变(所用方法包括ARMS、superARMS方法及二代测序方法)。但是我们的实验结果显示，痰液无细胞上清中存在较血浆标本更多的杂质成分，需要提高上样前的离心转速至13000g/min，以保证更高的cfDNA提取效率。

3)确定适合使用痰液标本进行基因改变检测的NSCLC患者人群：目前研究发现15例手术切除标本EGFR基因突变患者仅1例应用痰液标本检测出EGFR基因突变，检测灵敏度低(6.7％)，故早期可手术切除患者(I-IIIA期)不适合使用痰液标本进行检测。进展期NSCLC患者，特别是可以自然咳出痰液晚期患者，利用痰液标本检测基因改变是一个很好的选择。

4)送检痰液标本中查见癌细胞是否为选择痰液标本无细胞上清进行基因改变检测的必要条件：目前的研究数据显示，与肿瘤标本EGFR基因改变检测结果比较，如果痰液中查见癌细胞(不论为低/高肿瘤细胞含量)，应用痰液无细胞上清cfDNA检测结果阳性预测值可以达到100％(11/11)，一致率达100％(25/25)；痰液标本中未见癌细胞进展期NSCLC患者，与肿瘤标本检测结果比较，EGFR基因突变检测阳性预测值70.5％(12/17)。所以进展期NSCLC患者选用痰液标本检测EGFR基因突变，首先痰液标本中查见癌细胞标本，其次为晚期痰液标本中无癌细胞NSCLC患者。

实施例1

本发明提供一种痰液标本中cfDNA的提取方法，包括如下步骤：

痰液标本的收集：首先，选择适合应用痰液标本进行基因改变检测的NSCLC患者：晚期(不包括局部晚期)NSCLC患者，同时可自然排出痰液患者(无需进行雾化诱导痰液)；其次，收集痰液：晚期NSCLC患者痰液标本(自然咳出痰液标本，无需诱导)，收集痰液标本量1-3ml，如痰液量不够可分次收集，收集过程将痰液标本放入-20℃，痰液标本达到足够量后，进行下一步骤；其中在运送过程中痰液标本建议保持在2-8℃温度下运送。

痰液标本储存：送往检测中心后，建议立即进行化痰处理，并离心收集痰液标本无细胞上清，冻存于-20℃，以备检测，也可直接进行检测。也可先将痰液标本冻存于-20至-80℃冰箱中，检测前进行化痰处理，建议痰液冻存时间不要超过2周。

痰液标本质控：需为深部痰液标本(细胞学涂片中见吞噬细胞)，唾液标本未被证实可以进行NSCLC基因改变检测。

化痰处理：用弯头镊子从收集的痰液中挑取1ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，加入10ml化痰液(先加入9ml生理盐水，再加入1ml 0.5mol/L二硫苏糖醇水溶液)(此时需要注意的是，配置的DTT溶液在进行化痰处理时在加入，请勿事前配好生理盐水及DTT混合液)；拧紧离心管管盖，置于震荡区上，震荡5min，观察化痰效果(化痰是否完全，是否仍存在未充分化解的粘液物质)，直至化痰完全(即不存在未充分化解的粘液物质)。

初次分离：将化痰完全的混合液，在室温(20℃±10℃)、转速1500g/min的条件下，离心5min，分离，得到无细胞上清液和细胞沉淀；收集无细胞上清液，移出置于另一离心管中，分装冻存于-20至-80℃冰箱；离心管底细胞沉淀加细胞保存液，固定，以备病理诊断所用；将保存的沉淀细胞通过显微镜下观察显示使用本发明配方对痰液标本进行化痰处理，对细胞形态及细胞病理诊断结果无影响(图中箭头指示痰液鳞状细胞)。如图2所示。

cfDNA的提取：从-20至-80℃取出痰液标本无细胞上清4ml，在13000g/min、4℃的条件下离心10分钟，如果一次就能够获取足够量的痰液，也可以不经过冷冻的步骤接进行此步骤。分离后将上清移至另一离心管中备用。采用循环DNA提取试剂盒(本发明使用的试剂为厦门艾德生物医药科技股份有限公司,货号：ADx-BL03)提取痰液上清cfDNA。将4ml痰液标本无细胞上清液与试剂盒中2.4ml Buffer CDL及210μL Digest Solution充分混匀，60℃消化15min，冷却至室温，加入400μL DNA Tracer，再加入3.3ml预冷异丙醇，离心。提取cfDNA具体操作步骤按试剂盒说明进行。

cfDNA的浓度的测定：应用Promega Quantus仪器及试剂(本发明采用，也可使用Qubit荧光定量仪及其试剂进行浓度测定)检测cfDNA的浓度及定量。20例2种配对痰液无细胞上清标本(同等量痰液标本应用本流程推荐使用的化痰液配方及新柏氏细胞清洗液化痰液配方)比较本发明使用的化痰液配方提取cfDNA的量有显著提升，本发明化痰液配方提取cfDNA浓度为(1.99-24ng/μl)，而20例新柏氏细胞清洗液化痰液提取cfDNA浓度(0.0256-14ng/μl)，t检验结果显示两者间存在显著性差异(p＜0.05)。

痰液标本中提取的cfDNA在基因检测中的应用：采用SuperARMS方法检测EGFR基因突变(本发明使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司，货号：ADx-EG14-MX)。取出试剂盒组分，P-EGFR反应液和P-EGFR阳性对照充分解冻后加入67.5μL的待测样品DNA，再加入2.16μL的P-EGFR混合酶。将P-EGFR8联条置于冰上，开盖后将混合好的DNA样品依次加入，盖好管盖。将PCR反应条置于实时PCR仪器中。设置反应条件：1阶段：95℃10min，一个循环；2阶段：95℃40sec，64℃40sec，72℃30sec，15循环；3阶段：95℃40sec，60℃45sec，72℃30sec,28循环；信号收集：第3阶段60℃收集FAM/ROX/CY5/HEX信号，执行实时PCR，保存文件。具体操作见试剂盒说明。所述的结果如图1所示，其中，图1图1a为通过目前临床使用的痰液标本细胞清洗液(新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，ThinprepCytoLyt solution)，提取其无细胞上清cfDNA进行EGFR基因突变检测结果，显示19缺失突变为曲线判读阳性困难，为可疑阳性标本；图1b为通过本发明的化痰液配方提取cfDNA检测EGFR基因19缺失突变为典型的阳性病例，提高了检测结果正确性。

实施例2

将实施例1中的化痰步骤中的“用弯头镊子从收集的痰液中挑取1ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，加入10ml化痰液(先加入9ml生理盐水，再加入1ml0.5mol/L二硫苏糖醇水溶液)”改成“用弯头镊子从收集的痰液中挑取1.5ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，加入8ml化痰液(先加入7ml生理盐水，再加入1ml0.3mol/L二硫苏糖醇水水溶液)”其余均与实施例1中的方法相同。

此时，10例2种配对痰液无细胞上清标本(实施例2与实施例1化痰液不同比例配方比较，实施例1中提取cfDNA浓度(1.99-24ng/μl)，而实施例2中提取cfDNA浓度(0.89-27ng/μl)，t检验结果显示两者间未显示显著性差异(p＞0.05)。

实施例3

将实施例1中的化痰步骤中的“用弯头镊子从收集的痰液中挑取1ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，加入10ml化痰液(先加入9ml生理盐水，再加入1ml0.5mol/L二硫苏糖醇水溶液)”改成“用弯头镊子从收集的痰液中挑取2ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，加入12ml化痰液(先加入11ml生理盐水，再加入1ml0.7mol/L DTT水溶液)”其余均与实施例1中的方法相同。

此时，10例2种配对痰液无细胞上清标本配方(实施例3与实施例1化痰液不同比例配方比较同等量痰液标本，实施例1中提取cfDNA浓度(1.99-24ng/μl)，而实施例3中提取cfDNA浓度(1.01-20ng/μl)，t检验结果显示两者间未显示显著性差异(p＞0.05)。

数据验证：

二代测序方法检测痰液标本无细胞上清cfDNA驱动基因改变。本发明的试剂采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的肺癌10基因二代测序试剂盒，包括NSCLC的已有上市或潜在靶向药物的驱动基因10个，EGFR,ALK,ROS1,RET,KRAS,NRAS,BRAF,PIK3CA,HER2,MET基因。具体建库操作及测序见试剂盒说明书。其中3例做了本发明化痰液配方及新柏氏细胞清洗液化痰液配方的配对比较，结果显示本发明化痰液配方在各种评价指标及结果上明显优于新柏氏细胞清洗液化痰液配方(如表1、图3中的数据所示)。

表1 不同配方化痰液配对标本进行二代测序检测数据比较

Claims (5)

1.一种痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将痰液标本与化痰液混合，至化痰完全，得到化痰混合液；

2)将化痰混合液进行离心处理，分离上清液和底部沉淀，所述上清液即为无细胞上清液；

3)将无细胞上清液进离心处理，收集上清液，得到提取样本；

其中，所述步骤1)中的化痰液为生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的混合液；所述痰液标本、生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的体积比为1:9:1；混合时，先加入生理盐水，再加入二硫苏糖醇水溶液，所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为0.5mol/L。

2.根据权利要求1所述的痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，其特征在于，所述痰液标本选自非小细胞肺癌晚期患者的可自然排出的痰液。

3.根据权利要求所述的痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的离心转速为1500g/min；离心时间为5min，离心温度为室温。

4.根据权利要求1-3所述的痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的离心转速为13000g/min；离心时间为10min，离心温度为4℃。

5.一种痰液标本中cfDNA的提取方法，其特征在于，将权利要求1-4任一所述的痰液中的cfDNA提取样本的制备方法中得到的样本通过DNA提取试剂盒进行cfDNA的提取，得到cfDNA。

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