CN109762808B - 用于提取痰液标本无细胞上清中游离dna的化痰液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的化痰液，由生理盐水和浓度为0.1‑0.7mol/L的二硫苏糖醇水溶液组成；生理盐水与二硫苏糖醇水溶液在使用前独立包装、存放；在使用现场将生理盐水与痰液标本、二硫苏糖醇水溶液混合；生理盐水与二硫苏糖醇水溶液的体积比为9:1。本发明的配方试剂容易获得，配制方法简单，利于广泛推广；与已应用于临床的化痰液试剂比较在化痰效果、获得cfDNA的量，以及基因改变检测结果的准确性方面均显示优势；由于获得cfDNA量丰富，可以进行多种基因检测；该配方为等渗液体，短期处理收集无细胞上清后，沉淀内加入细胞固定液不会破坏细胞形态，不影响后续细胞学病理诊断结果。

Description

用于提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的化痰液

技术领域

本发明涉及一种用于提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的化痰液，特别涉及一种化痰液配方，用于提取非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者痰液标本无细胞上清中游离DNA(cell free DNA，cfDNA)，获得的cfDNA可进行NSCLC患者相关驱动基因改变检测。

背景技术

近年来靶向药物在NSCLC临床肿瘤治疗中的地位已经确定，即所谓的“精准治疗”。应用靶向药物治疗均需进行不同的基因改变检测以选择患者，同时针对携带的不同基因改变，进行相应的药物选择。靶向药物治疗耐药患者肿瘤进展后，仍需进行基因改变检测，用于指导后续治疗。所以国内及国外NSCLC诊疗指南均推荐患者常规进行一组驱动基因改变检测，包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、Her-2、C-MET等基因。

传统上认为进行相关驱动基因检测所需标本为肿瘤组织或肿瘤细胞学标本。但是2/3的NSCLC发现均为晚期，部分患者无法获得肿瘤标本完成检测，目前液体活检技术，即利用血液标本检测基因改变结果，也为临床所接受。

应用痰液标本进行基因改变检测比肿瘤组织标本、血液标本更有优势：1)获取方便、无创；2)肿瘤原位产生的分泌物，可能比血液标本的检测灵敏度更高；3)晚期NSCLC患者可出现贫血现象，痰液标本收集无需考虑贫血问题。

虽然痰液标本进行基因改变检测可以分离痰标本中的肿瘤细胞，但应用痰标本中肿瘤细胞进行基因改变检测也存在问题，所以一直被业界认为是基因检测的困难标本，第一，痰标本找到癌细胞比例不高(仅有30％肺癌患者可以通过痰液找到癌细胞)，诊断灵敏度低；第二，即使查见癌细胞也几乎均为低肿瘤细胞含量标本，仅有少数痰液标本可以通过富集痰涂片中癌细胞进行基因改变检测。所以目前需要研究应用液体活检技术检测痰液标本无细胞上清cfDNA的技术与方法，但如何将痰液标本中粘液溶解，处理为可以直接使用提取血浆cfDNA试剂盒的液体，是目前痰液标本是否可以利用液体活检技术进行基因改变检测的一个重点也是难点的技术问题。

目前常用的化痰液配方为细胞清洗液(如新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，Thinprep CytoLyt solution，含甲醇产品)加入变性剂二硫苏糖醇(DTT)其作用目的为溶解痰液中的粘液，并保持痰液中细胞学标本完好形态，以利于病理诊断。但是此种化痰液由于含有甲醇或其他未知盐类物质使溶解痰液标本后提取的无细胞上清内cfDNA量较低，从而影响到后续的基因检测结果的准确性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于提取痰液标本无细胞上清中cfDNA的化痰液配方，实验结果显示本发明所述化痰液配方不仅化痰效果较现有的细胞清洗液好，而且显著提高了同等体积痰液标本中所提取的cfDNA量，基因检测结果更准确。同时使用本发明所述配方处理痰液标本，可以保证痰液标本中细胞的形态完好，不影响后续细胞学病理诊断结果。

本发明中涉及的各术语的定义：

1)化痰液：将痰液标本中粘液去除，以方便进行痰液标本中细胞的形态学观察及痰液无细胞上清中cfDNA提取的试剂配方；

2)驱动基因：对肿瘤发生及发展起到关键作用的基因，驱动基因的突变是肿瘤发生或者发展的重要原因，所谓“驱动”了正常细胞恶变的过程，在NSCLC患者常见的驱动基因为EGFR基因突变、ALK基因融合、ROS1基因融合等；

3)靶向治疗：是针对一个肿瘤驱动基因改变或者蛋白水平的改变，设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡和肿瘤发展得到控制的治疗手段；

4)基因改变检测：NSCLC患者携带的驱动基因改变检测，目的应用于临床肿瘤基因靶向治疗；

5)液体活检：应用血液标本血浆、血清标本或者非血液标本(肿瘤细胞学标本无细胞上清液)进行基因改变检测；

6)基因突变检测技术：从肿瘤患者标本检测驱动基因改变的技术，本项目中主要涉及的基因突变检测技术为SuperARMS技术及二代测序技术。

本发明所提供的化痰液，由生理盐水和二硫苏糖醇(DTT)组成，

其中，所述二硫苏糖醇以水溶液的形式存在；

所述二硫苏糖醇水溶液的浓度可为：0.1-0.7mol/L，具体可为0.5mol/L；

所述生理盐水与二硫苏糖醇(DTT)水溶液在使用前独立存放；

在使用现场将生理盐水与痰液标本、二硫苏糖醇(DTT)水溶液混合。

所述生理盐水与二硫苏糖醇(DTT)水溶液的体积比可为7～11:1，具体可为9：1。

本发明还提供一种利用上述化痰液提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的方法。

所述提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的方法，包括如下步骤：

将生理盐水与痰液标本、二硫苏糖醇水溶液混合，震荡，肉眼观察直到化痰完全(即无未充分化解的粘液物质)，离心，收集无细胞上清，即可。

所述方法还可进一步包括将收集无细胞上清后的沉淀使用含甲醇细胞固定液固定，继续后续液基细胞学处理过程的操作。

上述方法中，所述痰液标本、生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的体积比为1～2:7～11:1，具体可为1:9:1。

所述离心的条件可为：1500转/min，5min。

本发明提供的所述化痰液具有以下优点：

1)目前临床病理科使用的痰液标本化痰液多属于公司专利产品，对其具体成分未知，实验室无法自行配制，特别是分子生物学实验室，无痰液标本处理经验及获取此类试剂途径，对于应用液体活检技术检测痰液标本无细胞上清cfDNA的工作可能存在困难。本发明的配方试剂容易获得，配制方法简单，利于广泛推广；

2)与目前已应用于临床的化痰液试剂比较在化痰效果、获得cfDNA的量，以及基因改变检测结果的准确性方面均显示优势；

3)与目前已应用于临床的化痰液试剂比较由于获得cfDNA量丰富，可以进行多种基因检测(本研究完成了应用二代测序技术检测10个基因突变的工作)；

4)该配方为等渗液体，短期处理收集无细胞上清后，沉淀内加入细胞固定液不会破坏细胞形态，不影响后续液基细胞学操作及细胞学病理诊断结果。

附图说明

图1a为目前临床使用的其中一种化痰液配方-痰液标本细胞清洗液(新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，Thinprep CytoLyt solution)，提取其无细胞上清cfDNA进行EGFR基因突变检测结果，显示EGFR基因19号外显子缺失突变曲线判读阳性困难，为可疑阳性标本；

图1b为通过本发明的化痰液配方提取cfDNA检测EGFR基因19号外显子缺失突变为典型的阳性病例，提高了检测结果正确性。

图2表明通过显微镜下观察显示使用本发明配方对痰液标本进行化痰处理，对细胞形态及细胞病理诊断结果无影响(图中箭头指示痰液鳞状细胞)。

图3 A不同化痰液处理DNA提取总量。同一个痰样本，分别使用不同的化痰液进行处理，本发明化痰液处理后DNA的提取总量平均约为新柏氏细胞清洗液化痰液处理的16.4倍。

图3 B文库GC含量相比于新柏氏细胞清洗液化痰液。经本发明化痰液处理后的样本其文库GC偏好性更低，文库均一性(指测序深度达到平均深度20％以上的目标区域占总目标区域的比例)更好。

图3 C覆盖度。本发明化痰液处理的样本，文库的测序覆盖度(指目标区域被测序数据覆盖的比例)均为100％；新柏氏细胞清洗液化痰液处理的样本，不同样本的文库间的测序覆盖度波动较大。

图3 D平均原始深度。在给定相同数据量的条件下，本发明化痰液处理样本的文库平均原始深度(指测序得到的目标区域中碱基平均深度)普遍较高，且不同样本间的平均原始深度相差小。

图3 E、F有效深度。采用本发明化痰液处理，样本DNA提取总量高，模板原始拷贝数多，NGS检测表现为有效深度SSBCDepth(指经过校正后得到的单链DNA模板数目)和有效深度DSBCDepth(指经过校正后得到的双链DNA模板数目)均显著高于新柏氏细胞清洗液化痰液处理条件的样本，有效深度高有利于突变的检出。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、

化痰液配方的确定：1)临床及实验室获取方便；2)必须为等渗液体，以保证痰液细胞学形态完好，不影响细胞学病理诊断；3)尽量减少化痰液上清中的盐离子成分，避免影响上清中提取cfDNA试剂盒的提取效率；4)二硫苏糖醇及β巯基乙醇均为实验常用的变性剂，但二硫苏糖醇无色无味更适合实验室使用；5)文献报道对于DTT化痰浓度差异较大[1],在不同盐离子浓度下，二硫苏糖醇的最佳化痰浓度需要进行实验证明。

为了观察二硫苏糖醇浓度对化痰效果有无改变，本实验从0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L mol/L不同二硫苏糖醇浓度进行观察，从化痰时间及化痰的效果2方面观察，最后确定0.5mol/L确为最佳浓度。

基于以上考虑本研究实验设计如下：

生理盐水+二硫苏糖醇：将9ml生理盐水+1ml痰液+分别1ml0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L DTT，震荡5min，肉眼观察化痰效果，离心1500转/min，5min，收集无细胞上清，将离心管底细胞沉淀使用含甲醇细胞固定液进行固定，继续后续液基细胞学处理过程；

PBS液+二硫苏糖醇：将9ml PBS+1ml痰液+1ml0.5mol/L DTT，震荡5min，肉眼观察化痰效果，离心1500转，5min，收集无细胞上清，将沉淀使用含甲醇固定液进行固定，继续后续液基细胞学处理过程。

实验结果显示对比新柏氏公司痰液标本细胞清洗液+DTT及PBS+DTT配方，生理盐水+0.5mol/L DTT配方在同等痰液量的情况下化痰效果及无细胞上清提取cfDNA的量存在显著优势。20例新柏氏公司痰液标本细胞清洗液+DTT的细胞清洗液cfDNA浓度(0.0256-14ng/μL)，配对PBS+DTT配方提取cfDNA量(0.15-13ng/μL)，配对本申请化痰液配方(生理盐水+0.5mol/L DTT)cfDNA浓度为(1.99-24ng/μl)。

图1a/1b具体操作步骤如下：

1)用弯头镊子从收集的痰液中挑取1ml标本(尽量挑取含血丝痰液标本)，置于50ml离心管中，图1a显示结果为：加入9ml痰液标本细胞清洗液(新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，Thinprep CytoLyt solution)，再加入1ml(7.7％)DTT；图1b显示结果为本发明的化痰液配方：将9ml生理盐水+1ml痰液，再加入1ml0.5mol/L DTT；

2)拧紧离心管管盖，置于震荡区上，震荡5min，观察化痰效果(化痰是否完全，是否仍存在未充分液化的粘液物质)；

3)离心，转速1500转/min，时间5min，室温；

4)收集无细胞上清液，移出置于另一离心管中，分装冻存于-80℃冰箱；离心管底沉淀加细胞保存液，用于液基细胞学制片后进行细胞学病理诊断；

5)提取cfDNA时，从-80℃取出痰液标本无细胞上清4ml，应用提取血浆标本cfDNA的试剂盒提取痰液无细胞上清标本中cfDNA。采用循环DNA提取试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司,货号：ADx-BL03)提取痰液上清cfDNA。将4ml痰液标本无细胞上清液与试剂盒中2.4ml Buffer CDL及210μL Digest Solution充分混匀，60℃消化15min，冷却至室温，加入400μL DNA Tracer，再加入3.3ml预冷异丙醇，离心。提取cfDNA具体操作步骤按试剂盒说明进行。

6)应用Promega Quantus仪器及试剂检测cfDNA的浓度及定量。20例2种配对痰液无细胞上清标本(同等量痰液标本应用本发明化痰液配方及新柏氏细胞清洗液化痰液配方)比较本发明化痰液配方提取cfDNA的量有显著提升，本发明化痰液配方提取cfDNA浓度为(1.99-24ng/μl)，而20例新柏氏细胞清洗液化痰液提取cfDNA浓度(0.0256-14ng/μl)，t检验结果显示两者间存在显著性差异(p＜0.05)。

7)采用SuperARMS方法检测EGFR基因突变(厦门艾德生物医药科技股份有限公司，货号：ADx-EG14-MX)。取出试剂盒组分，P-EGFR反应液和P-EGFR阳性对照充分解冻后加入67.5μL的待测样品DNA，再加入2.16μL的P-EGFR混合酶。将P-EGFR8联条置于冰上，开盖后将混合好的DNA样品依次加入，盖好管盖。将PCR反应条置于实时PCR仪器中。设置反应条件：1阶段：95℃10min，一个循环；2阶段：95℃40sec，64℃40sec，72℃30sec，15循环；3阶段：95℃40sec，60℃45sec，72℃30sec,28循环；信号收集：第3阶段60℃收集FAM/ROX/CY5/HEX信号，执行实时PCR，保存文件。具体操作见试剂盒说明。

图1a为目前临床使用的其中一种化痰液配方-痰液标本细胞清洗液(新柏氏公司液基细胞学制片专利产品，Thinprep CytoLyt solution)，提取其无细胞上清cfDNA，进行EGFR基因突变检测结果，显示EGFR基因19号外显子缺失突变为曲线判读阳性困难，为可疑阳性标本；

图1b为使用本发明的化痰液配方提取cfDNA检测EGFR基因19号外显子缺失突变为典型的阳性病例，提高了检测结果正确性。

8)二代测序方法检测痰液标本无细胞上清cfDNA驱动基因改变。试剂采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的肺癌10基因二代测序试剂盒，包括NSCLC已上市或具有潜在靶向药物的驱动基因10个，EGFR,ALK,ROS1,RET,KRAS,NRAS,BRAF,PIK3CA,HER2,MET基因。具体建库操作及测序见试剂盒说明书。其中3例做了本发明化痰液配方及新柏氏细胞清洗液化痰液配方的配对比较，结果显示本发明化痰液配方在各种评价指标及结果上明显优于新柏氏细胞清洗液化痰液配方(表1、图3)。

表1 3例2种配方化痰液配对标本进行二代测序检测数据比较

表1结果说明：

1.采用本发明化痰液配方DNA提取总量高，约是新柏氏细胞清洗液化痰液配方的16.4倍；

2.采用本发明化痰液配方处理的样本，文库的GC偏好性较低，且文库均一性更好；

3.采用本发明化痰液配方处理的样本有效测序深度高；

4.样本名称LLZ，采用本发明化痰液配方处理时，NGS测序成功检出EGFR L747_A750delinsP突变(0.41％)，而采用新柏氏细胞清洗液化痰液配方处理时该位点漏检。

图3 A不同化痰液处理DNA提取总量。同一个痰样本，分别使用不同的化痰液进行处理，本发明化痰液处理后DNA的提取总量平均约为新柏氏细胞清洗液化痰液处理的16.4倍。

图3 B文库GC含量相比于新柏氏细胞清洗液化痰液。经本发明化痰液处理后的样本其文库GC偏好性更低，文库均一性(指测序深度达到平均深度20％以上的目标区域占总目标区域的比例)更好。

图3 C覆盖度。本发明化痰液处理的样本，文库的测序覆盖度(指目标区域被测序数据覆盖的比例)均为100％；新柏氏细胞清洗液化痰液处理的样本，不同样本的文库间的测序覆盖度波动较大。

图3 D平均原始深度。在给定相同数据量的条件下，本发明化痰液处理样本的文库平均原始深度(指测序得到的目标区域中碱基平均深度)普遍较高，且不同样本间的平均原始深度相差小。

图3 E、F有效深度。采用本发明化痰液处理，样本DNA提取总量高，模板原始拷贝数多，NGS检测表现为有效深度SSBCDepth(指经过校正后得到的单链DNA模板数目)和有效深度DSBCDepth(指经过校正后得到的双链DNA模板数目)均显著高于新柏氏细胞清洗液化痰液处理条件的样本，有效深度高有利于突变的检出。

对结果的说明和讨论

国内及国际NSCLC诊疗指南均推荐，NSCLC患者需要进行一组驱动基因检测，所以从检测标本中获取更多量cfDNA，可以通过检测得到更多基因改变的信息，也是决定基因检测灵敏度的一个关键环节。针对痰液标本而言，用于提取痰液标本无细胞上清中cfDNA的化痰液配方要达到：第一，保证提取cfDNA的量，第二，保证细胞形态不被破坏，不影响后续细胞学病理诊断结果。所以化痰液配方要去除目前化痰液配方中可能影响cfDNA产出的甲醇等物质，但又必须是等渗，短时间处理不会影响细胞形态。本着这些原则，选择生理盐水加一定浓度的变性剂配方，可以达到上述的要求。实验的结果也证实本配方的在基因改变检测中的优势。

与新柏氏公司的专利产品细胞清洗液化痰效果比较，本配方在化痰效果上好于新柏氏细胞清洗液，同等量的痰液标本应用本品进行化痰处理后，离心后离心管底无残留未得到充分溶解的粘液物质，而新柏氏公司的细胞清洗液化痰后离心管底可见沉淀物。

同等量痰液标本应用两种不同化痰液处理后，比较提取cfDNA的量有显著提升，提取20例痰液标本的细胞清洗液cfDNA浓度(0.0256-14ng/μl)，配对本申请化痰液配方cfDNA浓度为(1.99-24ng/μl)，t检验结果显示两者间存在显著性差异(p＜0.05)。

以肿瘤组织或细胞学标本基因检测结果作为金标准[2-4]，应用本配方与新柏氏公司的细胞清洗液无细胞上清液比较，无论采用SuperARMS方法及NGS方法，提取cfDNA进行EGFR基因突变检测显示出更高的检测灵敏度。

使用本配方对痰液标本进行化痰处理对细胞形态及细胞病理诊断结果无影响(如图2所示)。

且本发明所用试剂易于获取，配制简单，可以在临床更广泛推广。

参考文献：

[1]Tockman MS1,Qiao Y,Li L,Zhao GZ,Sharma R,Cavenaugh LL,ErozanYS.Safe separation of sputum cells from mucoid glycoprotein.Acta Cytol.1995Nov-Dec；39(6):1128-36.

[2]DiStasio M,Chen Y,Rangachari D,Costa DB,Heher YK,VanderLaanPA.Molecular Testing Turnaround Time for Non-Small Cell Lung Cancer inRoutine Clinical Practice Confirms Feasibility of CAP/IASLC/AMP GuidelineRecommendations:A Single-center Analysis.Clin Lung Cancer.2017 Sep；18(5):e349-e356.

[3]Rafael OC,Aziz M,Raftopoulos H,Vele OE,Xu W,Sugrue C.Moleculartesting in lung cancer:fine-needle aspiration specimen adequacy and testprioritization prior to the CAP/IASLC/AMP Molecular Testing Guidelinepublication.Cancer Cytopathol.2014 Jun；122(6):454-8.

[4]王征,武晓楠,石远凯,韩晓红,程刚,李琳,张力,张予辉,穆新林,朱广卿,樊再雯,杨丽,邸靖,贾新蕊,刘冬戈。细胞学标本表皮生长因子受体基因突变检测的规范化流程。中华肿瘤杂志.2014；36(7)：516-521。

Claims (4)

1.化痰液在提取痰液标本无细胞上清中游离DNA中的应用，

所述化痰液由生理盐水和二硫苏糖醇组成；

所述二硫苏糖醇以水溶液的形式存在；

所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为：0.5mol/ L；

所述生理盐水与二硫苏糖醇水溶液的体积比为7~11:1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述化痰液中，生理盐水与二硫苏糖醇水溶液在使用前独立存放；

在使用现场将生理盐水与痰液标本、二硫苏糖醇水溶液混合。

3.利用权利要求1中的化痰液提取痰液标本无细胞上清中游离DNA的方法，包括：将生理盐水与痰液标本、二硫苏糖醇水溶液混合，震荡，肉眼观察直到化痰中粘液完全溶解，离心，收集无细胞上清，即可；

所述方法中，所述痰液标本、生理盐水和二硫苏糖醇水溶液的体积比为1~2:7~11:1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还进一步包括将收集无细胞上清后离心管底细胞沉淀加入含甲醇固定液，进行后续液基细胞学处理，完成细胞学病理诊断。

Images