CN1425676A - 保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液及保存试样中核糖核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一保存及萃取核酸的双效溶液，尤其是保存及萃取核糖核酸的双效溶液，该溶液不仅可保存试样避免试样中核酸的降解，而且可用于纯化存在试样中的核酸。例如，当使用该技术中公知的纯化步骤时，此双效溶液可应用在保存并稳定粪便并萃取其中细胞所含的核糖核酸分子，由此去除粪便中的杂质，使所得到的核糖核酸产物可以顺利进行下游实验。

Description

保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液及 保存试样中核糖核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种在进行核酸纯化前尤其是核糖核酸纯化前保存细胞核糖核酸的试剂与方法，并可用于萃取细胞内核糖核酸。此外并不需要保存在低温环境中。

背景技术

核糖核酸因为很容易被环境中所存在的核糖核酸酶分解，所以核糖核酸在一般环境下能完整存在的时间很短，保存上的稳定度远比脱氧核糖核酸低，故长久以来，如何得到高品质及完整的核糖核酸一直是进行许多基础分生实验上欲解决的重要问题。完整的核糖核酸不但可使反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)容易成功，对于北方墨点杂交、核酸酶保护分析实验等皆扮演关键角色。

近年来，由于分子生物技术逐渐应用于临床鉴定或是检验上，研究人员或医护人员必须在最短时间内以最适当的条件将临床样本送至研究单位或检验单位，以保存其中的重要指标物质-核糖核酸使不被降解，进而能顺利进行与基因表达相关的研究或检验。

关于核糖核酸的保存技术，美国安比恩(Ambion)公司生产一种可保存完整细胞的溶液RNAlater^TM(美国专利第6,204,375号)，该产品包含25mM柠檬酸钠、10mM乙二胺四乙酸以硅胶珠作为干燥粪便的手段藉以保存、萃取与扩增粪便中的DNA。在Loktionov et al.，Clin.Cancer Res.4(2)：337-42，Feb.1998中则是从人类粪便表面分离剥落的大肠细胞(colonocytes)检测特定脱氧核糖核酸(DNA)，希望作为大肠癌的筛检工具。Ahlquist D.A.et al.，Gastroenterology 119(5)：1219-1227，Nov.2000亦通过检测粪便中产生变化的人类DNA作为大肠癌的筛检。美国专利第6,268,136号涉及粪便样本的制备以产生大量的DNA，分析标的DNA而依循作为大肠癌的指标。

Alexander R.J.et al.，Digestive Disease and Sciences43(12)：2652-2658，Dec.1998涉及从人类粪便样本纯化总核糖核酸的方法，其说明了如何从新鲜粪便抽取总核糖核酸。该方法使用研钵将粪便在液态氮急速冷冻情形下研磨0.6至1克的粪便，最后加入2～3毫升的10mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM氯化钠与1mM EDTA溶解并进行离心，但在该文献中仍是使用液态氮的方式研磨样本进行核糖核酸的纯化，也未提及如何保存粪便中的核糖核酸。

因此，需要一种在一般温度下可以方便保存微量细胞并从其中萃取出高品质且完整的核糖核酸的试剂与方法。

发明内容

为了能够早期以非侵入性的方法检测出体内细胞核糖核酸表现是否产生变化，而且可以不需亲自到医院去提供检测的试样，并将试样的运送便利化，使收取到的试样能够容易进行后续的纯化萃取步骤。因此本发明的一个目的是提供一种核糖核酸保存/萃取的双效缓中液，该核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，包含离液(chaotropic)物质与至少一盐类，该保存/萃取双以硅胶珠作为干燥粪便的手段藉以保存、萃取与扩增粪便中的DNA。在Loktionov et al.，Clin.Cancer Res.4(2)：337-42，Feb.1998中则是从人类粪便表面分离剥落的大肠细胞(colonocytes)检测特定脱氧核糖核酸(DNA)，希望作为大肠癌的筛检工具。Ahlquist D.A.et al.，Gastroenterology 119(5)：1219-1227，Nov.2000亦通过检测粪便中产生变化的人类DNA作为大肠癌的筛检。美国专利第6,268,136号涉及粪便样本的制备以产生大量的DNA，分析标的DNA而依循作为大肠癌的指标。

Alexander R.J.et al.，Digestive Disease and Sciences43(12)：2652-2658，Dec.1998涉及从人类粪便样本纯化总核糖核酸的方法，其说明了如何从新鲜粪便抽取总核糖核酸。该方法使用研钵将粪便在液态氮急速冷冻情形下研磨0.6至1克的粪便，最后加入2～3毫升的10mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM氯化钠与1mM EDTA溶解并进行离心，但在该文献中仍是使用液态氮的方式研磨样本进行核糖核酸的纯化，也未提及如何保存粪便中的核糖核酸。

因此，需要一种在一般温度下可以方便保存微量细胞并从其中萃取出高品质且完整的核糖核酸的试剂与方法。

发明内容

为了能够早期以非侵入性的方法检测出体内细胞核糖核酸表现是否产生变化，而且可以不需亲自到医院去提供检测的试样，并将试样的运送便利化，使收取到的试样能够容易进行后续的纯化萃取步骤。因此本发明的一个目的是提供一种核糖核酸保存/萃取的双效缓中液，该核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，包含离液(chaotropic)物质与至少一盐类，该保存/萃取双管，直立置于室温(25℃)6天(144小时)后，加入一小匙的玻璃珠(约5至10颗，直径2～4厘米)与3毫升的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，再进行下述核糖核酸抽取步骤。

核糖核酸的抽取纯化

将已加入玻璃珠与核糖核酸保存/萃取双效缓冲液的样本于50毫升离心管内强烈震荡15分钟，使样本充分分散并溶解于缓冲液中，接着以离心机在12,000g、4℃下离心一分钟。

取出离心管内2毫升以上清液至15毫升的离心管中，加入6毫升商品化核糖核酸纯化溶液BLUE EXTRACT(浊水溪生物科技公司，台湾)根据成套设备纯化指示进行后续核糖核酸纯化至异丙醇沉淀步骤为止，但是在以异丙醇沉淀的步骤之前另外加上以等体积的酚/三氯甲烷萃取两次。

接着，使经过异丙醇沉淀后所取得的沉淀物溶于经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水(DEPC-H₂O)100微升(μl)及台湾富联生物料技公司(VIOGENE-BIOTEK CORP.)所生产的核糖核酸萃取成套设备“Total RNA Extraction Miniprep System”内所附的RX buffer 350μl与纯酒精250μl，并放入总核糖核酸管柱(Total RNA Mini Column)，之后依照该公司所推荐的流程进行后续核糖核酸的纯化。

以上述方法，由两位受试者粪便中抽出核糖核酸，测量其O.D值，换算所抽到的总核糖核酸浓度如下(平均值)：

		A	B	C
					总核糖核酸浓度(ng/μl)	第一位受试者	556	224.8	99.2
第二位受试者	674.8	274.4	8.4

由本发明所制备纯化的核糖核酸，测其在波长260nm与做调整；或例如加入二价阳离子螯合剂以使核糖核酸酶失去活性，该螯合剂可为一般使用的乙二胺四乙酸、乙二醇双乙胺醚-N，N’四乙酸(EGTA)或是任何可将二价阳离子抓离核酸酶的物质。亦可加入消解蛋白质双硫键的物质，例如一些可将双硫链链结还原的还原剂，消解蛋白质双硫键的目的是为了使存在于溶液中形成核糖核酸酶的胺基酸链形成双硫键的部分加以还原分开，使之失去原本的二级结构，让核糖核酸酶失去活性，较佳为使用β-巯基乙醇或二硫苏糖醇等。为促进样本中所含细胞溶于缓冲液中，还可添加可促使样本分散的物质例如玻璃珠粒。该玻璃珠粒可在纯化核糖核酸时帮助样本的分散，譬如通过震荡装有玻璃珠粒与缓冲液和样本的容器，使珠粒振击样本以使样本分散。添加珠粒的数量可以根据要保存粪便的硬度或是保存日数来决定。保存时间越长，在保存缓冲液中的样本就越松散，助于样本分散的珠粒数目便可以越少。

为维持缓冲液pH值的稳定性，可加入一些稳定pH值的物质例如柠檬酸钠、醋酸钠、柠檬酸钾、醋酸钾、三羟甲基氨基甲烷缓冲液等pH值稳定剂。核糖核酸保存/萃取双效缓冲液的pH值较佳则是在4～8间。例如pH值在中性，如7.4左右。

本发明的保存/萃取双效缓冲液与使用该缓冲液来进行保存及/或萃取核糖核酸可以用于不同新鲜动物、植物、藻类等微生物的组织或细胞样本上。发明人亦预期对保存脱氧核糖核酸有效。保存的试样种类可以非常广泛，含有细胞的试样便可，尤其是象粪便、尿液、唾液或是其它细胞数较少或是杂质多的样本，因为其内所含不明物与核糖核酸酶的量比起其它一般组织或是细胞来说为更多，防止核糖核酸的降解相对不易。其它例如细胞悬浮液、组织细胞、血球细胞、精子、血液、细菌、组织培养细胞等都预期可以由该保存/萃取双效缓冲液处理样本而保存并纯化出总核糖核酸，以进行各种分子上的检测或是应用，如进行反转录，或反转录后针对特定待测基因表达进行扩增(amplification)或是进一步纯化其中的信使核糖核酸。可以针对相关疾病或是症候的分子变化做检测，例如肠癌的早期指标或是其它消化道或直肠相关疾病或是慢性病。因为不需侵入体内，也可收集试样作为地区公共卫生调查。

保存核糖核酸的温度不同于以往必须储存于-80℃或是取得样本后马上以液态氮处理再储存于-80℃下，经由本发明的缓冲液储存的样本，可以储存在大于-20℃的环境，而且在室温下以此方法保存的粪便样本可以稳定保存至少一星期以上。在实际运用下，受试者可以在家自行采集样本，取得的样本可以马上置入含有本发明的保存/萃取双效缓冲液中加以保存，也可以放在室温中，以邮寄方式寄至医院或是检验中心，不需为了类似的分子检验而亲自至医院采样。此外，因为降低了试样处理紧急性，检验人员或是研究人员的时间调配也更加容易。

在纯化核糖核酸时，该保存/萃取双效缓冲液不需与样本分离便可直接进行纯化的步骤。可以直接进行胍盐为主的传统核糖核酸萃取与纯化，或是套用市售的核糖核酸纯化成套设备或是管柱将核糖核酸与细胞碎片或是其它杂质分离。按照技术人员所熟知的方法，保存的核糖核酸可以很容易从样本或试样中获得。此外在纯化步骤中可以根据来源试样的干净程度选择性地加入额外的萃取步骤，以提高所纯化核糖核酸的纯度。

本发明的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液可以做成成套设备型式，除了装盛双效缓冲液的容器与其中的定量缓冲液(可为事先互相混合或是分开装盛当场混合)外，还可包含采集粪便用的用具，如刮勺或类似物，方便定量采集粪便置入缓冲液中保存。

实施例1

核糖核酸保存/萃取双效缓冲液

-1％(v/v)β-氢硫乙醇，使用前加入

-1％(v/v)三合一抗生素：阿莫西林/链霉素/两性霉素，使用前加入，生物工业公司(Biological Industries)，以色列

-10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)，pH值7.4

-200mM氯化钠

-1mM乙二胺四乙酸(EDTA)

-4M异硫氰酸胍(guanidium isothiocyanate)

样品处理

因为研究的方便性，在此“新鲜”可以代表是刚排便出或是在排便后马上将粪便置于-80℃下保存待实验进行时取出的。

A    量取新鲜的受试者粪便1.0克置入50毫升的离心管，加入一小匙的玻璃珠(约5至10颗，直径2～4厘米)与3毫升的上述核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，置于室温(25℃)6天(144小时)之后进行下述核糖核酸抽取步骤。

B    量取新鲜的受试者粪便1.0克置入50毫升的离心管，加入一小匙的玻璃珠(约5至10颗，直径2～4厘米)与3毫升的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，马上进行下述核糖核酸抽取步骤。

C    量取新鲜的受试者粪便1.0克置入50毫升的离心管，直立置于室温(25℃)6天(144小时)后，加入一小匙的玻璃珠(约5至10颗，直径2～4厘米)与3毫升的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，再进行下述核糖核酸抽取步骤。

核糖核酸的抽取纯化

将已加入玻璃珠与核糖核酸保存/萃取双效缓冲液的样本于50毫升离心管内强烈震荡15分钟，使样本充分分散并溶解于缓冲液中，接着以离心机在12,000g、4℃下离心一分钟。

取出离心管内2毫升以上清液至15毫升的离心管中，加入6毫升商品化核糖核酸纯化溶液BLUE EXTRACT(浊水溪生物科技公司，台湾)根据成套设备纯化指示进行后续核糖核酸纯化至异丙醇沉淀步骤为止，但是在以异丙醇沉淀的步骤之前另外加上以等体积的酚/三氯甲烷萃取两次。

接着，使经过异丙醇沉淀后所取得的沉淀物溶于经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水(DEPC-H₂O)100微升(μl)及台湾富联生物料技公司(VIOGENE-BIOTEK CORP.)所生产的核糖核酸萃取成套设备“Total RNA Extraction Miniprep System”内所附的RX buffer 350μl与纯酒精250μl，并放入总核糖核酸管柱(Total RNA Mini Column)，之后依照该公司所推荐的流程进行后续核糖核酸的纯化。

以上述方法，由两位受试者粪便中抽出核糖核酸，测量其O.D值，换算所抽到的总核糖核酸浓度如下(平均值)：

		A	B	C
					总核糖核酸浓度(ng/μl)	第一位受试者	556	224.8	99.2
第二位受试者	674.8	274.4	8.4

由本发明所制备纯化的核糖核酸，测其在波长260nm与280nm的比值为大于1.8，显示核酸与杂质已进行良好的分离。

由抽到的核糖核酸溶液中取出1微克的核糖核酸，以技术人员所熟知的反转录-聚合酶链式反应进行管家基因(housekeeping gene)以及致癌基因的扩增放大，并以电泳胶进行扩增产物的鉴定。反转录时使用技术人员所熟知的反转录酵素及随机引子(random pimer)将核糖核酸反转录成为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。管家基因选用边缘细胞角质蛋白基因(cytokeratin；CK 18)(引子序列为：第1号ID：正意股：5’-CGAGGACTTTAATCTTGGTG，第2号ID：反意股：5’-TAATGCCTCAGAACTTTGGT-3’)、过氧化体法呢基化蛋白基因(peroxisomal farnesyl protein，PxF)(引子序列为：第3号ID：正意股：5’-TGCAGCAGCTACAAGATTTA-3’，第4号ID：反意股：5’-GACTCAGAGAGGAAAACGTG)，致癌基因则选用了K-ras，并进行二次聚合酶链式反应(第一次反应引子序列：第5号ID：正意股：5’-GACTGAATATAAACTTGTGG-3’，第6号ID：反意股：5’-AACTAATGTATAGAAGGCATC-3’；第二次反应引子序列：正意股：同第一次，第7号ID：反意股：5’-TCTATTGTTGGATCATATTC-3’)。

图1为取其中一位受试者的cDNA以上述管家基因的引子进行聚合酶链式反应后进行洋菜胶电泳，以溴化乙锭染色后鉴定的结果。M代表标准分子量核酸混合溶液(100碱基对为间隔)(伯昂公司，台湾)，第1至第3条代表加入扩增CK 18所用引子第1号ID及第2号ID的PCR产物，第4至第6条代表加入扩增PxF所用引子第3号ID及第4号ID的PCR产物，其中第1条与第4条代表负控制组(不加受试者cDNA)，第2与第5条代表加入以样品处理方法A所得的cDNA作为模板(8μl)，第3与第6条代表正控制组的结果，系加入胎盘cDNA 0.5μl为模板(由一微克胎盘总核糖核酸作反转录)。由实验结果可知以本发明的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液处理的粪便，其核糖核酸可以因此被保存维持144小时(6天)以上或更久，而且特殊易于后续核糖核酸的处理与纯化，甚至可用于进行基因表达的检验。

图2为取其中一位受试者的cDNA以上述致癌基因K-ras的引子进行聚合酶链式反应后进行洋菜胶电泳胶鉴定的结果。M代表标准分子量核酸混合溶液(100碱基对为间隔)，第1至4条代表以第一次反应引子序列第5号ID及第6号ID为引子进行聚合酶链式反应的结果，第5至9条代表以第二次反应引子序列第5号ID及第7号ID为引子进行聚合酶链式反应的结果。第1条为正控制组的结果，系加入胎盘cDNA 0.5μl为模板，第2条代表加入以样品处理方法A所得的cDNA 2μl作为模板所得的结果，第3条代表加入以样品处理方法C所得的cDNA 2μl作为模板所得的结果。第4条为第一次聚合酶链式反应的负控制组，以水代替核酸模板。第5条为进行第二次聚合酶链式反应的正控制组，系以第一次聚合酶链式反应正控制组的扩增核酸2μl为模板，第6条为样品处理方法A以第一次聚合酶链式反应所得溶液进行第二次聚合酶链式反应的结果(取2μl为模板)。第7条为以样品处理方法C以第一次聚合酶链式反应所得溶液进行第二次聚合酶链式反应的结果(取2μl为模板)。第8条为以第一次聚合酶链式反应的负控制组所得溶液进行第二次聚合酶链式反应的结果(取2μl为模板)。第9条为单一第二次聚合反应的负控制组，以水取代核酸模板。

由该图的结果可知，经过2次聚合酶链式反应后，K-ras基因表达的特定片段可以被扩增放大(长度为105碱基对)，印证本发明核糖核酸保存/萃取双效缓冲液对于试样核糖核酸保存的能力亦可到达一般表现量少的基因。

本说明书的以上叙述是为熟悉本技术领域的技术人员所能了解并加以实施的，且本发明的实施例或所描述技术仅是作为具体例的例示而非用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神的一些微小变更或其它用途均视为本发明所包含的范围。此外，本说明书所提到的现有技术或参考资料亦作为本发明说明书的一部分。

Claims (10)

1.一种保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液，包含离液物质与至少一盐类，该保存/萃取双效缓冲液具有总盐类浓度在10克/100毫升与该盐类的饱和浓度间，且该保存/萃取双效缓冲液可将核糖核酸保存在大于-20℃。

2.如权利要求1所述的保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液，其还包含可消解双硫键的物质。

3.如权利要求1所述的保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液，其还包含可促进样本分散的玻璃珠粒。

4.如权利要求1所述的保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液，其pH值在4与8中间。

5.如权利要求1所述的保存/萃取核糖核酸的双效缓冲液，其中该核糖核酸来自身体的剥落细胞。

6.一种保存/萃取试样中核糖核酸的方法，其包括：

取得试样；

将该试样完全漫于一种包含离液物质与至少一盐类，并具有总盐类浓度在10克/100毫升与该盐类的饱和浓度间的保存/萃取核糖核酸双效缓冲液；

于大于-20℃下保存该浸于缓冲液中的试样；

将缓冲液内的试样分散均质化，直接进行核糖核酸的萃取纯化。

7.如权利要求6所述的方法，其中该缓冲液还包含可促进样本分散的玻璃珠粒。

8.如权利要求6所述的方法，其中该缓冲液pH值在4与8之间。

9.如权利要求6所述的方法，其中该核糖核酸来自身体剥落的细胞。

10.如权利要求7所述的方法，利用促进样本分散的玻璃珠粒在保存核糖核酸后进行萃取纯化时以震荡方式将样本打散。

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