CN117778378A - 一种核酸提取液、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸提取液、试剂盒及其应用，该核酸提取液包括月桂基麦芽糖新戊二醇和Tween‑20，所述月桂基麦芽糖新戊二醇的浓度为1～5mg/mL，所述Tween‑20的体积分数为4％～6％。本发明将月桂基麦芽糖新戊二醇引入核酸提取液，搭配Tween‑20，同时限定月桂基麦芽糖新戊二醇的浓度为1～5mg/mL，Tween‑20的体积分数为4％～6％，能够大大提高检测灵敏度，显著减少因核酸提取不完全造成的定量偏差，能更好地体现样本的真实浓度，从而减少漏检的情况，再者，裂解结合同时进行，减少操作步骤，从而提高提取效率。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种核酸提取液、试剂盒及其应用。
背景技术
核酸提取的方法主要包括酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、煮沸法、离心柱提取法、玻璃珠吸附法及微纳米磁珠提取法。而相比较之下，磁珠法核酸提取技术由于自动化程度高、样本通量大，尤其是安全性高，已成为业内主流方法。国内核酸提取主流厂家拥有全自动核酸提取系统采用磁珠法原理，无需离心且操作自动化，可减少人员接触，并使用深孔板耗材，可避免交叉污染。
随着核酸检测的广泛应用，核酸提取技术也在飞速发展，但目前市面上现有的病原体核酸提取试剂盒中，试剂盒中具有以下弊端：灵敏度低等原因容易造成漏检；核酸提取不完全造成定量偏差，不能很好地反映样本的真实浓度；裂解结合分步进行，操作繁琐，这些弊端会影响临床样本的提取效率以及对结果的判读。以HBV(乙型肝炎病毒)检测为例，目前，我国《乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸测定试剂技术审查指导原则》将HBV的灵敏度要求提升到了30IU/mL和50IU/mL，这对核酸提取液具有较高的要求，需要更高的提取效率才能达到要求。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明的目的在于提供一种核酸提取液、试剂盒及其应用，该核酸提取液在核酸提取中，核酸提取得率高，从而提高检测灵敏度，降低漏检和核酸提取不完全造成定量偏差，从而很好地反映样本的真实浓度。
本发明提供一种核酸提取液，所述核酸提取液包括月桂基麦芽糖新戊二醇和Tween-20，所述月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)的浓度为1～5mg/mL，所述Tween-20(聚山梨醇酯-20)的体积分数为4％～6％。
本发明所述月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)的浓度为1～5mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用。本发明所述Tween-20的体积分数为4％～6％，例如可以是4％、4.5％、5％、5.5％、6％，但不限于所列举的数值，数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明将月桂基麦芽糖新戊二醇引入核酸提取液，搭配Tween-20，同时限定月桂基麦芽糖新戊二醇的浓度为1～5mg/mL，Tween-20的体积分数为4％～6％，该核酸提取液在核酸提取中，核酸提取得率高，从而提高检测灵敏度，降低漏检和核酸提取不完全造成定量偏差，从而很好地反映样本的真实浓度。再者，裂解结合同时进行，减少操作步骤，从而提高提取效率。
优选地，所述核酸提取液还包括胍盐、缓冲液、钠盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇中的至少一种。
优选地，在所述核酸提取液中，所述胍盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍中的至少一种，和/或，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种，和/或，所述钠盐包括氯化钠、醋酸钠中的至少一种。
优选地，在所述核酸提取液中，所述胍盐的浓度为2-4M，和/或，所述缓冲液的浓度为50mM-100mM，和/或，所述钠盐的浓度为50mM-100mM，和/或，所述乙二胺四乙酸的浓度为20-25mM，和/或，所述异丙醇的体积分数为35％-45％。
更优选地，所述胍盐为盐酸胍，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述钠盐为氯化钠。
本发明提供一种核酸提取试剂盒，包括所述核酸提取液。
本发明试剂盒操作简便，可以进行手工提取、半自动核酸提取仪器。本发明试剂盒还可以采用预分装好的核酸提取试剂，可搭配核酸提取设备，可通过半自动仪器提取方案在40分钟之内提取48例样本，极大程度提高了核酸提取效率和报告发送时间，有单人份试剂，根据需求进行选择，减少试剂浪费，进一步降低了成本且简单高效。
优选地，所述核酸提取试剂盒还包括洗涤液、洗脱液中的至少一种。
优选地，所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括异丙醇、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、胍盐、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇中的至少一种，所述洗涤液2包括缓冲液、乙醇中的至少一种。
优选地，在所述洗涤液1中，所述胍盐包括盐酸胍、硫氰酸胍中的至少一种。
优选地，在所述洗涤液2中，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。
优选地，所述洗脱液包括缓冲液、乙二胺四乙酸中的至少一种。
优选地，在所述洗脱液中，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。
优选地，所述核酸提取试剂盒还包括磁珠和/或蛋白酶K。
本发明还提供所述核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用，所述核酸提取包括手工提取、核酸提取仪器提取中的至少一种。
优选地，手工提取的方法，包括如下步骤：
S1.向样本中加入磁珠，再加入蛋白酶K，震荡；
S2.加入所述核酸提取液，震荡、离心、加热静置；
S3.室温静置，进行磁性分离，去掉液体；
S4.加入所述洗涤液1，震荡，磁性分离，去掉液体；
S5.加入所述洗涤液2，震荡，磁性分离，去掉液体；
S6.离心后，磁性分离，去掉液体，静置；
S7.加入洗脱液，震荡，静置，提取得到核酸。
优选地，在所述S6中，所述静置的时间为4～5min。
本方案限定步骤S6中静置的时间为4～5min，在该静置时间范围，磁珠上的中的乙醇充分挥发，避免残留的乙醇对后续实验造成不良影响；同时避免静置干燥的时间较长导致磁珠挂壁难以洗脱。
优选地，在所述S7中，所述静置包括室温静置或55～58℃条件下静置。
本方案限定步骤S7中静置包在55～58℃条件下静置，可提高样本的核酸洗脱效率。
优选地，在所述S7中，所述静置包括室温条件下静置10min。
更优选地，在所述S7中，所述静置包括56℃条件下静置5min。
附图说明
图1为实施例1核酸提取试剂盒用于手工提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图2为实施例1核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图3为实施例2核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图4为实施例3核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图5为对比例1核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图6为对比例2核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图7为对比例3核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
图8为对比例4核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本得到核酸的检测扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例的核酸提取试剂盒包括0.2mg/mL磁珠悬浮液、20mg/mL蛋白酶K溶液、核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。
核酸提取液的组成包括盐酸胍3mol/L、Tris-HCl(PH＝8.0)50mmol/L、NaCl100mmol/L、EDTA 25mmol/L、月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)1mg/mL、Tween-20体积分数5％、体积分数40％异丙醇。
洗涤液1的组成包括异丙醇体积分数10％、NP40体积分数1％、硫氰酸胍1mmol/L、EDTA25mmol/L和二硫苏糖醇0.1mmol/L。
洗涤液2的组成包括Tris-HCl(pH＝8.0)50mmol/L和无水乙醇体积分数75％。
洗脱液的组成包括Tris-HCl(pH＝8.0)10mmol/L和EDTA1mmol/L。
将本实施例的核酸提取试剂盒用于手工提取HBV病毒核酸的提取方法包括如下步骤：
S1.样本处理：将乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)系列血清(液体)标准物质(4.6E+06IU/mL)GBW(E)090139)用阴性人血浆稀释至5IU/mL；
S2.将HBV样本震荡混匀后取400μL样本加入到1.5mL离心管中，加入20μL浓度为0.2mg/mL磁珠悬浮液，加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，震荡10s；
S3.加入750μL核酸提取液，震荡1min，瞬时离心，65℃静置10min；
S4.室温静置1min；将离心管置于磁性分离器上，5min后吸弃废液；
S5.加入800μL洗涤液1，震荡30s，将离心管置于磁性分离器上，3min后缓慢吸弃废液；
S6.加入800μL洗涤液2，震荡30s，将离心管置于磁性分离器上，2min后缓慢吸弃废液；
S7.瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，吸弃管底液体，室温静置5min；
S8.加入50μL洗脱液，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置10min；将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到新的1.5mL离心管中，提取得到核酸。
将本实施例的核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取样本中的HBV核酸的提取方法包括如下步骤：
S1.样本处理：将乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)系列血清(液体)标准物质(4.6E+06IU/mL)GBW(E)090139)用阴性人血浆稀释至5IU/mL；
S2.核酸提取：采用圣湘生物科技股份有限公司的Natch48A酸提取仪对5IU/mL的HBV标准品进行提取，具体操作如下：
向48孔深孔板的第1板加入750μL核酸提取液，然后加入400μL样本、20μL磁珠以及20μL蛋白酶K，向第2板加入800μL洗涤液1，向第3板加入800μL洗涤液2，向第4板加入50μL洗脱液。按照Natch48A位置依次将48深孔板放入对应位置。
将48孔深孔板放入圣湘生物科技股份有限公司的Natch48A核酸提取仪中，按表1的程序进行核酸提取。
表1
S3.提取程序运行结束，取下48孔深孔板，此时第4块板中的洗脱产物即为含纯化的HBV核酸(DNA)的溶液，进行PCR扩增反应。
核酸检测
将本实施例手工提取和核酸提取仪器提取的HBV核酸溶液采用SLAN-P96荧光定量PCR仪进行扩增，检测HBV核酸。
S1.扩增总体积为50μL，其中HBV反应液为30μL，核酸提取产物为20μL，PCR扩增反应液使用AXygen 0.2mL平盖八联管。
S2.扩增程序如表2，其中“*”表示荧光信号采集点，采集通道设置为FAM和VIC，荧光参比为ROX。
表2HBV扩增程序
表2
实施例2～3和对比例1～4的核酸提取试剂盒各组成成分及其相应的配比如下表3中的表2所示，采用实施例2～3和对比例1～4的酸提取试剂盒进行手工提取、核酸提取仪器提取和核酸检测的方法与实施例1严格保持一致。
表3
实施例1～3和对比例1～4的核酸检测结果如图1～8所示。
图1为实施例1核酸提取试剂盒用于手工提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图1可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为38.77，检出率为100％。
图2为实施例1核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图2可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为38.56，检出率为100％。
图3为实施例2核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图3可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为38.25，检出率为100％。
图4为实施例3核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图4可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为38.43，检出率为100％。
图5为对比例1核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图5可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为39.81，检出率为75％。
图6为对比例2核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图6可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为40.22，检出率为80％。
图7为对比例3核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图7可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为39.57，检出率为85％。
图8为对比例4核酸提取试剂盒用于核酸提取仪器提取5IU/mL HBV样本的检测扩增曲线图(该图中的内标为β-球蛋白基因)。由图8可知，该样本平行测20次，平均值Ct值为39.17，检出率为90％。
表4为实施例1～3和对比例1～4的核酸检测结果。
表4
由上述图1～8和表4可知，使用含有本发明核酸提取液的核酸提取试剂盒能提取低至5IU/mL的HBV样本且可以准确检出，自动化仪器提取48例样本的时间为40分钟。与对比例1～4相比，本发明实施例1、实施例2、实施例3在核酸提取液中添加月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)和Tween-20，且月桂基麦芽糖新戊二醇的浓度为1～5mg/mL，所述Tween-20的体积分数为4％～6％，更有效地提取HBV病毒，扩增曲线Ct值合适，检出率和Ct值较比对例均好，充分体现了其灵敏度高、操作简单的特点，特别适合血浆病原体的检测与筛查，快速准确获得检测结果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种核酸提取液，其特征在于，所述核酸提取液包括月桂基麦芽糖新戊二醇和Tween-20，所述月桂基麦芽糖新戊二醇的浓度为1～5mg/mL，所述Tween-20的体积分数为4％～6％。
2.根据权利要求1所述核酸提取液，其特征在于，所述核酸提取液所述提取液还包括胍盐、缓冲液、钠盐、乙二胺四乙酸、异丙醇中的至少一种。
3.根据权利要求2所述核酸提取液，其特征在于，在所述核酸提取液中，所述胍盐的浓度为2-4M，和/或，所述缓冲液的浓度为50mM-100mM，和/或，所述钠盐的浓度为50mM-100mM，和/或，所述乙二胺四乙酸的浓度为20-25mM，和/或，所述异丙醇的体积分数为35％-45％。
4.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述核酸提取液。
5.根据权利要求4所述核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括洗涤液、洗脱液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，所述洗涤液1包括异丙醇、乙基苯基聚乙二醇、胍盐、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇中的至少一种，所述洗涤液2包括缓冲液、乙醇中的至少一种。
7.根据权利要求5所述核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括缓冲液、乙二胺四乙酸中的至少一种。
8.根据权利要求4所述核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括磁珠和/或蛋白酶K。
9.一种如权利要求4-8任一项所述核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用，其特征在于，所述核酸提取包括手工提取、核酸提取仪器提取中的至少一种。
10.根据权利要求9所述核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用，其特征在于，所述手工提取的方法，包括如下步骤：
S1.向样本中加入磁珠，再加入蛋白酶K，震荡；
S2.加入所述核酸提取液，震荡、离心、加热静置；
S3.室温静置，进行磁性分离，去掉液体；
S4.加入所述洗涤液1，震荡，磁性分离，去掉液体；
S5.加入所述洗涤液2，震荡，磁性分离，去掉液体；
S6.离心后，磁性分离，去掉液体，静置；
S7.加入洗脱液，震荡，静置，提取得到核酸。
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