CN111235227A - 一种游离dna提取及甲基化转化方法、试剂及试剂盒 - Google Patents

一种游离dna提取及甲基化转化方法、试剂及试剂盒 Download PDF

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CN111235227A CN202010239949.2A CN202010239949A CN111235227A CN 111235227 A CN111235227 A CN 111235227A CN 202010239949 A CN202010239949 A CN 202010239949A CN 111235227 A CN111235227 A CN 111235227A
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卜振中
孙瑶
李红东
郭军辉
韩文
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

本发明公开了一种游离DNA提取及甲基化转化方法、试剂及试剂盒，能提供足量、高纯度的游离DNA，属于生物技术领域，解决了现有技术中灵敏度不高，不能有效识别甲基化位点的问题。本发明的方法包括：采用磁珠法对样本中的游离DNA进行富集纯化；利用亚硫酸盐使纯化后的DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转化成尿嘧啶；利用磁珠法对转化后的DNA进行纯化。本发明的试剂包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂。本发明的试剂盒包括上述试剂。本发明操作简单，方便，所需要样本量小，2‑4mL即可，能提供足量、高纯度的游离DNA，使得后续的PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术能够有效识别甲基化位点。

Description

一种游离DNA提取及甲基化转化方法、试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及血液游离DNA检测领域，更特别地，具体涉及一种游离DNA提取及甲基化转化方法、试剂及试剂盒。
背景技术
正常细胞、肿瘤细胞或胎儿组织细胞分裂后，细胞中的DNA会释放到人体体液中，游离在细胞之外，其中进入到血液的这部分DNA统称作外周血游离DNA(cfDNA)。cfDNA是一种无细胞状态的胞外DNA，以DNA—蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。健康人外周血也存在cfDNA，但肿瘤患者的外周血cfDNA含量与健康人外周血cfDNA相比较有显著性的增高，肿瘤细胞死亡后将释放自身的DNA片段到血循环中，即循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等。当肿瘤DNA进入血液时，这些基因缺陷模式在血浆和血清中也可被检测到。研究显示，血液中的循环肿瘤DNA可以作为一类特异性的分子标志物用于肿瘤的检测和预后监测。
DNA甲基化作为最早发现的表观修饰途径之一，其异常甲基化模式在不同肿瘤组织中具有高度特异性。ctDNA甲基化检测在癌症诊疗应用中，基于血液标本一定程度上可以克服实体瘤组织标本的局限性。
循环肿瘤DNA甲基化检测的第一步是对人类血浆血清进行游离DNA提取，第二步是对甲基化位点进行识别。提取产物的质量直接影响到检测结果的准备性和可靠性，在血浆血清中，游离DNA片段小、含量低，因而能有效提取足量的游离DNA，对后续检测的灵敏度影响较大。因此，一种游离DNA提取及甲基化转化方法，灵敏度高，能使得后续的PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术能够有效识别甲基化位点，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种游离DNA提取及甲基化转化方法，能提供足量、高纯度的游离DNA，使得后续的PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术能够有效识别甲基化位点。
本发明还提供了一种游离DNA提取及甲基化转化的试剂。
本发明又提供了一种游离DNA提取及甲基化转化的试剂盒。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的一种游离DNA提取及甲基化转化方法，包括以下步骤：
步骤1：采用磁珠法对样本中的游离DNA进行富集纯化；
步骤2：利用亚硫酸盐使步骤1中纯化后的DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转化成尿嘧啶；
步骤3：利用磁珠法对转化后的DNA进行纯化。
本发明的技术方案中，所述样品包括血清、血浆样品；优选地，包括人血清、人血浆样品。
本发明所述的一种游离DNA提取及甲基化转化的试剂，包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂。
其中，磁珠的浓度为10-30mg/ml。
本发明的技术方案中，所述游离DNA提取试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗脱液；
或/和所述DNA甲基化试剂包括DNA转化试剂、结合液、脱磺试剂、洗脱液；优选地，所述游离DNA提取试剂还包括蛋白酶K稀释液、洗涤液A和洗涤液B；
优选地，所述DNA甲基化试剂还包括转化试剂溶解液、转化试剂助溶剂、转化试剂稀释液、洗涤液C。
本发明的技术方案中，临用前，将蛋白酶K粉末加蛋白酶K稀释液溶解，制成蛋白K含量为10-30mg/ml，优选为20mg/ml的蛋白酶K溶液。
本发明的技术方案中，所述裂解液包括无核酸酶水、第一缓冲液、组分1和组分2；其中，所述组分1为异硫氰酸胍、盐酸胍或高氯酸钠中的至少一种；所述组分2为AEO、TritonX-100、SDS或PEG6000中的至少一种；
或/和所述蛋白酶K稀释液包括无核酸酶水、氯化钠及第一缓冲液，其中氯化钠的含量为0.05-0.5M；
或/和所述洗涤液A包括无核酸酶水、第二缓冲液、无机盐、醇溶液；
或/和所述洗涤液B包括无核酸酶水、氯化钠、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述洗脱液包括无核酸酶水、第二缓冲液；
优选地，所述第一缓冲液为Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；
优选地，所述第二缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或者TE缓冲液中的一种；优选地，所述无机盐溶液为氯化钠溶液、碘化钠溶液或碘化钾溶液中的至少一种；
优选地，所述醇溶液为异丙醇或无水乙醇中的至少一种。
本发明的技术方案中，所述DNA转化试剂包括无核酸酶水、亚硫酸盐、氯化钠、第一缓冲液；
或/和所述转化试剂溶解液包括无核酸酶水、氢氧化物中的一种；
或/和所述转化试剂稀释液包括无核酸酶水、氯化钠溶液、第一缓冲液；
或/和所述转化试剂助溶剂包括无核酸酶水、二甲基甲酰胺；
或/和所述结合液包括氯化钾溶液、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述洗涤液C包括无核酸酶水、氯化钠溶液、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述脱磺试剂包括氯化钠溶液、碱液、醇溶液；
优选地，所述碱液中的碱为Tris碱或氢氧化物中的一种。
优选地，所述亚硫酸盐包括Na2SO3、K2SO3、NaHSO3、KHSO3。
本发明的技术方案中，所述裂解液的制备方法为：取无核酸酶水、组分1、组分2在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值为6.0-8.0，所述裂解液中组分1的含量为2-5M，组分2的质量含量或体积含量为2％-30％。
本发明的技术方案中，所述DNA转化试剂的制备方法为：取无核酸酶水、亚硫酸盐、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值为6.0-8.0，所述DNA转化试剂中亚硫酸盐的含量为1-5M，氯化钠含量0.1-0.5M；
所述转化试剂溶解液的制备方法为：将无核酸酶水、氢氧化物，在室温条件下搅拌至溶解；氢氧化物的含量为0.1-1M；
所述转化试剂助溶剂的制备方法为：将无核酸酶水、二甲基甲酰胺，室温条件搅拌溶解；二甲基甲酰胺的含量为0.05-1M；
所述转化试剂稀释液的制备方法为：将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，再加入第一缓冲液调节pH值为6.0-8.0；所述转化试剂稀释液中氯化钠的含量为0.2-1M；
所述DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液及转化试剂助溶剂的体积比为1-3:1-2:1-5:0.1-0.5。
本发明的一些实施例中，所述结合液的制备方法为：将氯化钾溶液、醇溶液混合均匀，然后用第二缓冲液调节PH值为6-7；所述结合液中氯化钾的含量为0.1-0.5M，醇溶液的体积含量为10-30％；
或/和所述脱磺试剂的制备方法为：将氯化钠溶液、碱液、醇溶液混合即得；所述脱磺试剂中，氯化钠的含量为0.1-1M、碱液的含量为0.5-1M，醇溶液的体积含量为5％-30％。
本发明的技术方案中，所述洗涤液A的制备方法为将无核酸酶水、无机盐在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值为6-8，所述洗涤液A中，无机盐的含量为0.5-1M，醇溶液的含量为5-20v％。
所述洗涤液B的制备方法为将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值为6-8，所述洗涤液B中，氯化钠的含量为0.1-0.5M，醇溶液的含量为60-80v％。
所述洗涤液C的制备方法为将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值为6-8，所述洗涤液C中，氯化钠的含量为0.05-0.5M，醇溶液的含量为70-90v％。
所述洗脱液的制备方法为将无核酸酶水加第二缓冲液调节pH值为6-8，即得。
本发明所述的一种包含上述试剂的试剂盒。
本发明中所述的化合物或基团的英文缩写为：
AEO：脂肪醇聚氧乙烯醚
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚X-100
SDS：十二烷基磺酸钠
PEG6000：聚乙二醇6000
Tris碱：三羟甲基氨基甲烷
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用磁珠法对血清/血浆样本中的游离DNA进行富集纯化，利用偏重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转化成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(mC)保持不变，并利用磁珠法对转化后的DNA进行纯化，使得PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术能够有效识别甲基化位点。本发明操作简单，方便，所需要样本量小，2-4mL即可，能提供足量、高纯度的游离DNA，使得后续的PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术能够有效识别甲基化位点。
附图说明
附图1对照试剂1#样本扩增曲线图；
附图2对照试剂2#样本扩增曲线图；
附图3对照试剂3#样本扩增曲线图；
附图4对照试剂4#样本扩增曲线图；
附图5对照试5#样本扩增曲线图；
附图6对照试6#样本扩增曲线图；
附图7对照试7#样本扩增曲线图；
附图8对照试8#样本扩增曲线图；
附图9对照试剂9#样本扩增曲线图；
附图10本发明试剂1#样本扩增曲线图；
附图11本发明试剂2#样本扩增曲线图；
附图12本发明试剂3#样本扩增曲线图；
附图13本发明试剂4#样本扩增曲线图；
附图14本发明试剂5#样本扩增曲线图；
附图15本发明试剂6#样本扩增曲线图；
附图16本发明试剂7#样本扩增曲线图；
附图17本发明试剂8#样本扩增曲线图；
附图18本发明试剂9#样本扩增曲线图。
具体实施方式
本发明的实施例中，裂解液的制备方法为：取无核酸酶水、组分1、组分2在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值，即得；
所述蛋白酶K稀释液的制备方法为将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌溶解，再加入第一缓冲液调节pH值，即得；
所述DNA转化试剂的制备方法为：取无核酸酶水、亚硫酸盐、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值，即得；
所述转化试剂溶解液的制备方法为：将无核酸酶水、氢氧化物，在室温条件下搅拌至溶解，即得；
所述转化试剂助溶剂的制备方法为：将无核酸酶水、二甲基甲酰胺，室温条件搅拌溶解，即得；
所述转化试剂稀释液的制备方法为：将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，再加入第一缓冲液调节pH值，即得；
所述结合液的制备方法为：将氯化钾溶液、醇溶液混合均匀，然后用第二缓冲液调节PH值，即得；
所述脱磺试剂的制备方法为：将氯化钠溶液、碱液、醇溶液混合即得；
洗涤液A的制备方法为将无核酸酶水、无机盐在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值，即得；
所述洗涤液B的制备方法为将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值，即得；
所述洗涤液C的制备方法为将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌溶解，而后加入醇溶液混合均匀，再加入第二缓冲液调节pH值，即得。
所述洗脱液的制备方法为将无核酸酶水与第二缓冲液混合均匀，即得。
实施例1
本实施例公开了本发明的试剂盒的组成，包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂，具体见下表：
表1
Figure BDA0002432218270000061
Figure BDA0002432218270000071
临用前，将蛋白酶K加蛋白酶K稀释液溶解，制成蛋白K含量为10-30mg/ml的蛋白酶K溶液；
临用前，将DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液、转化试剂助溶剂按体积比1-3:1-2:1-5:0.1-0.5。混合均匀，制成DNA转化试剂混合溶液。
实施例2
本实施例公开了本发明的试剂盒的组成，包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂，具体见下表：
表2
Figure BDA0002432218270000072
Figure BDA0002432218270000081
临用前，将蛋白酶K加蛋白酶K稀释液溶解，制成蛋白K含量为10mg/ml的蛋白酶K溶液；
临用前，将DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液、转化试剂助溶剂按体积比1-3:1-2:1-5:0.1-0.5混合均匀，制成DNA转化试剂混合溶液。
实施例3
本实施例公开了本发明的试剂盒的组成，包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂，具体见下表：
表3
Figure BDA0002432218270000082
临用前，将蛋白酶K加蛋白酶K稀释液溶解，制成蛋白K含量为10-30mg/ml的蛋白酶K溶液；
临用前，将DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液、转化试剂助溶剂按体积比1-3:1-2:1-5:0.1-0.5混合均匀，制成DNA转化试剂混合溶液。
实施例4
本实施例提供了采用实施例1-3的试剂盒进行游离DNA提取及甲基化转化的方法，具体如下：
1.游离DNA提取步骤
1.1在15ml离心管中加入2～4ml血清/血浆样品及160μl蛋白酶K溶液、6ml裂解液、80μl预先混匀的磁珠，室温充分混匀10min。
1.2将离心管置于磁力架上3min，使管内磁珠完全吸附，移走管内液体。
1.3取下离心管，向其中加入1ml洗涤液A，用移液器吹吸使得磁珠重悬，而后将磁珠溶液转移至一个1.5ml离心管中(尽量将磁珠溶液转移完全)，置于磁力架上静置3min。
1.4用移液器小心吸去上清，避免损失磁珠，然后向离心管中加入1ml洗涤液B，涡旋10s使磁珠重悬，然后将离心管置于磁力架上，静置1min。
1.5重复步骤1.4一次。
1.6用移液器小心吸去上清，避免损失磁珠，取下离心管置于小型离心机上离心10s，然后将离心管置于磁力架上1min，用移液器小心吸去液体，保留磁珠。
1.7取下离心管，向管中加入80μl洗脱液，置于涡旋仪上涡旋10～30s(至管底无磁珠沉淀)。
1.8将离心管置于55℃金属浴中，温浴5min。
1.9取出离心管置于涡旋仪上涡旋30s，短暂离心。
1.10将离心管置于磁力架上磁吸1min，将液体转移至一个无核酸酶的离心管中，如不立即进行转化，则-20℃保存备用。
2.DNA甲基化步骤及甲基化后的纯化步骤
2.1将1.10提取产物置于室温融化，涡旋混匀后进行短暂离心。
2.2取2个0.2ml的PCR管各加入110μl DNA转化试剂混合溶液和40μl提取产物，涡旋混匀后短暂离心。
2.3将PCR管置于PCR仪中，设置温度98℃，10min；80℃，45min；4℃，∞(4℃保存时间请勿超过1h)。
2.4程序结束后将PCR管取出，将2个PCR管中液体转移至1个2ml离心管中，加入1.2ml结合液，40μl预先混匀的磁珠，涡旋混匀10s。
2.5室温静置5min，将离心管短暂离心后置于磁力架上，静置5min，吸弃上清(小心操作，防止吸到磁珠)。
2.6取下离心管，向其中加入400μl洗涤液C，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力架上，静置1min，吸弃上清。
2.7加入200μl脱磺试剂(使用前需充分混匀)，涡旋混匀10s，室温(20℃～30℃)放置15min，短暂离心后将离心管置于磁力架上，静置1min，吸弃上清。
2.8取下离心管，向其中加入400μl洗涤液C，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力架上，静置1min，吸弃上清。
2.9取下离心管，短暂离心10s，将离心管置于磁力架上，静置1min，吸弃上清。
2.10将离心管转移至55℃金属浴中，开盖干燥3min。
2.11取出离心管，向其中加入50μl洗脱液，涡旋混匀30s，将离心管置于55℃金属浴中加热5min。
2.12取出离心管，涡旋混匀30s，短暂离心后转移至磁力架上，静置1min，然后将洗脱产物转移至无核酸酶的离心管中，-20℃保存备用。
实施例5
分别采用实施例1的试剂盒和对照试剂，按照实施例4的操作步骤，对孕妇Septin9基因高度甲基化，以孕妇血浆作为样本，对血清/血浆游离DNA提取及转化试剂性能进行评估。其中，采用实施例1的试剂盒时，蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL，将DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液、转化试剂助溶剂按体积比1:1:1:0.1混合均匀，制成DNA转化试剂混合溶液。
采用对照试剂时，所述DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液及转化试剂助溶剂的体积比为2:2.5:6:0.7，其余条件均与实施例1的试剂盒相同。
结果如下表及附图1-18所示：
表4
Figure BDA0002432218270000101
Figure BDA0002432218270000111
由上表可知，采用本发明的试剂，其检出率(灵敏度高)及检测效果(Ct值小)优于对照试剂。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种游离DNA提取及甲基化转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用磁珠法对样本中的游离DNA进行富集纯化；
步骤2：利用亚硫酸盐使步骤1中纯化后的DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转化成尿嘧啶；
步骤3：利用磁珠法对转化后的DNA进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种游离DNA提取及甲基化转化方法，其特征在于，所述样品包括血清、血浆样品；优选地，包括人血清、人血浆样品。
3.一种游离DNA提取及甲基化转化的试剂，其特征在于，包括磁珠、游离DNA提取试剂，DNA甲基化试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述游离DNA提取试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗脱液；
或/和所述DNA甲基化试剂包括DNA转化试剂、结合液、脱磺试剂、洗脱液；优选地，所述游离DNA提取试剂还包括蛋白酶K稀释液、洗涤液A和洗涤液B；优选地，所述DNA甲基化试剂还包括转化试剂溶解液、转化试剂助溶剂、转化试剂稀释液、洗涤液C。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述裂解液包括无核酸酶水、第一缓冲液、组分1和组分2；其中，所述组分1为异硫氰酸胍、盐酸胍或高氯酸钠中的至少一种；所述组分2为AEO、TritonX-100、SDS或PEG6000中的至少一种；
或/和所述蛋白酶K稀释液包括无核酸酶水、氯化钠及第一缓冲液；
或/和所述洗涤液A包括无核酸酶水、第二缓冲液、无机盐、醇溶液；
或/和所述洗涤液B包括无核酸酶水、氯化钠、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述洗脱液包括无核酸酶水、第二缓冲液；
优选地，所述第一缓冲液为Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；
优选地，所述第二缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或者TE缓冲液中的一种；优选地，所述无机盐溶液为氯化钠溶液、碘化钠溶液或碘化钾溶液中的至少一种；
优选地，所述醇溶液为异丙醇或无水乙醇中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述DNA转化试剂包括无核酸酶水、亚硫酸盐、氯化钠、第一缓冲液；
或/和所述转化试剂溶解液包括无核酸酶水、氢氧化物中的一种；
或/和所述转化试剂稀释液包括无核酸酶水、氯化钠溶液、第一缓冲液；
或/和所述转化试剂助溶剂包括无核酸酶水、二甲基甲酰胺；
或/和所述结合液包括氯化钾溶液、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述洗涤液C包括无核酸酶水、氯化钠溶液、第二缓冲液、醇溶液；
或/和所述脱磺试剂包括氯化钠溶液、碱液、醇溶液；
优选地，所述碱液中的碱为Tris碱或氢氧化物中的一种。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述裂解液的制备方法为：取无核酸酶水、组分1、组分2在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值为6.0-8.0，所述裂解液中组分1的含量为2-5M，组分2的质量含量或体积含量为2％-30％。
8.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述DNA转化试剂的制备方法为：取无核酸酶水、亚硫酸盐、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，然后用第一缓冲液调节PH值为6.0-8.0，所述DNA转化试剂中亚硫酸盐的含量为1-5M，氯化钠含量0.1-0.5M；
转化试剂溶解液的制备方法为：将无核酸酶水、氢氧化物，在室温条件下搅拌至溶解；氢氧化物的含量为0.1-1M；
转化试剂助溶剂的制备方法为：将无核酸酶水、二甲基甲酰胺，室温条件搅拌溶解；二甲基甲酰胺的含量为0.05-1M；
所述转化试剂稀释液的制备方法为：将无核酸酶水、氯化钠在室温条件下搅拌至溶解，再加入第一缓冲液调节pH值为6.0-8.0；所述转化试剂稀释液中氯化钠的含量为；
所述DNA转化试剂、转化试剂溶解液、转化试剂稀释液及转化试剂助溶剂的体积比为1-3:1-2:1-5:0.1-0.5。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述结合液的制备方法为：将氯化钾溶液、醇溶液混合均匀，然后用第二缓冲液调节PH值为6-7；所述结合液中氯化钾的含量为0.1-0.5M，醇溶液的体积含量为10-30％；
或/和所述脱磺试剂的制备方法为：将氯化钠溶液、碱液、醇溶液混合即得；所述脱磺试剂中，氯化钠的含量为0.1-1M、碱液的含量为0.5-1M，醇溶液的体积含量为5％-30％。
10.一种包含权利要求3-9任意一项所述试剂的试剂盒。
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