CN104805076A - 氧化石墨烯作为rna保护试剂的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，属于RNA纳米保护技术领域。氧化石墨烯生产工艺简单，易于获得，价格低廉，性质稳定，便于储存使用，不需要特定的冷冻储存环境，运输方便；将其作为RNA保护剂能有效的降低实验成本。氧化石墨烯RNA保护效应稳定，不会随着放置在室温中时间的增长而急剧降低。
Description
技术领域
本发明属于RNA纳米保护技术领域，特别涉及一种基于氧化石墨烯纳米材料吸附功能的RNA保护策略，该方案能够有效的阻断RNA保存过程中酶促降解过程。
背景技术
核糖核酸(RNA)存在于细胞及部分病毒、类病毒当中，并行使遗传信息载体的功能。其广泛参与各项重要的生命历程，对于生命活动的维系具有重要作用。根据RNA的功能可将RNA大致分为四类：1)mRNA：即信使RNA，主要功能是将DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，以传递遗传信息；2)tRNA：具有特异识别、转运氨基酸功能；3)rRNA：核糖体的重要组成成分。4)microRNA：具有调控功能。由此可见，RNA在生物体内，对于生物体生命活性具有重要意义。为了实现RNA功能探索及生理意义相关研究，通常需要对RNA进行分离纯化，并将纯化的RNA进行冷冻保存。然后，RNA的易降解性使RNA的保存面临严峻的挑战。目前，研究者通常采用添加RNA酶抑制剂的方法，人为添加RNA酶抑制剂到RNA溶液当中，以降低或抑制RNA酶的催化活性，从而达到RNA保护的目的。但此类方法所需的RNA酶抑制物往往存在成本很高、运输存储困难、易变质、活性不稳定等问题。因此，开发新型的、易储存运输、活性稳定的RNA保护策略对于RNA保护及相关领域具有重要意义。
近年来，随着纳米技术的进步，纳米材料已广泛运用于生命科学领域。其中，氧化石墨烯更是成为了“明星”纳米材料，并广泛运用于电子学、材料学、诊断学等学科。众所周知，氧化石墨烯能够通过π-π堆叠效应，吸附核酸及蛋白质，产生固定化作用，而固定化作用导致的分子自由度的变化可能会引起酶促反应过程的巨变，可以产生酶促反应过程的阻断。正如我们预想的那样，我们在实验过程中发现，在总RNA提取物中加入氧化石墨烯能够延长RNA的储存时间，氧化石墨烯似乎具有RNA保护功能。由此，我们对氧化石墨烯的RNA保护功能进行了深入的研究，并发现氧化石墨烯通过固定RNA，在其表面形成一个保护界面，可以有效的阻止RNA酶对RNA的降解。同时，我们发现氧化石墨烯能够固定RNA酶，固定后的RNA酶活性明显降低。因此，氧化石墨烯的RNA保护功能是通过对RNA及RNA酶的吸附，阻断了酶促反应过程而实现的。综上，本发明发展了氧化石墨烯RNA保护策略，能够克服当前RNA抑制剂保护方法存在的问题，其易于存储运输、性能稳定，通过后续实验发现，氧化石墨烯能够为RNA提供有效的保护。
发明内容
为了克服现有RNA保护技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用。本发明采用在RNA溶液中加入氧化石墨烯的方法，通过石墨烯的吸附作用，使RNA及RNA酶吸附在氧化石墨烯表面，从而使RNA酶的酶促反应过程得到抑制，达到RNA保护的目的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，包括如下步骤：将氧化石墨烯与RNA样品或RNA酶进行混合，震荡混匀，并室温放置5～15分钟，得到氧化石墨烯RNA混合液或氧化石墨烯RNA酶混合液；使氧化石墨烯充分吸附RNA，达到保护RNA的目的；
所述的氧化石墨烯，与RNA样品的质量比优选为1：(1～10)；
所述的氧化石墨烯，与RNA酶的比值优选为1μg：(1～40U)；
所述的氧化石墨烯RNA混合液，在常温下放置4天，RNA基本无降解；
所述的氧化石墨烯RNA酶混合液中，RNA酶活性大大降低，从而降低了RNA酶对RNA的降解能力。
所述的氧化石墨烯作为RNA保护试剂的新应用，包括以下具体步骤：
1、总RNA提取：
(1)选取单增李斯特菌作为研究对象，取菌液离心去上清(原则上每107个细胞加入1mL TRIZOL，不能超过108个细胞，8000g，4℃离心2min，去掉上清液体，仔细将上清液吸取干净，不要触及EP管底部的细菌)
(2)加入250μL，20mg/mL的溶菌酶(使用无RNA酶的TE溶解)吹打混匀，放入37℃的水浴锅或者培养箱中孵育10min。
(3)再加入1mL TRIZOL裂解液吹打混匀，再使用振荡器震荡，放置在常温下6～10min。(一定要室温静置，静置完毕后可以直接放入-80℃冰箱保存)。
(4)往步骤(3)中已经备好的裂解液中加入氯仿(TRIZOL 1/5的体积量，一般200μL左右，最多300μL)盖紧离心管盖，剧烈震荡，直到将混合液乳化成乳白色状态。室温静置5min。
(5)将上层无色液体转移至一新的离心管中(上层液体吸取时尽量使用200μL的枪头，尽量不要吸取到中间蛋白层，一般取600μL足矣)。
(6)向吸取的上清液中加入0.5～1倍体积的异丙醇(最多750μL，并且异丙醇要置入-20℃冰箱中提前预冷)，上下颠倒混匀后，4℃静置10min。12000g，4℃离心10min。
(7)小心去掉上清液(先倾倒出液体，再使用200μL的枪头将剩余的异丙醇吸掉，在吸取异丙醇的时候一定不要触及底部的RNA沉淀，宁可剩余一点异丙醇在EP管内)，加入75％的乙醇约1.5mL，(乙醇一定要在-20℃预冷，使用DEPC处理水配制)，尽量吹打3～5次，然后再振荡器再使用振荡器震荡3～5次(每次1～2s，动作不能太剧烈，再轻弹管壁使得RNA悬浮起来。)，7500g，4℃离心5min。
(8)打开离心管盖，室温干燥5～10min(打开操作台上的风扇吹，切不可太干)，干燥完毕后，加入适量的无RNA酶水或者DEPC处理水溶解(一般取50μL，反复吹打溶解，清洗EP管底部的位置30～50次左右)，得到总RNA提取原液。
(9)电泳检测并评估提取总RNA的纯度和保存完好程度。
步骤(1)中所述的单增李斯特菌细胞数量优选107个；
步骤(2)所述的溶菌酶需要严格防止RNA酶的污染，以免对实验产生干扰；
步骤(3)中所用TRIZOL试剂优选Life Technologies品牌；
步骤(5)中所述的离心管需要用DEPC处理；
步骤(6)中所述的异丙醇需要在-20℃冰箱预冷，预冷时间优选24小时；
步骤(8)中RNA干燥方式优选风扇干燥，以免是RNA无法溶解；
步骤(9)中所述的电泳过程中所涉及的所有电泳试剂、器皿都需要用DEPC处理；
2、氧化石墨烯RNA保护原理探究
(1)验证RNA酶能否降解被氧化石墨烯吸附的RNA
①取步骤1中所得总RNA提取物。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入39μL无RNA酶的水补足至90μL，震荡混匀，并室温放置5～15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。所述的氧化石墨烯与总RNA的质量比优选为1：(1～10)。
③向上述混合体系中，加入RNA酶10μL，充分混匀，并37℃孵育30分钟，得反应液。
④配制1％的琼脂糖凝胶，冷却备用。
⑤取出步骤③中反应液8μL，加入10×RNA荧光染料(SYBR Gold)2μL，混匀并染色10min。然后，再加入电泳载样缓冲液(Loading Buffer，6×)2μL，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。
⑥取步骤④中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤⑤所述混合液的电泳分析(电压：120V，45min)。
⑦凝胶成像，并观察记录实验结果。通过电泳结果验证石墨烯吸附的RNA是否稳定存在即可验证该原理是否成立。
步骤①中所述的总RNA提取物，在使用之前需要用吸收光谱仪定量，以确保后续实验的顺利展开。一般地，该提取物中RNA原液的量为100μg/mL左右。
步骤②中所述的氧化石墨烯优选南京先丰纳米材料科技有限公司产品。
步骤③中所述的RNA酶优选NEW ENGLAND BioLabs产品。
步骤⑤中所述的SYBR Gold优选Life Technologies产品。
(2)验证被氧化石墨烯固定化RNA酶的酶活是否有改变
①取RNA酶原液。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入到步骤①中所述RNA酶原液，并加入39μL无RNA酶的水补足至50μL，震荡混匀，并室温放置5～15分钟，使氧化石墨烯充分吸附RNA酶。所述的氧化石墨烯与RNA酶的比值优选为1μg：(1～40U)。
③向上述混合体系中，加入50μL步骤1中所得RNA提取物，充分混匀，并37℃孵育30分钟。
④配制1％的琼脂糖凝胶，冷却备用。
⑤取出步骤③中反应液8μL，加入10×RNA荧光染料(SYBR Gold)2μL，混匀并染色10min。然后，再加入电泳载样缓冲液(Loading Buffer，6×)2μL，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。
⑥取步骤④中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤⑤所述混合液的电泳分析(电压：120V，45min)。
⑦凝胶成像，并观察记录实验结果。通过电泳结果验证加入的RNA提取物是否稳定及条带的完整性即可验证该原理是否成立。
3、氧化石墨烯RNA保护原理验证
(1)验证氧化石墨烯在空气中保护RNA能力。
①取步骤1中所得总RNA提取物50μL。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入49μL无RNA酶的水补足至100μL，震荡混匀，并室温放置5～15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。
③另取步骤1中所得总RNA提取物50μL。加入无RNA酶的水补足至100μL。
④将步骤②，③所得实验组，开盖暴露于空气中，常温放置24小时。
⑤取步骤④中处理后的实验组，进行琼脂糖凝胶电泳实验(电压：120V，45min)。并分析电泳条带、评价RNA的完好程度。
(2)验证氧化石墨烯对抗RNA酶降解能力
①取步骤1中所得总RNA提取物50μL。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入39μL无RNA酶的水补足至90μL，震荡混匀，并室温放置5～15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。加入RNA酶10μL，充分混匀。
③另取步骤1中所得总RNA提取物50μL。加入无RNA酶的水补足至100μL。
④将步骤②，③所得实验组，并37℃孵育30分钟。
⑤取步骤④中处理后的实验组，进行琼脂糖凝胶电泳实验(电压：120V，45min)。并分析电泳条带用于评价RNA的完好程度。
4、氧化石墨烯RNA保护效应的能力极限探究
(1)保护时间极限
①取750μL步骤1中所得总RNA提取物，并加入15μL氧化石墨烯原液(1mg/mL)，充分混匀后，等量分装至15个200μL的离心管中，每管51μL。
②分别在上述离心管中，加入49μL无RNA酶的纯水。充分混匀备用。
③将上述15组样品暴露于空气当中，并室温放置。
④每隔24小时，取一管样品，并用琼脂糖凝胶电泳评价每个实验组中总RNA提取物的完整程度。以此完成15天的监测过程。
⑤汇总实验结果，并根据15个样品总RNA提取物的完好程度及变化趋势去评价氧化石墨烯提供的RNA保护时间的极限。
(2)氧化石墨烯耐受RNA酶极限
①取8μL氧化石墨烯原液(初始浓度1mg/mL)，并均分入200μL离心管中，每组1μL。
②将RNA酶原液梯度稀释，稀释7次，每次均稀释10倍，形成浓度为100、101、102、103、104、105、106、107倍稀释的RNA酶溶液。
③向步骤①中所述的氧化石墨烯溶液中加入等量的(50μg/μL)总RNA提取物，并随之加入梯度稀释的RNA酶溶液。充分混匀，得到8组氧化石墨烯-总RNA-RNA酶混合液备用。
④将步骤③中所得的混合液37℃孵育30min。
⑤配制1％的琼脂糖凝胶，冷却备用。
⑥取出步骤④中反应液8μL，加入10×RNA荧光染料(SYBR Gold)2μL，混匀并染色10min。然后，再加入电泳载样缓冲液(Loading Buffer，6×)2μL，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。
⑦取步骤⑥中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤④所述混合液的电泳分析(电压：120V，45min)。
⑧凝胶成像，并观察记录实验结果。根据电泳结果中RNA的完整程度及变化趋势，判断单位氧化石墨烯耐受RNA酶的极限能力。
5、氧化石墨烯RNA保护效应在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中运用
(1)构建RNA反转录反应体系
本反应体系将M-MuLV反转录酶作为反应该反应体系的反转录扩增酶，主要通过以下步骤实现：
①配置10×反转录酶反应缓冲液，该反应溶液包括750mM KCl、500mMTris-HCl、30mM MgCl2、10mM DTT。
②构建反转录反应体系，其包含氧化石墨烯保护的总RNA(1μL)、1×的反转录酶反应缓冲液、2.5mM的dNTP、M-MuLV反转录酶20U，终体积为25μL。将各组分混合后充分混匀后备用。
③将上述反应混合液放入PCR中，先在16℃孵育20分钟，使M-MuLV反转录酶与RNA组充分结合，然后42℃反应40分钟。至此，反转录反应体系完成。最终，得到cDNA产物。
(2)构建PCR反应体系
本反应步骤承接上述步骤(1)，并行使扩增步骤(1)中所得cDNA的功能。主要通过以下步骤实现：
①配置10×PCR反应缓冲液，该反应溶液由100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mMKCl、15mM MgCl2组成。
②构建PCR反应体系，其包含1×PCR反应缓冲液、7.5个单位的taq酶、正向引物和反向引物(10μM)各1μL、10μL的cDNA产物，终体积为25μL。PCR反应条件为94℃变性10秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，循环30次。最终得到逆转录PCR产物。
③电泳分析逆转录PCR产物，用以评价氧化石墨烯保护效应在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中运用的效果。
本发明旨在于开发一种基于氧化石墨烯纳米材料的RNA保护策略，相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用氧化石墨烯作为RNA保护试剂，利用氧化石墨烯对蛋白及RNA的吸附作用，以达到RNA保护的目的。
(2)氧化石墨烯性质稳定，便于储存使用，不需要特定的冷冻储存环境，运输方便。
(3)氧化石墨烯RNA保护效应稳定，不会随着放置在室温中时间的增长而急剧降低。
(4)此功能的发现尚属首次，创新性高。
(5)氧化石墨烯生产工艺简单，易于获得。
(6)氧化石墨烯价格低廉，将其作为RNA保护剂能有效的降低实验成本。
附图说明
图1是实施例1获得的总RNA提取电泳图；其中，泳道M为DL2000DNAMarker，泳道1、2、3为提取的总RNA。
图2是氧化石墨烯RNA保护机制原理图。
图3是实施例2验证RNA酶能否降解被氧化石墨烯吸附的RNA的电泳图；其中，泳道Marker为DL2000DNA Marker，泳道G1为氧化石墨烯吸附的总RNA，泳道G2为氧化石墨烯吸附的总RNA及RNA酶。
图4是实施例2验证被氧化石墨烯固定化RNA酶的酶活是否有改变的电泳图；其中，泳道Marker为DL2000DNA Marker，泳道T1为总RNA提取物，泳道T2为总RNA提取物+RNA酶，泳道T3为总RNA提取物+氧化石墨烯固定化RNA酶。
图5是实施例2评价氧化石墨烯对暴露在空气中的总RNA保护能力的电泳图；其中，泳道Marker为DL2000DNA Marker，N1为新的总RNA提取物，N2为氧化石墨烯保护的总RNA，泳道N3为无氧化石墨烯保护的总RNA。
图6是实施例3验证氧化石墨烯对暴露在空气中的总RNA保护能力的电泳图；其中，泳道Marker为DL2000DNA Marker，泳道a为新的总RNA提取物，泳道b为总RNA提取物+RNA酶，泳道c为总RNA提取物+氧化石墨烯+RNA酶，泳道d为总RNA提取物暴露于空气24小时，泳道e为总RNA提取物+氧化石墨烯暴露于空气24小时。
图7是实施例4氧化石墨烯RNA保护效应的时间极限探究。
图8是实施例5氧化石墨烯RNA保护效应在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中的运用；其中，对照组为无RNA，实验组为总RNA提取物+氧化石墨烯。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1总RNA提取
(1)本实施例选取单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(购买于广州微生物研究所，菌种编号：CMCC54007)作为研究对象，将单增李斯特菌复苏后，液体培养过夜(LB培养基，37℃培养)，取1mL菌液并离心(8000g，4℃离心2min)去上清(仔细将上清液吸取干净，不要触及EP管底部的细菌)，得到菌体沉淀。
(2)由于单增李斯特菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，故需要向步骤(1)中所述菌体沉淀中，加入250μL(20mg/mL)的溶菌酶(使用无RNA酶的TE溶解)(需要严格防止RNA酶的污染，以免对实验产生干扰)吹打混匀，放入37℃的水浴锅或者培养箱中孵育10min。使菌体破壁，以达到较好的提取效果。
(3)再加入1mL TRIZOL裂解液(Life Technologies)吹打混匀，再使用振荡器震荡，放置在常温下6～10min。此步骤一定要室温静置，冷冻或冷藏都会降低破壁效率，静置完毕后可以直接放入-80℃冰箱保存，以备后续使用。
(4)往步骤(3)中已经备好的裂解液中加入氯仿(TRIZOL 1/5的体积量，一般200μL左右，最多300μL)盖紧离心管盖，剧烈震荡，直到将混合液乳化成乳白色状态。室温静置5min。由于氯仿易挥发，此过程需注意离心管盖弹开。
(5)12000g离心15min，混合液分层，上层为RNA层，中层为蛋白层，下层为有机相层。将上层无色液体(上清液)转移至一新的离心管(离心管需要预先用DEPC处理)中(上层液体吸取时尽量使用200μL的枪头，尽量不要吸取到中间蛋白层，一般取600μL足矣)。
(6)向吸取的上清液中加入等体积的异丙醇(在-20℃冰箱预冷，预冷时间为24小时)，上下颠倒混匀后，4℃静置10min。12000g，4℃离心10min。
(7)小心去掉上清液(先倾倒出液体，再使用200μL的枪头将剩余的异丙醇吸掉，在吸取异丙醇的时候一定不要触及底部的RNA沉淀，宁可剩余一点异丙醇在EP管内)，加入75(v/v)％的乙醇约1.5mL，(乙醇一定要在-20℃预冷，使用DEPC处理水配制)，尽量吹打3～5次，然后再振荡器再使用振荡器震荡3～5次(每次1～2s，动作不能太剧烈，再轻弹管壁使得RNA悬浮起来)，7500g，4℃离心5min。
(8)打开离心管盖，室温干燥5～10min(打开操作台上的风扇吹，切不可太干，以免是RNA无法溶解)，干燥完毕后，加入适量的无RNA酶水或者DEPC处理水溶解(一般取50μL，反复吹打溶解，清洗EP管底部的位置30～50次左右)，得到总RNA提取物。所述的总RNA提取物，在使用之前需要用吸收光谱仪定量，以确保后续实验的顺利展开。一般地，该提取物中RNA原液的量为100μg/mL左右。
(9)电泳检测并评估提取总RNA的纯度和保存完好程度。
总RNA提取物的电泳实验结果如图1所示，每个样品组都有三条电泳带，分别为5s RNA、18s RNA及28s RNA。该结果符合总RNA提取原理。由图1可知，得到的总RNA条带清晰，亮度较强。由此，可判定总RNA提取有效、且提取效果较好。电泳过程中所涉及的所有电泳试剂、器皿都需要用DEPC处理。
实施例2氧化石墨烯RNA保护原理探究
本实施例的目的在于探究氧化石墨烯RNA保护的原理。于此，我们整理并推测了氧化石墨烯RNA保护作用的可能性机制，并将其整理到图2当中。本实施例主要通过以下实验完成：
(1)验证RNA酶能否降解被氧化石墨烯吸附的RNA(如图2B所示)
①取实施例1中所得总RNA提取物50μL。
②取1μL氧化石墨烯(购自南京先丰纳米材料科技有限公司)(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入39μL无RNA酶的水补足至90μL，震荡混匀，并室温放置15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。
③向上述混合体系中，加入RNA酶(NEW ENGLAND BioLabs)10μL，充分混匀，并37℃孵育30分钟，得反应液。
④配制1(w/v)％的琼脂糖凝胶，冷却备用。
⑤取出步骤③中反应液8μL，加入10×RNA荧光染料(SYBR Gold)2μL，混匀并染色10min。然后，再加入电泳载样缓冲液(Loading Buffer，6×)2μL，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。
⑥取步骤④中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤⑤所述混合液的电泳分析(电压：120V，45min)。
⑦凝胶成像，并观察记录实验结果。通过电泳结果验证氧化石墨烯吸附的RNA是否稳定存在即可验证该原理是否成立。
实验结果如图3所示，被氧化石墨烯吸附的总RNA提取物保持稳定(G1实验组)，即使加入了RNA酶(G2)，总RNA提取同样保持稳定。由此可知，氧化石墨烯对RNA的吸附导致了RNA酶促降解的阻断，从而保护了RNA。
(2)验证被氧化石墨烯固定化RNA酶的酶活是否有改变
①取RNA酶原液10μL。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入到步骤①中所述RNA酶原液，并加入39μL无RNA酶的水补足至50μL，震荡混匀，并室温放置15分钟，使氧化石墨烯充分吸附RNA酶。
③向上述混合体系中，加入50μL实施例1中所得总RNA提取物，充分混匀，并37℃孵育30分钟，得反应液。
④配制1％的琼脂糖凝胶，冷却备用。
⑤取出步骤③中反应液8μL，加入10×RNA荧光染料(SYBR Gold，LifeTechnologies)2μL，混匀并染色10min。然后，再加入电泳载样缓冲液(LoadingBuffer，6×)2μL，并剧烈震荡。最终得到用于电泳分析的混合液。
⑥取步骤④中预先制备好的琼脂糖凝胶，用于步骤⑤所述混合液的电泳分析(电压：120V，45min)
⑦凝胶成像，并观察记录实验结果。通过电泳结果验证加入的总RNA提取物是否稳定及条带的完整性即可验证该原理是否成立。
电泳实验结果如图4所示，被氧化石墨烯吸附而固定化的RNA酶(T3实验组)，其活性降低，而游离的RNA酶使总RNA提取物(T2实验组)几乎降解完全。由此可知，氧化石墨烯的固定化作用使RNA酶活性大大降低。
综上(1)(2)，总RNA提取物在被氧化石墨烯吸附后，形成了保护界面使RNA酶的降解作用受到了极大的抑制。与此同时，被固定化的RNA酶活性大大降低，从而降低了RNA酶对RNA的降解能力。以上两种作用共同介导了氧化石墨烯对RNA的保护能力(如图2C所示)。
在以上实验基础上，我们评价了氧化石墨烯对暴露在空气中的总RNA的保护能力。实验结果如图5所示，氧化石墨烯能够为暴露在空气中的总RNA提供较好的保护(N2实验组)，而无氧化石墨烯保护的总RNA被空气中的RNA酶所降解。
实施例3氧化石墨烯RNA保护原理验证
(1)验证氧化石墨烯对抗RNA酶降解能力
①取实施例1中所得总RNA提取物50μL。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入39μL无RNA酶的水补足至90μL，震荡混匀，并室温放置15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。加入RNA酶10μL，充分混匀。
③另取实施例1中所得总RNA提取物50μL，加入无RNA酶的水补足至100μL。
④将步骤②，③所得实验组，并37℃孵育30分钟。
⑤取步骤④中处理后的实验组，进行琼脂糖凝胶电泳实验(电压：120V，45min)。并分析电泳条带用于评价RNA的完好程度。实验结果如图6所示，总RNA在RNA酶的作用下，出现了很大程度的降解，电泳条带变模糊(条带b)。而加入了氧化石墨烯的总RNA保持完整(条带c)。由此可知，氧化石墨烯能够对抗RNA酶的降解，从而达到RNA保护的目的。
(2)验证氧化石墨烯在空气中保护RNA能力
①取实施例1中所得总RNA提取物50μL。
②取1μL氧化石墨烯(1mg/mL)，加入步骤①中所述总RNA提取物，并加入49μL无RNA酶的水补足至100μL，震荡混匀，并室温放置15分钟，使氧化石墨烯充分吸附。
③另取实施例1中所得总RNA提取物50μL，加入无RNA酶的水补足至100μL。
④将步骤②，③所得实验组，开盖暴露于空气中，常温放置24小时。
⑤取步骤④中处理后的实验组，进行琼脂糖凝胶电泳实验(电压：120V，45min)。并分析电泳条带、评价RNA的完好程度。实验结果如图6所示(条带d和e)，氧化石墨烯能为RNA提供有效的保护，即使是将RNA暴露于空气中24h，也能得到清晰的，完好的条带。
实施例4氧化石墨烯RNA保护效应的保护时间极限探究
①取750μL实施例1中所得总RNA提取物，并加入15μL氧化石墨烯原液(1mg/mL)，充分混匀后，等量分装至15个200μL的离心管中，每管51μL。
②分别在上述离心管中，加入49μL无RNA酶的纯水，充分混匀备用。
③将上述14组样品暴露于空气当中，并室温放置。
④每隔24小时，取一管样品，并用紫外吸收光谱仪(购买于美国PerkinElmer公司，型号lamda35)去评价每个实验组中总RNA提取物的完整程度。以此完成14天的监测过程。
⑤汇总实验结果，并根据14个样品总RNA提取物的完好程度及变化趋势去评价氧化石墨烯提供的RNA保护时间的极限。由图7A可知，氧化石墨烯能够为RNA提供长达4天的保护。而未加氧化石墨烯的RNA，出现了严重的降解。
(2)氧化石墨烯耐受RNA酶极限
①取12μL氧化石墨烯原液(初始浓度1mg/mL)，并均分入200μL离心管中，每组1μL。
②向以上石墨烯溶液中分别加入10～120U的RNA酶，每隔10U设置一实验组。
③向步骤①中所述的氧化石墨烯溶液中加入等量(1μL)的(50μg/μL)总RNA提取物，并随之加入梯度稀释的RNA酶溶液。充分混匀，得到12组氧化石墨烯-总RNA-RNA酶混合液备用。
④将步骤③中所得的混合液37℃孵育30min。
⑤用紫外吸收光谱仪去评价每个实验组中总RNA提取物的完整程度。
由图7B可知，氧化石墨烯能够为RNA提供有效的保护。能够对抗40U RNA酶的降解。
实施例5氧化石墨烯RNA保护效应在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中运用
(1)构建RNA反转录反应体系
本反应体系将M-MuLV反转录酶作为反应该反应体系的反转录扩增酶，主要通过以下步骤实现：
①配置10×反转录酶反应缓冲液，该反应溶液包括750mM KCl、500mMTris-HCl、30mM MgCl2、10mM DTT。
②构建反转录反应体系，其包含氧化石墨烯保护的总RNA(1μL)、1×的反转录酶反应缓冲液、2.5mM的dNTP、M-MuLV反转录酶20U，终体积为25μL。将各组分混合后充分混匀后备用。
③将上述反应混合液放入PCR中，先在16℃孵育20分钟，使M-MuLV反转录酶与RNA组充分结合，然后42℃反应40分钟。至此，反转录反应体系完成。最终，得到cDNA产物。
(2)构建PCR反应体系
本反应步骤承接上述步骤(1)，并行使扩增步骤(1)中所得cDNA的功能。主要通过以下步骤实现：
①配置10×PCR反应缓冲液，该反应溶液由100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl、15mM MgCl2组成。
②构建PCR反应体系，其包含1×PCR反应缓冲液、7.5个单位的taq酶、正向引物和反向引物(10μM)各1μL、10μL的cDNA产物，终体积为25μL。PCR反应条件为94℃变性10秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，循环30次。最终得到逆转录PCR产物。
引物序列为：1.正向引物：ACAAGCAGCTCCAGTAGTTA，2.反向引物：CTGGTTTTGCAGCTTCTGTT。该组引物借鉴于VIJAY K.JUNEJA等人发表在APPLIED AND E NVIRONMENTAL MICROBIOLOGY杂志上的文章，题目为Sensitive Detection of Viable Listeria monocytogenes by ReverseTranscription-PCR。
③电泳分析逆转录PCR产物，用以评价氧化石墨烯保护效应在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中运用的效果。
④荧光分析逆转录PCR产物。
由图8可知，对照组中无RNA样品，无法获得电泳条带；由氧化石墨烯保护的RNA能被扩增出清晰电泳条带，荧光分析也能证明氧化石墨烯RNA保护效应并不影响逆转录聚合酶链式反应的进行。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.氧化石墨烯作为RNA保护试剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于包括如下步骤：将氧化石墨烯与RNA样品或RNA酶进行混合，震荡混匀，并室温放置，得到氧化石墨烯RNA混合液或氧化石墨烯RNA酶混合液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的氧化石墨烯，与RNA样品的质量比为1：(1～10)。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的氧化石墨烯，与RNA酶的比值为1μg：(1～40U)。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的室温放置的时间为5～15分钟。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的氧化石墨烯RNA混合液，在常温下放置4天，RNA基本无降解。
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