JPWO2018168986A1 - 遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット - Google Patents
遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018168986A1 JPWO2018168986A1 JP2019506251A JP2019506251A JPWO2018168986A1 JP WO2018168986 A1 JPWO2018168986 A1 JP WO2018168986A1 JP 2019506251 A JP2019506251 A JP 2019506251A JP 2019506251 A JP2019506251 A JP 2019506251A JP WO2018168986 A1 JPWO2018168986 A1 JP WO2018168986A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- filter
- genetic test
- test method
- detection target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 76
- 238000010998 test method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 71
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 156
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 28
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 20
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 claims description 16
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 9
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 8
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 8
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 8
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 229920005553 polystyrene-acrylate Polymers 0.000 claims description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 3
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 claims description 3
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 3
- 241000369757 Sapovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 3
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 claims description 3
- 108010081577 aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 2
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 claims description 2
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 claims 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 claims 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 24
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 17
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 2
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 2
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000124429 Phlox Species 0.000 description 2
- 239000004699 Ultra-high molecular weight polyethylene Substances 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229920000785 ultra high molecular weight polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011345 viscous material Substances 0.000 description 2
- BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 1,1-Difluoroethene Chemical compound FC(F)=C BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101150051438 CYP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- IKWOQYSBHRZITG-UHFFFAOYSA-N FC(=C(F)F)F.[Si] Chemical group FC(=C(F)F)F.[Si] IKWOQYSBHRZITG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150019793 G2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 101150019913 MTHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 101150067366 adh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 101150055425 aldh gene Proteins 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000013013 elastic material Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000012755 real-time RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012858 resilient material Substances 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical group FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/26—Inoculator or sampler
- C12M1/28—Inoculator or sampler being part of container
- C12M1/30—Sampler being a swab
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本発明の目的は、遺伝子検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法を提供すること、及び、そのような方法において使用されるキットを提供することである。即ち、本発明は、被検出物を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出物の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法を提供する。特定の実施態様において、本発明の遺伝子検査方法及びキットは、ろ過フィルターとして焼結フィルターを用いる。
Description
本発明は、遺伝子検査方法及び遺伝子検査キットに関する。
種々の遺伝子検査方法が知られている（たとえば、非特許文献１および特許文献１）。遺伝子検査に用いる試料の中には種々の物質が混入している。これらの混入物は、検査方法に影響を与えて感度を低下させたり、偽陽性等の結果をもたらしたり、さらには、検査に用いる機器のトラブル（たとえば、流路系の詰まり）の原因となったりする可能性がある。従来、この混入物を除去するために遠心分離法などを用いていたが、専用機器が必要であり、操作が煩雑で時間を要する。
特許文献２には、特異的結合能を有する捕捉試薬（例えば、特定の抗原に対する抗体等）による検出を意図したメンブレンアッセイ法を用いた検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法が開示されている。
日本国特許庁ホームページ掲載、標準技術集「核酸の増幅及び検出」（掲載日：２００１年８月２８日）
本発明の目的は、遺伝子検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法を提供すること、及び、そのような方法において使用されるキットを提供することである。
本発明者は、遺伝子検査方法において、被検出物を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被測定物の存在を検出又は定量することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。
［項１］ 被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
［項２］ ろ過フィルターが焼結フィルターである項１に記載の遺伝子検査方法。
［項３］ 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される項２に記載の遺伝子検査方法。
［項４］ 焼結フィルターの孔径が１０〜１００μｍである項２に記載の遺伝子検査方法。
［項５］ 遠心分離による前処理を必要としない項１に記載の遺伝子検査方法。
［項６］ 検体採取器具として綿棒またはスワブを用いて被検出対象を含む検体を採取して試料とし、アッセイに用いる、項１に記載の遺伝子検査方法。
［項７］ 検体が生体試料である項６に記載の遺伝子検査方法。
［項８］ 検体がヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体である項７に記載の遺伝子検査方法。
［項９］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１０］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項９に記載の遺伝子検査方法。
［項１１］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１２］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１１に記載の遺伝子検査方法。
［項１３］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１４］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１３に記載の遺伝子検査方法。
［項１５］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１６］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である項１５に記載の遺伝子検査方法。
［項１７］ ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
［項１８］ 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる項１７記載の遺伝子検査方法。
［項１９］ 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キット。
（１）焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。
［項２０］ さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項２１］ さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項１］ 被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
［項２］ ろ過フィルターが焼結フィルターである項１に記載の遺伝子検査方法。
［項３］ 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される項２に記載の遺伝子検査方法。
［項４］ 焼結フィルターの孔径が１０〜１００μｍである項２に記載の遺伝子検査方法。
［項５］ 遠心分離による前処理を必要としない項１に記載の遺伝子検査方法。
［項６］ 検体採取器具として綿棒またはスワブを用いて被検出対象を含む検体を採取して試料とし、アッセイに用いる、項１に記載の遺伝子検査方法。
［項７］ 検体が生体試料である項６に記載の遺伝子検査方法。
［項８］ 検体がヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体である項７に記載の遺伝子検査方法。
［項９］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１０］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項９に記載の遺伝子検査方法。
［項１１］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１２］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１１に記載の遺伝子検査方法。
［項１３］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１４］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である項１３に記載の遺伝子検査方法。
［項１５］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である項８に記載の遺伝子検査方法。
［項１６］ 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である項１５に記載の遺伝子検査方法。
［項１７］ ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
［項１８］ 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる項１７記載の遺伝子検査方法。
［項１９］ 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キット。
（１）焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。
［項２０］ さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む項１９記載の遺伝子検査キット。
［項２１］ さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む項１９記載の遺伝子検査キット。
本発明の方法又は装置を用いて検体試料中の被検出対象を検出・定量する場合、検体が口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物等の不純物を多く含む検体であっても、検体採取器具及び／又はろ過フィルターにより検体量を減らすことなく、不純物を除去することができる。その結果、不純物に影響されることなく、正確な結果を得ることができる。また、本発明によれば、遠心分離法による前処理を行う必要がないので、遠心分離を行う場合に必要となる専用機器や操作の手間が不要となり、より簡便に、短時間に、正確な結果を得ることが可能となる。
本発明の実施態様のひとつは、被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法である。また、具体的には、採取器具を用いて被検対象を採取した後、当該被検対象を含む採取器具を容器に入れ、容器内の液に懸濁したのち、採取器具を容器から取り出し、容器に本発明のフィルターを取り付け、容器内部の液をフィルターに通過させて容器外へと溶出させ、当該溶出液中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法である。
本発明において遺伝子検査方法は特に限定されず、たとえば、遺伝子の配列情報を根拠に病気や感染などを検査できる方法であればよい。具体的には、たとえば、試料から特定の感染源や病気に特有の塩基（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の部分配列を検出したり、多型（たとえば、一塩基多型（ＳＮＰ））を検出する態様が挙げられる。
前記の遺伝子検査方法に用いる検出原理は特に限定されず、たとえば、対立遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、変性勾配ゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＰＣＲなどの方法で増幅させた試料に適当なプローブ（たとえば、Ｑプローブ）をハイブリダイズさせて融解曲線分析を行う方法など種々の公知の方法を用いることができる。
前記の遺伝子検査方法に用いる検出原理は特に限定されず、たとえば、対立遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、変性勾配ゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＰＣＲなどの方法で増幅させた試料に適当なプローブ（たとえば、Ｑプローブ）をハイブリダイズさせて融解曲線分析を行う方法など種々の公知の方法を用いることができる。
本発明において被検出対象は特に限定されない。たとえば、ゲノム、構造遺伝子、調節遺伝子、遺伝子転写産物（ｍＲＮＡまたはその前駆体など）、あるいはそれらの断片などの一部に存在する特定の核酸、特定のオリゴヌクレオチド部分、特定のポリヌクレオチド部分などが挙げられる。それらはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであっても良いし、両者のキメラであっても良い。
前記被検出対象を含む試料は、生体などから採取されたもの（たとえば、被検出対象を含む検体そのもの）であっても良いし、何らかの手段で前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が複製または増幅などされたものであっても良い。複製または増幅に用いる方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法など種々の公知の方法を用いることができる。
また、前記被検出対象を含む試料は、何らかの物理化学的手段により前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が修飾または分解などされたものであっても良い。
前記被検出対象を含む試料は、生体などから採取されたもの（たとえば、被検出対象を含む検体そのもの）であっても良いし、何らかの手段で前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が複製または増幅などされたものであっても良い。複製または増幅に用いる方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法など種々の公知の方法を用いることができる。
また、前記被検出対象を含む試料は、何らかの物理化学的手段により前記検体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ等が修飾または分解などされたものであっても良い。
前記において、ＤＮＡの複製または増幅をＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、α型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＤＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
また前記において、ＲＮＡの検出をＲＴ−ＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、ＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、逆転写活性を有するＴｔｈポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＲＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
また前記において、ＲＮＡの検出をＲＴ−ＰＣＲ法で行う場合は、特に限定はされないが、ＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼ（または、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましく、逆転写活性を有するＴｔｈポリメラーゼを用いることがさらに好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、試料からのＲＮＡの抽出または精製を行うことなく、簡便なろ過操作のみで、被検出対象の存在を検出又は定量することができる。
本発明において、被検出対象を含む試料は、ろ過フィルターを用いてろ過される。ろ過フィルターは遺伝子検査装置のシリカモノリス等の目詰まりや偽陽性及びろ過フィルター自身の目詰まりを防ぐため、１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良いが、本発明においては、少なくとも１種のろ過フィルターを含むことが必要である。
前記ろ過フィルターとしては、特に限定されないが、焼結フィルターを用いることが好ましい。焼結フィルターの素材は特に限定されないが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択されることが好ましい。
前記ろ過フィルターは、外部からの力に対して変形しにくいフィルター（強剛性フィルター）であることが好ましい。
たとえば、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターはろ過チューブ内の検体試料等の液体や空気の圧力を受ける。または、チューブが弾力のある素材のものであれば人が直接手で容器を押えることにより圧力を受ける。このとき、フィルターの厚さ方向の潰れや湾曲等の変形が発生する可能性があるが、これらの現象はフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ、フィルター自身が目詰まりする原因となる。本発明に用いるろ過フィルターは、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているフィルターであることが好ましい。別の言い方では、ろ液の圧力によってもフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えたフィルターであることが好ましい。
たとえば、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターはろ過チューブ内の検体試料等の液体や空気の圧力を受ける。または、チューブが弾力のある素材のものであれば人が直接手で容器を押えることにより圧力を受ける。このとき、フィルターの厚さ方向の潰れや湾曲等の変形が発生する可能性があるが、これらの現象はフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ、フィルター自身が目詰まりする原因となる。本発明に用いるろ過フィルターは、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液を遺伝子検査試薬を添加した容器（例えば、チューブ等）等に滴下する際に、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているフィルターであることが好ましい。別の言い方では、ろ液の圧力によってもフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えたフィルターであることが好ましい。
前記ろ過フィルターは変形しにくいため、目詰まりが起こりにくい。また、積層したり、あるいは厚さを数ｍｍ〜数ｃｍ程度に厚く加工することができるため、それにより有効ろ過面積が大きくできるため、目詰まりが起こりにくい。
フィルターの厚さ方向に潰れにくい剛性を備えているとは、例えば、検体試料をろ過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が０．２［ＭＰａ］を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が５％以上とならず、好ましくは２％以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかってもろ過時のフィルターの曲率半径が２ｃｍ以下とならないことをいう。
フィルターの厚さ方向に潰れにくい剛性を備えているとは、例えば、検体試料をろ過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が０．２［ＭＰａ］を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が５％以上とならず、好ましくは２％以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかってもろ過時のフィルターの曲率半径が２ｃｍ以下とならないことをいう。
前記ろ過フィルターとしては各種の金属繊維をワインドしたもの、金属繊維の不織布を用いたもの、プラスチックスを発泡させたもの、金属メッシュを層状に重ね合わせたもの、金属、プラスチックス、セラミック等の粉末や金属繊維を熱や圧力で接着した焼結フィルターが挙げられ、いずれも本発明において使用可能である。
前記焼結フィルターは、たとえば、金属、セラミック、プラスチック等の粉末粒子や金属繊維を熱及び圧力により直接接着（焼結）することにより製造できる。本発明に用いられる焼結フィルターは、例えば、フィルターの原料となる繊維等の素材をフィルター原料の融点×０．３〜０．７℃程度の加熱処理により焼結することで得ることができ、好ましくはフィルター原料の融点×０．５℃程度の加熱処理により焼結することにより得ることができる。強剛性フィルターの中でも焼結フィルターは、１）安価である、２）粒子の大きさにより孔径を制御することが可能である、３）大量製造に向く、４）生体物質との親和性が低いため被検出対象を含む試料と特異的に結合しない、５）液体中の水分の吸収がほとんどない、６）粒子の大きさにより様々な孔径のものを作製できる、という特徴を有するので、生体物質を含む検体試料のろ過に好ましい。
前記焼結フィルターの素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン（低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂、アルミナ、ジルコニア、ケイ素、ケイ素四フッ化エチレン重合体、ステンレス鋼等を挙げることができるが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂を用いたものが加工性の面から好ましく、なかでもポリプロピレン、ポリエチレンが好ましい。
前記ろ過フィルターは、２種類以上の強剛性フィルターを組み合わせて作製してもよい。また、強剛性フィルターと強剛性フィルター以外のフィルターと組み合わせてもよい。
前記ろ過フィルターは精密ろ過用としても、粗ろ過用としても用いることができるが、少なくとも１種類のろ過フィルターの孔径又は保留粒子径は２００μｍ以下が好ましい。
本発明の遺伝子検査方法においては、たとえば、ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されており、最小孔径を有するフィルターの孔径が、１μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が２００μｍ以下である、ろ過フィルターを用いればよい。好ましくは、最小孔径を有するフィルターの孔径が５μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が１５０μｍ以下であり、より好ましくは最小孔径を有するフィルターの孔径が１０μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が１００μｍである。また、被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させても良い。
例えば、ポリプロピレン製強剛性フィルターの孔径は５〜２００μｍ、低密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０〜７０μｍ、高密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０〜５０μｍ、超高分子量ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は１０〜２０μｍ、ポリスチレン製強剛性フィルターの孔径は１００〜２００μｍ、四フッ化エチレン重合体製強剛性フィルターの孔径は３０〜１００μｍである。素材及び／孔径の異なる複数の強剛性フィルターを組合せて用いてもよい。また、ろ過フィルターとして焼結フィルターを用いる場合には、必ずしも複数の強剛性フィルターを組み合わせて用いる必要はなく、１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いても良い。
１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いる場合、孔径は特に限定されないが、例えば、１μｍ〜２００μｍとすることができ、５μｍ〜１５０μｍであることが好ましく、１０μｍ〜１００μｍであることがより好ましい。
１種類の素材の強剛性フィルターを焼結フィルターとして用いる場合、孔径は特に限定されないが、例えば、１μｍ〜２００μｍとすることができ、５μｍ〜１５０μｍであることが好ましく、１０μｍ〜１００μｍであることがより好ましい。
精密ろ過用フィルターとして例えば膜状のフィルターを用いることができ、その材質はセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、ニトロセルロース、セルロースエステル、ニトロセルロースとセルロースエステルの混合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６、ポリエステル、コットン、ステンレススチール繊維等の中から好適なものを適宜選択することができるが、被検出対象を含む試料を結合させず、検体浮遊液の吸収量が多くないものにすることが必要である。
前記ろ過フィルターを構成するフィルターの中で最小の孔径又は保留粒子径を有するフィルターの最小の孔径又は保留粒子径は、孔径１０μｍ程度であることが好ましい。
前記強剛性フィルター及び強剛性フィルター以外の別の種類のフィルター（以下、非強剛性フィルターということがある）の組合せ方は、例えば、フィルターを２つ用いる場合、フィルターを後記のろ過チューブのろ過用ノズルの底面から１段目フィルター、２段目フィルターとすると（この場合、最初に検体試料と接触するのは、１段目フィルターであり、検体試料は１段目フィルターを通過して、アッセイ装置に添加される）、１段目フィルターと２段目フィルターの組合せとして、強剛性フィルターと強剛性フィルター、強剛性フィルターと非強剛性フィルターの組合せがある。なお、ノズル先端部に近いフィルターを下流側フィルターと呼び、より早く検体試料に接触するフィルターを上流側フィルターと呼ぶことがある。フィルターを組合せる場合、孔径が異なるフィルターを組合せることが好ましい。強剛性フィルターはいずれもフィルターの表面だけでなく、その内部でも混入物をトラップするため、ある程度の厚さが必要である。必要な厚みは混入物の量やフィルターの孔径や大きさにより当然異なるが、一般に遺伝子検査法での検査に必要な検体試料１００〜２０００μｌを直径が５〜２０ｍｍ程度の試料ろ過フィルターでろ過する場合、強剛性フィルター又は非強剛性フィルターの厚さは、限定されないが、好ましくは、０．５ｍｍ〜７ｍｍ、さらに好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍである。また、試料ろ過フィルターの厚さの合計は２ｍｍ〜１０ｍｍ程度が好ましい。
前記ろ過フィルターに孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせる場合は、孔径又は保留粒子径の大きなフィルターを上流側に、小さなフィルターを下流側に、両フィルターが重なるように配置することが、ろ過時における検体試料の目詰まりを回避する上で好ましい。例えば、２つのフィルターを組合わせる場合、１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径が大きいフィルターを用い、２段目のフィルターに孔径が小さいフィルターを用いることが好ましい。
用いるフィルターのサイズは、アッセイに用いる検体浮遊液チューブのサイズによるが、例えば、円形で直径０．５〜１．５ｃｍである。
上記で述べたようなフィルターとして、特許文献２に記載されているものを使用してもよい。
本発明においては、検体採取するための器具として綿棒、白金耳、スポイト又はさじ形状の用具等を用いて被検出対象を含む検体を採取し、アッセイに用いることができる。中でも、綿棒またはスワブを用い、検体を採取しアッセイに用いることが好ましい。特に人体を被験体とし、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、口腔内擦過物、肺胞洗浄液、便懸濁液又は直腸拭い液、を検体とする場合は、検体採取器具として主として綿棒またはスワブを用いることが好ましい。
前記綿棒は特に限定されない。たとえば、軸部の片方の先端にある頭部に綿を巻き付けた綿球から形成される態様が挙げられる。この態様において綿球部分が検体採取部分に該当する。あるいは、ブラシ状綿棒と呼ばれる、天然物又は人工物でできた繊維がブラシ状に配置され、毛細管現象を利用し液体を採取する方式の綿棒が市販されており、これを用いても良い。前記ブラシ状綿棒は、以下の理由により本発明に特に好適に使用することができる。ブラシ状綿棒は、例えばフロック加工と呼ばれる、短く切った繊維（フロック）を、静電気により接着剤を塗布した綿棒の柄に付着させる方法により作製することができる。また、この方式の綿棒では、液体中の溶解物や混合物である固体や粘性物質も採取可能であり、この場合毛細管現象だけではなく、固体や粘性物質が本発明に器具の被分析試料採取部位に吸着等により結合することを利用して採取する。従来の綿棒と比較して表面積が大幅に増えるので、それだけ検体の採取量が大きく、検体中の被検出対象を含む試料をより多く吸着することが可能である。また浮遊液に浮遊させる際にも従来の綿棒とは異なり、浮遊液は容易に繊維間に入り込むことができるため、前記試料が放出されやすく、効率的に前記試料を浮遊液中に回収することができる。以上のような観点から、本発明の遺伝子検査方法では検体採取のために、ブラシ状綿棒（ブラシ状スワブともいう）を用いることが好ましく、短繊維を付着したフロックスワブを用いることが特に好ましい。
上記で述べたような検体採取器具として、特許文献２に記載されているものを使用してもよい。
本発明において、被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項（ｍａｔｔｅｒ）は特に限定されない。たとえば、呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス等）、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌及び肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられ、さらに具体的には、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質が挙げられる。また、本発明の遺伝子検査方法はヒト遺伝子多型を検査することもでき、さらに具体的には、薬剤耐性遺伝子多型（例えば、薬剤代謝酵素シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ遺伝子）の遺伝子多型）、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ遺伝子）の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ遺伝子）の遺伝子多型、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＭＴＨＦＲ遺伝子）の遺伝子多型等を検査するために使用することが可能である。
本発明の検査方法により分析するための検体は、特に限定されない。たとえばヒト又は他の動物などから得られる生体試料が挙げられる。具体的には、たとえば、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液及び直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物からなる群から選択すればよい。
特定の実施態様において、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遺伝子検査方法において通常は必須と考えられていた遠心分離法による前処理を行う必要が無い。遠心分離法を前処理として行う場合、専用機器が必要であることに加えて、遠心分離の操作が煩雑で手間と時間がかかるという問題がある。しかし、本発明の遺伝子検査方法によれば、そのような遠心分離法を行うための専用機器を準備する必要がなく、煩雑な操作を省くことが可能である。更に、遠心分離法にかかる時間も短縮することができるので、被験体からの検体採取から遺伝子検査結果を得るまでの時間を短縮することができ、例えば、検体採取から遺伝子検査結果が得られるまでの時間を１日以内、好ましくは半日以内、より好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、なかでも好ましくは２時間以内（例えば、１時間半以内）とすることが可能となり得る。
本発明の別の実施態様は、強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブを含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キットである。本発明のキットは、さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含んでも良い。また、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬等を当然含む。この遺伝子検査試薬は、チューブや瓶等の試薬容器に充填され、使用時に開封可能な形態として本発明のキットに含まれる。
本実施態様の遺伝子検査キットの構成図の例を、図８に示す。検体試料用ろ過チューブ２は内部に焼結フィルター（２１−ａ、２１−ｂ）を含み、検体を含む試料を本ろ過チューブ２に通すことで焼結フィルター（２１−ａ、２１−ｂ）のろ過処理を行うことができる。なお、焼結フィルター２１−ａ、２１−ｂの孔径は、同じであってもよいし異なっても良い。また、本図面では、焼結フィルターを２枚重ねているろ過チューブを例示しているが、焼結フィルターの枚数はこれに限定されず、３枚以上重ねてもよいし、又は１枚だけでもよい。また、焼結フィルターを含む先端部とチューブ本体部は脱着可能に別々に構成し、ろ過操作時に取り付けるようにしてもよい。また、溶出を速やかにするために、人が直接手で容器を押えて圧力がかけられるよう弾力がある素材のチューブを用いることができる。スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）３は、スワブ軸部３２の先端に設けた検体採取部分３１に短繊維が付着されている。遺伝子検査試薬４は、容器本体４１に充填されており、保管時は蓋部４２等で密閉されている。なお、本図面では、遺伝子検査試薬を充填した容器を１つだけ例示しているが、遺伝子検査に用いる試薬を充填した容器は２つ以上であり得る。本発明の遺伝子検査キットは、包装箱１に収納されて提供することもできるが、別々の包装で供給されて使用時にセットで用いるキットであってもよい。なお、本発明の遺伝子検査キットの構成は、図８で示す例に限定されず、上記で例示したもの以外のもの（例えば、取扱説明書）等も任意に含むことができる。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：ナイセリアゴノレア（淋菌）の検出〕
（１）試料の調製
ナイセリアゴノレアから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００（コピー／μＬ）となるように調製し、子宮頸管粘液と混合して試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりナイセリアゴノレアを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
ナイセリアゴノレアから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００（コピー／μＬ）となるように調製し、子宮頸管粘液と混合して試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりナイセリアゴノレアを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号２）０．２μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号３、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号２）０．２μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号３、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
結果
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフのうちＮＧ ＤＮＡはナイセリアゴノレアＤＮＡ試料の解析結果を、ＷａｔｅｒはＮＣである水の解析結果を示している。図１より明らかなように、ナイセリアゴノレアが検出されている。なお、上記実施例で、頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００）を用いて検体を採取した試料を用いても、同様の結果を得た。
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフのうちＮＧ ＤＮＡはナイセリアゴノレアＤＮＡ試料の解析結果を、ＷａｔｅｒはＮＣである水の解析結果を示している。図１より明らかなように、ナイセリアゴノレアが検出されている。なお、上記実施例で、頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００）を用いて検体を採取した試料を用いても、同様の結果を得た。
遺伝子検査方法においてろ過フィルターで子宮頸管粘液から調製した検体試料をろ過することにより目詰まりによる無効や偽陽性を防ぎ、さらにブラシ状綿棒との組み合わせによっても感度・特異性が共に高い測定が可能となることが判明した。
〔実施例２：百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号４）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号５）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号６、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号４）０．４μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号５）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号６、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
試料３μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
百日咳菌のカットオフ値：１０
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
百日咳菌のカットオフ値：１０
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図２は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう内部コントロールの蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフは内部コントロールの結果を示しており、フィルターありは焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過していない解析結果を示している。図２より明らかなように、フィルターありの場合で内部コントロールが検出されている。しかし、フィルターなしの場合、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害により内部コンロトールが検出されていない。この結果から、百日咳菌の遺伝子検査では、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
図２は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう内部コントロールの蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフは内部コントロールの結果を示しており、フィルターありは焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過していない解析結果を示している。図２より明らかなように、フィルターありの場合で内部コントロールが検出されている。しかし、フィルターなしの場合、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害により内部コンロトールが検出されていない。この結果から、百日咳菌の遺伝子検査では、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
〔実施例３：肺炎マイコプラズマの検出〕
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、終濃度０．２％となるようにムチン液と混合して疑似咽頭拭い液生体試料とした。この試料を孔径３００μｍ、１００μｍ、２０μｍの焼結フィルター（ポリプロピレン製）や焼結フィルター以外のフィルター（核酸抽出前ゴミ取り用として市販のフィルター：メッシュフィルター（核酸抽出用フィルター）孔径０．４５μｍ、メンブレンフィルター孔径０．８μｍ以下など）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５（コピー／μＬ）となるように調製し、終濃度０．２％となるようにムチン液と混合して疑似咽頭拭い液生体試料とした。この試料を孔径３００μｍ、１００μｍ、２０μｍの焼結フィルター（ポリプロピレン製）や焼結フィルター以外のフィルター（核酸抽出前ゴミ取り用として市販のフィルター：メッシュフィルター（核酸抽出用フィルター）孔径０．４５μｍ、メンブレンフィルター孔径０．８μｍ以下など）を含むろ過フィルターを通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない液も試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図３、４は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化について種々のフィルターの結果を横軸に、グラフの縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３はマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、図４は内部コントロールの結果を示している。図３より明らかなように、フィルターありの場合でマイコプラズマ・ニューモニエが検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害によりマイコプラズマ・ニューモニエが検出されていない。また、図４より、２０、１００μｍの焼結フィルター以外で内部コントロールが検出されていない。この結果から、マイコプラズマ・ニューモニエの遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、特定の大きさの孔径の焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
図３、４は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化について種々のフィルターの結果を横軸に、グラフの縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３はマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、図４は内部コントロールの結果を示している。図３より明らかなように、フィルターありの場合でマイコプラズマ・ニューモニエが検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、試料に含まれる物質のＰＣＲ阻害によりマイコプラズマ・ニューモニエが検出されていない。また、図４より、２０、１００μｍの焼結フィルター以外で内部コントロールが検出されていない。この結果から、マイコプラズマ・ニューモニエの遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、特定の大きさの孔径の焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
〔実施例４：肺炎マイコプラズマの検出〕
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、フィルターろ過せず、従来法に従い遠心分離（１３，０００ｒｐｍで３分）した上清を、比較例の試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
マイコプラズマ・ニューモニエから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０（コピー／μＬ）となるように調製し、生理食塩水で懸濁した咽頭拭い液と混合して疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、フィルターろ過せず、従来法に従い遠心分離（１３，０００ｒｐｍで３分）した上清を、比較例の試料として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号７）０．２μＬ
１００μＭ リバースプライマー（配列番号８）０．３μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号９、５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
試料４μＬ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
マイコプラズマ・ニューモニエのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図５は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフはマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、フィルターろ過は焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、遠心分離は試料を遠心機で１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、その上清を試料とした解析結果を示している。図５より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理したマイコプラズマ・ニューモニエの蛍光値が、遠心分離で処理した場合より蛍光値が高い。従って、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遠心分離法よりも、簡便な方法でありながら、より高感度に検出できることが明らかとなった。
図５は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフはマイコプラズマ・ニューモニエの結果を示しており、フィルターろ過は焼結フィルターで試料をろ過した解析結果を、遠心分離は試料を遠心機で１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、その上清を試料とした解析結果を示している。図５より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理したマイコプラズマ・ニューモニエの蛍光値が、遠心分離で処理した場合より蛍光値が高い。従って、本発明の遺伝子検査方法は、従来の遠心分離法よりも、簡便な方法でありながら、より高感度に検出できることが明らかとなった。
〔実施例５：インフルエンザの検出〕
（１）試料の調製
インフルエンザ精製ＲＮＡを滅菌水で懸濁した鼻腔拭い液で１０００倍、２０００倍希釈し疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりインフルエンザＡ型を検出した。核酸増幅として、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
インフルエンザ精製ＲＮＡを滅菌水で懸濁した鼻腔拭い液で１０００倍、２０００倍希釈し疑似生体試料とした。この試料を焼結フィルター（ポリプロピレン製、孔径２０μｍ）で通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりインフルエンザＡ型を検出した。核酸増幅として、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１０）１μＬ
１０μＭ リバースプライマー（配列番号１１）１μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号１２、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１）０．４μＬ、
ＱＲＺ−１０１（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（Ｒ）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ、東洋紡製）
試料４μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ フォワードプライマー（配列番号１０）１μＬ
１０μＭ リバースプライマー（配列番号１１）１μＬ
１０μＭ プローブ（配列番号１２、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１）０．４μＬ、
ＱＲＺ−１０１（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（Ｒ）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ、東洋紡製）
試料４μＬ
ＲＴ−ＰＣＲ条件
５０℃・１０分
９５℃・１分
（以上１サイクル）
９５℃・１５秒
６０℃・４５秒
（以上５０サイクル）
５０℃・１０分
９５℃・１分
（以上１サイクル）
９５℃・１５秒
６０℃・４５秒
（以上５０サイクル）
結果
図６は、上記の条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った解析結果を表した表である。フィルター有りは焼結フィルターで試料をろ過した場合の解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過しない場合の解析結果を示している。図６より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理した場合のインフルエンザ試料のカットオフ値（Ｃｔ値）が、フィルターろ過しない場合より立ち上がりが早い。この結果より、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
図６は、上記の条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った解析結果を表した表である。フィルター有りは焼結フィルターで試料をろ過した場合の解析結果を、フィルターなしは試料を焼結フィルターでろ過しない場合の解析結果を示している。図６より明らかなように、焼結フィルターろ過で処理した場合のインフルエンザ試料のカットオフ値（Ｃｔ値）が、フィルターろ過しない場合より立ち上がりが早い。この結果より、焼結フィルターで前処理するだけで高感度な検査結果が得られることが明らかとなった。
〔実施例６：ノロウイルスＲＮＡの検出〕
（１）試料の調製
フロックスワブで採取したノロウイルスＧ２型を含む糞便試料を精製水に懸濁した試料を、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターに通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりノロウイルスＧ２型を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
フロックスワブで採取したノロウイルスＧ２型を含む糞便試料を精製水に懸濁した試料を、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径１００μｍ）を含むろ過フィルターに通過させて試料を調製した。また、焼結フィルターでろ過しない試料も比較として使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬に添加して、下記条件によりノロウイルスＧ２型を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号１３）
１．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号１４）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号１５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
試料３μＬ
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号１３）
１．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号１４）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号１５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
試料３μＬ
逆転写反応、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃ １８０秒（逆転写反応）
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９８℃・１秒
６０℃・１０秒
６３℃・１０秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Ｇ２のカットオフ値：７
内部コントロールのカットオフ値：１．５
４２℃ １８０秒（逆転写反応）
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９８℃・１秒
６０℃・１０秒
６３℃・１０秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Ｇ２のカットオフ値：７
内部コントロールのカットオフ値：１．５
結果
図７は、上記の条件でＲＴ−ＰＣＲを行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図７より明らかなように、フィルターありの場合でノロウイルスＧ２が検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、蛍光値が低くカットオフ値以下となり、弱陽性となっている。この結果から、ノロウイルスＧ２遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
図７は、上記の条件でＲＴ−ＰＣＲを行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図７より明らかなように、フィルターありの場合でノロウイルスＧ２が検出されている。しかし、フィルターなしの場合は、蛍光値が低くカットオフ値以下となり、弱陽性となっている。この結果から、ノロウイルスＧ２遺伝子検査において、高感度な検査結果を得るには、焼結フィルターを用いることが重要であることが明らかとなった。
本発明の方法及びキットは、疾患の検出・診断等に利用することができる。
１：遺伝子検査キット本体（包装箱）
２：検体試料用ろ過チューブ
２１−ａ、２１−ｂ：焼結フィルター
３：スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）
３１：短繊維を付着した検体採取部分
３２：スワブ軸部
４：遺伝子検査試薬
４１：遺伝子検査試薬の容器本体
４２：遺伝子検査試薬の蓋部
２：検体試料用ろ過チューブ
２１−ａ、２１−ｂ：焼結フィルター
３：スワブ（短繊維を付着したフロックスワブ）
３１：短繊維を付着した検体採取部分
３２：スワブ軸部
４：遺伝子検査試薬
４１：遺伝子検査試薬の容器本体
４２：遺伝子検査試薬の蓋部
Claims (21)
- 被検出対象を含む試料をろ過フィルターによってろ過した後に、前記試料中の被検出対象の存在を検出又は定量することを特徴とする遺伝子検査方法。
- ろ過フィルターが焼結フィルターである請求項１に記載の遺伝子検査方法。
- 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される請求項２に記載の遺伝子検査方法。
- 焼結フィルターの孔径が１０〜１００μｍである請求項２に記載の遺伝子検査方法。
- 遠心分離による前処理を必要としない請求項１に記載の遺伝子検査方法。
- 検体採取器具として綿棒またはスワブを用いて被検出対象を含む検体を採取して試料とし、アッセイに用いる、請求項１に記載の遺伝子検査方法。
- 検体が生体試料である請求項６に記載の遺伝子検査方法。
- 検体がヒト又は他の動物の口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される検体である請求項７に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項８に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、及び肺炎クラミジアからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項９に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項８に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項１１に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が性感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項８に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質である請求項１３に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項がヒト遺伝子多型の検出である請求項８に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象の存在を検出又は定量することにより検査できる事項が薬剤代謝酵素遺伝子の遺伝子多型、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型、及びメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の遺伝子多型からなる群から選択されるヒト遺伝子多型である請求項１５に記載の遺伝子検査方法。
- ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
- 被検出対象を含む検体試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる請求項１７記載の遺伝子検査方法。
- 以下を含む、検体試料中の被検出対象の存在を検査するための遺伝子検査キット。
（１）焼結フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ。 - さらに、検体採取器具として綿棒またはスワブを含む請求項１９記載の遺伝子検査キット。
- さらに、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬が充填されている容器を含む請求項１９記載の遺伝子検査キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017049528 | 2017-03-15 | ||
| JP2017049528 | 2017-03-15 | ||
| PCT/JP2018/010136 WO2018168986A1 (ja) | 2017-03-15 | 2018-03-15 | 遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2018168986A1 true JPWO2018168986A1 (ja) | 2020-01-16 |
| JP7264046B2 JP7264046B2 (ja) | 2023-04-25 |
Family
ID=63522200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019506251A Active JP7264046B2 (ja) | 2017-03-15 | 2018-03-15 | 遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7264046B2 (ja) |
| CN (1) | CN108884488A (ja) |
| WO (1) | WO2018168986A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019208487A1 (ja) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 病原性微生物の核酸検出方法 |
| JP7187175B2 (ja) * | 2018-04-27 | 2022-12-12 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 病原性微生物の核酸検出方法 |
| JP7329912B2 (ja) * | 2018-10-09 | 2023-08-21 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| CN112805388A (zh) * | 2018-10-09 | 2021-05-14 | 公益财团法人筑波医疗中心 | 微生物的检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003533212A (ja) * | 2000-05-13 | 2003-11-11 | ディーエヌエー リサーチ イノヴェイションズ リミテッド | 分離装置 |
| JP2008122372A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-29 | Denka Seiken Co Ltd | 試料ろ過フィルターを用いる簡易メンブレンアッセイ方法及びキット |
| JP2008527997A (ja) * | 2005-01-21 | 2008-07-31 | ザ ニューヨーク ブラッド センター インコーポレイテッド | 核酸の抽出及び同定方法 |
| JP2008546388A (ja) * | 2005-06-14 | 2008-12-25 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | 多型検出のためのｑ−融解 |
| WO2013002354A1 (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | 生体試料の前処理方法、ｒｎａの検出方法及び前処理キット |
| WO2014017187A1 (ja) * | 2012-07-25 | 2014-01-30 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用試料の調製方法及び核酸増幅反応用試料の調製装置 |
| JP2014198029A (ja) * | 2013-03-29 | 2014-10-23 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用試料の調製方法、核酸増幅方法、固相状核酸増幅反応用試薬及びマイクロチップ |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100619189B1 (ko) * | 2004-10-08 | 2006-08-31 | 굿젠 주식회사 | 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법 |
| JP2010522537A (ja) * | 2006-11-30 | 2010-07-08 | ナビジェニクス インコーポレイティド | 遺伝子分析系および方法 |
| CN101538567B (zh) * | 2008-03-20 | 2012-09-19 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 过滤式微量核酸临床样品快速处理方法 |
| CN104312913B (zh) * | 2014-10-17 | 2016-05-11 | 复旦大学附属华山医院 | 整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片及其应用 |
-
2018
- 2018-03-15 WO PCT/JP2018/010136 patent/WO2018168986A1/ja active Application Filing
- 2018-03-15 CN CN201880000710.0A patent/CN108884488A/zh active Pending
- 2018-03-15 JP JP2019506251A patent/JP7264046B2/ja active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003533212A (ja) * | 2000-05-13 | 2003-11-11 | ディーエヌエー リサーチ イノヴェイションズ リミテッド | 分離装置 |
| JP2008527997A (ja) * | 2005-01-21 | 2008-07-31 | ザ ニューヨーク ブラッド センター インコーポレイテッド | 核酸の抽出及び同定方法 |
| JP2008546388A (ja) * | 2005-06-14 | 2008-12-25 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | 多型検出のためのｑ−融解 |
| JP2008122372A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-29 | Denka Seiken Co Ltd | 試料ろ過フィルターを用いる簡易メンブレンアッセイ方法及びキット |
| WO2013002354A1 (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | 生体試料の前処理方法、ｒｎａの検出方法及び前処理キット |
| WO2014017187A1 (ja) * | 2012-07-25 | 2014-01-30 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用試料の調製方法及び核酸増幅反応用試料の調製装置 |
| JP2014198029A (ja) * | 2013-03-29 | 2014-10-23 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用試料の調製方法、核酸増幅方法、固相状核酸増幅反応用試薬及びマイクロチップ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 宇治家武史: "簡便な遺伝子検査のツール「核酸クロマト法」", 臨床化学, vol. 36, JPN6018021635, 2007, pages 19 - 24, ISSN: 0004876754 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018168986A1 (ja) | 2018-09-20 |
| JP7264046B2 (ja) | 2023-04-25 |
| CN108884488A (zh) | 2018-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7264046B2 (ja) | 遺伝子検査方法及び遺伝子検査キット | |
| Paul et al. | Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases | |
| CN101883776B (zh) | 用于纯化核酸的装置、系统和方法 | |
| JP5202732B2 (ja) | 核酸抽出装置 | |
| JP6688883B2 (ja) | 生物学的サンプルから生体分子を精製しおよび検査するためのデバイスのコンポーネント、デバイス、および方法 | |
| EP1173623B1 (en) | Solid medium and process for the storage and rapid purification of nucleic acid | |
| EP2600972B1 (en) | New columns for incubation and isolation of chemical and/or biological samples | |
| JP5528440B2 (ja) | 核酸抽出方法 | |
| US20120231466A1 (en) | Methods and compositions for isolating nucleic acid | |
| JP2016208978A (ja) | 胎児細胞および幹細胞の分離および増殖を含む粒子の分離のための方法および装置 | |
| CN102409079A (zh) | 一种新型传染病核酸快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| US20210363514A1 (en) | Syringe-type nucleic acid extraction apparatus, nucleic acid extraction kit and nucleic acid extraction method therewith | |
| CN201648403U (zh) | 一种无仪器核酸提取装置 | |
| CN107988210A (zh) | 一种快速提取血液和口腔拭子基因组dna的方法 | |
| CN116724122A (zh) | 用于浓缩和鉴定血液中微生物的系统、方法和设备 | |
| WO2017185086A1 (en) | Devices and methods for in vivo capture of biological samples and nucleic acids therein | |
| JP2022033527A (ja) | Ｒｎａろ過器及びｒｎａろ過方法 | |
| CN210506297U (zh) | 微流道芯片以及微流道结构 | |
| CN103881902A (zh) | 多级pcr反应系统及其应用 | |
| JP6437250B2 (ja) | 前処理方法及びそれに用いられる核酸抽出キット | |
| US20220049321A1 (en) | Method, system and apparatus for blood processing unit | |
| TWM583855U (zh) | 具有不平整結構的微流道晶片及微流道結構 | |
| CN210230001U (zh) | 微流道芯片以及微流道结构 | |
| WO2019208487A1 (ja) | 病原性微生物の核酸検出方法 | |
| JP2005073595A (ja) | 核酸試料調製法及び核酸増幅法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220118 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220513 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220920 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221114 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230116 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230314 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230327 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7264046 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |