CN204039404U

CN204039404U - 肺炎衣原体检测试剂盒

Info

Publication number: CN204039404U
Application number: CN201420194714.6U
Authority: CN
Inventors: 柳辉
Original assignee: SHENZHEN KANGMEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN KANGMEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2024-04-21

Abstract

本实用新型涉及生物技术领域，特别涉及肺炎衣原体检测试剂盒。本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1）；盒体（1）内设置有海绵垫（2）、八联PCR反应管（3）和说明书（4）；海绵垫（2）设置有5个容器孔（5），容器孔放置有：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。本实用新型提供的试剂盒组成结构简单，其中配制有八联PCR反应管（3），提高了使用的方便性，能够实现对肺炎衣原体的快速准确检测。

Description

肺炎衣原体检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及生物技术领域，特别涉及肺炎衣原体检测试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，CP）是一种严格真核细胞内寄生的原核细胞微生物，与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属。肺炎衣原体基因组大小约1.2Mbp、由21个Pmp基因、一个III型分泌毒力因子系统基因、3个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和2个磷脂酶-D样蛋白基因组成。其染色体DNA G+Cmol%含量为40%，但与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体的同源性小于10%，限制性内切酶图谱极不相同。世界不同地区分离得到的肺炎衣原体不同株DNA的同源性可达94%以上，限制性内切酶图谱基本一致，标准株为TW-183和AR-39。肺炎衣原体只有一个血清型，代表株为TWAR。肺炎衣原体具有属特异性抗原和种特异性抗原，属特异性抗原主要有两个抗原决定簇表位，一个是肺炎衣原体LPS核心多糖的第三个KDO残基，一个是分子量为39.5KDa的主要外膜蛋白（MOMP），这两个抗原决定簇均对甲醇敏感，与其它衣原体种间存在交叉；肺炎衣原体的种特异性抗原为98KDa的主要外膜蛋白（MOMP），该抗原对丙酮敏感，并不与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗血清发生交叉反应。

肺炎衣原体的感染极为普遍，无显著的性别和地区差异，一年四季均可发生，主要引起人类的呼吸道感染和非典型性肺炎，与人口密度呈正相关，临床上多以隐性、持续性感染的形式存在，其反复迁延导致难以治疗的并发症。研究发现肺炎衣原体与哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密切相关。肺炎衣原体的感染率随着年龄的增加迅速上升，儿童感染率在20%左右，青壮年感染率可达50-60%，老年的感染率为70-80%。肺炎衣原体通过呼吸道分泌物进行人与人传播，在家庭、学校、军队以及其他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。目前，肺炎衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)的主要病原体，肺炎衣原体急性感染率占23%，肺炎病人仅占感染者的小部分，70-90%为亚临床表现。肺炎衣原体感染的潜伏期为15-23天，可引起上呼吸道感染，如鼻窦炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。呼吸道感染多数表现为咽痛、发热、咳嗽，病情通常较轻，有自限性。老年肺炎衣原体肺炎病人症状可能较为严重，有时甚至致死，尤其是在合并细菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病时，其致死几率大大增加。因此，肺炎衣原体感染早期诊断对于尽早发现和治疗肺炎衣原体感染性疾病非常重要。

目前对肺炎衣原体的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、血清学诊断技术和核酸检测技术等方法。因为肺炎衣原体是一种极难培养的衣原体，其抵抗力较弱，对室温或冰冻敏感，难以从临床标本中分离培养成功，传代也比较困难，所以不适合采用病原体分离培养技术进行诊断。目前临床上常用的肺炎衣原体的检测方法主要是检测特异性抗体的方法。由于病原体进入机体进行复制、抗原刺激到产生抗体需要一定时间，导致这种方法仍不能满足早期病原体确诊的需要，进而不能满足进行早期积极治疗的临床需求。

实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。

因此，为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎衣原体的检测，很有必要提供一种结构简单，能够快速检测肺炎衣原体的核酸检测试剂盒。

实用新型内容

有鉴于此，本实用新型提供了肺炎衣原体检测试剂盒。该试剂盒结构简单，可用于肺炎衣原体感染的临床快速诊断。

为了实现上述实用新型目的，本实用新型提供以下技术方案：

本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1）；

盒体（1）内设置有海绵垫（2）、八联PCR反应管（3）和说明书（4）；

海绵垫（2）设置有5个容器孔（5），容器孔放置有：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。

作为优选，海绵垫（2）的体积占盒体（1）容积的二分之一。

海绵垫（2）上设置有容器孔，可将溶液管固定于盒体内。一方面使各试剂之间便于区分，另一方面减少运输或使用过程中试剂之间的相互碰撞或倾倒。

作为优选，八联PCR反应管（3）为0.2mL的高管或0.1mL的矮管。

作为优选，八联PCR反应管（3）带有八联管盖。

优选的，八联PCR反应管（3）装于自封袋中。

作为优选，八联PCR反应管（3）的数量为4条。

作为优选，样本处理液管（51）内装有样品处理液，所述样品处理液pH值为8.0，包括：

作为优选，反应液A管（52）内装有反应液A，包括：

优选的，上游引物序列为：5’-TTCCCCTTGCCAACAGACG-3’；

下游引物序列为：5’-GGCTGAGCAATGCGGATGT-3’；

探针序列为：5’FAM-CGACCATCAATTATC-MGB3’。

作为优选，反应液B管（53）内装有反应液B，包括：Taq DNA聚合酶与UDG酶，其中Taq DNA聚合酶与UDG酶的体积比为10:1。

作为优选，阳性对照管（54）内装有阳性对照液，包括：肺炎衣原体质粒。

优选的，肺炎衣原体质粒的浓度为10⁴Copies/μL。

作为优选，阴性对照管（54）内装有阴性对照液，阴性对照页的pH值为8.0，其中包括：

Tris-HCl 10mmol/L；

EDTA 1mmol/L。

本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1）；盒体（1）内设置有海绵垫（2）、八联PCR反应管（3）和说明书（4）；海绵垫（2）设置有5个容器孔（5），容器孔放置有：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。本实用新型提供的试剂盒组成结构简单，其中配制有八联PCR反应管（3），且试剂的拿取方便，不易混淆，提高了使用的方便性，且使用本实用新型提供的试剂盒能够在2h内完成对肺炎衣原体的检测，实现了对肺炎衣原体快速准确检测的目的。

附图说明

图1示本实用新型提供的肺炎衣原体检测试剂盒结构示意图；其中1为盒体，2为海绵垫，3为八联PCR反应管，4为说明书，5为容器孔，51为样本处理液管，52为反应液A管，53为反应液B管，54为阳性对照管，55为阴性对照管。

具体实施方式

本实用新型公开了一种肺炎衣原体检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本实用新型内。本实用新型已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内来实现和应用本实用新型技术。

下面结合实施例，进一步阐述本实用新型。

实施例1肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的结构

如图1所示，本实用新型一种肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒，其包括盒体（1）和海绵垫（2），海绵垫（2）的体积大小为盒体的二分之一，上面设有五个容器孔（5），分别用于放置：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。盒体中另一半空间用于放置八联PCR反应管（3）和说明书（4）。

实施例2肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的制备

1、配制各溶液：

a、样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，以灭菌超纯水配制成，其中Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L；EDTA(pH8.0)1mmol/L；NaCl0.15mol/L；NP-401mg/mL；SDS1mg/mL。

b、反应液A：

其中包括：Tris-HCl1mmol/L；KCl5mmol/L；MgCl₂4.8mmol/L；dNTP/dUTP Mixture200μmol/L；BSA1mg/mL；上游引物100nmol/L；下游引物100nmol/L；探针50nmol/L。

上游引物序列为：5’-TTCCCCTTGCCAACAGACG-3’

下游引物序列为：5’-GGCTGAGCAATGCGGATGT-3’，

探针序列为：5’FAM-CGACCATCAATTATC-MGB3’

根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后即得。

c、反应液B：CP PCR反应液B由Taq DNA聚合酶、UDG酶组成。其中Taq DNA聚合酶的酶活力为5U/μL，购买自宝生物工程（大连）有限公司；UDG酶的酶活力为5U/μL，购买自New England Biolabs公司。根据实际需求，取Taq DNA聚合酶与UDG酶按照体积比10:1进行混合，即得，低温保存。混合后，Taq DNA聚合酶的酶活力为4.5U/μL；UDG酶的酶活力为0.45U/μL，

d、阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，以无菌超纯水配制调节pH为8.0。

e、阳性对照：肺炎衣原体质粒，浓度为10⁴Copies/μL。

2、按照市场需求，将所得样本处理液、反应液A、反应液B、阳性对照和阴性对照分装至分别独立包装，贴标签后，置于试剂盒盒体内的海绵垫上，在盒体内装入八联PCR反应管和说明书，即得。

实施例3肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的使用

取实施例2制得的试剂盒，考察本实用新型提供的试剂盒在检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因中的应用。

本实用新型提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定量PCR，使用时，以试剂盒中所带的阴性对照和阳性对照作为检测模板，根据扩增曲线定性判定检测结果。

质控结果判定必须符合下述条件：

阴性对照：阴性无扩增，结果为阴性。

阳性对照：结果为阳性，且在FAM荧光通道下的Ct值为25＜Ct≤29。

以上两项需在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。

样本检测结果判定：

FAM荧光通道下结果判断：根据仪器的要求设置好基线和阈值后，仪器会自动分析并计算出每个样本的Ct值，其中扩增曲线呈现典型的“S”型且Ct≤37，则判断结果为阳性；无Ct值或Ct值为40，则判断结果为阴性；如37＜Ct值＜40之间，建议此样本重做，若重新检查Ct值＜40则判断为阳性，否则判断为阴性。

以10⁴Copies/μL肺炎衣原体质粒为模板，按照30μL的体系配制PCR反应体系，其中：

反应液A 27.78μL，

反应液B 0.22μL，

模板 2μL。

按照下列反应条件进行反应：

64℃收集FAM荧光信号，得出扩增曲线。该扩增曲线呈现标准的S型，且Ct≤37，检测结果为阳性，说明本实用新型实施例2提供的试剂盒能够检测出肺炎衣原体98KDa MOMP基因，可应用于肺炎衣原体核酸的检测。

实施例4试剂盒应用于临床样本检测

取实施例2制得的试剂盒，应用于临床样本的检测。

1.临床样本类型：咽拭子、呼吸道抽吸液和痰液。

2.临床样本收集

(1)咽拭子：

让患者仰头张口，用压舌板压舌，用无菌棉拭子在咽部涂抹数次取分泌物，放入干燥无菌样本管或含采样液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管，密封立即送检。最佳采集时间为发病后3天内，一般不超过7天。

(2)呼吸道抽吸液：

将负压收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次，洗液收集于无菌容器送检。

(3)痰液：

肺部感染时应采取痰标本，以清晨第一口痰为最佳。采取标本的时间一般在发病的第一日采集，最迟不得超过3日，清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器送检。

3.临床样本储存与运输

采集样本应立即送检，如当天不能检测时在2～8℃保存不应超过24小时，-20℃以下保存不超过3个月。应该避免反复冻融，冻存样本解冻后应充分混匀。采用冰壶加冰或泡沫箱密封进行运输。

4.临床样本检测前处理

(1)咽拭子：向样本管中加入1mL无菌生理盐水充分摇匀，挤干棉拭子，吸取全部液体至1.5mL灭菌离心管，或是取出全部收集液，12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀。

(2)痰液或呼吸道抽吸液：向样本中加入4倍体积4%的NaOH溶液摇匀，室温放置30min左右，使其充分液化，用吸嘴混匀后吸取1mL液体至1.5mL灭菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀。

(3)取上述咽拭子沉淀、痰液沉淀、呼吸道抽吸液沉淀、分别加入50μL样本处理液，振荡混匀。100℃干浴或沸水浴10min，12000转/min离心10min备用，即为待测模板。建议已处理的模板DNA样品于当天进行PCR检测，当天不能检测的样品应置于-20℃保存。

5.反应体系配制及反应参数

临床样品咽拭子、痰液和呼吸道抽吸液均来自同一名肺炎患者，该患者临床病症症状为：发热、咳嗽1周、咳痰、痰中带血，并伴有胸痛、呼吸困难；临床鉴定为肺炎患者。按照上述方法进行处理，作为反应体系的模板，备用。各个反应体系除了模板不同外，其他组分相同，配制方法相同。具体配制方法为：取实施例2制得的试剂盒中的反应液A和反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中，

反应液A 27.78μL，

反应液B 0.22μL，

模板 2μL。

按照下列反应条件进行反应：

64℃收集FAM荧光信号。

6.结果分析

临床样本咽拭子、临床样本痰液、呼吸道抽吸液的扩增曲线皆呈现S型，表明三个样品检测结果均为阳性，与检测样本都含有肺炎衣原体的实际情况相符，且三者的Ct值与临床样品中所含有的肺炎衣原体核酸的量成正比与样品中（针对本实施例所收集到的样品，相同的处理条件下，此处所用到的临床样品中含肺炎衣原体的浓度大小为：咽拭子>痰液>呼吸道抽吸液），即采用本实用新型实施例2制得的试剂盒检测临床样本时，根据扩增曲线和Ct值能够准确检测出待测样品中肺炎衣原体，且Ct值的大小能够在一定程度上反映出待测临床样本中肺炎衣原体的含量。所以，本实用新型实施例2制得的试剂盒能够应用于临床样本检测。在检测过程中，样本处理需耗时约30min，PCR反应过程需1.5h，整个检测过程不超过2h，表明本实用新型提供的试剂盒可以实现对肺炎衣原体的快速检测。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims

1.一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1）；

所述盒体（1）内设置有海绵垫（2）、八联PCR反应管（3）和说明书（4）；

所述海绵垫（2）设置有5个容器孔（5），所述容器孔（5）放置有：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述海绵垫（2）的体积占所述盒体（1）容积的二分之一。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3）为0.2mL的高管或0.1mL的矮管。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3）带有八联管盖。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3）的数量为4条。