CN108344620A - 一种浓缩和保存尿液样本中基因组dna的方法及其装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种浓缩和保存尿液样本中基因组DNA的方法及其装置。具体而言，本发明涉及利用能够吸附DNA的膜浓缩和长期保存尿液DNA的方法与装置。本发明的方法将尿液DNA吸附在膜上，以真空、干燥的形式保存，不仅简单易行，而且所需费用低，不需要任何的有机溶剂，不会对环境造成污染。它不仅实现了将尿液中低浓度的DNA浓缩的效果，也可以使DNA在完全真空、干燥的状态下保存，避免了DNA降解，可以在室温下长期保存尿液DNA，保留了尿液中各成分的DNA，为后续构建信息更为全面的生物样本库奠定基础。

Description

一种浓缩和保存尿液样本中基因组DNA的方法及其装置
技术领域
本发明涉及生物和医学领域，具体而言涉及生物样本中基因组DNA的浓缩、收集、保存方法及其装置。
背景技术
20世纪90年代后期，科学家们提出生物样本库的概念，即标准化收集、处理、储存和应用健康和疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本，并用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。
尿液作为机体排出的废物，且可以大量无创连续获得。越来越多的研究也逐渐证明，尿液不仅能够动态的反映肾脏和泌尿系统的变化，也能够反映身体其它部位的异常或疾病信息[1-3]。因此，尿液也越来越多被临床基础研究所关注，也逐渐发展为生物样本库中的一员。
基因组DNA是组成生物基因组的所有DNA，DNA能够承载人类的遗传性状，在很多疾病研究中都涉及到DNA遗传因素的分析，甚至有些游离的DNA能够作为分子诊断的工具或成为癌症的标志物[4,5]。而尿液中的DNA也是分子诊断潜在的良好的来源[5]，应该随着病程的发展被保存下来。
目前，尿液的保存一般是冻存于-80℃的冰箱里，往往需要很大的空间。尿液由于浓度稀，体积大，含盐高，不适合直接大规模的原尿保存。因此要以液体冻存的方式保存如此众多的尿液临床样本是非常耗费人力物力的工作。
鉴于此，人们仍然需要一种简单易行且经济的浓缩和保存尿液DNA的方法，为生物样本库的发展，以及临床医药领域的应用提供新的思路。
发明内容
因此，根据本公开的一些实施方案提供了一种浓缩和保存尿液样本中基因组DNA的方法，其包括如下步骤：a)提供尿液样本，b)在存在压差的情况下，使尿液样本依次通过吸附DNA的膜和滤纸，或者使尿液样本仅通过吸附DNA的膜，c)干燥吸附DNA的膜，以及d)将吸附DNA的膜置于真空密封袋中，于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜的干燥可以通过选自如下的方式进行：室温自然干燥、吹风机吹干。
为了使DNA截留在吸附DNA的膜上，需要使尿液样本通过吸附DNA的膜。然而，吸附DNA的膜是柔软的，因此，需要将吸附DNA的膜放置在一个刚性支撑物上以便截留DNA；同时在支撑物的两侧提供压差，便于尿液样本通过吸附DNA的膜。在一个具体的实施方案中，将漏斗用作刚性支撑物，将吸附DNA的膜和滤纸放置在漏斗中。在另一个具体的实施方案中，将换膜过滤器作为刚性支撑物，将吸附DNA的膜放置在换膜过滤器中。其中，换膜过滤器由上、下两部分组成，且上、下均有圆柱形的孔可以与其它装置相连接，例如，上面圆柱形的孔可以与注射器(不带针头)相连来提供压差。换膜过滤器上、下两个部分之间可以容纳纸片状的膜，且有橡胶圈来保证密封性，因此可作为吸附DNA的膜的刚性支撑物。
在具体的实施方案中，在尿液样本通过之前，吸附DNA的膜和/或滤纸是浸湿的。技术人员理解浸湿的吸附DNA的膜和/或滤纸更有利于DNA的吸附。
在一些实施方案中，在漏斗或换膜过滤器的两侧(相当于在吸附DNA的膜的两侧)提供压差。技术人员理解，可以在漏斗的桶形容器(即斗)入口或换膜过滤器的入口上施加正压，也可以在漏斗或换膜过滤器的出口处施加负压，使得尿液样本在压力的推动下通过吸附DNA的膜(和滤纸)。适用于本公开方法的压差选自3KPa、4KPa、5KPa、10KPa、15KPa、20KPa、30KPa、40KPa、50KPa或上述任意两个数值之间的范围。例如，在一个具体的实施方案中，是5KPa至50KPa。
在一些实施方案中，尿液样本通过吸附DNA的膜(和滤纸)的速度在0.5至3滴/秒范围内，例如1至2滴/秒。在具体的实施方案中，尿液样本通过吸附DNA的膜(和滤纸)的速度为1至1.5滴/秒，以确保DNA与吸附DNA的膜的相互作用。
在一些实施方案中，任何能够吸附DNA的膜均可以用于实施本公开的方法。因此，吸附DNA的膜选自PVDF膜、硝酸纤维膜和尼龙膜，优选尼龙膜。吸附DNA的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围。在具体的实施方案中，是0.22μm。在具体的实施方案中，吸附DNA的膜的数目为单层。
在一些实施方案中，滤纸为定性滤纸。在具体的实施方案中，可用的定性滤纸为快速型、中速型和慢速型定性滤纸。在一个具体的实施方案中，为102型中速定性滤纸。在一些实施方案中，所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层。在具体的实施方案中，滤纸的数目是3、4或5层。
在具体的实施方案中，漏斗是布氏漏斗。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜和滤纸的尺寸(或面积)是相同的。技术人员理解，此处所述的“相同”并非是完全相同，包含了相近的含义。吸附DNA的膜和/或滤纸的尺寸根据所用漏斗或换膜过滤器的底面面积而变化，其面积足以覆盖漏斗或换膜过滤器的底面，而又不是过大以至于难以安置在漏斗或换膜过滤器中。
在一些实施方案中，所述尿液样本为新鲜尿液样本。本文所述“新鲜尿液”是指离开人体后5小时内收集的尿液。一个具体的实施方案中，尿液样本为离开人体后3小时内，更优选1小时内收集的尿液。
因为，尿液在收集后放置过久，容易导致DNA在尚未保存之前就被降解了。
一个具体的实施方案中，提供了一种浓缩和保存尿液样本中DNA的方法，其由如下步骤组成：
a)提供1小时内收集的新鲜尿液样本；
b)在5KPa压差下，使20ml至50ml尿液样本按照1至1.5滴/秒的速度依次通过水浸湿的单层尼龙膜(和水浸湿的3至5层滤纸)，其中尼龙膜和滤纸的直径为47mm，尼龙膜孔径为0.22μm；
c)在室温自然干燥尼龙膜或者用吹风机吹干尼龙膜；以及
d)将干燥的尼龙膜置于真空密封袋中于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
根据本公开的另一方面，提供了一种用于实施上述方法的装置，其包含或由如下组件组成：吸附DNA的膜、滤纸、漏斗、收集器以及压差产生装置。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜和滤纸放置于漏斗中。在一些实施方案中，吸附DNA的膜和滤纸放置于漏斗桶形容器(即斗)的底面上。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜以最大接触面积的方式接触滤纸，同时滤纸也以其最大接触面积接触漏斗底面；因此滤纸介于吸附DNA的膜和漏斗底面之间，使得吸附DNA的膜不直接地接触漏斗底面。
在一些实施方案中，收集器用于收集流穿吸附DNA的膜和滤纸的尿液样本；同时在本公开的方法中，也可以通过在收集器中产生负压，使得尿液样本在压力作用下流穿吸附DNA的膜和滤纸。因此，在具体的实施方案中，收集器包含两个口，两个口分别与漏斗出口和压差产生装置密闭连接。在一些实施方案中，密闭连接方式可以通过有孔胶塞的方式进行，或者通过软管连接。
根据本公开的另一方面，提供了另一种用于实施上述方法的装置，其包含或由如下组件组成：吸附DNA的膜、换膜过滤器、收集器以及压差产生装置。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜单独放置于换膜过滤器中，并且以最大接触面积的方式接触换膜过滤器底面。
在一些实施方案中，压差产生装置，使得尿液样本在压力作用下流穿吸附DNA的膜。因此，在具体的实施方案中，压差产生装置可以为注射器，即注射器在换膜过滤器一端提供正压。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围。在具体的实施方案中，是0.22μm。在具体的实施方案中，吸附DNA的膜的数目为单层。
在一些实施方案中，滤纸为定性滤纸。在具体的实施方案中，可用的定性滤纸为快速型、中速型和慢速型定性滤纸。在一个具体的实施方案中，为102型中速定性滤纸。在一些实施方案中，所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层。在具体的实施方案中，滤纸的数目是3、4或5层。
在一些实施方案中，吸附DNA的膜和滤纸的尺寸(或面积)是相同的。技术人员理解，此处所述的“相同”并非是完全相同，包含了相近的含义。吸附DNA的膜和/或滤纸的尺寸根据所用漏斗的底面面积或换膜过滤器的面积而变化，其面积足以覆盖漏斗或换膜过滤器的底面，而又不是过大以至于难以安置在漏斗或换膜过滤器中。
在一些实施方案中，漏斗为布氏漏斗。在一些实施方案中，压差产生装置为真空泵或注射器。在一些实施方案中，收集器为抽滤瓶或烧杯。
附图说明
图1：本发明中一种收集尿液DNA的装置图。
图2：本发明中另一种收集尿液DNA的装置图，其中1代表注射器，2代表换膜过滤器。
图3：在不同个体中，采用琼脂糖凝胶检测验证本发明的方法浓缩和保存的尿液样本中基因组DNA的完整性。
图4：在同一个体中，采用琼脂糖凝胶检测验证本发明的方法浓缩和保存的尿液样本中基因组DNA的完整性。
图5：男性(M)SNP在染色体上的分布图。曲线的高低表示对应区域SNP的数量。
图6：女性(F)SNP在染色体上的分布图。曲线的高低表示对应区域SNP的数量。
具体实施方式
实施例
实施例1：尿液DNA的浓缩、收集和保存
1.材料与试剂
1.1仪器：装置见图1。
1.2材料和试剂：纯净水；小镊子；0.22μm孔径的尼龙膜；102型中速定性滤纸；剪刀；真空封装机；封装袋。
2.实验方法
(1)从志愿者中新鲜收集尿液样本；
(2)尼龙膜和滤纸的准备：
每份尿液样品(大概20ml至50ml)保存在一张或多张0.22μm尼龙膜上。按需裁剪相应张数的直径为47mm的圆形尼龙膜和滤纸。
在布氏漏斗上放置3到5张用水浸润的圆形滤纸。
将尼龙膜浸入纯净水中进行清洗，然后置于圆形滤纸之上，注意避免气泡的产生。
(3)安装好真空抽滤瓶，倒入20ml至50ml尿液。
(4)将真空抽滤瓶和真空泵连接，通过调整真空压力为5KPa左右，使尿液穿过尼龙膜和滤纸后逐滴滴下，随着时间的累积，逐渐增大真空泵压力至50KPa，直至尿液全部滤过后即可，总时间约为5分钟至15分钟左右(具体时间根据需要抽滤的尿液体积有所变化，但保证尿液逐滴滴下，约1至1.5滴/秒)。
(5)待尿液滤过完毕，取下尼龙膜。
(6)于室温干燥，或吹风机吹干也可。
(7)将尼龙膜连同标签纸(记录内容：病历号，取尿日期，取尿时间，用药前后，尿常规编号)放入独立的真空封装袋内于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
实施例2：尿液DNA的浓缩、收集和保存
1.材料与试剂
1.1仪器：装置见图2，其中换膜过滤器2由上、下两部分组成，且上、下均有圆柱形的孔可以与其它装置相连接，上面圆柱形的孔与注射器1(不带针头)相连来提供压差。尼龙膜位于换膜过滤器上、下两个部分之间。
1.2材料和试剂：纯净水；小镊子；0.22μm孔径的尼龙膜；102型中速定性滤纸；剪刀；真空封装机；封装袋。
2.实验方法
(1)从志愿者中新鲜收集尿液样本；
(2)尼龙膜的准备：
每份尿液样品(大概20ml至50ml)保存在一张或多张0.22μm尼龙膜上。按需裁剪相应张数的直径为47mm的圆形尼龙膜。
将尼龙膜浸入纯净水中浸湿，然后置于换膜过滤器中，拧紧。
(3)将注射器中吸入20ml至50ml尿液。
(4)将装有尿液的注射器插入换膜过滤器的入口端，推动注射器使尿液穿过尼龙膜后逐滴滴下，换膜过滤器另一出口端对准烧杯等容器。随着时间的累积，逐渐增大推力，直至尿液全部滤过后即可，总时间约为5分钟至15分钟左右(具体时间根据需要浓缩、收集的尿液体积有所变化，但保证尿液逐滴滴下，约1至1.5滴/秒)。
(5)待尿液滤过完毕，取下尼龙膜。
(6)于室温干燥，或吹风机吹干也可。
(7)将尼龙膜连同标签纸(记录内容：病历号，取尿日期，取尿时间，用药前后，尿常规编号)放入独立的真空封装袋内于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
对比例1：尿液DNA的浓缩、收集和保存
1.材料与试剂
1.1仪器：装置见图1。
1.2材料和试剂：纯净水；小镊子；0.22μm孔径的尼龙膜；102型中速定性滤纸；剪刀；真空封装机；封装袋。
2.实验方法
(1)从志愿者中新鲜收集尿液样本。
(2)将尿液于4℃，5,000×g离心30分钟，去除离心管底部的杂质，保留上清。
(3)尼龙膜和滤纸的准备：
每份尿液样品(大概20ml至50ml)保存在一张或多张0.22μm尼龙膜上。按需裁剪相应张数的直径为47mm的圆形尼龙膜和滤纸；
在布氏漏斗上放置3到5张用水浸润的圆形滤纸；
将尼龙膜浸入纯净水中进行清洗，然后置于圆形滤纸之上，注意避免气泡的产生。
(4)安装好真空抽滤瓶，倒入20ml至50ml尿液。
(5)将真空抽滤瓶和真空泵连接，通过调整真空压力为5KPa左右，使尿液穿过尼龙膜和滤纸后逐滴滴下，随着时间的累积，逐渐增大真空泵压力至50KPa，直至尿液全部滤过后即可，总时间约为5分钟至15分钟左右(具体时间根据需要抽滤的尿液体积有所变化，但保证尿液逐滴滴下，约1至1.5滴/秒)。
(6)待尿液滤过完毕，取下尼龙膜。
(7)于室温干燥，或吹风机吹干也可。
(8)将尼龙膜连同标签纸(记录内容：病历号，取尿日期，取尿时间，用药前后，尿常规编号)放入独立的真空封装袋内于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
实施例3尼龙膜上保存的DNA的提取
(1)将尼龙膜剪碎，放在离心管中，加入1.2ml裂解液，涡旋振荡1min。
(2)于60℃水浴2h，或过夜。
(3)加500μl酚：氯仿(1:1)，涡旋振荡30s。
(4)于4℃，12,000rpm离心15分钟。
(5)取上清，加入500μl酚：氯仿(1:1)，振荡混匀。
(6)然后4℃，12,000rpm离心10min。
(7)取上清，加入等体积的异丙醇，混匀。
(8)于4℃，12,000rpm离心15min。
(9)弃上清后，加入1ml的75％的乙醇，振荡混匀，于4℃，12,000rpm离心10min。
(10)弃上清后，空气中干燥10～15分钟，注意不能让沉淀完全变干，否则会增加其不溶性。
(11)最后用少量无RNA酶的水(10μl至30μl)溶解，在NanoDrop 2000紫外分光光度仪上测OD260/OD280得出DNA的浓度，剩余DNA需在-80℃冰箱保存，或进行后续的测序或PCR。
测试例1：琼脂糖凝胶检测
(1)从志愿者中新鲜收集尿液样本；男性1人(M1)，女性2人(F1、F2)。
(2)将M1、F1、F2各50ml尿液(每个人重复A、B两次或A、B、C三次，根据尿量来决定)，分别采用实施例1和对比例1的方法对尿液DNA进行浓缩、收集和保存。同时保留采用对比例1中的方法对F2处理离心后的沉淀。
(3)按照实施例3的实验流程提取尼龙膜上保存的DNA。采用相同方法，同时提取F2所得沉淀的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳的方法，来进行对比分析。
结果如图3、图4所示。图3中各样品信息编号如表1所示，图4中个样品信息编号如表2所示。图3和图4中的M表示核酸标记(Marker)。如图3、图4所示，尿液样品通过实施例1的方法结合DNA的膜的浓缩和保存后，所提取的DNA能够明显在琼脂糖胶上看到基因组DNA的条带。而尿液样品通过对比例1的方法结合DNA的膜的浓缩和保存后，所提取的DNA不能在琼脂糖胶上看到基因组DNA的条带，而细胞沉淀提取的DNA能够在琼脂糖胶上看到基因组DNA的条带。这表明，采用本发明的方法对于尿液中基因组DNA的完整性良好，而对比例中的离心步骤会丢失尿液中基因组DNA的信息。
表1.图3中的样品编号
表2.图4中的样品编号
测试例2：尼龙膜上保存DNA 2b-RAD测序
按照实施例1或2，以及实施例3的实验流程，将男性(M)和女性(F)的20ml尿液保存于尼龙膜上。将干燥的尼龙膜剪碎，提取膜上保存的DNA，进行2b-RAD测序。
结果如图5、图6所示，据筛选得到的每个样品独立的SNP，统计SNP在基因组的位置，以20Kbp为窗口大小，每次移动步长10Kbp，曲线峰值区代表该位置SNP数量较多。可见，男性(M)样品共得到独立的SNP 14,347,440个，女性(F)样品共得到独立的SNP 18,538,720个，且这些SNP位点几乎平均分布于各条染色体上。此结果进一步证实，用膜来浓缩和保存尿液中的DNA的方法，能够很好的反映人体的基因组信息。
总结：
本公开的技术方案虽不限于具体理论，但是可以理解为，由于DNA中的部分嘧啶碱基可与尼龙膜(一种合成的长链聚酰胺薄膜)上的正电荷结合，带正电荷的尼龙膜对DNA结合力强，敏感性也较高，且韧性较强。当采用本发明的方法将尿液DNA吸附在尼龙膜上时，便于以真空、干燥的形式保存尿液DNA。同时，在本公开的技术方案中，收集尿液后，无需任何处理，直接进行浓缩、收集和保存，使得采用本发明的方法保留了尿液中各成分的DNA，检测尿液样本中所携带的更为完整的信息，例如其中含有的细胞和它们带来的整个基因组DNA，具有重要的临床的意义，这也为后续构建信息更为全面的生物样本库奠定基础。此方法简便易行，而且费用低。它不仅实现了将尿液中低浓度的DNA浓缩的效果，也可以使DNA在完全真空、干燥的状态下保存，避免了DNA降解，可以在室温下长期保存尿液DNA。
参考文献：
1.Smith,E.R.,等人,Urinary biomarkers predict brain tumor presence andresponse to therapy.Clin Cancer Res,2008.14(8):p.2378-86.
2.Shao,C.,等人,A tool for biomarker discovery in the urinaryproteome:a manually curated human and animal urine protein biomarkerdatabase.Mol Cell Proteomics,2011.10(11):p.M111 010975.
3.Huang,J.T.,等人,Clinical validity of plasma and urinary desmosineas biomarkers for chronic obstructive pulmonary disease.Thorax,2012.67(6):p.502-8.
4.Salvi,S.,等人,Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer:current insights.Onco Targets Ther,2016.9:p.6549-6559.
5.Chan,A.K.,等人,Cell-free nucleic acids in plasma,serum and urine:anew tool in molecular diagnosis.Ann Clin Biochem,2003.40(Pt 2):p.122-30.

Claims (10)

1.一种浓缩和保存尿液样本中基因组DNA的方法，其包括如下步骤：
a)提供尿液样本；
b)在存在压差的情况下，使尿液样本依次通过能够吸附DNA的膜和滤纸，或者使尿液样本仅通过能够吸附DNA膜；
c)干燥吸附DNA的膜，所述干燥通过选自如下的方式进行：室温自然干燥，或吹风机吹干；
d)将吸附DNA的膜置于真空密封袋中，于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述吸附DNA的膜选自PVDF膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜，优选尼龙膜；
吸附DNA的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围，优选0.22μm；
所述吸附DNA的膜的数目为单层。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述吸附DNA的膜和所述滤纸置于同一漏斗中；优选布氏漏斗。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中：
所述滤纸为定性滤纸，定性滤纸选自快速型、中速型和慢速型定性滤纸；优选102型中速定性滤纸；
所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层，优选所述滤纸的数目是3、4或5层。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述吸附DNA的膜单独置于换膜过滤器中。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述压差选自3KPa、4KPa、5KPa、10KPa、15KPa、20KPa、30KPa、40KPa、50KPa或上述任意两个数值之间的范围；优选5KPa至15KPa。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述尿液样本为新鲜尿液样本，优选离开人体后5小时内，优选3小时内，更优选1小时内收集的尿液样本。
8.权利要求1-2和5-7中任一项所述方法中用的一种装置，其包括或由如下组成：
吸附DNA的膜、换膜过滤器、注射器；
其中，
吸附DNA的膜放置于换膜过滤器中；
换膜过滤器的其中一个口与注射器密闭连接。
9.根据权利要求8所述的装置，其中
所述吸附DNA的膜选自PVDF膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜，优选尼龙膜；
所述吸附DNA的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围，优选0.22μm；所述吸附DNA的膜的数目为单层。
10.根据权利要求8所述的装置，其中所述压差产生装置为注射器。
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