CN105567670A - 一种保存尿液样本中核酸的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保存尿液样本中核酸的方法及其装置。具体而言，本发明涉及利用能够吸附核酸的膜长期保存尿液核酸的方法与装置。本发明的方法将尿液核酸吸附在膜上，以真空、干燥的形式保存尿液核酸，不仅简单易行，而且所需费用低，不需要任何的有机溶剂，不会对环境造成污染，最重要的是核酸是在完全真空、干燥的状态下保存，避免了核酸降解，可以在室温下长期保存尿液核酸。

Description

一种保存尿液样本中核酸的方法及其装置

技术领域

本发明涉及生物和医学领域，具体而言涉及生物样本中核酸的收集、保存方法及其装置。

背景技术

20世纪90年代后期，科学家们提出生物样本库的概念，即标准化收集、处理、储存和应用健康和疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本，并用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。

尿液由肾脏产生，且可以无创连续获得。然而，目前生物医学实验的主要研究对象血液，由于受稳态机制的影响不易容纳变化。而尿液没有任何稳定的机制，所以尿液也可能是比血液更好的生物标志物来源[1]。人体内各种体液与器官的关系中很少有像尿液与肾脏这般密切联系且容易获得的。除此之外，尿液不仅能够动态的反映肾脏和泌尿系统的变化，也能够反映身体其它部位的异常或疾病信息。因此在尿液中寻找疾病的生物标志物可能是生物标志物研究领域中最易突破的方向之一。

综上所述，尿液是体内的一种重要的生物样本，而其中的尿液核酸应该随着病程的发展被保存下来。大量尿液核酸的保存将促进以后核酸生物标志物的临床样本验证，利于生物标志物的研究以及最终向临床应用的转化。利用此方法，将尿液核酸样本作为生物样本库中的一员被保存变成了可能。

目前，尿液的保存一般是冻存在-80℃的冰箱里，往往需要很大的空间。尿液由于具有浓度稀，体积大，含盐高，不适合直接大规模的原液保存。因此要以液体冻存的方式保存如此众多的尿液临床样本是非常耗费人力物力的工作。

鉴于此，人们仍然需要一种简单廉价的保存尿液核酸的方法，可以作为全面保存生物样本的一部分。

发明内容

因此，根据本公开的一些实施方式提供了一种收集尿液样本中核酸的方法，其包括如下步骤：

a)提供尿液样本，b)去除尿液样本中的杂质，c)在存在压差的情况下，使尿液样本依次通过吸附核酸的膜和滤纸，d)任选地，干燥吸附核酸的膜。如此得到的吸附核酸的膜上便吸附有尿液样本中的核酸。在一些实施方式中，吸附核酸的膜的干燥可以通过选自如下的方式进行：室温自然干燥、在40℃至60℃下在烘箱中干燥。

本公开还提供了一种保存尿液样本中核酸的方法，其包括如下步骤：a)提供尿液样本，b)去除尿液样本中的杂质，c)在存在压差的情况下，使尿液样本依次通过吸附核酸的膜和滤纸，d)干燥吸附核酸的膜，以及e)将吸附核酸的膜置于真空密封袋中于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。

在本公开中，核酸是指DNA或RNA。在具体的实施方式中，尤其涉及保存尿液中的RNA，因为RNA极为容易被广泛存在的RNA酶所降解。

在一些实施方式中，吸附核酸的膜的干燥可以通过选自如下的方式进行：室温自然干燥、在40℃至60℃下在烘箱中干燥。

在一些实施方式中，去除尿液样本中的杂质是指去除尿液样本中的不溶性物质，包括但不限于细胞或细胞的碎片。适用于本公开方法的去除方式是通过离心进行的。

为了使核酸截留在吸附核酸的膜上，需要使尿液样本通过吸附核酸的膜。然而，吸附核酸的膜是柔软的，因此，需要将吸附核酸的膜放置在一个刚性支撑物上以便截留核酸；同时在支撑物的两侧提供压差，便于尿液样本通过吸附核酸的膜。在一个具体的实施方式中，将漏斗用作刚性支撑物，将吸附核酸的膜和滤纸放置在漏斗中。在具体的实施方式中，在尿液样本通过之前，吸附核酸的膜和滤纸是浸湿的。技术人员理解浸湿的吸附核酸的膜和滤纸可以更好地覆盖漏斗的底面。

在一些实施方式中，在漏斗的两侧(相当于在吸附核酸的膜的两侧)提供压差。技术人员理解，可以在漏斗的桶形容器(即斗)入口上施加正压，也可以在漏斗的出口处施加负压，使得尿液样本在压力的推动下通过吸附核酸的膜和滤纸。适用于本公开方法的压差选自3KPa、4KPa、5KPa、10KPa、15KPa、20KPa、30KPa、40KPa、50KPa或上述任意两个数值之间的范围。例如，在一个具体的实施方式中，是5KPa至50KPa。

在一些实施方式中，尿液样本通过吸附核酸的膜和滤纸的速度在0.5至3滴/秒范围内，例如1至2滴/秒。在具体的实施方式中，尿液样本通过吸附核酸的膜和滤纸的速度为1至1.5滴/秒，以确保核酸与吸附核酸的膜的相互作用。

在一些实施方式中，任何能够吸附核酸的膜均可以用于实施本公开的方法。因此，吸附核酸的膜选自PVDF膜、硝酸纤维膜和尼龙膜，优选尼龙膜。吸附核酸的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围。在具体的实施方式中，是0.45μm。在具体的实施方式中，吸附核酸的膜的数目为单层。

在一些实施方式中，滤纸为定性滤纸。在具体的实施方式中，可用的定性滤纸为快速型、中速型和慢速型定性滤纸。在一个具体的实施方式中，为102型中速定性滤纸。在一些实施方式中，所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层。在具体的实施方式中，滤纸的数目是4、5或6层。

在具体的实施方式中，漏斗是布氏漏斗。

在一些实施方式中，滤纸和吸附核酸的膜的尺寸(或面积)是相同的。技术人员理解，此处所述的“相同”并非是完全相同，包含了相近的含义。滤纸和吸附核酸的膜的尺寸根据所用漏斗的底面面积而变化，其面积足以覆盖漏斗的底面，而又不是过大以至于难以安置在漏斗中。

在一些实施方式中，所述尿液样本为新鲜尿液样本。本文所述“新鲜尿液”是指离开人体后5小时内收集的尿液。一个具体的实施方式中，尿液样本为离开人体后3小时内，更优选1小时内收集的尿液。

因为，尿液在收集后放置过久，容易导致核酸在尚未保存之前就被降解了。

一个具体的实施方式中，提供了一种保存尿液样本中核酸的方法，其由如下步骤组成：

a)提供1小时内收集的新鲜尿液样本；

b)尿液样本于4℃5000×g离心30分钟，取上清尿液样本；

c)在5KPa压差下，使50ml至100ml上清尿液样本按照1至1.5滴/秒的速度依次通过水浸湿的单层尼龙膜和水浸湿的4至6层滤纸，其中尼龙膜和滤纸的直径为47mm，尼龙膜孔径为0.45μm；

d)在56℃下烘箱中干燥5分钟或者在室温自然干燥尼龙膜；以及

e)将尼龙膜置于真空密封袋中于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。

根据本公开的另一方面，提供了一种用于实施上述方法的装置，其包含或由如下组件组成：吸附核酸的膜、滤纸、漏斗、收集器以及压差产生装置。

在一些实施方式中，吸附核酸的膜和滤纸放置于漏斗中。在一些实施方式中，吸附核酸的膜和滤纸放置于漏斗桶形容器(即斗)的底面上。

在一些实施方式中，吸附核酸的膜以最大接触面积的方式接触滤纸，同时滤纸也以其最大接触面积接触漏斗底面；因此滤纸介于吸附核酸的膜和漏斗底面之间，使得吸附核酸的膜不直接地接触漏斗底面。

在一些实施方式中，收集器用于收集流穿吸附核酸的膜和滤纸的尿液样本；同时在本公开的方法中，也可以通过在收集器中产生负压，使得尿液样本在压力作用下流穿吸附核酸的膜和滤纸。因此，在具体的实施方式中，收集器包含两个口，两个口分别与漏斗出口和压差产生装置密闭连接。在一些实施方式中，密闭连接方式可以通过有孔胶塞的方式进行，或者通过软管连接。

在一些实施方式中，吸附核酸的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围。在具体的实施方式中，是0.45μm。在具体的实施方式中，吸附核酸的膜的数目为单层。

在一些实施方式中，滤纸为定性滤纸。在具体的实施方式中，可用的定性滤纸为快速型、中速型和慢速型定性滤纸。在一个具体的实施方式中，为102型中速定性滤纸。在一些实施方式中，所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层。在具体的实施方式中，滤纸的数目是4、5或6层。

在一些实施方式中，滤纸和吸附核酸的膜的尺寸(或面积)是相同的。技术人员理解，此处所述的“相同”并非是完全相同，包含了相近的含义。滤纸和吸附核酸的膜的尺寸根据所用漏斗的底面面积而变化，其面积足以覆盖漏斗的底面，而又不是过大以至于难以安置在漏斗中。

在一些实施方式中，漏斗为布氏漏斗。在一些实施方式中，压差产生装置为真空泵。在一些实施方式中，收集器为抽滤瓶。

附图说明

图1：收集尿液核酸的装置图。

具体实施方式

实施例1尿液核酸的收集和保存

1.材料与试剂

1.1仪器：装置见图1。

1.2材料和试剂：纯净水；小镊子；0.45μm孔径的尼龙膜；102型中速定性滤纸滤纸；剪刀；真空封装机；封装袋。

2.实验方法

(1)从志愿者中新鲜收集尿液样本；

(2)将尿液于4℃，5,000×g离心30分钟，去除离心管底部的杂质，保留上清。

(3)尼龙膜和滤纸的准备：

每份尿液样品(大概100ml至200ml)保存在两张或多张0.45μm尼龙膜上。按需裁剪相应张数的直径为47mm的圆形滤纸和尼龙膜。

在布氏漏斗上放置4到6张用水浸润的圆形滤纸。

将尼龙膜浸入纯净水中进行清洗，然后置于圆形滤纸之上，注意避免气泡的产生。

(4)安装好真空抽滤瓶，倒入50ml至100ml尿液。

(5)将真空抽滤瓶和真空泵连接，通过调整真空压力为5KPa左右，使尿液穿过尼龙膜和滤纸后逐滴滴下，随着时间的累积，逐渐增大真空泵压力至50KPa，直至尿液全部滤过后即可，总时间约为5分钟至15分钟左右(具体时间根据需要抽滤的尿液体积有所变化，但保证尿液逐滴滴下，约1至1.5滴/秒)。

(6)待尿液滤过完毕，取下尼龙膜。

(7)于56℃烤箱烘烤5分钟，或室温干燥也可。

(8)将尼龙膜连同标签纸(记录内容：病历号，取尿日期，取尿时间，用药前后，尿常规编号)放入独立的真空封装袋内于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。

实施例2、尼龙膜上保存的尿液核酸的提取

1、将尼龙膜剪碎，放在离心管中，加入1mlTRIzol试剂，于冰上裂解。

2、加入0.25ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，在室温放置2至3分钟，于4℃，12,000rpm离心15分钟。

3、离心后取上层水相，加入异丙醇0.6ml，室温放置10分钟(或-20℃过夜)，然后4℃，12,000rpm离心10分钟。

4、离心后弃上清，可见离心管底部有少量胶冻样沉淀，加入1ml75％乙醇振荡混匀，然后4℃，12,000rpm离心10分钟。

5、弃上清后，加入1ml75％乙醇振荡混匀，然后4℃，12,000rpm离心10分钟。

6、弃上清，空气中干燥10至15分钟，注意不能让沉淀完全变干，否则会增加其不溶性。

7、最后用少量无RNA酶的水(10μl至30μl)溶解，在NanoDrop2000紫外分光光度仪上测OD₂₆₀/OD₂₈₀得出RNA的浓度，剩余RNA需在-80℃冰箱保存，或进行后续的逆转录与实时定量PCR使用。

测试例1.尼龙膜上核酸保存量重复性

按照实施例1的实验流程，将混合的50ml尿液保存于尼龙膜上，平行重复7次实验。将干燥的尼龙膜剪碎，提取膜上保存的RNA，在NanoDrop2000紫外分光光度仪上测OD₂₆₀/OD₂₈₀得出RNA的浓度，并计算总量。

结果如表1所示，RNA总量的平均值±标准差为7788.65±145.9ng，变异系数为0.0187，表明重复性良好。

表1.七次重复实验RNA含量

测试例2.室温保存3个月前、后膜上核酸含量比较

将混合的100ml尿液抽滤到尼龙膜上真空、干燥保存，重复8次。

然后随机挑选4张膜，提取膜上的RNA，并在NanoDrop2000紫外分光光度仪上测OD260/OD280得出RNA的浓度，并计算RNA总量，结果如表2所示。

另外4张膜，与室温保存3个月后，提取膜上的RNA，并在NanoDrop2000紫外分光光度仪上测OD260/OD280得出RNA的浓度，并计算RNA总量，结果如表3。

其中第0天重复四次所得RNA总量的平均值±标准差为11264.70±666.23ng，变异系数为0.0232，3个月重复四次所得RNA总量的平均值±标准差为11920.73±766.56ng，变异系数为0.0219。

表2.第0天4次重复实验表3.第3个月4次重复实验

结果显示，经过室温约3个月的保存，核酸并无明显减少，说明至少在3个月，室温保存的核酸并没有降解。

总结：

本公开的技术方案虽不限于具体理论，但是可以理解为，由于核酸中的部分嘧啶碱基可与尼龙膜(一种合成的长链聚酰胺薄膜)上的正电荷结合，带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高，且韧性较强。当采用本发明的方法将尿液核酸吸附在尼龙膜上时，便于以真空、干燥的形式保存尿液核酸。此方法简便易行，而且费用低。它不需要任何的有机溶剂，利于环保，最重要的是核酸是在完全真空、干燥的状态下保存，避免了核酸降解，可以在室温下长期保存尿液核酸。

参考文献：

1.高友鹤.尿液有可能成为生物标志物的金矿吗.中国科学：生命科学,2013,43:1。

Claims (10)

1.一种保存尿液样本中核酸的方法，其包括如下步骤：

a)提供尿液样本；

b)去除尿液样本中的杂质；

c)在存在压差的情况下，使尿液样本依次通过能够吸附核酸的膜和滤纸；

d)干燥吸附核酸的膜，所述干燥通过选自如下的方式进行：室温自然干燥、在40℃至60℃下在烘箱中干燥；

e)将吸附核酸的膜置于真空密封袋中，于室温、4℃、-20℃或-80℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

所述吸附核酸的膜选自PVDF膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜，优选尼龙膜；

吸附核酸的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围，优选0.45μm；

所述吸附核酸的膜的数目为单层。

3.根据权利要求1所述的方法，其中：

所述滤纸为定性滤纸，定性滤纸选自快速型、中速型和慢速型定性滤纸；优选102型中速定性滤纸；

所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层，优选所述滤纸的数目是4、5或6层。

4.根据权利要求1所述的方法，在步骤b)中通过离心去除尿液样本中的杂质，其中所述杂质包含细胞或其碎片。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述吸附核酸的膜和所述滤纸置于同一漏斗中；优选布氏漏斗。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述压差选自3KPa、4KPa、5KPa、10KPa、15KPa、20KPa、30KPa、40KPa、50KPa或上述任意两个数值之间的范围；优选5KPa至15KPa。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述尿液样本为新鲜尿液样本，优选离开人体后5小时内，优选3小时内，更优选1小时内收集的尿液样本。

8.一种用于权利要求1-7任一项所述方法的装置，其包含或由如下组成：

吸附核酸的膜、滤纸、漏斗、收集器以及压差产生装置；

其中，

吸附核酸的膜和滤纸放置于漏斗中；

吸附核酸的膜接触滤纸，滤纸接触漏斗底面，吸附核酸的膜不接触漏斗底面；

收集器的两个口分别与漏斗出口和压差产生装置密闭连接。

9.根据权利要求8所述的装置，其中

所述吸附核酸的膜选自PVDF膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜，优选尼龙膜；

所述吸附核酸的膜的孔径为0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm、0.65μm、或上述任意两个数值之间的范围，优选0.45μm；所述吸附核酸的膜的数目为单层；

所述滤纸为定性滤纸，定性滤纸选自快速型、中速型和慢速型定性滤纸；优选102型中速定性滤纸；所述滤纸的数目选自3、4、5、6、7和8层，优选所述滤纸的数目是4、5或6层。

10.根据权利要求8所述的装置，其中

所述漏斗为布氏漏斗；

所述压差产生装置为真空泵。