CN206082188U - 一种收集和保存尿液中蛋白质的装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种收集和保存尿液中蛋白质的装置。所述装置包括抽滤瓶和与抽滤瓶配合的漏斗；漏斗的底部由下至上依次铺设有滤纸、吸附膜和隔离膜；抽滤瓶与真空抽滤装置相连接。利用本实用新型装置对尿液中蛋白质进行收集和保存时，首先用绒毛浆作为吸收体收集新鲜的尿液，再通过抽滤装置将吸收体吸收的尿液中蛋白质洗脱下来，并吸附结合在吸附膜上，将膜干燥后，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白质。本实用新型装置收集和保存尿液中蛋白质的装置，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白质，简便易行，而且费用低；它不需要任何的有机溶剂，利于环保，最重要的是蛋白质是在完全干燥的状态下保存，避免了蛋白质的降解，可以在室温下长期保存尿液蛋白质。

Description

一种收集和保存尿液中蛋白质的装置

技术领域

本实用新型涉及一种收集和保存尿液中蛋白质的装置。

背景技术

生物标志物指的是与生理或病理生理过程相关的可监测的变化，其本质是变化。血浆作为机体内环境的重要组成部分，受稳态机制调节各种理化成分保持相对恒定，即变化范围小、容纳生物标志物少；而尿液作为机体的代谢废物，包含更多反映机体变化的信息，即非常多的生物标志物。此外，尿液样本获取无创，可以连续、大量收集，受酶解作用影响小。因此，同一个受试者可以重复多次取样，从而方便的动态监测疾病的变化。尿蛋白质组成相对血液更加简单、背景低。尿蛋白质组蛋白质含量动态范围大致在106，在对血浆和尿液采用完全一样的蛋白质鉴定分析策略的情况下，尿液中可以鉴定到更多的蛋白质。尿蛋白质组中70％蛋白质来自泌尿系统，另30％是由血浆经肾小球滤过产生。因此尿蛋白质不仅能够直接反应泌尿系统的生理和病理生理变化；还能够反应机体其它系统的疾病。综上所述，尿液可能是比血液更好的挖掘生物标志物的来源。

据Urinary Protein Biomarker Database所收录的信息，很多能够反映不同病理生理状态的尿液蛋白质候选标志物被报道，但在应用于临床以前需要对此进行大规模的临床验证。因此，尿液作为重要的生物样本，如果能将其与临床病历在疾病的每个阶段一同保存下来，那么在未来寻找生物标志物的回顾性和前瞻性研究中，特别是在大规模临床验证实验中，将起到不可估量的作用。

无自主排尿功能的群体，例如婴幼儿及意识丧失昏迷的患者，在疾病诊断过程中不能给出准确的主诉，从而使疾病的诊断更多的依赖于实验室检查。而血液检查属于有创检查，因此从尿液中寻找疾病标志物为疾病的诊断提供有价值的线索，尤其是婴幼儿。鉴于此，收集无自主排尿功能人尿液时存在一些困难，需要提供一种简单地收集和保存尿液中蛋白质的装置。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种能简单地收集和保存尿液中蛋白质的装置，特别适用于无自主排尿功能的群体(婴幼儿及意识丧失昏迷的患者等)的尿液中的蛋白质，本实用新型能够长期保存所收集的尿液中蛋白质。

本实用新型所提供的收集和保存尿液中蛋白质的装置，它包括一抽滤瓶和与所述抽滤瓶配合的漏斗；所述漏斗的底部由下至上依次铺设有滤纸、吸附膜和隔离膜。

上述的装置中，所述抽滤瓶与真空抽滤装置相连接，可进行真空抽滤，以加速混合液的通过。

上述的装置中，所述真空抽滤装置可选择真空泵。

上述的装置中，所述漏斗可为布氏漏斗。

上述的装置中，所述吸附膜为硝酸纤维素膜或活化的PVDF膜，所述活化指的是将PVDF膜在甲醇中浸泡几秒中。

上述的装置中，所述隔离膜可为PVDF膜；

所述隔离膜的孔径为可为0.22～0.45μm，具体可为0.22μm，以去除隔离一些颗粒杂质。

上述的装置中，所述隔离膜的层数为1层；

所述吸附膜的孔径为0.22～0.45μm，具体可为0.22μm。

上述的装置中，所述滤纸的层数可为3～8层，具体可为4～6层，可选用中速滤纸；

上述的装置中，所述吸附膜的层数为1层。

使用所述装置时，所述隔离膜、所述吸附膜和所述滤纸依次进行叠加，首先用水浸润，以防止气泡的产生。

利用本实用新型装置进行尿液中蛋白质的收集和保存时，可按照如下步骤进行：

(1)利用绒毛浆作为吸收体收集新鲜的尿液；

(2)将所述绒毛浆吸收的尿液中的蛋白质进行洗脱，并吸附于吸附膜上，即实现尿液中蛋白质的保存，所述洗脱的方法如下：

1)将所述绒毛浆与洗脱液混合并搅拌得混合液；

2)将所述混合液置于所述抽滤瓶中进行抽滤，使所述混合液流经所述吸附膜，则尿液中蛋白质吸附于所述吸附膜上。

上述的方法中，所述绒毛浆作为吸收体能够快速有效的吸收尿液，并且不与尿液中的绝大多数蛋白质产生永久而牢固的结合，从而能够将尿蛋白质从吸收体上洗脱下来。所述绒毛浆的材质以及纤维长度和分布均不影响其吸收效果。

上述的方法中，所述洗脱液可为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度可为1M，pH值可为6(通过添加氢氧化钠调节)，其具有一定酸碱度缓冲能力，可以调节尿液的pH值；

所述洗脱液的用量以能浸没所述绒毛浆、且能使所述绒毛浆搅拌均匀即可。

所述隔离膜的作用是：在混合液顺利通过时隔离膜不结合尿液蛋白质，并且阻隔所述绒毛浆纤维及尿液中的细胞和细胞碎片与所述硝酸纤维素膜结合接触；

上述的方法中，所述方法还包括对吸附了尿液中蛋白质的所述吸附膜进行干燥的步骤，

所述干燥在不高于56℃的烘箱中进行或为室温下自然干燥，所述室温指的是20～25℃。

收集得到的吸附了尿液中蛋白质的吸附膜进行保存时，可将其与记录有尿液样本信息的标签纸放入独立的真空密封袋中，于-80℃或室温保存。

利用本实用新型装置对尿液中蛋白质进行收集和保存时，首先用绒毛浆作为吸收体收集新鲜的尿液，再通过抽滤装置将吸收体吸收的尿液中蛋白质洗脱下来，并吸附结合在吸附膜上，将膜干燥后，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白质。

本实用新型装置收集和保存尿液中蛋白质的装置，以真空、干燥的形式保存尿液蛋白质，简便易行，而且费用低；它不需要任何的有机溶剂，利于环保，最重要的是蛋白质是在完全干燥的状态下保存，避免了蛋白质的降解，可以在室温下长期保存尿液蛋白质。

附图说明

图1为本实用新型收集和保存尿液中蛋白质的装置的结构示意图。

图1中各标记如下：

1真空抽滤瓶、2布氏漏斗、3橡胶塞、4细颈。

图2为本实用新型实施例2中尿液收集过程的示意图。

图3为本实用新型实施例2中尿液蛋白质保存到硝酸纤维素膜上过程的示意图。

图4为本实用新型实施例3中尿液中蛋白质的SDS-PAGE分析图。

图5为本实用新型实施例3中尿液中蛋白质丰度的变异系数的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步说明，但本实用新型并不局限于以下实施例。

实施例1、收集和保存尿液中蛋白质的装置

本实用新型提供的收集和保存尿液中蛋白质的装置的结构示意图如图1所示。

本实用新型装置包括一个真空抽滤瓶1和与该真空抽滤瓶1密封配合的布氏漏斗2，布氏漏斗2与真空抽滤瓶1之间通过橡胶塞3进行密封配合。布氏漏斗2的底部(图中未示出)上由下至上依次铺设有滤纸、硝酸纤维素膜和隔离膜，进行铺设之前，均先用水进行润湿，以防止产生气泡。滤纸铺设4～6层，为中速滤纸。硝酸纤维素膜铺设一层，孔径为0.22μm，用于吸附尿液中蛋白质。隔离膜具体可为PVDF膜，孔径为0.22μm，用于阻隔绒毛浆纤维及尿液中的细胞和细胞碎片与硝酸纤维素膜结合接触，并且其不结合尿液蛋白质。为了加速滤液通过，将真空抽滤瓶1的细颈4与真空抽滤装置(图中未示出)(如真空泵)相连接。

实施例2、收集和保存尿液中蛋白质(绒毛浆作为吸收体收集尿液，硝酸纤维素膜保存尿蛋白质)

本实施例中尿液收集的过程示意图如图2所示。

本实施例中尿液蛋白质保存到硝酸纤维素膜上的过程示意图如图3所示。

利用实施例1提供的装置进行尿液中蛋白质的收集，具体步骤如下：

1、将30ml混合尿液倾倒在绒毛浆吸收体上，20℃下放置30min，将吸有尿液的部分剪下，取出绒毛浆置于洁净烧杯中。

2、在烧杯中加入80ml洗脱液(1M磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液(pH6))完全浸没绒毛浆，约80ml，用玻璃棒充分搅拌均匀。

3、在布氏漏斗2上放置4张用纯净水浸润的圆形滤纸(中速)，将用纯净水浸润的硝酸纤维素膜置于圆形滤纸之上，将用纯净水润湿的PVDF膜作为隔离膜置于硝酸纤维素膜之上，整个过程中避免气泡的产生。

4、安装好真空抽滤瓶1，倒入步骤2得到的混合物。

5、将真空抽滤瓶1和真空泵连接，通过调整真空压力使液体依次穿过PVDF膜、硝酸纤维素膜和滤纸后逐滴滴下，随着时间的累积，逐渐增大真空泵压力，直至液体全部滤过后即可，总时间约为30分钟左右。

6、待液体滤过完毕，取下硝酸纤维素膜，20℃下自然干燥。

将结合尿蛋白质的硝酸纤维素膜与尿夜样本信息记录纸(如：样品编号、取尿时间、尿常规编号等等)放入独立的真空封装袋内室温保存。

本实施例硝酸纤维素膜上保存的尿液中蛋白质的提取过程如下：

1、将吸附尿蛋白质的硝酸纤维膜剪碎置于2mL离心管中，依次加入1.7mL丙酮，0.2mL 0.5％碳酸氢铵水溶液。

2、将混合物室温强烈振荡20s，置于55℃干浴器60min，且每隔20min停止加热强烈振荡30s。

3、4℃轻摇2h，12 000r/min、18℃离心15min，弃上清，室温放置10min，晾干。

4、加入150μL裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、40mM Tris、25mM二硫苏糖醇)，吹打后超声3min。

5、12 000r/min、18℃离心15min，取上清。

6、Bradford法测蛋白质浓度后，-80℃冻存备用。

对比例1、丙酮沉淀法提取尿液中蛋白质

丙酮沉淀尿蛋白质方法参照文献(Thongboonkerd V,Mcleish K,Arthur J,etal.Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetoneprecipitation or ultracentrifugation.Kidney Int,2002,62(4):1461–1470.)进行，混合尿液(与实施例1中尿液相同)3500g/min、4℃离心30min，取上清12000g/min、4℃离心30min，取上清20ml加入60mL预冷的丙酮，-20℃沉淀4h。Bradford法测蛋白质浓度-80℃保存备用。

实施例3、本实用新型实施例2保存的尿液中蛋白质和对比例1提取的尿液中蛋白质的分析

1、SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分析

分离胶4％～12％，考马斯亮蓝染色。

分析结果：每个样品取25μg尿蛋白质进行SDS-PAGE分析的结果如图4所示，由图4可以看出，本发明用绒毛浆作为吸收体收集尿液、硝酸纤维素膜保存尿液蛋白质的方法，与用丙酮沉淀法所制备的蛋白质样品做对照组相比，涵盖了绝大部分相同条带、无明显的蛋白质降解，说明本发明方法具有很好的技术重复性。

2、尿蛋白质酶切与LC-MS/MS分析

取100μg尿蛋白质，按Wisniewski等(Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,etal.Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat Methods,2009,6(5):359–363.)方法酶切，酶切后肽段用Oasis小柱除盐。除盐后肽段溶于0.1％甲酸，色谱分离(Thermo EASY-nLC 1200)：洗脱时间60min，色谱柱流速0.3μL/min，洗脱梯度为4％～28％流动相B(0.1％甲酸+79.9％乙腈+20％水)。反相柱洗脱下的多肽用(ThermoOrbitrap Fusion Lumos)进行质谱扫描。每个样品3次技术重复。

数据分析：所有二级质谱结果用Mascot(Perkins DN,Pappin DJC,Creasy DM,etal.Probaility-based protein identification by searching sequence databasesusing mass spectrometry data.Electrophoresis,1999,20(18):3551–3567.)(MatrixScience公司，版本2.4.0)软件进行数据库检索。所用数据库为Swissprot_human database(数据截止至2013年5月3日)。检索条件：胰酶酶切；允许最多2个漏切位点；固定修饰为半胱氨酸的脲基甲基化；母离子和子离子质量精确度均为0.05Da。采用Progenesis(Nonlinear公司，版本4.1)软件对蛋白进行定量，方法参照文献(Hauck S,Dietter J,Kramer R,etal.Deciphering membrane-associated molecular processes in target tissue ofautoimmune uveitis by label-free quantitative mass spectrometry.Mol CellProteomics,2010,9(10):2292–2306.)。选择进行定量的谱峰电荷数为+2、+3、+4；Mascot肽段评分(Ions score)>30，假阳性率(FDR)<1％；若蛋白只有一条肽段得到鉴定，即认为该蛋白不具有定量信息。

质谱鉴定蛋白质丰度的变异系数的分析结果：

利用绒毛浆作为吸收体收集尿液、硝酸纤维素膜结合尿液蛋白质方法分别处理3个尿液样品，共同鉴定到629个蛋白质，其丰度CV值的均数是20.1％，且62.3％的蛋白质丰度CV值<20％；用丙酮沉淀方法处理3个尿液样品，共同鉴定到730个蛋白质的丰度CV值的均数是22.2％，且56.6％的蛋白质丰度CV值<20％，如图5所示。

上述分析结果显示，利用绒毛浆作为吸收体收集尿液、硝酸纤维素膜保存尿蛋白质的方法，相较广泛应用的丙酮沉淀直接从尿液中提取蛋白质法，二者的技术重复性没有实质性差异。

Claims (1)

1.一种收集和保存尿液中蛋白质的装置，它包括一抽滤瓶和与所述抽滤瓶配合的布氏漏斗；其特征在于：所述布氏漏斗的底部由下至上依次铺设有滤纸、吸附膜和隔离膜；

所述抽滤瓶与真空泵相连接；

所述吸附膜为硝酸纤维素膜或活化的PVDF膜；

所述吸附膜的孔径为0.22~0.45μm；

所述吸附膜的层数为1层；

所述隔离膜为PVDF膜；

所述隔离膜的孔径为0.22~0.45μm；

所述隔离膜的层数为1层；

所述滤纸的层数为3~8层。