CN110724684A - 一种提取生物样本dna的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提取生物样本DNA的方法，其特征在于，使用滤膜过滤生物样本，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本。本发明还公开了一种提取生物样本DNA的装置、试剂盒，以及滤膜在制备用于提取法医样本DNA的产品中的用途。使用本发明的方法提取的DNA的效率高，且滤膜在室温下可长期存放。

Description

一种提取生物样本DNA的方法和装置
技术领域
本发明涉及生物科学领域，具体涉及生物样本中的DNA检测方法。
背景技术
尿液是一种较常见的生物检材，由人体肾脏生成，通过输尿管、膀胱及尿道排出体外(寇丽筠.临床基础检验学[M].北京：人民卫生出版社，1997，96-130)。正常人尿液中有核细胞成分少，DNA含量低，男性为 4-60ng/mL，女性为14-200ng/mL，同时由于尿液中DNA易降解并含有PCR抑制剂，DNA检验成功率低(刘开会，李宗亮.实用法医DNA检验学 [M].西安：西安出版社，2000：90-91)。通常采用离心取沉淀的方法(陈荣华等.尿液及尿斑DNA分型的研究[J].中国法医学杂志，2005，20(2)：71-73；李佑英，程建波.犯罪现场尿液DNA检验1例[J].中国法医学杂志，2006，21 (增刊)：16)、磁珠法直接吸附尿液中DNA的方法(郝晓明等.磁珠直接吸附法对体态检材游离DNA的提取[J].中国法医学杂志，2017，32 (4)：379-381)以及向尿液中加入蛋白酶K等消化细胞后纯化提取全部消化液的方法(孙树毅等.冰冻尿液的DNA提取及其检验[J].中国法医学杂志，2010，25(4)：259-261)等提取尿液中的细胞DNA。这些提取方法较为繁琐，且往往需要增加待检样本用量或结合纯化柱浓缩后方能提高检验成功率。另外，尿液保存时间对检测结果有直接影响(Brinkmann B，Rand S，BajanowskiT.Forensic identification of urine sediment[J].Int J LegaL Med， 1992，105(1)：59-61)，室温存放7天以上时无法检出样品的基因型(陈荣华等.尿液及尿斑DNA分型的研究[J].中国法医学杂志，2005，20(2)：71-73)。
发明内容
一方面，本发明公开了一种提取生物样本DNA的方法，其特征在于，使用滤膜过滤生物样本，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本。
其中，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
其中，所述方法进一步包括：将过滤后的滤膜干燥并剪碎，向剪碎的滤膜加入裂解液、蛋白酶进行纯化的步骤。
在一个具体实施例中，所述法医样本选自尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液。
在一个具体实施例中，所述水溶液包括从环境中直接获得的经过稀释的尿液、血液、或唾液，或者经过缓冲溶液冲洗尿斑、血斑、或唾液斑获得的溶液，或者从雪中收集的尿液、血液、或唾液。例如，受试者排泄的尿液，或者混合有其他溶液例如水的稀释尿液，从环境中使用缓冲溶剂冲洗或溶解倪傲班、血斑、或唾液斑所产生的水溶液，从雪中收集的尿液、血液、或唾液，该样本可以混合部分雪水。
在一个具体实施例中，所述从环境中直接获得的经过稀释的尿液中，尿液原液的体积百分比为1％至100％，优选为5％至20％；例如尿液原液的体积百分比为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、2、 15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者小于1％，例如0.5％、0.1％、0.01％。
在一个具体实施例中，所述法医样本可以为存放1天以上的样本，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，优选存放4天以上或7天以上的样本。
其中，缓冲溶液包括由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。本领域技术人员应理解，只要能够稀释或者溶解法医样本的缓冲液均应该在本发明的范围内。缓冲液也包含纯水。
在一个具体实施例中，所述聚醚砜滤膜的孔径为1μm以下，例如孔径为0.45μm(有时也会标注为0.5μm)、0.22μm(有时也会标注为0.2μm)。本领域技术人员可以知晓，只要能够达到截留溶液中细胞的作用的滤膜，应均具有本发明中所述的功能。
另一方面，本发明还公开了一种提取生物样本DNA的装置，其特征在于，所述装置包括滤膜和抽滤装置，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其选自尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液。
在一个具体实施例中，所述抽滤装置包括一次性医用注射器、真空抽滤装置、或减压抽滤装置。
其中，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
在一个具体实施例中，所述水溶液包括从环境中直接获得的经过稀释的尿液、血液、或唾液，或者经过缓冲溶液冲洗尿斑、血斑、或唾液斑获得的溶液，或者从雪中收集的尿液、血液、或唾液。例如，受试者排泄的尿液，或者混合有其他溶液例如水的稀释尿液，从环境中使用缓冲溶剂冲洗或溶解倪傲班、血斑、或唾液斑所产生的水溶液，从雪中收集的尿液、血液、或唾液，该样本可以混合部分雪水。
其中，缓冲溶液包括由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。本领域技术人员应理解，只要能够稀释或者溶解法医样本的缓冲液均应该在本发明的范围内。缓冲液也包含纯水。
在一个具体实施例中，所述聚醚砜滤膜的孔径为1μm以下，例如孔径为0.45μm(有时也会标注为0.5μm)、0.22μm(有时也会标注为0.2μm)。本领域技术人员可以知晓，只要能够达到截留溶液中细胞的作用的滤膜，应均具有本发明中所述的功能。
再一方面，本发明还提供了一种提取生物样本DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括滤膜，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其包括尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液。
其中，所述试剂盒进一步包括裂解液、PK蛋白酶、DTT。
其中，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
在一个具体实施例中，所述水溶液包括从环境中直接获得的经过稀释的尿液、血液、或唾液，或者经过缓冲溶液冲洗尿斑、血斑、或唾液斑获得的溶液，或者从雪中收集的尿液、血液、或唾液。例如，受试者排泄的尿液，或者混合有其他溶液例如水的稀释尿液，从环境中使用缓冲溶剂冲洗或溶解倪傲班、血斑、或唾液斑所产生的水溶液，从雪中收集的尿液、血液、或唾液，该样本可以混合部分雪水。
其中，缓冲溶液包括由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。本领域技术人员应理解，只要能够稀释或者溶解法医样本的缓冲液均应该在本发明的范围内。缓冲液也包含纯水。
在一个具体实施例中，所述聚醚砜滤膜的孔径为1μm以下，例如孔径为0.45μm(有时也会标注为0.5μm)、0.22μm(有时也会标注为0.2μm)。本领域技术人员可以知晓，只要能够达到截留溶液中细胞的作用的滤膜，应均具有本发明中所述的功能。
本发明进一步公开了滤膜在制备用于提取生物样本DNA的产品的用途，其特征在于，所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其包括尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液，所述产品包括装置或试剂盒。
其中，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
在一个具体实施例中，所述水溶液包括从环境中直接获得的经过稀释的尿液、血液、或唾液，或者经过缓冲溶液冲洗尿斑、血斑、或唾液斑获得的溶液，或者从雪中收集的尿液、血液、或唾液。例如，受试者排泄的尿液，或者混合有其他溶液例如水的稀释尿液，从环境中使用缓冲溶剂冲洗或溶解倪傲班、血斑、或唾液斑所产生的水溶液，从雪中收集的尿液、血液、或唾液，该样本可以混合部分雪水。
其中，缓冲溶液包括由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。本领域技术人员应理解，只要能够稀释或者溶解法医样本的缓冲液均应该在本发明的范围内。缓冲液也包含纯水。
在一个具体实施例中，所述聚醚砜滤膜的孔径为1μm以下，例如孔径为0.45μm(有时也会标注为0.5μm)、0.22μm(有时也会标注为0.2μm)。本领域技术人员可以知晓，只要能够达到截留溶液中细胞的作用的滤膜，应均具有本发明中所述的功能。
有益效果
采用滤膜法提取的DNA平均含量是离心取沉淀法的6倍左右，体现了滤膜法较为明显的优势。滤膜法具备操作简单，提取效率高等优点，尤其适合放置时间较久、体积较大的尿液类检材的DNA提取。且过滤尿液后的滤膜室温下可长期存放，如与抽滤装置联合使用，可大批量处理尿液类生物检材。另外，尿液还是打击滥用氯胺酮和苯丙胺类毒品行为中体内毒品及代谢物检测的主要检材之一，尿液的同一性认定在遇到当事人质疑送检尿样来源时具有重要作用[8]，通过滤膜法提取涉毒人员尿样的DNA 提取，不但滤膜可随尿样长期存放，而且不会影响到尿样中的毒品提取。滤膜法还可应用于血水、雪中血液尿液检材的DNA提取，具备良好的应用前景。
附图说明
图1示出标准曲线线形图。
图2示出三种提取方法定量结果对比。
图3示出尿液三种提取方法对比。
具体实施方式
下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。
除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本申请中，单数形式“一个”、“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚规定。
本申请中的术语“缓冲溶液”是指由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。
本申请中的术语“抽滤装置”是指用于溶液过滤使用的负压抽滤装置。
本申请中的术语“滤膜”是指孔径为1μm以下的聚四氟乙烯滤膜 (PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES) 中的至少一种以上。
本申请中的术语“法医样本”是指含人有核细胞的各类生物检材，包括含尿液、血液及唾液等的各种体液类检材。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1不同方法检测尿液原液
1.检材与方法
1.1实验材料
对11名志愿者(其中3名女性)的新鲜尿液摇匀后平行取两份5mL。
1.2方法
A组(滤膜法)：用一次性医用注射器抽取5mL尿液，过聚醚砜滤膜，滤液备用。过滤后使用注射器抽取空气吹干滤膜。取出滤膜，剪碎后放入 1.5mL离心管内。
B组(离心取沉淀法)：取5mL尿液于15mL离心管内，10000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，剩余约100μL液体转移至1.5mL离心管内。
C组(滤液二次滤膜法)：将A组过滤后的滤液再次过聚醚砜滤膜，吹干滤膜后取出，剪碎后放入1.5mL离心管内。
分别向A、B、C三组所述1.5mL离心管内依次加入200μL裂解液、 10μL PK蛋白酶(Merck，德国)、10μLDTT(AMRESCO，美国)，56℃温浴1h后使用Automate自动纯化提取仪(ABI，美国)提取上述检材，检材洗脱体积为30μL。
1.3 PCR定量分析
使用Quantifiler Trio PCR Reagents试剂盒(ABI，美国)，采用10μL 体系，对DNA提取液进行DNA定量检测。其中Reaction Mix 5μL，Primer Mix 4μL，标准品及样品DNA各1μL。采用7500型荧光定量PCR仪(ABI，美国)，反应条件为95℃5分钟；95℃9秒，共40个循环；60℃30秒。采用HID Real-Time PCR Analysis Software分析数据。
1.4 PCR扩增及STR分型检验
对提取的DNA用Identifiler Plus试剂盒(ABI，美国)进行复合扩增，反应体系为10μL，DNA模板1μL。PCR产物用ABI 3500XL型遗传分析仪(ABI，美国)进行毛细管电泳分型检测，用GeneMapper ID-X 1.5基因软件进行数据分析，将各色光谱阈值定为50，以杂合子相对荧光单位 (RFU)值高于50、纯合子RFU值高于100，且获得≥13个STR基因座基因分型即视该样品为检出，获得全部16个基因座基因分型为分型成功。
2.结果及讨论
2.1 PCR定量检测结果
表1.三种提取方法定量结果
Figure BSA0000192580130000081
采用7500型荧光定量PCR仪对三种提取方法检材进行DNA含量检测，标准曲线线形图见图1，Slope值为-3.214，R2值为0.998。
尽管不同检材通过滤膜法提取DNA含量差别较大，体现了不同个体尿液中DNA含量较大的差异性，但表1的结果显示：滤膜法提取检材DNA 平均含量为0.874ng/μL，离心取沉淀法DNA平均含量为0.139ng/μL，滤液二次滤膜法DNA平均含量为0.006ng/μL(表1)，不论针对于每一个个体还是群体，滤膜法和沉淀法之间是存在显著性差异。通过对三种提取方法的定量结果对比，采用滤膜法提取的DNA平均含量是离心取沉淀法的6 倍左右，体现了滤膜法较为明显的优势。二次滤膜法DNA含量极低(图2)，说明滤膜收集细胞效率高，无需二次过滤。
2.2 STR(short tandem repeat，短片段重复序列)分型检验结果
表2.不同方法提取尿液样本STR检出基因座个数
Figure BSA0000192580130000082
使用滤膜法提取的11组尿液样本全部分型成功，但使用离心取沉淀法的有9组分型成功(表2)，同时，观察STR图谱发现滤膜法提取样本信号值更高、峰形更均匀(图3)，说明滤膜能够有效地收集尿液中游离的细胞，同时将PCR抑制物例如尿素、尿酸等过滤掉。滤膜法滤液再次用滤膜法处理的无分型成功样本(表2)，说明滤膜分离效率高，一次过滤即可将尿液中的细胞几乎全部收集到。
实施例2不同方法检测稀释后的尿液
1检材与方法
1.1实验材料
对3名志愿者(其中1名女性)的新鲜尿液分别用纯水稀释0、5、10、 20倍，摇匀后平行取两份5mL。
1.2方法
对稀释不同倍数的尿液分别用滤膜法、离心沉淀法提取，具体操作同实施例1。
2.结果及讨论
2.1 PCR定量检测结果：
表3.两种方法提取稀释不同倍数尿液PCR定量结果/单位：ng/μL
Figure BSA0000192580130000091
三个志愿者尿液分为A、B、C三组，按照滤膜法、离心沉淀法不同提取方法依次分为AM组、AL组、BM组等6组。随着稀释倍数增加，两种提取方法尿液中DNA含量均下降明显(表3)，在稀释同等倍数的条件下，滤膜法DNA含量明显高于离心沉淀法。另外，从表3也可以看出，尽管不同个体尿液中DNA含量差异较大，且DNA含量与稀释倍数并无明显线性关系，但当尿液被稀释5倍以上时，滤膜法检测值为离心法的5-10 倍，甚至当尿液稀释为20倍时，例如志愿者A，滤膜法仍然可以较好的检测出DNA含量，而离心法测得的数值极低。可见，在检测被稀释的样本例如马桶中提取的尿液时，滤膜法会比离心法的灵敏度更高。
2.2 STR分型检验结果
在尿液稀释10倍以上时，采用离心沉淀法无法获得分型。而采用滤膜法仍能检出绝大多数基因分型，体现了滤膜法较高的提取效率。在实际案例中，如提取到嫌疑人在马桶内遗留的尿液，往往是经过稀释的样本，采用传统的离心沉淀法处理不仅操作繁琐，为提高检出成功率往往需要同时用多个离心管离心合并，增加了污染的可能。采用滤膜法不仅操作简便，而且所有样本只通过一个滤膜过滤，大大降低了污染的可能。
实施例3不同方法检测放置后的尿液
1检材与方法
1.1实验材料
对3名志愿者(其中1名女性)的新鲜尿液分别于室温静置1、4、7 天，摇匀后平行取两份5mL。
1.2方法
对放置不同天数的尿液分别用滤膜法、离心沉淀法提取，具体操作同施例1。
2.结果及讨论
2.1 PCR定量检测结果：
表4.两种方法提取放置不同天数尿液PCR定量结果/单位：ng/μL
Figure BSA0000192580130000101
从表4可以看出，放置不同天数的三组尿液，采用滤膜法提取的Q值 (DNA含量，单位：ng/μL)明显高于离心沉淀法，特别是在放置7天后，采用滤膜法提取的A、B两组尿液DNA含量仍能高于0.02ng/μL。
降解指数(Degradation Index，以下简称DI)是反映DNA检材降解程度的指标，通常DI＜1，表示检材无降解；1＜DI＜10，表示检材轻度降解；DI＞10，表示检材重度降解。对比表4数据，在静置1天、4天时，采用两种方法提取的DI并无明显差别，证明前4天尿液中DNA降解不甚明显。静置7天后，离心沉淀法提取的DI数值无明显变化，而滤膜法提取的DI数值巨大，且检测得到的尿液PCR值较离心法高。由于随着静置时间延长，尿液中细胞的细胞膜、核膜分解，DNA分子释放并降解严重，多数DNA分子断裂成不同大小的片段。采用离心沉淀法无法收集游离的 DNA分子，故其Q值、DI数值均较低。采用滤膜法提取的DI数值巨大，证明滤膜可以有效收集尿液中游离的DNA分子，包括大量降解的DNA分子片段。显然，在滤膜法可以有效检测放置时间较长的检材。
总之，相比离心法，滤膜法不仅仅在检测新鲜检材上灵敏度较高，也适用放置时间较长的检材检测。
2.2 STR分型检验结果
表5.两种方法提取放置不同天数尿液STR检出基因座个数
Figure BSA0000192580130000111
放置4天的尿液，采用滤膜法全部成功检出分型，采用离心沉淀法的 B组、C组仅分别检出7、3个位点(表5)。放置7天的尿液，采用离心沉淀法均未检出分型，采用滤膜法提取的均检出13个以上以上分型。结合定量试验结果，进一步印证了滤膜法在提取放置时间较长的尿液中 DNA时的明显优势。
前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。

Claims (10)

1.一种提取生物样本DNA的方法，其特征在于，使用滤膜过滤生物样本，收集滤膜做进一步分析，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：将过滤后的滤膜干燥并剪碎，向剪碎的滤膜加入裂解液、蛋白酶进行纯化的步骤。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述法医样本选自尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶液包括从环境中直接获得的经过稀释的尿液、血液、或唾液，或者经过缓冲溶液冲洗或溶解尿斑、血斑、或唾液斑获得的溶液，或者从雪中收集的尿液、血液、或唾液，优选地，所述从环境中直接获得的经过稀释的尿液中，尿液原液的体积百分比为1％至100％，优选为5％至20％；优选地，其中所述法医样本可以为存放1天以上的样本，优选存放4天以上或7天以上的样本。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为1μm以下。
6.一种提取生物样本DNA的装置，其特征在于，所述装置包括滤膜和抽滤装置，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其包括尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述抽滤装置包括一次性医用注射器、真空抽滤装置、或减压抽滤装置。
8.一种提取生物样本DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括滤膜，其中所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其包括尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、或含有唾液的水溶液，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括裂解液、PK蛋白酶、DTT(二硫苏糖醇)。
10.滤膜在制备用于提取生物样本DNA的产品的用途，其特征在于，所述生物样本为含有微量核酸的法医样本，其选自尿液原液、含有尿液的水溶液、含有血液的水溶液、含有唾液的水溶液，所述产品包括装置或试剂盒，所述滤膜选自聚四氟乙烯滤膜(PTFE)、尼龙滤膜(Nylon)、再生纤维素滤膜(RC)、聚醚砜滤膜(PES)中的至少一种以上。
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