TWI654310B - 檢測犬艾利希體的引子對、套組及方法 - Google Patents
檢測犬艾利希體的引子對、套組及方法Info
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Abstract
本案揭露檢測犬艾利希體的引子對、套組及方法，該引子對具有一順向引子及一逆向引子，該套組具有該引子對及一探針，其中，該順向引子的序列如序列編號1所示，該逆向引子的序列如序列編號2所示，該探針的序列如序列編號3所示。
Description
本案係關於一種犬艾利希體的快速診斷，尤指一種檢測犬艾利希體的引子對、套組及方法。
犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)為一小型、桿狀、細胞內寄生且由壁蝨傳播的病原體，革蘭氏染色呈陰性，屬於α-變形菌(α-proteobacterium)，且主要由棕色犬壁蝨(brown dog tick，學名為Rhipicephalus sanguineus
)所傳播。此病原體呈微菌落方式寄生在以薄膜區隔的細胞內液泡，且主要寄生在哺乳類宿主的單核細胞及巨噬細胞中。艾利希體(Ehrlichia
)與立克次體(Rickettsia
)、無形體(Anaplasma
)及沃爾巴克氏體(Wolbachia)是非常接近的菌種，且具有類似的細胞內結構。
犬艾利希體最早於西元1935年在阿爾及利亞被發現，且目前所知已廣泛分布在美國、歐洲、南美洲及亞洲。犬艾利希體會造成犬隻的艾利希體症(ehrlichiosis)，其係經由壁蝨傳播而感染，而感染的犬隻若未受治療，可能成為無症狀的帶原者長達數年，且最後因大量出血而死亡。艾利希體症會影響犬隻、人類及其他馴養或野生的動物品種。隨著全球暖化、壁蝨分布區域的擴大及國際旅行的增加，此疾病也可能會散播至過去非流行的區域。
艾利希體症可產生多重有臨床症狀或無臨床症狀的表現，使得此疾病的診斷富有挑戰性。急性和慢性期以及與其他蜱媒病原體的共同感染，也使得治療更加複雜。儘管用抗生素治療且臨床症狀已解除，通常病原體也無法被完全消除。
由於這些感染通常會造成血小板低下症，因此血小板計數是重要的篩檢試驗，然而少量的病原體增加了試驗的困難度，故此診斷方法缺乏靈敏度。而其他用於犬艾利希體診斷的方法尚包括血液抹片、血清診斷及分子診斷，但前述方法皆有其限制。
利用血液抹片鏡檢來檢測典型細胞內寄生的犬艾利希體之桑葚胚對於艾利希體症的診斷是具有高度專一性的，然而此方法相當費時且不是非常可靠，因為在急性感染期間，桑葚胚在血液抹片中僅有小量的存在，而此鏡檢的靈敏度僅有約4%。
血清診斷則有助於辨識犬艾利希體抗體的存在，但可能無法偵測出疾病急性期的早期感染。血清診斷的限制更在於交叉反應，尤其常見於艾利希體屬(Ehrlichia spp.
)及無形體屬(Anaplasma spp.
)之間。此外，血清診斷也無法區分出是曾經感染(post exposure)或是正在感染(present infection)。
而診斷犬艾利希體最佳的方式便是分子診斷，尤其是利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)進行檢測。聚合酶連鎖反應是一種更靈敏且更具專一性的技術，提供了診斷犬艾利希體的另一替代方案。舉例而言，由BioinGentech公司所提供的犬艾利希體檢測套組(VetPCR Ehrlichia canis Detection Kit)可用來檢測犬艾利希體感染，且診斷快速、準確及可靠。然而，此檢測套組仍須結合終端PCR偵測方法，例如凝膠電泳(gel electrophoresis)，使得整個檢測過程需花費3小時，仍是相當費時及費力。
因此，提供一種可改善現有技術缺點之犬艾利希體診斷方法實為本領域之人士需要努力的方向。
本案的目的在於提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的引子對，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出犬艾利希體感染。
本案的另一目的在於提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的套組，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出犬艾利希體感染。
本案的又一目的在於提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的方法，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準確的診斷出犬艾利希體感染。
為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。該順向引子及該逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及該探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。該順向引子、該逆向引子及該探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。又，該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的核酸分子，且所採用之一順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，一逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及一探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。 該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。
本案係利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，簡稱Real-time PCR)，又稱定量聚合酶鏈鎖反應(Quantitative polymerase chain reaction，簡稱為Q-PCR)來進行犬艾利希體(Ehrlichia Canis
)的檢測，且採用探針偵測系統(probe-based detection)。首先，具有專一性的順向引子、逆向引子及探針會雜合到犬艾利希體的目標DNA上，探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，3’端接上淬滅體(quencher)。在PCR擴增反應過程中，探針會被切割，使得報導染劑與淬滅體分離，即可偵測到報導染劑所發出的螢光。在一實施例中，報導染劑為FAM螢光基團，淬滅體為BHQ1基團。
在此試驗中的目標DNA為犬艾利希體的p30基因(基因庫登錄號為CP000107.1)中的一段可變區域(variable region)，其包含對犬艾利希體具有特異性的序列。本案之PCR引子及探針係利用Primer3軟體所設計，且依GC含量及不含髮夾結構(hairpin structure)之基礎進行選擇。第1圖顯示所採用的順向引子、逆向引子及探針對應於p30基因序列的位置，其中，順向引子起始於基因序列第42個位置，探針起始於基因序列第79個位置，逆向引子起始於基因序列第182位置。利用此順向引子、逆向引子及探針的組合將可擴增犬艾利希體DNA而得出大小為141-bp的擴增子(amplicon)片段。第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的DNA序列，其中，順向引子(序列編號1)大小為21-mer，逆向引子(序列編號2)大小為22-mer，探針(序列編號3)大小為27-mer。
為確認所採用的PCR引子及探針對犬艾利希體具有專一性，利用美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)提供的Primer-BLAST系統對前述包含順向引子及逆向引子的引子對及探針進行比對，結果顯示沒有其他相近的物種具有與本案設計的引子對及探針完全相同的序列。此結果也顯示本案的引子對及探針的專一性相當高，且只能用來擴增及檢測犬艾利希體的p30基因。
因此，本案提供了一種用以檢測犬艾利希體的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。本案同時提供一種用以檢測犬艾利希體的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及該探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。另一方面，本案亦提供一種用以檢測犬艾利希體的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬艾利希體的核酸分子，且所採用之一順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，一逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及一探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。
在另一些實施例中，由於本案之引子對可專一地檢測犬艾利希體，故只要是位於順向引子及逆向引子序列位置之間的序列，皆可設計為探針序列，因此，本案提供之檢測犬艾利希體的套組或方法亦可不限制採用前述的探針序列，且探針可選擇雜合至DNA的任一股上，故相同位置的互補序列皆可做為探針序列。因此，與前述探針序列互補的序列亦可做為本案之探針序列。
以下將以實例說明利用本案設計之引子對及探針進行犬艾利希體的檢測。
首先，取200 μl以EDTA保存的待測全血樣品進行DNA萃取，其係利用Qiagen提供的萃取套組QIAamp DNA Blood Mini Kit來萃取，並溶在100 μl的沖提緩衝液中。接著進行即時聚合酶鏈鎖反應，其係利用Bio-Rad即時聚合酶鏈鎖反應機器(CFX96)來執行。PCR反應混合物中包含10 µl的KAPA Fast probe universal master mix，250 nM的順向引子及逆向引子，及 250 nM的探針，其中，順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’， 逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。將3 µl的萃取DNA模板加入至每一反應管中，並使總體積達20 µl。PCR循環條件則先95°C 3分鐘，接著進行95°C 3秒鐘的變性(denaturation)及60°C 20秒鐘的黏合(annealing)及延伸(extension)，重複40個循環。
正控制組(positive control)係為具有犬艾利希體部分p30基因片段的選殖載體(RBC Cloning System)。將此重組DNA質體製備一系列十倍稀釋液，分別為10, 102
, 103
, 104
, 105
及106
copies/µl的稀釋液。每一稀釋液係進行三次重複(triplicate)分析，以測定犬艾利希體DNA偵測的下限，以及即時聚合酶鏈鎖反應擴增的線性關係及效率。
第3A圖及第3B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。第3A圖顯示不同拷貝數的質體樣本的擴增曲線，可看出本案的檢測方法具有相當高的靈敏度。第3B圖顯示本案的檢測方法具有相當好的線性關係，其R2
為0.998，非常接近最佳理論值1.0，因此，本案的檢測方法可進行定量分析，用以估計臨床樣本中基因的拷貝數。
綜上所述，本案提供一種檢測犬艾利希體的方法，其係利用即時聚合酶鏈鎖反應及具有特異性的引子對及探針來進行偵測。本案提供之方法具有高靈敏性，可在無臨床症狀的感染案例中檢測到小量的犬艾利希體。此外，早期或急性期的診斷對於犬艾利希體的治療非常關鍵，有些研究顯示當犬隻在艾利希體症急性期即獲得治療的話，可在24至48小時內快速復原，且在接受完整療程後之預後相當良好。又，本案提供之方法更具有高專一性，可區別出犬艾利希體及其他蜱媒病原體，且有助於獸醫師選擇最適當的治療方法。再者，對於治療後復發的病症或是治療失敗的情形，本案提供之方法亦可判斷是否原始診斷有誤，並降低輸血感染。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
無
第1圖顯示順向引子、逆向引子及探針對應於p30基因序列的位置。 第2圖顯示順向引子、逆向引子及探針的DNA序列。 第3A圖及第3B圖顯示即時聚合酶鏈鎖反應擴增結果的分析。
＜110＞ 台達電子國際（新加坡）私人有限公司 ＜120＞ 檢測犬艾利希體的引子對、套組及方法 ＜160＞ 3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成引子 ＜400＞ 1 attaatgtac tatgctccaa g 21 ＜210＞ 2 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成引子 ＜400＞ 2 gttgagtttc tttcttcttt ag 22 ＜210＞ 3 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成探針 ＜400＞ 3 actatacaag acgataacac tggtagc 27
Claims (8)
- 一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis )的引子對，包含一順向引子及一逆向引子，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’， 該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。
- 如申請專利範圍第1項所述的引子對，其中該順向引子及該逆向引子係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
- 一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis )的套組，包含一順向引子、一逆向引子及一探針，其中，該順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’，以及該探針的序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。
- 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該順向引子、該逆向引子及該探針係用於即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)。
- 如申請專利範圍第3項所述的套組，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
- 一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis )的方法，包含利用即時聚合酶鏈鎖反應來擴增犬艾利希體(Ehrlichia Canis )的核酸分子，且所採用之一順向引子的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，及一逆向引子的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。
- 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中用於該即時聚合酶鏈鎖反應之一探針序列為5’-ACTATACAAGACGATAACACTGGTAGC-3’。
- 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，且3’端接上淬滅體(quencher)。
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