CN106222232A - 一种用于检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种用于检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN106222232A
CN106222232A CN201610584170.8A CN201610584170A CN106222232A CN 106222232 A CN106222232 A CN 106222232A CN 201610584170 A CN201610584170 A CN 201610584170A CN 106222232 A CN106222232 A CN 106222232A
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Abstract

本发明开创了一种前所未有的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，并相应开发了与其配备的试剂盒。本发明检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，优化了细菌培养的时间、接种浓度、荧光染料以及外排泵抑制剂的浓度，有效避免了高浓度染料和外排泵抑制剂对细菌毒性和生长曲线的影响，方法特异性高且稳定性好；本发明用来检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒，操作方便，比传统的针对已知的泵基因设计多组PCR的扩增的方法结果更加全面和直接可靠，可用于我国各级医院感染防控单位和抗生素耐药监测机构用于检测鲍曼不动杆菌临床分离株携带的耐药外排泵分布水平，具有良好的应用前景。

Description

一种用于检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒及 其检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒及其检测方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌是一类重要的革兰氏染色阴性的非发酵医院内感染病原菌，常引起医院内免疫功能低下患者严重的呼吸机相关性肺炎、手术伤口部位感染、泌尿道感染、血流感染以及继发性脑膜炎等。随着近年来广谱抗生素普遍使用等原因，临床上鲍曼不动杆菌的多重耐药株和泛耐药株在世界范围内不断涌现。鲍曼不动杆菌针对碳氢酶烯类抗生素的耐药机制主要有四类：⑴表达碳氢酶烯酶。主要是Ambler分类中的D类酶，即苯唑西林酶(OXA)，包括OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58。⑵产生构象改变的青霉素结合蛋白降低碳氢酶烯类抗生素的结合量。⑶下调外膜通道蛋白(prions)的表达或缺如，如Car类、OPM类，从而减少抗生素进入细菌。⑷多种细菌外排泵基因的过量表达，将进入细菌的抗生素主动排出。鲍曼不动杆菌的外排泵主要有五大家族，其中最重要的为RND家族(resistance-nodulation-division family)，包括均由3部分构成的AdeABC、AdeFGH和AdeIJK等外排泵。细菌外排泵基因的表达上调成为临床上鲍曼不动杆菌耐药的重要机制，而且外排泵种类繁多而细菌临床分离株的表达水平各异，目前单纯依靠分子生物学的检测方法预测菌株的耐药水平方法复杂，费时费力且结果可靠性不够。开发新的检测临床分离株各种外排泵表达水平的检测方法，对于鲍曼不动杆菌多重耐药菌株(MDR)以及泛耐药菌株(PDR)的流行病学防控具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种全面、简便、准确、快速、特异性和灵敏性好以及低成本的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，本发明还提供了与方法相对应的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明第一方面提供了一种组合物，由外排泵抑制剂和荧光染料组成。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙。
在一优选例中，所述荧光染料为Hoechst 33342。
本发明第二方面提供了所述的组合物在制备检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒中的应用。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括外排泵抑制剂和荧光染料。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙。
在一优选例中，所述荧光染料为Hoechst 33342。
在一优选例中，还包括适于培养鲍曼不动杆菌的培养基。
在一优选例中，所述适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。
在一优选例中，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌szp株。
在一优选例中，所述阴性对照为鲍曼不动杆菌szn株。
在一优选例中，还包括检测板。
在一优选例中，所述检测板为无菌96孔检测板。
本发明第四方面提供了上述的试剂盒在检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平中的用途。
本发明第五方面提供了一种检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，包括以下步骤：
步骤一：预培养
将活化的鲍曼不动杆菌接种在适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中预培养，得到菌液；
步骤二：接种
将菌液离心收集细菌沉淀，将细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液，将菌悬浮液接种到检测板上；
步骤三：培养
在有菌悬浮液的部分检测板中加入外排泵抑制剂，分别将有菌悬浮液的检测板和含有外排泵抑制剂且有菌悬浮液的检测板继续培养；
步骤四：检测
在有菌悬浮液的检测板和既有菌悬浮液又有外排泵抑制剂的检测板中均加入荧光染料染色，检测荧光值，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平。
在一优选例中，所述步骤一中的适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，所述步骤一中的预培养条件为：置于33-37℃温箱中孵育3-5小时。
在一优选例中，所述步骤一中的预培养条件为：置于35℃温箱中孵育4小时。
在一优选例中，所述步骤一中预培养后菌液的浓度为1.5xl08CFU/ml；
在一优选例中，所述步骤一中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，所述步骤二中将菌液离心收集细菌沉淀是在2000g离心15min后收集细菌沉淀。
在一优选例中，所述步骤二中收集细菌沉淀后，是用O.lmol/L pH7.0的PBS溶液冲洗2遍,在2000g离心15min后,将得到的细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液。
在一优选例中，所述步骤二中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，所述步骤二中所述菌悬浮液的浓度为0.5麦氏单位。
在一优选例中，所述步骤三中在有菌悬浮液的检测板中加入外排泵抑制剂，是使外排泵抑制剂的终浓度达到10μM。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙。
在一优选例中，所述步骤三中培养条件为：置于35℃温箱中孵育16小时。
在一优选例中，所述步骤四中，所述荧光染料为Hoechst 33342。
在一优选例中，所述步骤四中，所述荧光染料的终浓度为2.0-3.0μM。
在一优选例中，所述步骤四中，加入荧光染料染色的时间为120min。
在一优选例中，所述步骤四中，是用德国BMG LABTECH公司的FLUOstar OPTIMA多功能酶标仪检测荧光值，激发光波长为530nm，发射光波长为600nm。
在一优选例中，还包括对阳性对照和阴性对照进行上述预培养、接种、培养和检测的步骤。
在一优选例中，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌szn株。
在一优选例中，所述阴性对照为鲍曼不动杆菌szp株。
在一优选例中，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平具体为：根据接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值与含有外排泵抑制剂且接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值之比来判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平；
在一优选例中，所述荧光值之比为1.5。
本发明第六方面提供了一种鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的检测装置，包括：
预培养单元，用于将活化的鲍曼不动杆菌接种在适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中预培养；
接种单元，所述接种单元与预培养单元相连，用于将预培养得到的菌液离心得到的细菌沉淀配制成菌悬浮液接种到检测板上；
培养单元，所述培养单元与接种单元相连，用于将接种有菌悬液的检测板进行培养以及将外排泵抑制剂加入到接种有菌悬浮液的检测板进行培养；以及
检测单元，所述检测单元与培养单元相连，用于分别在接种有菌悬液的检测板和含有外排泵抑制剂且接种有菌悬浮液的检测板中添加荧光染料并检测荧光值，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平。
在一优选例中，所述预培养单元中的预培养条件为：置于34-36°C温箱中孵育3-5小时。
在一优选例中，所述预培养单元中的预培养条件为：置于35℃温箱中孵育4小时。
在一优选例中，所述预培养单元中预培养后菌液的浓度在约为1.5xl08CFU/ml。
在一优选例中，所述预培养单元中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，所述接种单元中将菌液离心收集细菌沉淀是在2000g离心15min后收集细菌沉淀。
在一优选例中，所述接种单元中收集细菌沉淀后，是再用O.lmol/L pH7.0的PBS溶液冲洗2遍,在2000g离心15min后,将得到的细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液。
在一优选例中，所述接种单元中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基。
在一优选例中，所述接种单元中所述菌悬浮液的浓度为0.5麦氏单位。
在一优选例中，所述培养单元中将外排泵抑制剂加入到接种有菌悬浮液的检测板，是使外排泵抑制剂的终浓度达到10μM。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂。
在一优选例中，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙。
在一优选例中，所述培养单元中培养条件为：置于35℃温箱中孵育16小时。
在一优选例中，所述检测单元中，所述荧光染料为Hoechst 33342。
在一优选例中，所述检测单元中，所述荧光染料的终浓度为2.0-3.0μM。
在一优选例中，所述检测单元中，加入荧光染料染色的时间为120min。
在一优选例中，所述检测单元中，是用德国BMG LABTECH公司的FLUOstar OPTIMA多功能酶标仪检测荧光值，激发光波长为530nm，发射光波长为600nm。
在一优选例中，所述检测单元中，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平具体为：根据接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值与含有外排泵抑制剂且接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值之比来判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平。
在一优选例中，所述荧光值之比为1.5。
在一优选例中，所述预培养单元中还包括对阳性对照和阴性对照进行预培养，然后进入接种单元、培养单元和检测单元；
在一优选例中，所述阳性对照为荧光值之比为1.6～2.4的鲍曼不动杆菌szn株。
在一优选例中，所述阴性对照为荧光值之比为0.6～1.4的鲍曼不动杆菌szp株。
细菌外排泵对药物的外排作用是主动耗能过程，其能力源于质子的浓度梯度，而羰基氰化物间氯苯腙可以抑制质子转运的解偶联剂，通过破坏质子浓度梯度，抑制主动外排系统的外排作用。需要注意的是，并非只要符合可以抑制质子转运的解偶联剂均可用于构建检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，还需要满足多个试剂和各步骤之间的配合作用。
本发明涉及的术语“羰基氰化物间氯苯腙”(carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone)的缩微名为CCCP。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明开创了一种前所未有的全面的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，并相应开发了与其配备的试剂盒。
(2)使用本发明的试剂盒对鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平进行检测时简便、快速、准确，重复性、特异性和灵敏性好，且成本较低。
(3)使用本发明的试剂盒对鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平进行检测，与采用聚合酶链式反应(PCR)法相比，具有如下优点：本发明所建立的荧光法检测耐药外排泵分布水平是直接针对细菌外排泵的效能检测，而PCR法只能检测到细菌是否具有某外排泵的基因，而无法判断泵基因表达水平；鉴于现已发现的细菌外排泵有五大家族数十种基因的庞大数目，且尚有未知的泵基因，PCR方法设计引物繁杂而且难以穷尽，而用荧光法可以较好的规避这些问题。
(4)本发明设计使用荧光染料和外排泵抑制剂的方法检测鲍曼不动杆菌临床外排泵携带水平，优化了细菌培养的时间、接种浓度、荧光染料以及外排泵抑制剂的浓度，有效避免了高浓度染料和外排泵抑制剂对细菌毒性和生长曲线的影响，方法特异性高且稳定性好；本发明用来检测鲍曼不动杆菌菌株外耐药外排泵携带水平的试剂盒，操作方便，用户只需将待检菌株的培养后，加入反应管中，根据要求加入配制好的外排泵抑制剂和荧光染料，放入多功能酶标仪检测荧光结果即可得出检测结果，比传统的针对已知的泵基因设计多组PCR的扩增的方法结果更加直接可靠，可适用于我国各级医院感染防控单位和抗生素耐药监测机构用于检测鲍曼不动杆菌临床分离株携带的耐药外排泵分布水平，具有良好的应用前景。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中使用的样品鲍曼不动杆菌s1株、样品鲍曼不动杆菌s2株、阳性对照鲍曼不动杆菌szp株和阴性对照鲍曼不动杆菌szn株均由深圳市第二人民医院提供。
实施例1
本实施例提供了一种试剂盒，由以下部分组成：
(1)外排泵抑制剂；
(2)荧光染料；
(3)适于培养鲍曼不动杆菌的培养基；
(4)阳性对照和阴性对照；以及
(5)检测板。
所述外排泵抑制剂优选为氧化磷酸化抑制剂；所述外排泵抑制剂进一步优选为羰基氰化物间氯苯腙(来自sigma公司，货号为75926)。
所述荧光染料优选为Hoechst 33342(来自sigma公司，货号为B2261)。
所述适于培养鲍曼不动杆菌的培养基优选为LB肉汤培养基(来自sigma公司，货号为L7275)。
所述阳性对照优选为鲍曼不动杆菌szp株；所述阴性对照优选为鲍曼不动杆菌szn株。所述鲍曼不动杆菌szp株分离自呼吸疾病患者痰液标本，为多重耐药菌株(MDR)，药敏实验结果提示其对五个大类：青霉素类、碳氢酶烯类、头孢菌素类、氨基糖苷类和喹诺酮类的抗生素均有耐药性,药敏试验即菌株最小抑菌浓度(MIC)结果判读按2010版美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准进行；亚胺培南(IPM)最小抑菌浓度(MIC)为16μg/ml，加泵抑制剂CCCP后MIC为1μg/ml。所述鲍曼不动杆菌szn株为分离自正常人咽部分泌物标本，对碳氢酶烯类、三代头孢菌素类、氨基糖苷类的抗生素敏感，亚胺培南(IPM)最小抑菌浓度为0.25μg/ml，加泵抑制剂CCCP后MIC为0.5μg/ml。
上述针对亚胺培南(IPM)的药敏实验的具体步骤为：复苏冻存于-70℃超低温冰箱的菌株，接种于MH平板37℃培养10-16h后，选择鲍曼不动杆菌典型单菌落接种于MH肉汤培养基；37℃，180rpm恒温振荡过夜培养16-18h后，配置菌液浓度0.5个麦氏单位，用MH肉汤1:1000稀释后每孔中100μl接种以下2种96孔板：⑴泵抑制试验板：各孔含终浓度10μg/ml的CCCP，且每行第1-12孔从左到右依次为含终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0μg/ml的IPM，每行最后1孔均为仅含相同浓度CCCP的MH肉汤做生长对照孔；⑵MIC测定板：不含CCCP，且每行各孔从左到右依次为含终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0μg/ml的IPM；将各96孔板置于37℃普通空气孵箱中,孵育16-20h判断结果。
阴阳性确定：对于鲍曼不动杆菌，一般以加入泵抑制剂后的MIC除以未添加抑制剂的MIC所得比值是否大于等于4为判断阴阳的标准。即MICCCCP/MIC≥4,则判为菌株外排泵携带阳性；反之，判为阴性。
所述检测板优选为无菌96孔检测板(购自美国康宁公司，货号为3799)
本发明的上述试剂盒的可应用于检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平中。
实施例2
本实施例提供了一种利用实施例1的试剂盒构建的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，包括以下步骤：
步骤一：预培养
将菌株(样品鲍曼不动杆菌sx株、阴性对照鲍曼不动杆菌szn株和阳性对照鲍曼不动杆菌szp株)活化后，用接种环取一环，接种到LB肉汤培养基中,置于35℃温箱中孵育4小时，这时吸光度值达到0.6麦氏单位,菌液的浓度在约为1.5xl08CFU/ml。
步骤二：接种
按2000g离心15min后收集细菌沉淀A，用浓度为O.lmol/L且pH为7.0的PBS溶液冲洗细菌沉淀A 2遍,冲洗细菌沉淀A第2遍时2000g再度离心15min后得到细菌沉淀B，将细菌沉淀B悬浮于LB肉汤培养基中,配制浓度为0.5麦氏单位的菌悬浮液，取配制好的菌悬浮液176μL/孔接种于无菌96孔检测板。
步骤三：培养
在有菌悬浮液的部分无菌96孔检测板中加入4μL/孔的羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，使CCCP的终浓度达到10μM，设置3个生物学重复孔，分别将有菌悬浮液的无菌96孔检测板，和含有CCCP且有菌悬浮液的无菌96孔检测板均置于35℃温箱中继续培养16小时。
步骤四：检测
加入25μM的Hoechst 33342的荧光染料20μL/孔,作用120min，再用德国BMGLABTECH公司的FLUOstar OPTIMA多功能酶标仪检测添加荧光染料120min后的荧光值，其中激发光波长选为530nm，发射光波长600nm。
根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平，先分别计算出阴性对照鲍曼不动杆菌szn株和阳性对照鲍曼不动杆菌szp株的耐药外排泵携带水平，即An/A0＝(szn+cccp)/szn和Ap/A0＝(szp+cccp)/szp；再用如下公式计算样品鲍曼不动杆菌sx耐药外排泵携带水平：Ax/A0＝(sx+cccp)/sx。
其中：
szn代表与阴性对照鲍曼不动杆菌szn株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szn+cccp代表与阴性对照鲍曼不动杆菌szn株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szp代表与阳性对照鲍曼不动杆菌szp株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szp+cccp代表与阳性对照鲍曼不动杆菌szp株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
sx代表与样品鲍曼不动杆菌sx株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值；sx+cccp代表与样品鲍曼不动杆菌sx株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
判断标准：Ax/A0＝(sx+cccp)/sx的比值越大，提示所携带耐药外排泵越多，比值越小，提示所携带耐药外排泵越少；当Ax/A0＝(sx+cccp)/sx的比值≥1.5时，判为菌株外排泵携带阳性，当Ax/A0＝(sx+cccp)/sx的比值﹤1.5时,判为菌株外排泵携带阴性。而且当阴性对照的An/A0＝0.6～1.4，阳性对照的Ap/A0＝1.6～2.4时，证明实验结果是可靠的。
实施例3
本实施例提供了实施例2的检测鲍曼不动杆菌临床分离株携带的耐药外排泵分布水平的方法的应用实例。
实验样品：样品鲍曼不动杆菌s1株、样品鲍曼不动杆菌s2株、阴性对照鲍曼不动杆菌szn株和阳性对照鲍曼不动杆菌szp株。
检测步骤同实施例2的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，得到如表1所示的检测结果。
表1
其中s1代表与样品鲍曼不动杆菌s1株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
s1+cccp代表与样品鲍曼不动杆菌s1株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
s2代表与样品鲍曼不动杆菌s2株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
s2+cccp代表与样品鲍曼不动杆菌s2株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szn代表与阴性对照鲍曼不动杆菌szn株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szn+cccp代表与阴性对照鲍曼不动杆菌szn株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szp代表与阳性对照鲍曼不动杆菌szp株关联的不加羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
szp+cccp代表与阳性对照鲍曼不动杆菌szp株关联的加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)培养检测到的荧光值。
A1/A0＝(s1+cccp)/s1为样品鲍曼不动杆菌s1株外排泵携带相对比，A1/A0＝1.52≥1.5，判为菌株外排泵携带阳性；A1/A0＝(s2+cccp)/s2为样品鲍曼不动杆菌s2株外排泵携带相对比，A2/A0＝1.08﹤1.5,判为菌株外排泵携带阴性。szn为阴性对照，An/A0＝1.1，szp为阳性对照，Ap/A0＝2.1，其数值均在实施例3的对应范围之间，由此可见，此次实验结果是可靠的。
实施例4
本实施例对实施例2建立的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法进行了有效性和准确性验证。
用药物敏感性试验方法(简称药敏法，按照2010版美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准进行，所使用的碳氢酶烯类抗生素亚胺培南)对16株经验证不产碳氢酶烯酶的鲍曼不动杆菌株(由深圳市第二人民医院提供，分别编号为A1、A2…，A15，A16)进行检验。
利用本发明实施例2的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法(简称荧光法)对与上述药敏法检测同样的16株鲍曼不动杆菌株进行检验，得到如表2所示的鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的检测结果。
表2
菌株编号 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16
药敏法 8(+) 32(+) 4(+) 1(-) 16(+) 2(-) 8(+) 4(+) 32(+) 8(+) 16(+) 2(-) 16(+) 2(-) 16(+) 2(-)
荧光法 1.85 2.56 1.56 1.1 2.21 0.97 1.92 1.42 2.77 1.67 2.01 1.24 2.32 1.39 1.98 1.75
注：表中药敏法数值为IPM的MIC(最小抑菌浓度)，单位为μg/ml，(+)代表药敏法泵抑制剂试验为阳性，(-)代表药敏法泵抑制剂试验为阴性。
荧光值一栏分别为A1/A0＝(s1+cccp)/s1、A2/A0＝(s2+cccp)/s2、A15/A0＝(s15+cccp)/s15和A16/A0＝(s16+cccp)/s16的计算结果。
表3
注：表3中数值为荧光法和药敏法所测的16株鲍曼不动杆菌中阴阳性的株数。
统计学分析，针对两种方法所得结果做kappa检验，P0＝0.875Pe＝0.570Kappa＝0.709>0.7,拒绝H0,由此可见荧光法与药敏法对检测鲍曼不动杆菌外排泵水平结果具有一致性，从而证明实施例2建立的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法是可靠的。
实施例5
本实施例对实施例2建立的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法进行了重复性验证。
用实施例2的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法(简称荧光法)对16株鲍曼不动杆菌株(由深圳市第二人民医院提供，分别编号为A1、A2…，A15，A16)进行检验(计为M1，每个菌株做3个重复)，重复一次(计为M2，每个菌株做3个重复)，得到如表4所示的鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的检测结果。
表4
注：M1和M2分别为第一次M1和第二次M2的测量结果的均值，每个菌株做3个重复取均值。用spss16.0做t检验，P＝0.5〉0.05，证明两次的检测结果无差异。
对比例1
将本发明试剂盒中的或建立的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法中使用的荧光染料Hoechst 33342替换为溴化乙锭(EB)，用实施例2的检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法对实施例4提到的16株鲍曼不动杆菌株进行检验，则经统计学分析所得结果无法与药敏法一致，且EB为致癌的化学品，试验操作的安全性难以与荧光染料Hoechst 33342相比。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，由外排泵抑制剂和荧光染料组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
任选的，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂；
任选的，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙；
任选的，所述荧光染料为Hoechst 33342。
3.权利要求1或2所述的组合物在制备检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的试剂盒中的应用。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括外排泵抑制剂和荧光染料。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂；
任选的，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙；
任选的，所述荧光染料为Hoechst 33342；
任选的，还包括适于培养鲍曼不动杆菌的培养基；
任选的，所述适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，还包括阳性对照和阴性对照；
任选的，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌szp株，
任选的，所述阴性对照为鲍曼不动杆菌szn株；
任选的，还包括检测板；
任选的，所述检测板为无菌96孔检测板。
6.权利要求4或5的试剂盒在检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平中的用途。
7.一种检测鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：预培养
将活化的鲍曼不动杆菌接种在适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中预培养，得到菌液；
步骤二：接种
将菌液离心收集细菌沉淀，将细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液，将菌悬浮液接种到检测板上；
步骤三：培养
在有菌悬浮液的部分检测板中加入外排泵抑制剂，分别将有菌悬浮液的检测板和含有外排泵抑制剂且有菌悬浮液的检测板继续培养；
步骤四：检测
在有菌悬浮液的检测板和既有菌悬浮液又有外排泵抑制剂的检测板中均加入荧光染料染色，检测荧光值，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤一中的适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，所述步骤一中的预培养条件为：置于33-37℃温箱中孵育3-5小时；
任选的，所述步骤一中的预培养条件为：置于35℃温箱中孵育4小时；
任选的，所述步骤一中预培养后菌液的浓度为1.5xl08CFU/ml；
任选的，所述步骤一中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，所述步骤二中将菌液离心收集细菌沉淀是在2000g离心15min后收集细菌沉淀；
任选的，所述步骤二中收集细菌沉淀后，是用O.lmol/L pH7.0的PBS溶液冲洗2遍,在2000g离心15min后,将得到的细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液；
任选的，所述步骤二中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，所述步骤二中所述菌悬浮液的浓度为0.5麦氏单位；
任选的，所述步骤三中在有菌悬浮液的检测板中加入外排泵抑制剂，是使外排泵抑制剂的终浓度达到10μM；
任选的，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂；
任选的，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙；
任选的，所述步骤三中培养条件为：置于35℃温箱中孵育16小时；
任选的，所述步骤四中，所述荧光染料为Hoechst 33342；
任选的，所述步骤四中，所述荧光染料的终浓度为2.0-3.0μM；
任选的，所述步骤四中，加入荧光染料染色的时间为120min；
任选的，所述步骤四中，是用德国BMG LABTECH公司的FLUOstar OPTIMA多功能酶标仪检测荧光值，激发光波长为530nm，发射光波长为600nm；
任选的，还包括对阳性对照和阴性对照进行上述预培养、接种、培养和检测的步骤；
任选的，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌szn株；
任选的，所述阴性对照为鲍曼不动杆菌szp株；
任选的，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平具体为：根据接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值与含有外排泵抑制剂且接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值之比来判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平；
任选的，所述荧光值之比为1.5。
9.一种鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平的检测装置，其特征在于，包括：
预培养单元，用于将活化的鲍曼不动杆菌接种在适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中预培养；
接种单元，所述接种单元与预培养单元相连，用于将预培养得到的菌液离心得到的细菌沉淀配制成菌悬浮液接种到检测板上；
培养单元，所述培养单元与接种单元相连，用于将接种有菌悬液的检测板进行培养以及将外排泵抑制剂加入到接种有菌悬浮液的检测板进行培养；以及
检测单元，所述检测单元与培养单元相连，用于分别在接种有菌悬液的检测板和含有外排泵抑制剂且接种有菌悬浮液的检测板中添加荧光染料并检测荧光值，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平。
10.根据权利要求9所述的检测装置，其特征在于，所述预培养单元中的预培养条件为：置于34-36℃温箱中孵育3-5小时；
任选的，所述预培养单元中的预培养条件为：置于35℃温箱中孵育4小时；
任选的，所述预培养单元中预培养后菌液的浓度在约为1.5xl08CFU/ml；
任选的，所述预培养单元中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，所述接种单元中将菌液离心收集细菌沉淀是在2000g离心15min后收集细菌沉淀；
任选的，所述接种单元中收集细菌沉淀后，是再用O.lmol/LpH7.0的PBS溶液冲洗2遍,在2000g离心15min后,将得到的细菌沉淀悬浮于适于培养鲍曼不动杆菌的培养基中，得到菌悬浮液；
任选的，所述接种单元中适于培养鲍曼不动杆菌的培养基为LB肉汤培养基；
任选的，所述接种单元中所述菌悬浮液的浓度为0.5麦氏单位；
任选的，所述培养单元中将外排泵抑制剂加入到接种有菌悬浮液的检测板，是使外排泵抑制剂的终浓度达到10μM；
任选的，所述外排泵抑制剂为氧化磷酸化抑制剂；
任选的，所述外排泵抑制剂为羰基氰化物间氯苯腙；
任选的，所述培养单元中培养条件为：置于35℃温箱中孵育16小时；
任选的，所述检测单元中，所述荧光染料为Hoechst 33342；
任选的，所述检测单元中，所述荧光染料的终浓度为2.0-3.0μM；
任选的，所述检测单元中，加入荧光染料染色的时间为120min；
任选的，所述检测单元中，是用德国BMG LABTECH公司的FLUOstarOPTIMA多功能酶标仪检测荧光值，激发光波长为530nm，发射光波长为600nm；
任选的，所述检测单元中，根据荧光值判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平具体为：根据接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值与含有外排泵抑制剂且接种有菌悬液的检测板中添加荧光物质的荧光值之比来判断鲍曼不动杆菌耐药外排泵分布水平；
任选的，所述荧光值之比为1.5；
任选的，所述预培养单元中还包括对阳性对照和阴性对照进行预培养，然后进入接种单元、培养单元和检测单元；
任选的，所述阳性对照为荧光值之比为1.6～2.4的鲍曼不动杆菌szn株；
任选的，所述阴性对照为荧光值之比为0.6～1.4的鲍曼不动杆菌szp株。
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