CN110184369B - 一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物及其方法和应用，所述的特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示，通过提取待测样品基因组DNA，使用上述引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在410bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有鲍曼不动杆菌。采用本发明的检测方法检测鲍曼不动杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度较高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

Description

一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物及其方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物及其方法和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中的一种，属革兰氏阴性杆菌,广泛分布于自然界，是人和动物重要的条件致病菌，常引起人类呼吸道感染、皮肤软组织感染、泌尿系感染、中枢神经系统感染及菌血症等多种疾病，导致畜禽的呼吸道疾病、新生驹的败血症、水貂肺炎、胎猪流产，以及引起斑点叉尾鮰、乌龟、银鲫等某些水生动物的死亡。近年来，不动杆菌属受到越来越多的关注，由于抗生素的不停滥用，使得多重耐药性细菌菌株甚至是泛耐药性细菌菌株越来越多，其引发的疾病亦越来越严重，给临床治疗带来极大困难。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，针对防治。

传统上的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类鉴定，操作繁琐、费时费力、灵敏度较低、重复性差，不利于及时诊断病因，查找病原，控制病情蔓延。而诸如16S rRNA测序等手段，不适用于常规检测。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。本发明建立的检测方法可为临床上鲍曼不动杆菌快速诊断和流行病学调查提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲍曼不动杆菌PCR检测引物及方法。该引物可用于鲍曼不动杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物，所述的特异性引物包括正向引物和反向引物，具体为：

正向引物F：5’-TCGCGGAAAGCTCATCTTGT-3’；

反向引物R：5’-TGATGCGGAAGCAGTGATGA-3’。

在本发明的另一方面，提供了一种检测鲍曼不动杆菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)使用上述引物进行PCR扩增；

3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在410bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有鲍曼不动杆菌。

进一步，所述的样品基因组利用一管式通用样品DNA抽提试剂盒提取。

进一步的，所述的PCR扩增反应体系为10μL：2×TSINGKEMasterMix(blue)5μL，引物对1μL，模板DNA 1μL，双蒸水补至10μL。

进一步的，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，降温12℃，结束。

此外，本发明还提供了所述的特异性引物在鲍曼不动杆菌检测中的应用。

同时，本发明还提供了一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，所述的试剂盒包含上述引物对。

本发明的有益效果为：

采用本发明的检测方法检测鲍曼不动杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时常、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特意，易于判定，相对于16S rRNA测序的方法又节约了时间。

附图说明

图1为实施例中鲍曼不动杆菌特异性引物的最适退火温度的筛选结果；图中，M为DNAMarker 2000；1-6分别是退火温度为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃；

图2为实施例中PCR检测方法特异性评估试验凝胶电泳结果；图中，M为DNAMarker2000，1为去离子水作阴性对照，2-13的模板分别为鲍曼不动杆菌、贝氏不动杆菌、皮特不动杆菌、约翰逊不动杆菌、托内利不动杆菌、洛菲不动杆菌、大肠埃希氏菌、摩根氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、深红沙雷氏菌、柯氏柠檬酸杆菌；

图3为实施例中PCR检测方法细菌灵敏度评价试验凝胶电泳结果；图中，M为DNAMarker 2000，1为去离子水作阴性对照，2-10分别为菌液稀释度10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，相对应的菌液浓度为4.6×10⁹cfu/mL、4.6×10⁸cfu/mL、4.6×10⁷cfu/mL、4.6×10⁶cfu/mL、4.6×10⁵cfu/mL、4.6×10⁴cfu/mL、4.6×10³cfu/mL、4.6×10²cfu/mL、4.6×10¹cfu/mL；

图4为实施例中PCR检测方法DNA灵敏度评价试验凝胶电泳结果；图中，M为DNAMarker 2000，1为去离子水作阴性对照，2-10分别为DNA稀释度10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，相对应的DNA浓度为3.004×10²ng/μL、3.004×10¹ng/μL、3.004×10⁰ng/μL、3.004×10^-1ng/μL、3.004×10^-2ng/μL、3.004×10^-3ng/μL、3.004×10^-4ng/μL、3.004×10^-5ng/μL、3.004×10^-6ng/μL。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1鲍曼不动杆菌特异性PCR检测方法建立

(一)鲍曼不动杆菌特异性引物设计

本实施例针对鲍曼不动杆菌的DNA拓扑异构酶IV亚基(parC基因)，设计出对鲍曼不动杆菌具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物，该特异性引物对具体信息如下：

引物序列为：

F：5’-TCGCGGAAAGCTCATCTTGT-3’；

R：5’-TGATGCGGAAGCAGTGATGA-3’。

(二)鲍曼不动杆菌DNA模板制备

2.1鲍曼不动杆菌DNA的提取

使用一管式通用样品DNA抽提试剂盒，提取鲍曼不动杆菌的DNA，具体步骤如下：

1)取200μL 37℃恒温培养箱培养24h的鲍曼不动杆菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温10000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，加入100μL Qlysis-G Reagent和10μLProteinase K溶液，震荡混匀，65℃水浴5min至细胞完全裂解；

2)95℃水浴3min；

3)加入100μLBufferNST，震荡混匀；

4)12000rpm室温离心5min；

5)取上清液作为模板直接用于PCR检测。提取的DNA可立即进行下一步试验或-20℃保存。

2.2鲍曼不动杆菌特异性引物最适退火温度的探索

分别以鲍曼不动杆菌的菌液为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃。PCR扩增产物在1.2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5μL，用全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果，根据PCR后的凝胶电泳结果确定为鲍曼不动杆菌特异性引物的最佳退火温度。

PCR反应体系(10μL)：2×TSINGKE MasterMix(blue)5μL；引物对1μL；待试菌株菌液1μL；ddH₂O 3μL。

PCR反应条件：第一阶段：95℃，5min；第二阶段：95℃，30s；57℃，30s；72℃40s；35cycles；第三阶段：72℃，10min；第四阶段：12℃保存。

由图1可见，59℃、61℃时的电泳条带相对于51～57℃时较暗，根据PCR基本原则，在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性，故确定最佳退火温度为57℃。

(三)鲍曼不动杆菌特异性PCR检测方法建立

PCR检测体系(10μL)：2×TSINGKE MasterMix(blue)5μL；引物对1μL；模板DNA 1μL；ddH2O 3μL。

PCR检测反应程序：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

(四)PCR扩增结果凝胶电泳判定

PCR扩增产物在1.2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5μL，用全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果，如果出现410bp的单一扩增条带，则说明样品中含有鲍曼不动杆菌；反之，则样品中不含鲍曼不动杆菌。

实施例2特异性评估试验

按实施例1中DNA模板制备与PCR检测方法，对本实验室保存的鲍曼不动杆菌，贝氏不动杆菌，皮特不动杆菌，约翰逊不动杆菌，托内利不动杆菌，洛菲不动杆菌，大肠埃希氏菌，摩根氏菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，深红沙雷氏菌，柯氏柠檬酸杆菌进行PCR扩增反应。

如图2所示，电泳结果为只有鲍曼不动杆菌在410bp处出现特异性条带，而其他菌种未出现特异性条带。

实施例3灵敏度评价试验

将鲍曼不动杆菌接种于1mL普通营养肉汤液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h增菌后，按照10倍梯度依次稀释，稀释度均分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，选取稀释度为10^-5～10^-8的菌液接种于普通营养琼脂平板上，每个稀释度接种两个平板，培养后进行菌落计数，结果显示原菌液浓度为4.6×10⁹cfu/mL。再将上述稀释好的鲍曼不动杆菌菌液分别作为PCR扩增模板，检验其灵敏性。

扩增结果(图3)显示，在泳道4可以看到清晰条带，相对应检测细菌浓度为4.6×10⁷cfu/mL，本法具有较好的灵敏度。

将鲍曼不动杆菌接种于1mL普通营养肉汤液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h增菌后，使用一管式通用样品DNA抽提试剂盒，提取鲍曼不动杆菌的DNA，NanoDropTM One超微量紫外分光光度计计数得到细菌基因组DNA浓度为300.4ng/μL，然后按照10倍梯度依次稀释，稀释度均分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，将上述稀释好的鲍曼不动杆菌DNA分别作为PCR扩增模板。

扩增结果(图4)显示，在泳道5可以看到清晰条带，即稀释后最低检测DNA浓度为3.004×10^-1ng/μL；由于每个PCR扩增反应的DNA模板量为1μL，则鲍曼不动杆菌最低检测DNA量为0.3004ng，表明本法具有较好的灵敏度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物及其方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgcggaaag ctcatcttgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatgcggaa gcagtgatga 20

Claims (7)

1.一种检测鲍曼不动杆菌的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如SEQ IDNO.1~2所示。

2.一种非治疗诊断目的检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

3）凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在410 bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有鲍曼不动杆菌。

3.根据权利要求2所述的一种非治疗诊断目的检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于，所述的样品基因组利用一管式通用样品DNA抽提试剂盒提取。

4.根据权利要求2所述的一种非治疗诊断目的检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为10 µL：2×TSINGKE Master Mix blue5µL，引物对 1µL，模板DNA1µL，双蒸水补至10 µL。

5.根据权利要求2所述的一种非治疗诊断目的检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，降温12℃，结束。

6.权利要求1所述的特异性引物在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。

7.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物。

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