KR101908870B1

KR101908870B1 - 마그네슘 이온의 검출을 통하여 다제내성 아시네토박터 바우마니균(mrab)의 감염을 진단하기 키트

Info

Publication number: KR101908870B1
Application number: KR1020170179023A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 최재호; 이봉규; 김형수; 김기원; 이재성; 전효성; 윤소라
Original assignee: (주)바이오액츠
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-10-16

Abstract

본 발명은 검체의 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB)의 감염 여부를 판단하는 진단키트에 대한 것으로서, 상기 진단키트를 이용하여 MRAB의 감염여부를 판단하는 방법은 LAMP 반응 후의 발색변화를 육안으로 관측함으로써 이루어지고, 상기 발색 변화는 마그네슘 농도 변화에 의한 것으로써 마그네슘 이온에 민감하게 반응하는 본 발명에서 개발된 특별한 염료 화합물을 이용하여 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 MRAB DNA의 증폭은 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하고 있어서, 본 발명에서 제공하는 진단키트는 언제 어디서나 편리하게 사용할 수 있고 또한 신속하게 진단이 가능하다는 장점이 있다.

Description

마그네슘 이온의 검출을 통하여 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB)의 감염을 진단하기 키트{Kit for detecting MRAB by detecting divalent magnesium ions and use thereof}

본 발명은 검체의 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB; Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)의 감염여부를 판단하는 데에 있어서, 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)상기 MRAB의 대사반응 중에서 산출되는 마그네슘 2가 이온(Mg2+)의 농도변화를 염료 화합물을 이용하여 육안으로 확인함으로써 간단하게 MRAB의 감염여부를 판단할 수 있는 진단키트에 대한 것이다.

최근 바이오 진단 분야에서는 고가의 장비 없이 현장검사를 신속하게 실시할 수 있는 진단 체계인 현장현시검사(Point of care Test, POCT) 시장이 빠르게 성장하고 있으며 기존 유전자 검사와 분자진단 키트들이 이러한 시장경쟁력을 갖추고자 새로운 플랫폼에 적용된 컨텐츠가 많이 개발되고 있다.

현재 주로 사용되는 진단 방식의 경우는, 세균 배양 동정법, PCR 및 염기서열 분석법 그리고 세균을 직접 측정하는 POCT가 있지만 검출에 따라 진단 Lab 중심으로 고도의 장비와 많은 인력이 요구된다.

다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB; Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)은 병원 및 중환자실에서 흔히 존재하는 기회감염균으로 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성을 나타내며, 면역력이 저하된 사람에게 감염되었을 경우 폐렴, 혈류감염, 창상감염 등을 유발할 수 있고 감염부위에 따라 다양한 증상을 나타낸다. 따라서 환자에게 적절한 항균제를 선택하고 원내감염의 관리를 위해서는 정확하고 신속한 균 동정 및 항균제 감수성 검사가 필수적이다.

환자의 MRAB 감염여부를 판단하기 위해서는 환자의 혈액을 채취하여 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 3개 계열 항생제에 모두 내성을 나타내는 지를 확인하거나 분자생물학적으로 확인하는 방법이 있다.

MRAB의 동정에 주로 이용하는 방법은 분자생물학적 검사방법인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)과 염기서열 분석법을 이용하여 16S rRNA 유전자, rpoB 유전자 등의 염기서열을 분석한 후 항생제 감수성 검사를 실시하여 내성을 확인한다. 그 동안 전통적으로 사용해 왔던 항균제 감수성 검사법은 배양 시간만도 24시간이 소요되고 배지의 종류나 배양조건에 따라 내성 발현에 차이를 보이기 때문에 신속하고 정확한 결과를 기대하기는 어렵다.

또한, 상기와 같은 세균을 직접 측정하는 POCT법의 경우, 고비용적 측면과 검사 결과의 민감도 및 정확도를 신뢰할 수 있는 수준에 도달하지 못한 문제가 있으며, 최근에는 이러한 단점을 보완하고자 고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 활용한 병원균 검출에 적합한 기술이 제안되었다.

기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 온도변화를 주어야 하는 반면 고리매개 등온증폭법(LAMP)은 한 가지 온도에서 DNA 증폭 반응이 일어나기 때문에 중합효소 연쇄반응처럼 별도의 특수한 기기 (PCR machine)가 필요하지 않다.

고리매개 등온증폭법(LAMP)은 60~65℃에서 1시간 내에 목표 핵산을 10⁹ copies로 증폭시킬 수 있으므로 64 ~ 65도 정도의 항온유지 장치만 있으면 측정 가능하고 검사시간이 30-60분 정도로 짧고 육안으로 관찰이 가능하고 고가의 장비의 구입 및 장비 운용에 필요한 전문지식의 습득이 불필요하여 간편하고 쉽게 DNA를 증폭할 수 있다.

이 방법은 강력한 strand displacement activity의 DNA polymerase에 의한 autocycling strand displacement DNA 합성에 기초하고 있는데, 등온 조건하에서 반응이 일어나기 때문에 실험 자체가 아주 간단하고, 온도 변화에서 시간의 손실이 없기 때문에 증폭효율이 매우 높다. 이와 같이 등온증폭을 통한 진단방법의 경우, 매우 적은 소량의 DNA도 짧은 시간 내 일반 PCR 보다 합성 효율이 뛰어나 DNA를 직접 검출하거나, DNA 증폭 후 부산물들을 검출하여 진단키트로 활용할 수 있는 장점이 있다.

한편, 마그네슘 이온(Mg2+)은 세포 내에 가장 풍부한 양으로 존재하는 2가 금속 이온으로서, 수 백여 가지의 효소 활성 조절에 관여할 뿐만 아니라, DNA 합성을 위한 중요 인자로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 세포 증식 및 사멸과 같은 많은 세포 과정에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 이러한 세포 내 마그네슘 이온을 검출하기 위해서, 다양한 세포-투과성 형광체와 일광자 또는 이광자 형광 탐침을 구비한 공초점 현미경을 이용하여 검출하는 방법이 제안되었다.

그러나 상기와 같은 방법들은 고가의 장비를 이용하여서만 검출이 가능하다는 문제점이 있다. 이에, 진단키트 뿐만 아니라 마그네슘과 관련된 세포 실험외 기타 연구에 용이하게 활용될 수 있도록 육안으로 관측이 가능한 고감도 Magnesium ion indicator의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 사람에게 감염되어 다양한 질병을 일으키는 세균인 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB; Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)을 진단하는 데에 있어서, 염료 화합물의 발색 변화를 통해 마그네슘 농도 변화를 검출하는 방법을 이용하고, 상기 방법은 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 미세한 양의 DNA가 존재하더라고 고효율적으로 MRAB를 검출하며 이를 육안으로 확인할 수 있는 키트를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 사람에게 감염되어 다양한 질병을 일으키는 세균인 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB; Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)을 검출하기 위한 키트를 제공하고자 하는 것이다. MRAB 세균을 검출하기 위하여 본 발명에서는 검체 내에 존재하는 마그네슘 이온의 농도변화를 육안으로 확인할 수 있는 신규한 염료 화합물을 개발하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 마그네슘 이온의 존재를 육안으로 확인할 수 있는 마그네슘 이온 검출용 염료화합물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물을 이용한 마그네슘 이온 정량화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 DNA를 증폭할 때에 상기 마그네슘 이온 검출용 염료화합물을 이용하여 DNA 증폭을 확인할 수 있는 진단키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에서 개발된 MRAB 세균을 검출하기 위한 키트는 염료 화합물의 발색 변화를 통해 마그네슘 농도 변화를 검출함으로써 세균의 감염여부를 검사할 수 있는 키트로서 분자생물학적 방법에 의해서 MRAB를 검출하는 키트에서 사용되는 일반적인 LAMP 프라이머가 모두 사용될 수 있다.

선행기술문헌

-특허문헌

(특허문헌 1) 한국등록특허 제10-0858560호

(특허문헌 2) 한국등록특허 제10-1552159호

(특허문헌 3) 한국등록특허 제10-1329316호

-비특허문헌

Hye jin kim et al. 2016, Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii Harboring blaVIM-2, blaIMP-1 and blaOXA-23 Genes by Using Loop-Mediated Lsothermal Amplification Methods. Clinical Microbiology, 36:15-22.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물을 제공한다.

상기 화학식 1에서

R₁ 및 R₂는 수소, 히드록시 및 아미노(-NH₂) 중에서 선택되고, R₁ 또는 R₂는 히드록시이며, 상기 R₁이 히드록시면, 상기 R₂는 수소 또는 아미노이고, 상기 R₂가 히드록시면 상기 R₁은 아미노이며; R₃은 수소이고;

R₄는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, 탄소 1 내지 6의 알킬 및 페닐 중에서 선택되며; R₅ 및 R₆는 수소 또는 설폰산기이고, R₅ 및 R₆ 중 어느 하나가 설폰산기이면, 다른 하나는 수소이고;

Ar은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 페닐 또는 나프틸의 임의의 수소 1 내지 3개는 히드록시, 니트로, 설폰산기, 할로겐 중에서 선택되는 치환기로 치환되고, 상기 페닐 또는 나프틸의 치환기 중 적어도 하나는 히드록시기이며, 상기 적어도 하나의 히드록시기는 2번 탄소 위치에 치환되고;

상기 설폰산기는 설폰산(-SO₃H) 또는 설폰산나트륨염(-SO₃Na)이다.

본 발명에 따른 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물에 있어서, 마그네슘 이온과 반응하여 발색을 나타내기 위해서는 상기 [화학식 1]의 나프틸기에 1개의 히드록시기를 포함하여야 하며, 바람직하게는 R₁ 및 R₂ 중에서 어느 하나가 히드록시기여야 한다. 상기 R₁ 또는 R₂가 히드록시기인 것은 마그네슘 이온과 반응하여 본래의 색과 구별되는 색으로 발색하는데 주요한 작용을 한다.

본 발명에 있어서, 상기 R₃이 H인 것은 본 발명에 따른 염료 화합물의 용해성을 향상시키므로 중요하다. 상기 R₃이 아민과 같은 치환기로 치환되는 경우에는 수용해도가 매우 좋지 않으며, 마그네슘 이온과의 반응이 용이하지 않다.

본 발명에 있어서, R₄는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되며, 바람직하게는 -NHRa 또는 설폰산기일 수 있고, 보다 바람직하게는 -NHRa일 수 있다. 상기 R₄가 -NHRa 또는 설폰산기인 것이 보색으로 발색되는데 효과적이다. 여기서, 상기 Ra는 수소, 탄소 1개 내지 6개의 알킬 및 페닐 중에서 선택될 수 있는데, 바람직하게는 수소 또는 페닐이다.

본 발명에 있어서, R₅ 및 R₆ 중에서 어느 하나는 설폰산기이며, 다른 하나는 수소일 수 있으며, 바람직하게는 R₅가 설폰산기이고, R₆이 수소인 것이 마그네슘 이온과 반응하여 보색으로 발색되는데 효과적이다.

본 발명에 있어서, 상기 [화학식 1]의 모핵에서 Ar은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 페닐 또는 나프틸은 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다. 여기서 상기 Ar(페닐 또는 나프틸)의 2번 탄소에는 히드록시기가 치환되는 것이 바람직하며, 보다 바람직한 상기 [화학식 1]은 하기 [화학식 1a]일 수 있다.

[화학식 1a]

상기 [화학식 1a]에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 상기 [화학식 1]에서 제시한 바와 같으며, R₇ 및 R₈은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 니트로, 히드록시, 할로겐 및 설폰산기 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 R₇ 및 R₈는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 상기 R₇ 및 R₈ 중에서 적어도 하나 이상은 니트로, 히드록시, 설폰산기 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 R₇ 및 R₈ 중에서 적어도 하나 이상이 니트로인 것이 마그네슘 이온과 반응하여 뚜렷하게 구분이 가능한 색 또는 보색으로 발색될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 마그네슘 이온과 반응하여 마그네슘 이온과 반응하기 전과 상이한 파장으로 이동하며, 이동된 파장의 위치 및 강도에 따라 발색되는 색의 차이가 있다. 또한, 화합물의 치환기에 따라 이동되는 파장의 차이가 있으므로 상이한 발색을 나타낸다.

뿐만 아니라 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 마그네슘 이온 부재하에서 pH에 변화에 의해 미발색되거나 또는 마그네슘 이온에 의한 발색과는 상이한 색으로 발색되기 때문에 pH의 변화에 영향을 받지 않으므로 pH 조절을 필요로 하지않아 이용이 용이하며, pH 조절을 할 수 없는 검체에 적용하여 검체에 함유된 마그네슘 이온을 검출할 수 있으며, 육안 관측인 비색법이나 흡광광도법을 이용하여 검출이 가능하므로 산업상 적용이 유리하다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 구체적으로 예를 들면, 하기의 [화학식 2] 내지 [화학식 10]으로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

화합물 DKLS

본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 1 mM 내지 200 mM의 마그네슘 이온존재하에서 발색될 수 있으며, 치환기의 차이에 따라 검출 가능한 마그네슘 이온임계 농도의 차이 및 발색되는 색의 차이가 있다. 예를 들어, 상기 [화학식 4]의 화합물은 3 mM 이하 농도의 마그네슘 이온 존재하에서도 발색이 가능하나, 다른 화합물들은 8 mM 미만 농도의 마그네슘 이온에서는 발색되지 않는다. 상기 화합물의 치환기에 따라 발색되는 색상 및 검출 가능 임계 농도가 다르기 때문에 상기 임계농도가 서로 상이한 염료 화합물 다수개를 이용하면 검출하고자 하는 검체 안에 함유된 마그네슘 이온의 양을 육안으로 정량화할 수 있다.

본 발명은 상기의 [화학식 1]의 염료 화합물을 포함하는 마그네슘 이온 검출키트를 제공한다. 상기 검출 키트는 마그네슘 이온의 농도만 확인하기 위해서는 1종의 염료 화합물만 포함되어도 충분히 검출 가능하다. 한편, 서로 상이한 마그네슘 이온검출가능 임계농도를 가지는 염료 화합물을 다수 개 포함하는 키트를 이용하면 검출하고자 하는 검체에 함유된 마그네슘 이온을 정량화할 수 있다.

본 발명에 따른 마그네슘 이온의 존재를 육안으로 정량화하는 방법은 상기 화학식 2 내지 화학식 10으로 표현되는 화합물 중에서 선택되는 2 내지 9종의 염료 혼합물에 검출검체를 투여하여 반응시키는 단계; 및 색변화를 확인하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

또한 본 발명은 상기 [화학식 7]로 표시되는 염료 화합물을 포함하는 DNA 증폭을 육안으로 검사할 수 있는 진단 키트를 제공한다. 특히 MRAB의 DNA를 고리매개 등온증폭법(LAMP)에 의하여 증폭되는 것을 검사할 수 있는 키트를 제공한다. 종래에는 DNA 증폭여부를 육안으로 확인하는 것이 가능하지 않았다. 본 발명에 따른 [화학식 7]의 화합물을 포함하는 고리매개 등온증폭(LAMP) 반응액에 MRAB DNA를 첨가하여 반응시킴으로써 검출기계를 이용하지 않아도 육안으로 발색 변화를 통해 DNA 증폭여부를 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물은 온도 및 pH 변화에 안정적이면서, 마그네슘 이온의 존재하에서만 발색(변색)되므로 육안으로 마그네슘 이온을 손쉽게 검출 및 정량화할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 염료 화합물은 다제내성 아시네토박터 바우마니균의 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용한 DNA 증폭과정에서 발생하는 마그네슘 이온의 농도변화에 반응하여 발색되므로, 다제내성 아시네토박터 바우마니균의 DNA 증폭 여부를 확인을 위한 육안 검출용 진단 시약으로 적용이 가능하다. 뿐만 아니라 발색 임계 농도가 서로 상이한 염료화합물들과 반응시켜 발색여부를 확인함으로써 육안으로 마그네슘 이온의 함량을 정량화할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용되는 9종 화합물의 용해도와 마그네슘 이온에 대한 민감도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 적용되는 화합물의 고리매개 등온증폭법(LAMP)에 의한 MRAB의 존재에 따른 발색 평가 결과를 나타낸 것이다. 도면에서 P는 positive control, N은 negative control을 나타낸다.
도 3은 MRAB DNA의 증폭을 확인하기 위하여 전기영동법을 실시하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도면에서 P는 positive control, N은 negative control을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물의 고리매개 등온증폭법(LAMP)에 의한 MRAB DNA에 대한 민감도 평가결과를 나타낸 것이다. 도면에서 NC는 negative control을 나타낸다.
도 5는 화학식 7의 화합물의 MRAB DNA에 대한 발색 평가결과를 나타낸 것이다. 도면에서 NC는 negative control을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법에 의하여 MRAB를 검출하는 것과 종래의 기술인 PCR 반응을 이용하여 MRAB를 검출하는 것의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

따라서 본 발명은 상기 MRAB균을 검출하기 위하여 염료 화합물을 통해 마그네슘 이온의 농도 변화를 검출함으로써 MRAB의 감염여부 및 증폭과정을 육안으로 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것으로서 종래의 기술에 비하여 소요되는 비용과 시간이 현저하게 적다는 중요한 장점이 있다. 게다가 MRAB의 유전자를 증폭하기 위하여 PCR 방법을 사용하지 않고 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 사용함으로써 유전자의 증폭시간이 현저하게 짧다.

종래의 마그네슘 이온 검출에 이용되는 염료는 특정 pH 조건에서만 마그네슘에 의해 발색(변색)이 되고, 온도나 pH 조건이 변하면 마그네슘 이온이 존재하지 않은 조건하에서도 마그네슘이 있을 때와 동일한 색으로 발색이 되는 문제가 있어 신뢰도가 떨어지고, 검출시마다 pH를 조절해야하는 불편함이 있는 등 여러 문제점이 있었다. 이에, 본 발명의 발명자들은 온도 및 pH 변화에 안정적이면서, 마그네슘 이온의 존재를 육안으로 확인할 수 있는 염료화합물 및 서로 다른 마그네슘 이온의 농도 범위에서 발색되는 염료 화합물들을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.

합성예 1. 화학식 2의 화합물 제조

2-아미노-4-니트로페놀(2-amino-4-nitrophenol) (0.385 g, 2.50 mmol, 1 eq) 을 증류수 5.8 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.

4-히드록시나프탈렌-1-설폰산(4-hydroxynaphthalene-1-sulfonic acid) (0.58 g, 2.59 mmol, 1.04 eq)을 증류수 9 ml에 투입한 다음 pH 10으로 조정하고, 완용시킨 후 반응액에 투입하여 pH 10 및 10 ℃이하로 2시간 동안 교반한다.

반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물을 얻는다(128 mg. 13.2 %).

R_f = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

MALDI-TOF/MS, 계산치 C₁₆H₁₁N₃O₇S 389.34, 측정치 388.11

합성예 2. 화학식 3의 화합물 제조

2-아미노-5-니트로페놀(2-amino-5-nitrophenol) (0.385 g, 2.50 mmol, 1 eq)을 증류수 5.8 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.

7-아미노-4-하이드록시나프탈렌-2-설폰산(7-amino-4-hydroxynaphthaloene-2-sulfonic acid) (0.628 g, 2.62 mmol, 1.05 eq)을 증류수 9.4 ml에 투입하여 완용시킨 후 반응액에 투입하여 10 ℃ 이하로 2시간 동안 교반한다.

반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물을 얻는다(13 mg, 1.3 %).

R_f = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₁₆H₁₂N₄O₇S 404.35, 측정치 403.0

합성예 3. 화학식 4의 화합물 제조

2-아미노-4,6-디니트로페놀(2-amino-4,6-dinitrophenol) (0.498 g, 2.50 mmol, 1 eq)을 증류수 7.4 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃ 이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.

4-하이드록시-7-(페닐아미노)나프탈렌-2-설폰산(4-hydroxy-7-(phenylamino) naphthalene-2-sulfonic acid (0.817 g, 2.62 mmol, 1.05 eq)을 증류수 12.4 ml 에 투입하여 완용시킨 후 반응액에 투입하여 10 ℃ 이하로 2시간 동안 교반한다.

반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물을 얻는다(45 mg, 3.4 %).

R_f = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₂₂H₁₅N₅O₉S 525.45, 측정치 523.9

합성예 4 내지 8 : 화학식 5의 화합물 내지 화합물 9의 화합물의 제조는 상기 합성예 1 내지 3과 유사한 방법으로 합성하였다.

합성예 4. 화학식 5의 화합물 제조

(70 mg, 0.7 %)

R_f = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₁₆H₁₅N₅O₇S 421.38, 측정치 419.0

합성예 5. 화학식 6의 화합물의 제조

(200 mg, 22.5 %)

R_f = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₁₂H₉N₃O₈S 355.28, 측정치 350.9

합성예 6. 화학식 7의 화합물의 제조

(40 mg, 2.9 %)

R_f = 0.8 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₂₂H₁₆N₄O₁₀S₂ 560.51., 측정치 561.1

합성예 7. 화학식 8의 화합물의 제조

(35 mg, 4.0 %)

R_f = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₁₆H₁₀N₄O₆ 354.27, 측정치 352.9

합성예 8. 화학식 9의 화합물의 제조

(110 mg, 9.4 %)

R_f = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₁₆H₁₀N₃NaO₁₀S₂ 491.38, 측정치 489.8

합성예 9. 화학식 10의 화합물 DKLS의 제조

2-아미노-4-니트로페놀-6-설폰산(2-amino-4-nitrophenol-6-sulfonic acid) (0.5 g, 2.14 mmol, 1 eq)을 증류수 7.4 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃ 이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.

4-(벤즈아미도)-5-하이드록시나프탈렌-1,7-다이설폰산(4-(benzamido)-5-hydroxynaphthalene-1,7-disulfonic acid) (0.949 g, 2.24 mmol, 1.05 eq)을 증류수 12.4 ml 에 투입하여 완용시킨 후 반응액에 투입하여 10 ℃ 이하로 2시간 동안 교반한다.

반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물을 얻는다(64 mg, 4.5 %).

R_f = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C₂₄H₁₆N₄O₁₄S₃ 668.59, 측정치 667.0

하기에서는 상기 염료 화합물들을 이용하여 고리매개 등온증폭법을 이용한 MRAB 세균의 증폭과정을 모니터하기 위해 마그네슘 이온의 존재를 검사하기 위한 방법을 구체적인 실시예를 이용하여 설명한다. 또한, 본 발명에서 적용되는 범위는 하기의 실시예에 한정되지 않는다는 것은 자명하다.

<염료 화합물의 선별>

1) 후보물질의 합성

화합물 라이브러리를 통해 마그네슘 이온에 의해 발색되는 화합물을 스크리닝 하였으며, 선별된 화합물들을 기반으로 후보화합물 70종을 합성하였으며, 용해도 및 분광분석을 통해 후보물질을 선별하고, 선별된 화합물의 구조를 기반으로 추가로 모델링하여 추가로 최종적으로 화학식 2 내지 9의 화합물과 DKLS 등 9 종의 화합물을 얻었다.

2) 용해도 test

합성된 후보화합물의 가용성을 확인하기 위하여 물에 대한 용해도를 측정하였다. 구체적으로 대조군으로 마그네슘 이온에 의해 발색이 되는 것으로 알려진 화합물인 히드록시나프탈렌 블루(HNB), 후보화합물을 각각 10 mg을 3차 증류수1ml에 용해시킨 뒤 용해도를 확인하였다. 후보화합물 70종의 화합물 중에서 상기 9종의 화합물과 히드록시나프탈렌 블루가 물에 용해되는 것을 확인하였다. 확인결과 상기의 9종의 화합물은 물에서의 용해성이 우수한 것으로 나타났다.

<발색 특성 평가>

1) 용액의 제조

200 mM 염화마그네슘 용액은 0.9521 g 염화마그네슘을 3차 증류수 50 ㎖에 용해시켜 제조하였다.

10 mM 인산나트륨 완충제는 제1인산나트륨 59.99 ㎎과 제 2인산나트륨 70.98㎎을 각각 3차 증류수 50 ㎖에 용해시켜 용액을 제조한 다음, 제1인산나트륨 용액 28.85 ㎖과 제2인산나트륨 용액 21.15 ㎖를 혼합하여 pH 7의 인산나트륨 완충액을 제조하였다. 유사한 방법으로 상기 두 용액을 섞어 산도가 각각 pH 4, pH 7, pH 9, pH 11인 인산나트륨 완충액을 제조하였다.

발색여부 확인을 위하여, HNB 및 후보물질의 농도는 240 μM로 제조하여 실험에 이용하였다.

2) 검체의 제조

상기 용해도 test를 통해 선정된 히드록시나프탈렌 블루(HNB)와 수용해성 후보물질 9종을 증류수에 희석하여 각각 240 μM 농도로 검체를 준비하였다.

3) 마그네슘 이온 검출 특성 및 pH 안정성 평가

본 발명에 따른 후보물질이 마그네슘 이온과 반응하여 발색(변색)이 되는지 확인하였으며, 더불어 pH 변화와 무관하게 마그네슘 이온에만 반응하여 특이적으로 발색이 되는지 pH 안정성을 확인하였다.

96 well plate(12hole)를 이용하여 대조군(HNB)과 35종의 후보 물질에 대해 blank, MgCl2 용액, pH 4, pH 7, pH 9 및 pH 11 조건하에서의 발색을 확인하였다. 구체적으로 palte의 1행은 3차 증류수(blank) 100 ㎕, 2행은 MgCl2 용액, 3 내지 6행은 각각 상기 a)단계에서 제조한 10 mM 인산나트륨 완충제를 이용하여 pH가 각각 4, 7, 9 및 11인 용액 100 ㎕를 넣었으며, plate의 열에는 240 μM 농도로 준비한 검체를 6개의 행에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 총 36종의 검체에 대한 스크리닝을 하였다. 각 well에 함유된 MgCl2 용액의 최종농도는 100 mM이고, 검체의 최종농도는 120 μM이다.

각각의 검체는 3차 증류수(blank)에서 고유의 색을 나타내었으며, 200 mM MgCl2 존재하에서 발색(변색)되는 화합물을 9종을 확인하였다.

특히 화학식 3 및 4의 화합물은 마그네슘 이온 존재하에서 blank와 뚜렷히 구별이 되는 보색으로 발색되었으며, pH 변화에 대해서도 마그네슘 이온 존재하에서의 발색과 전혀 다른 색으로 발색되어 pH 안정성이 우수한 것을 확인하였다.

화학식 3의 화합물은 마그네슘 이온이 존재하지 않는 조건에서는 주황 또는 보라로 발색되나, 마그네슘 존재하에서만 짙은 청색으로 발색되고, 화학식 4의 화합물은 마그네슘 이온이 존재하지 않는 조건에서는 붉은색으로 발색되나, 마그네슘 존재하에서만 짙은 보라색으로 발색되어 뚜렷한 차이를 나타내었다. 한편, 화학식 2의 화합물은 중성~염기성 조건에서는 마그네슘 이온 존재하의 조건과 확연히 차이가 있는 발색을 보여, 대조군인 HNB와 유사한 특성을 가지는 것으로 평가되었다.

반면, 마그네슘 이온 존재하에서 발색되는 대표적인 발색제인 히드록시나프탈렌 블루(HNB)는 마그네슘 이온이 존재하지 않는 pH 7 내지 11의 산도 범위에서도 마치 마그네슘 이온이 존재할 때와 유사한 색으로 변색(발색) 되었다. 때문에, 히드록시나프탈렌 블루는 마그네슘 이온의 검출을 위해 검체를 산성, 바람직하게는 pH 4 부근으로 조절하여야 하는 불편함이 있으며 신뢰도가 떨어지는 문제점이 있는 것으로 확인되었다.

상기 실험을 통해 화학식 3 및 4의 화합물은 pH 변화에 영향을 받지 않으면서, 마그네슘 이온 존재 하에서만 특정 파장으로 발색되어 마그네슘 이온 검출에 특히 효과적인 염료화합물임을 입증하였다.

4) 온도 안정성 평가

본 발명에 따른 후보물질이 온도에 따라 발색 변화가 있는지 확인하였다. 1.5ml 용량의 튜브에 2) 단계에서 준비한 검체(HNB 및 35종의 후보 물질) 100 ㎕ 및 3차 증류수 100 ㎕를 넣었다(최종 부피 200 ㎕, 최종 검체농도 120 μM). 상온에서 잘 희석한 다음 발색 상태를 촬영하고, 80 ℃에서 12시간 동안 배양한 뒤 색변화를 관찰하였다.

실험결과 본 발명에 따른 검체는 온도에 영향을 받지 않고 색이 보존되었다.

5) 몰흡광계수 평가

HNB 및 9종의 후보물질을 3차 증류수에 용해시켜 100 ㎍/ml 스탁을 제조한 뒤, 3차 증류수로 희석하여 50, 25 및 12.5 ㎍/ml의 샘플을 제조하였다. 다음으로, 분석 장비 UV-vis 분광계(spectrometer, Agilent 8453)를 이용하여 흡수 스펙트럼을 얻은 다음, 10 mg/ml의 농도에서의 흡광계수 값을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

순번	화합물	몰흡광계수
1	HNB	13,000
2	화학식 2	12,000
3	화학식 3	44,000
4	화학식 4	31,000
5	화학식 5	33,579
6	화학식 6	18,000
7	화학식 7	25,000
8	화학식 8	5,117
9	화학식 9	23,000

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 3의 화합물은 몰 흡광계수가 44,000으로 가장 높았으며, HNB 보다 3.38배 높은 흡광계수를 가지고 있으며, 화학식 4의 화합물은 31,000으로 HNB 보다 2.38배 높은 흡광계수를 가지고 있는 것으로 확인되어 산업적으로 유용한 것으로 평가되었다.

<마그네슘 이온 민감성 평가>

1) 10 mM 미만 농도의 마그네슘 이온 민감성 평가

상기 평가를 통해 화학식 2, 3 및 4의 화합물이 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물로 특히 우수한 것으로 선정되었다. 선정된 4종 화합물과 HNB의 마그네슘 이온 검출 민감성을 평가하였다.

염화마그네슘을 3차 증류수에 용해시켜 각각 8, 10, 12, 14 및 16 mM로 희석하여 검체를 준비하였다. 다음으로, 염료 화합물은 HNB, 화학식 2는 240 μM의 농도로 준비하였으나, 화학식 3 및 4는 몰흡광계수가 대조군(HNB) 보다 2배 이상 높기 때문에 120 μM로 50% 희석하여 준비하였다.

96 well plate의 각 행에는 염료 화합물을 1 ml씩 넣었고, 각 열에는 dilution한 염화마그네슘 용액을 각각 1 ml씩 넣은 뒤, 색변화의 관찰 및 흡광도를 측정을 하였다. 96 well plate 내의 염화마그네슘의 최종농도는 0, 4, 5, 6, 7, 8 mM이며, HNB, 화학식 2의 최종농도는 120 μM이고, 화학식 3 및 4의 최종농도는 60μM이다.

화학식 3의 화합물은 4 mM의 매우 낮은 농도로 희석된 염화마그네슘 용액에 함유된 마그네슘 이온을 검출하여 보색을 나타내어 마그네슘 이온에 대한 민감도가 매우 우수하였다. 따라서 소량의 마그네슘 이온의 검출이 용이하여 산업적 이용 가능성이 매우 높다.

본 발명에 따른 화학식 3으로 표현되는 염료 화합물은 마그네슘 이온에 의해 흡수스펙트럼이 500 nm에서 640nm로 이동한 것이 관찰되었다. 뿐만 아니라, 마그네슘 이온 농도에 대해 흡광도 변화가 뚜렷하기 때문에, 흡광도 평가를 통해 측정 샘플에 함유된 마그네슘을 정량적으로 계산할 수 있다.

2) 10 mM 이상 농도의 마그네슘 이온 민감성 평가

10 mM 미만의 마그네슘 이온 농도에 대해 변색되지 않은 HNB, 화학식 2 및 4에 대한 마그네슘 이온 민감성을 평가하기 위하여 10 mM 이상의 농도에서 동일한 방법으로 추가 실험하였다. 96 well plate 내의 마그네슘 농도는 10 mM 부터 100 mM 까지 확인하였으며, 염료 화합물의 최종농도는 120μM으로 설정하였다.

HNB는 10 mM 이상의 농도에서 발색이 되기 시작하였으며, 20-30 mM에서 보라색으로, 40 mM 이상에서는 진청색으로 발색되었고, 화학식 2의 화합물은 100 mM 이상의 구간에서 보라색이 선홍색으로 눈에 띄는 발색을 나타내었으며, 화학식 4의 화합물은 10 mM 농도에서 적자색에서 자주색으로 발색이 시작되었으며, 20 mM농도 부근에서는 청보라색으로 발색되었다.

상기 실험에서와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 마그네슘 이온과 반응하여 흡수 스펙트럼이 이동하여 색변화(발색)가 있으며, 상기 화합물의 구조에 따라 마그네슘 이온의 검출 최저 농도가 다르다. 이에 본 발명에 따른 마그네슘 이온의 검출 최저 농도가 상이한 화합물들을 측정하고자 하는 샘플에 처리하고, 상기 샘플의 발색 여부 및 발색된 색상을 확인함으로써 샘플에 함유된 마그네슘의 이온의 농도의 확인을 육안으로 할 수 있다.

실시예 1 : MRAB(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii) 검출 키트 구성 화합물 선별

본 실시예에서 MRAB를 검출하기 위한 타겟 유전자로서 하기의 표2에 명시한 6가지의 프라이머를 제조하였다.

올리고 명칭	염기서열
F3	AGA ATA TGT GCC AGC CTC TAC
B3	CAG AAA TTA TCA ACC TGC TGT CC
FIP	TGT CAT GTC TTT TTC CCA AGC GG GGA TTG GAG AAC CAG AAA ACG G
BIP	CCC AGT CTA TCA GGA ACT TGC GTCA GCA TTA CCG AAA CCA ATA CG
LF	ACC TTT TCT CGC CCT TCC ATT T
LB	GAC GTA TCG GTC TTG ATC TCA TGC

1) 용해도 테스트 및 마그네슘 민감도에 따른 화합물 선별

상기의 화학식 1로 표현되는 다양한 발색염료를 증류수(D.W)에 녹여 용해도를 테스트하여 높은 용해도를 가지는 화합물을 선별하였다. 선별된 화합물을 농도별(100 uM, 50 uM, 25 uM, 12.5 uM, 6.25 uM, 3.13 uM)로 희석하여 농도별 마그네슘(마그네슘 농도 100 mM, 10 mM)과의 반응 민감도를 테스트 하였다.

위 실험결과로 D.W에 대한 용해도가 높으며, 마그네슘에 민감하게 반응하는 화합물 9종을 선별하였다. 도 1은 선별된 9종의 화합물(화학식 2 내지 9 및 DKLS)을 나타낸 것이다.

2) 고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 활용한 MRAB(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii) 검출.

화합물 9종에 관하여 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 MRAB 검출을 수행하였다. 고리매개 등온증폭법(LAMP)은 63℃에서 30분간 반응 후 80℃에서 5분간 효소 불활성화의 사이클을 가지며, 총 35분의 반응으로 이루어진다. 고리매개 등온증폭(LAMP) 후 도 2와 같이 4종의 화합물 (화학식 3, 4, 6, 8)에서는 변화가 관찰 되지 않았고, 5종의 화합물 (화학식 2, 5, 7, 9, DKLS)에서 발색의 변화가 관찰 되었다. 5종의 화합물 (화학식 2, 5, 7, 9, DKLS)은 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 MRAB 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.

화합물의 발색 변화를 확인 후 정확한 MRAB 증폭 여부를 확인하기 위해 DNA 전기영동 방법을 이용하여 MRAB의 증폭 여부를 확인한 결과 도 3과 같이 positive control에서 MRAB증폭이 이루어지고 negative control에서 MRAB 증폭이 이루어지지 않은 것을 확인하였다. 발색 변화가 없는 화합물도 MRAB 증폭은 이루어지고 발색의 변화만 없는 것을 확인하였다.

3) 고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 활용한 MRAB(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii) 검출 민감도 테스트.

고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 선별된 5종의 화합물 민감도 테스트를 수행하였다. MRAB DNA를 10배씩 희석하여 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg의 농도로 만든 후 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 이용하여 민감도 테스트를 수행하였으며, 이때 화합물 5종의 농도는 모두 동일하였다. 도 4와 같이 5종의 화합물 모두 1 pg의 DNA까지 검출이 가능하였고, 화학식 5의 화합물의 경우 100 fg까지 검출이 가능하였다.

4) 키트구성 발색 염료의 선별

실시예 1 실험의 결과를 바탕으로 최종적으로 MRAB 검출 키트 구성 화합물을 선정하였다. 화학식 5의 화합물은 100 fg의 MRAB까지 검출이 가능하지만 색 변화로 인해 육안 관찰 시 검출에 오류를 유발할 수 있는 문제를 확인하였다. 따라서 뚜렷한 색 변화로 인해 육안 검출이 용의하며, 1 pg의 MRAB를 검출할 수 있는 화학식 7의 화합물을 선별하였다.

실시예 2 : 검출 민감도 비교 검증

1) 고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 활용한 MRAB(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii) 검출 민감도 비교 검증.

본 발명의 키트 구성 MRAB primer와 논문(Hye jin kim et al. 2016. Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii Harboring blaVIM-2, blaIMP-1 and blaOXA-23 Genes by Using Loop-Mediated Lsothermal Amplification Methods. Clinical Microbiology. 36:15-22.)으로 보고된 primer의 비교를 통해 키트 구성 primer의 우수성을 검증하였다. 선별된 화학식 7의 화합물을 이용하였으며 MRAB DNA를 10배씩 희석하여 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg의 농도로 만들고, 고리매개 등온증폭(LAMP) 반응을 통하여 비교검증을 하였다. 도 5와 같이 키트 구성 MRAB primer는 1 pg의 MRAB DNA 검출이 가능하였다. 반면, 논문으로 보고 된 두 종류의 MRAB primer의 경우 1번 primer와 2번 primer 모두 1 ng의 MRAB DNA까지 검출되었다.

또한 종래의 기술인 PCR 방법과의 비교 검증을 수행하였다. 논문(Neil Woodford et al. 2006. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. Int J Antimicrob Agents. 27(4):351-3)에 명시된 primer 및 PCR 방법과의 비교를 통해 본 발명의 우수성을 검증하였다. MRAB DNA를 10배씩 희석하여 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg의 농도로 만들어 PCR 방법과 고리매개 등온증폭법(LAMP)에 동일한 양을 첨가하여 반응시켰다.

상기 실험결과 본 발명을 이용하여 MRAB를 검출하는 방법은 총 소요시간이 약 35분이었고 1pg 까지의 MRAB를 검출하는 것이 가능한 반면에, 종래의 기술인 PCR 방법을 이용했을 때는 총 소요시간은 약 2시간이 소요되었고 10 pg까지의 MRAB를 검출하는 것으로 나타나, 본 발명의 키트가 종래의 기술보다 더 효율적으로 MRAB의 감염을 확인할 수 있다는 것이 확인되었고, 이를 도 6에 나타내었다.

Claims

마그네슘 이온의 농도 변화를 통하여 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB)의 감염을 진단할 수 있는 키트에 있어서, 상기 키트는 하기의 화학식 1로 표현되는 염료 화합물을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트
[화학식 1]

상기 화학식 1에서
R₁은 히드록시기이며, 상기 R₂는 수소 또는 아미노이고, 상기 R₂가 히드록시면 상기 R₁은 아미노이며; R₃은 수소이고;
R₄는 수소 또는 -NHRa 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, 탄소 1개 내지 6개의 알킬 및 페닐 중에서 선택되며;
R₅ 및 R₆ 중 어느 하나는 설폰산기이고 다른 하나는 수소이고;
Ar은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 페닐 또는 나프틸의 임의의 수소 2 내지 3개는 히드록시, 니트로, 설폰산기, 할로겐 중에서 선택되는 치환기로 치환되고, 상기 임의의 수소 2 내지 3개에 치환된 치환기의 하나는 2번 탄소위치에 치환된 히드록시이며; 상기 설폰산기는 설폰산(-SO₃H) 또는 설폰산나트륨염(-SO₃Na)이다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 염료 화합물은 하기의 화학식 1a로 표현되는 것을 특징으로 하는 키트
[화학식 1a]

상기 [화학식 1a]에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 상기 [화학식 1]에서 제시한 바와 같으며, R₇ 및 R₈은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 니트로, 히드록시, 할로겐 및 설폰산기 중에서 선택될 수 있다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 염료 화합물은 하기의 화학식 2 내지 4, 7 및 9로 표현되는 화합물 중에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 키트
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 7]

[화학식 9]
제1항 내지 제3항 중 선택된 어느 한 항에 있어서 상기 다제내성 아시네토박터 바우마니균은 고리매개 등온증폭법(LAMP)에 의하여 증폭이 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트
하기의 화학식 2 내지 4, 7 내지 9로 표현되는 화합물 중 하나 이상을 이용하여 고리매개 등온증폭법(LAMP)을 통해 다제내성 아시네토박터 바우마니균(MRAB)의 감염을 검출하기 위한 방법에 있어서, 상기 검출방법은 화학식 2 내지 4, 7 내지 9로 표현되는 각각의 화합물이 LAMP 반응액 내의 마그네슘과 복합체를 형성하고, 고리매개 등온증폭(LAMP) 반응 과정에서 발생하는 마그네슘 농도 변화에 의하여 상기 화학식 2 내지 4, 7 내지 9로 표현되는 염료 화합물의 발색 파장이 서로 상이하게 변화하는 것을 특징으로 하는 육안으로 마그네슘 이온의 농도 변화를 통해 MRAB를 검출하는 방법
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]