KR101926696B1 - 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마그네슘 2가 이온(Mg2+)를 육안으로 검출 및 정량화할 수 있는 염료 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 마그네슘 2가 이온(Mg2+)를 검출 및 정량화할 수 있는 염료화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 바이오 진단 분야에서는 고가의 장비 없이 현장검사를 신속하게 실시 할 수 있는 진단 체계인 현장현시검사(Point of care Test, POCT) 시장이 빠르게 성장하고 있으며 기존 유전자 검사와 분자진단 키트들이 이러한 시장경쟁력을 갖추고자 새로운 플랫폼에 적용된 컨텐츠가 많이 개발되고 있다.
현재 주로 사용되는 진단 방식의 경우는, 세균 배양 동정법, PCR 및 염기서열 분석법 그리고 세균을 직접 측정하는 POCT가 있지만 검출에 따라 진단 Lab 중심으로 고도의 장비와 많은 인력이 요구된다. 세균을 직접 측정하는 POCT법의 경우, 고비용적 측면과 검사 결과의 민감도 및 정확도를 신뢰할 수 있는 수준에 도달하지 못한 문제가 있으며, 최근에는 이러한 단점을 보완하고자 고리매개 등온증폭법(loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)을 활용한 병원균 검출에 적합한 기술이 제안되었다. 등온증폭을 통한 진단방법의 경우, 매우 적은 소량의 DNA도 짧은 시간 내 일반 PCR 보다 합성 효율이 뛰어나 DNA를 직접 검출하거나, DNA 증폭 후 부산물들을 검출하여 진단 Kit로 활용할 수 있는 장점이 있다.
한편, DNA 증폭 후 부산물 중 하나인 마그네슘 이온(Mg2 +)은 생체 내 효소 반응 또는 DNA 합성을 위한 중요 인자로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 기능적 측면을 활용한 Cell imaging 및 여러 분자 반응을 확인할 수 있는 다양한 기술들이 연구되고 있다.
DNA 증폭 후 부산물 중 하나이기도 한 마그네슘 이온(Mg2 +)은 세포 내에 가장 풍부한 양으로 존재하는 2가 금속 이온으로서, 수 백여 가지의 효소 활성 조절에 관여할 뿐만 아니라, DNA 합성을 위한 중요 인자로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 세포 증식 및 사멸과 같은 많은 세포 과정에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 이러한 세포 내 마그네슘 이온을 검출하기 위해서, 다양한 세포-투과성 형광 체와 일광자 또는 이광자 형광 탐침을 구비한 공초점 현미경을 이용하여 검출하는 방법이 제한되었다. 상기와 같은 방법들은 고가의 장비를 이용하여서만 검출이 가능하다는 문제점이 있다. 이에, 진단 Kit 뿐만 아니라 Magnesium과 관련된 세포 실험 외 기타 연구에 용이하게 활용될 수 있도록 육안으로 관측이 가능한 고감도 Magnesium ion indicator의 개발이 요구되고 있다.
비특허문헌 1. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 16353-16360
비특허문헌 2. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 344-350
비특허문헌 3. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 1369-1377
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 마그네슘 이온의 존재를 육안으로 확인할 수 있는 마그네슘 이온 검출용 염료화합물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 마그네슘 이온 검출용 염료화합물을 이용한 마그네슘 이온 정량화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 마그네슘 이온 검출용 염료화합물을 이용하여 DNA 증폭 확인용 진단키트를 제공하는 것이다.
상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서
R1 및 R2는 수소, 히드록시 및 아미노(-NH2) 중에서 선택되고, R1 또는 R2는 히드록시이며, 상기 R1이 히드록시면, 상기 R2는 수소 또는 아미노이고, 상기 R2가 히드록시면 상기 R1은 아미노이며;
R3은 수소이고;
R4는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, C1 - 6알킬 및 페닐 중에서 선택되며;
R5 및 R6는 수소 또는 설폰산기이고, R5 및 R6 중 어느 하나가 설폰산기이면, 다른 하나는 수소이고;
Ar은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 페닐 또는 나프틸의 임의의 수소 1 내지 3개는 히드록시, 니트로, 설폰산기, 할로겐 중에서 선택되는 치환기로 치환되고, 상기 페닐 또는 나프틸의 치환기 중 적어도 하나는 히드록시기이며, 상기 적어도 하나의 히드록시기는 2번 탄소 위치에 치환되고;
상기 설폰산기는 설폰산(-SO3H) 또는 설폰산나트륨염(-SO3Na)이다.
본 발명에 따른 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물에 있어서, 마그네슘 이온과 반응하여 발색을 나타내기 위해서는 상기 [화학식 1]의 나프틸기에 1개의 히드록시기를 포함하여야 하며, 바람직하게는 R1 및 R2 중에서 어느 하나가 히드록시기여야 한다. 상기 R1 또는 R2가 히드록시기인 것은 마그네슘 이온과 반응하여 본래의 색과 구별되는 색으로 발색하는데 주요한 작용을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 R3이 H인 것은 본 발명에 따른 염료 화합물의 용해성을 향상시키므로 중요하다. 상기 R3가 아민과 같은 치환기로 치환되는 경우에는 수용해도가 매우 좋지 않으며, 마그네슘 이온과의 반응이 용이하지 않다.
본 발명에 있어서, R4는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되며, 바람직하게는 -NHRa 또는 설폰산기일 수 있고, 보다 바람직하게는 -NHRa일 수 있다. 상기 R4가 -NHRa 또는 설폰산기인 것이 보색으로 발색되는데 효과적이다. 여기서, 상기 Ra는 수소, C1 - 6알킬 및 페닐 중에서 선택될 수 있는데, 바람직하게는 수소 또는 페닐이다.
본 발명에 있어서, R5 및 R6 중에서 어느 하나는 설폰산기이며, 다른 하나는 수소일 수 있으며, 바람직하게는 R5가 설폰산기이고, R6이 수소인 것이 마그네슘 이온과 반응하여 보색으로 발색되는데 효과적이다.
본 발명에 있어서, 상기 [화학식 1]의 모핵에서 Ar은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 페닐 또는 나프틸은 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다. 여기서 상기 Ar(페닐 또는 나프틸)의 2번 탄소에는 히드록시기가 치환되는 것이 바람직하며, 보다 바람직한 상기 [화학식 1]은 하기 [화학식 1a] 또는 [화학식 1b]일 수 있다.
[화학식 1a]
[화학식 1b]
상기 [화학식 1a] 또는 [화학식 1b]에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 상기 [화학식 1]에서 제시한 바와 같으며,
R7 및 R8은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 니트로, 히드록시, 할로겐 및 설폰산기 중에서 선택되며;
R9은 수소 또는 설폰산기이고;
상기 설폰산기는 설폰산(-SO3H) 또는 설폰산나트륨염(-SO3Na)일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 R7 및 R8는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 상기 R7 및 R8 중에서 적어도 하나 이상은 니트로, 히드록시, 설폰산기 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 R7 및 R8 중에서 적어도 하나 이상이 니트로인 것이 마그네슘 이온과 반응하여 뚜렷하게 구분이 가능한 색 또는 보색으로 발색될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 마그네슘 이온과 반응하여 마그네슘 이온과 반응하기 전과 상이한 파장으로 이동하며, 이동된 파장의 위치 및 강도에 따라 발색되는 색의 차이가 있다. 또한, 화합물의 치환기에 따라 이동되는 파장의 차이가 있으므로 상이한 발색을 나타낸다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 마그네슘 이온 부재하에서 pH에 변화에 의해 미발색되거나 또는 마그네슘 이온에 의한 발색과는 상이한 색으로 발색되기 때문에 pH의 변화에 영향을 받지 않으므로 pH 조절을 필요로 하지 않아 이용이 용이하며, pH 조절을 할 수 없는 시료에 적용하여 시료에 함유된 마그네슘 이온을 검출할 수 있으며, 육안 관측인 비색법이나 흡광광도법을 이용하여 검출이 가능하므로 산업상 적용이 유리하다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 구체적으로 예를 들면, [화학식 2] 내지 [화학식 26]로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 12]
[화학식 13]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 22]
[화학식 23]
[화학식 24]
[화학식 25]
[화학식 26]
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 1 mM 내지 200 mM의 마그네슘 이온 존재하에서 발색될 수 있으며, 치환기의 차이에 따라 검출 가능한 마그네슘 이온 임계 농도의 차이 및 발색되는 색의 차이가 있다. 예를 들어, 상기 [화학식 4]의 화합물은 3 mM 이하 농도의 마그네슘 이온 존재하에서도 발색이 가능하나, 다른 화합물들은 8 mM 미만 농도의 마그네슘 이온에서는 발색되지 않는다. 상기 화합물의 치환기에 따라 발색되는 색상 및 검출 가능 임계 농도가 다르기 때문에 상기 임계 농도가 서로 상이한 염료 화합물 다수개를 이용하면 검출하고자 하는 시료 안에 함유된 마그네슘 이온의 양을 육안으로 정량화할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 [화학식 1]의 염료 화합물을 포함하는 마그네슘 이온 검출 키트를 제공한다.
상기 검출 키트는 마그네슘 이온의 존재 유무만 확인하기 위해서는 1종의 염료 화합물만 포함되어도 충분히 검출 가능하다. 한편, 서로 상이한 마그네슘 이온 검출가능 임계농도를 가지는 염료 화합물을 다수개 포함하는 키트를 이용하면 검출하고자 하는 시료에 함유된 마그네슘 이온을 정량화할 수 있다.
본 발명은 상기 [화학식 2] 내지 [화학식 26]의 화합물 중에서 선택되는 2 내지 25종의 염료 화합물에 검출시료를 투여하여 반응시키는 단계; 및 색변화를 확인하는 단계;를 포함하는 육안으로 마그네슘 이온을 정량화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 염료 화합물을 포함하는 PCR(polymerase chain reaction)의 DNA 증폭 육안 검사용 진단 키트를 제공한다. 종래에는 DNA 증폭여부를 육안으로 확인하는 것이 가능하지 않았으며, DNA 증폭량을 육안으로 정량화하는 것은 더욱 가능하지 않았다. 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물을 증폭시킨 DNA 샘플과 반응시킴으로써 발색 유무를 통해 DNA 증폭여부를 확인할 수 있다. 상기 DNA 증폭은 흡광광도법으로 분석도 가능하나, 본 발명에 따른 서로 상이한 마그네슘 이온 검출가능 임계농도를 가지는 염료 화합물을 다수개로 처리하면 검출기계를 이용하지 않아도 육안으로 증폭된 DNA의 정량화가 가능하다.
본 발명에 따른 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물은 온도 및 pH 변화에 안정적이면서, 마그네슘 이온의 존재하에서만 발색(변색)되므로 육안으로 마그네슘 이온을 손쉽게 검출 및 정량화할 수 있다. 본 발명에 따른 염료 화합물은 DNA 증폭(PCR 반응) 과정에서 발생하는 마그네슘 이온과 반응하여 발색되므로, DNA의 증폭 여부를 확인을 위한 육안 검출용 진단 시약으로 적용이 가능하며, 흡광광도법을 이용하여 DNA 증폭량을 정량화할 수 있다. 뿐만 아니라 검출 시료를 마그네슘 이온과의 반응에서 발색 임계 농도가 서로 상이한 염료화합물들과 반응시켜 발색여부를 확인함으로써 육안으로 마그네슘 이온의 함량을 정량화할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 디자인된 마그네슘 검출용 후보 화합물의 마그네슘 검출 특성 및 pH 안정성 테스트 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 디자인된 마그네슘 검출용 후보 화합물의 온도 안정성 테스트 결과이다.
도 3 및 4는 본 발명에 따라 선별된 마그네슘 검출용 염료 화합물의 발색 임계 농도 테스트 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 선별된 마그네슘 검출용 염료 화합물의 마그네슘 농도에 따른 흡수 스펙트럼 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 디자인된 마그네슘 검출용 후보 화합물의 온도 안정성 테스트 결과이다.
도 3 및 4는 본 발명에 따라 선별된 마그네슘 검출용 염료 화합물의 발색 임계 농도 테스트 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 선별된 마그네슘 검출용 염료 화합물의 마그네슘 농도에 따른 흡수 스펙트럼 결과이다.
종래의 마그네슘 이온 검출에 이용되는 염료는 특정 pH 조건에서만 마그네슘에의해 발색(변색)이 되고, 온도나 pH 조건이 변하면 마그네슘 이온이 존재하지 않은 조건하에서도 마그네슘이 있을 때와 동일한 색으로 발색이 되는 문제가 있어 신뢰도가 떨어지고, 검출시마다 pH를 조절해야하는 불편함이 있는 등 여러 문제점이 있었다. 이에, 본 발명의 발명자들은 온도 및 pH 변화에 안정적이면서, 마그네슘 이온의 존재를 육안으로 확인할 수 있는 염료화합물 및 서로 다른 마그네슘 이온 농도 범위에서 발색되는 염료 화합물들을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.
합성예 1. 화합물 1-1의 제조
6-아미노-4-히드록시나프탈렌-2-설폰산(6-amino-4-hydroxynaphthalene-2-sulfonic acid) (6 g, 25.1 mmol, 1 eq)을 증류수 90 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 7.5 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 1.9 g을 투입한 후, 5 ℃이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.19 g 을 투입하여, 3분 동안 교반한다.
β-나프톨(β-naphthol) (3.8 g, 26.4 mmol, 1.5 eq)을 증류수 56.8 ml에 투입한 뒤 pH 10으로 조정하고 80 ℃로 가열하며 완용시킨 후 상온 냉각한다. 냉각된 용액을 반응액에 투입한 후, pH 10 및 15℃ 이하의 온도에서 4시간 동안 교반한다.
반응 종료 후, 반응액을 여과하고, 염산 용액을 투입하여 pH 2.5로 조정한 다음, 정제염을 반응액 부피의 10%로 하여 입자를 석출한 후 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물 1-1을 얻는다(40 mg, 0.4 %).
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H14N2O5S 394.4, 측정치 393.0
합성예 2. 화합물 1-2의 제조
2-아미노-4-니트로페놀(2-amino-4-nitrophenol) (0.385 g, 2.50 mmol, 1 eq) 을 증류수 5.8 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.
4-히드록시나프탈렌-1-설폰산(4-hydroxynaphthalene-1-sulfonic acid) (0.58 g, 2.59 mmol, 1.04 eq)을 증류수 9 ml에 투입한 다음 pH 10으로 조정하고, 완용시킨 후 반응액에 투입하여 pH 10 및 10 ℃이하로 2시간 동안 교반한다.
반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물 1-2 을 얻는다(128 mg. 13.2 %).
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C16H11N3O7S 389.34, 측정치 388.11
합성예 3. 화합물 1-3의 제조
2-아미노-5-니트로페놀(2-amino-5-nitrophenol) (0.385 g, 2.50 mmol, 1 eq)을 증류수 5.8 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.
7-아미노-4-하이드록시나프탈렌-2-설폰산(7-amino-4-hydroxynaphthaloene-2-sulfonic acid) (0.628 g, 2.62 mmol, 1.05 eq)을 증류수 9.4 ml에 투입하여 완용시킨 후 반응액에 투입하여 10 ℃ 이하로 2시간 동안 교반한다.
반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물 1-3 을 얻는다(13 mg, 1.3 %).
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O7S 404.35, 측정치 403.0
합성예 4. 화합물 1-4의 제조
2-아미노-4,6-디니트로페놀(2-amino-4,6-dinitrophenol) (0.498 g, 2.50 mmol, 1 eq)을 증류수 7.4 ml에 분산시킨다. 염산(35%) 0.75 g을 투입한 후, 얼음을 투입하여 0 ℃로 온도를 낮춘다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 0.19 g을 투입한 후, 5 ℃ 이하로 1시간 동안 교반한 후, 술팜산(Sulfamic acid) 0.019 g을 투입하여, 3분 동안 교반한다.
4-하이드록시-7-(페닐아미노)나프탈렌-2-설폰산(4-hydroxy-7-(phenylamino) naphthalene-2-sulfonic acid (0.817 g, 2.62 mmol, 1.05 eq)을 증류수 12.4 ml 에 투입하여 완용시킨 후 반응액에 투입하여 10 ℃ 이하로 2시간 동안 교반한다.
반응액을 여과하여 얻어진 물질을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여, 순수한 화합물 1-4을 얻는다(45 mg, 3.4 %).
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H15N5O9S 525.45, 측정치 523.9
합성예 5 내지 75: 화합물 1-5 내지 화합물 1-75의 제조
상기 합성예 1 내지 4와 유사한 방법으로 합성예 5-75를 합성하였다.
합성예 5 : 화합물 1-5
(283 mg, 1.8 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N3O4 309.28, 측정치 308.1
합성예 6 : 화합물 1-6의 제조
(80 mg, 0.8 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O6S 388.35, 측정치 387.3
합성예 7 : 화합물 1-7의 제조
(30 mg, 0.3 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N3O7S 389.34, 측정치 388.0
합성예 8 : 화합물 1-8의 제조
(70 mg, 0.7 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H15N5O7S 421.38, 측정치 419.0
합성예 9 : 화합물 1-9의 제조
(150 mg, 1.6 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N3O7S 389.34, 측정치 388.1
합성예 10 : 화합물 1-10의 제조
(20 mg, 0.2 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11ClN2O5S 378.79, 측정치 377.1
합성예 11 : 화합물 1-11의 제조
(100 mg, 0.9 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13ClN4O8S 456.81, 측정치 455.0
합성예 12 : 화합물 1-12의 제조
(20 mg, 0.2 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O6S 388.35, 측정치 386.9
합성예 13 : 화합물 1-13의 제조
(175 mg, 1.6 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H18N4O5S 426.45, 측정치 423.0
합성예 14 : 화합물 1-14의 제조
(109 mg, 1.0 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C16H15N5O7S 421.38, 측정치 419.06
합성예 15 : 화합물 1-15의 제조
(5 mg, 0.7 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H9N3O5 275.22, 측정치 274.0
합성예 16 : 화합물 1-16의 제조
(160 mg, 17.0 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13ClN4O5 376.75, 측정치 375.0
합성예 17 : 화합물 1-17의 제조
(40 mg, 4.7 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H15N5O4 341.32, 측정치 338.0
합성예 18 : 화합물 1-18의 제조
(80 mg, 7.9 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O7S 404.35, 측정치 403.0
합성예 19 : 화합물 1-19의 제조
(40 mg, 4.0 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O7S 404.35, 측정치 403.0
합성예 20 : 화합물 1-20의 제조
(70 mg, 5.8 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H16N4O7S 480.45, 측정치 479.0
합성예 21 : 화합물 1-21의 제조
(30 mg, 3.9 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N3O4 309.28, 측정치 308.9
합성예 22 : 화합물 1-22의 제조
(50 mg, 5.3 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13ClN4O5 376.75, 측정치 375.0
합성예 23 : 화합물 1-23의 제조
(21 mg, 2.1 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13ClN4O5 404.35, 측정치 403.0
합성예 24 : 화합물 1-24의 제조
(67 mg, 0.6 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H18N4O5S 426.45, 측정치 425.5
합성예 25 : 화합물 1-25의 제조
(16 mg, 1.3 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H16N4O7S 480.45, 측정치 479.0
합성예 26 : 화합물 1-26의 제조
(25 mg, 2.9 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H15N5O4 341.32, 측정치 340.0
합성예 27 : 화합물 1-27의 제조
(30 mg, 4.4 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H9N3O5 275.22, 측정치 274.0
합성예 28 : 화합물 1-28의 제조
(60 mg, 6.7 %)
Rf = 0.8 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N2O6S 360.34, 측정치 360.9
합성예 29 : 화합물 1-29의 제조
(4 mg, 0.3 %)
Rf = 0.8 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H15N3O7S2 473.48, 측정치 471.6
합성예 30 : 화합물 1-30의 제조
(100 mg, 8.7 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H16ClN3O7S 461.88, 측정치 460.2
합성예 31 : 화합물 1-31의 제조
(45 mg, 3.7 %)
Rf = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H15N3O8S2 489.48, 측정치 494.9
합성예 32 : 화합물 1-32의 제조
(13 mg, 1.1 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H14N2O8S2 474.46, 측정치 472.8
합성예 33 : 화합물 1-33의 제조
(2 mg, 0.2 %)
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C26H19N3O8S2 565.57, 측정치
합성예 34 : 화합물 1-34의 제조
(40 mg, 5.4 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11ClN2O2 298.72, 측정치 297.0
합성예 35 : 화합물 1-35의 제조
(14 mg, 1.5 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12ClN3O4S 377.8, 측정치 375.9
합성예 36 : 화합물 1-36의 제조
(25 mg, 2.7 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13Cl2N3O3 366.2, 측정치
합성예 37 : 화합물 1-37의 제조
(25 mg, 1.3 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12ClN3NaO5S 415.78, 측정치 413.1
합성예 38 : 화합물 1-38의 제조
(10 mg, 0.9 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H16ClN3O5S 469.9, 측정치 470.2
합성예 39 : 화합물 1-39의 제조
(40 mg, 4.8 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H15ClN4O2 330.77, 측정치 327.0
합성예 40 : 화합물 1-40의 제조
(13 mg, 2.0 %)
Rf = 0.1 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H9ClN2O3 264.66, 측정치 265.1
합성예 41 : 화합물 1-41의 제조
(60 mg, 6.1 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11ClN3NaO5S 415.78, 측정치 412.3
합성예 42 : 화합물 1-42의 제조
(3 mg, 0.3 %)
Rf = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O9S2 468.42, 측정치 467.0
합성예 43 : 화합물 1-43의 제조
(200 mg, 22.5 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H9N3O8S 355.28, 측정치 350.9
합성예 44 : 화합물 1-44의 제조
(10 mg, 0.9 %)
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N3O10S2 469.4, 측정치
합성예 45 : 화합물 1-45의 제조
(40 mg, 2.9 %)
Rf = 0.8 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H16N4O10S2 560.51., 측정치 561.1
합성예 46 : 화합물 1-46의 제조
(55 mg, 4.5 %)
Rf = 0.9 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O10S2 484.42., 측정치 482.9
합성예 47 : 화합물 1-47의 제조
(50 mg, 4.2 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N4NaO10S2 506.4., 측정치 505.7
합성예 48 : 화합물 1-48의 제조
(30 mg, 2.7 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C16H11N5O9S 449.35, 측정치 449.08
합성예 49 : 화합물 1-49의 제조
(35 mg, 4.0 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H10N4O6 354.27, 측정치 352.9
합성예 50 : 화합물 1-50의 제조
(28 mg, 2.9 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H14N6O6 386.32, 측정치 385.0
합성예 51 : 화합물 1-51의 제조
(4 mg, 2.9 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H14N6O6 433.35, 측정치
합성예 52 : 화합물 1-52의 제조
(30 mg, 2.8 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12ClN5O7 421.75, 측정치 421.8
합성예 53 : 화합물 1-53의 제조
(45 mg, 5.6 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H8N4O7 320.21, 측정치 318.9
합성예 54 : 화합물 1-54의 제조
(35 mg, 3.2 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H10N4O9S 434.34, 측정치 432.9
합성예 55 : 화합물 1-55의 제조
(60 mg, 5.3 %)
Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N5O9S 449.35, 측정치 449.9
합성예 56 : 화합물 1-56의 제조
(13 mg, 1.1 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H15N3O7S2 473.48, 측정치
합성예 57 : 화합물 1-57의 제조
(5 mg, 0.4 %)
Rf = 0.9 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H16ClN3O6S 461.88, 측정치 461.8
합성예 58 : 화합물 1-58의 제조
(11 mg, 1.2 %)
Rf = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N2O6S 360.34, 측정치 359.0
합성예 59 : 화합물 1-59의 제조
(35 mg, 3.0 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H14N2O8S2 474.46, 측정치
합성예 60 : 화합물 1-60의 제조
(40 mg, 2.8 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C26H19N3O8S2 565.57, 측정치
합성예 61 : 화합물 1-61의 제조
(3 mg, 0.3 %)
Rf = 0.9 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H15N3O8S2 489.48, 측정치 487.9
합성예 62 : 화합물 1-62의 제조
(8 mg, 0.8 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H13N2NaO5S 416.38, 측정치 413.2
합성예 63 : 화합물 1-63의 제조
(70 mg, 6.0 %)
Rf = 0.9 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O9S2 468.42, 측정치 461.0
합성예 64 : 화합물 1-64의 제조
(144 mg, 12.7 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H13ClN4O8S 456.81, 측정치 455.0
합성예 65 : 화합물 1-65의 제조
(25 mg, 2.8 %)
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C12H9N3O8S 355.28, 측정치 357.2
합성예 66 : 화합물 1-66의 제조
(110 mg, 9.4 %)
Rf = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H10N3NaO10S2 491.38, 측정치 489.8
합성예 67 : 화합물 1-67의 제조
(30 mg, 2.1 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C22H16N4O10S2 560.51, 측정치 566.4
합성예 68 : 화합물 1-68의 제조
(38 mg, 3.1 %)
Rf = 0.8 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H12N4O10S2 484.42, 측정치 482.9
합성예 69 : 화합물 1-69의 제조
(28 mg, 2.3 %)
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C16H12N4O10S2 484.42, 측정치 487.0
합성예 70 : 화합물 1-70의 제조
(78 mg, 8.0 %)
Rf = 0.7 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C16H11N3O7S2 389.34, 측정치 389.2
합성예 71 : 화합물 1-71의 제조
(4g, 32.3 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11ClN3NaO8S2 495.85, 측정치
합성예 72 : 화합물 1-72의 제조
(4.3g, 29.3 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N4NaO13S3 586.46, 측정치
합성예 73 : 화합물 1-73의 제조
(3.5g, 28.64 %)
Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C20H15N3O8S2 489.03, 측정치
합성예 74 : 화합물 1-74의 제조
(4.3g, 29.3 %)
Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N4NaO13S3 586.46, 측정치
합성예 75 : 화합물 1-75의 제조
(2.8g, 19.1 %)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
LC/MS, 계산치 C16H11N4NaO13S3 586.46, 측정치
시험예 1. 염료 화합물의 선별
1) 후보물질 합성
화합물 라이브러리를 통해 마그네슘 이온에 의해 발색되는 화합물을 스크리닝 하였으며, 선별된 화합물들을 기반으로 후보화합물 70종을 합성하였으며, 용해도 및 분광분석을 통해 후보물질을 선별하고, 선별된 화합물의 구조를 기반으로 추가로 모델링하여 추가로 최종적으로 19종의 화합물을 얻었다.
2) 용해도 test
합성된 후보화합물의 가용성을 확인하기 위하여 물에 대한 용해도를 측정하였다. 구체적으로 대조군으로 마그네슘 이온에 의해 발색이 되는 것으로 알려진 화합물인 히드록시나프탈렌 블루(HNB), 후보화합물 70종을 각각 10 mg을 3차 증류수 1ml에 용해시킨 뒤 용해도를 확인하였다. 후보화합물 70종 중에서 35종이 화합물과 히드록시나프탈렌 블루가 물에 용해되는 것을 확인하였다.
물에서의 용해성이 우수한 것으로 확인된 후보물질은 35종은 화합물 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, 1-10, 1-12, 1-14, 1-18, 1-20, 1-23, 1-24, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-37, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46, 1-47, 1-54, 1-56, 1-58, 1-59, 1-61, 1-63, 1-64, 1-66, 1-67, 1-68, 1-70이었다. 나머지 35종의 화합물은 소량의 유기용매에 용해시킨 후 시료를 제조하여 실험에 사용하였다.
시험예 2. 발색 특성 평가
1) 용액의 제조
200 mM 염화마그네슘 용액은 0.9521 g 염화마그네슘을 3차 증류수 50 ㎖에 용해시켜 제조하였다.
10 mM 인산나트륨 완충제는 제1인산나트륨 59.99 ㎎과 제 2인산나트륨 70.98 ㎎을 각각 3차 증류수 50 ㎖에 용해시켜 용액을 제조한 다음, 제1인산나트륨 용액 28.85 ㎖과 제2인산나트륨 용액 21.15 ㎖를 혼합하여 pH 7의 인산나트륨 완충액을 제조하였다. 유사한 방법으로 상기 두 용액을 섞어 산도가 각각 pH 4, pH 7, pH 9, pH 11인 인산나트륨 완충액을 제조하였다.
발색여부 확인을 위하여, HNB 및 후보물질의 농도는 240 μM로 제조하여 실험에 이용하였다.
2) 시료의 제조
상기 용해도 test를 통해 선정된 히드록시나프탈렌 블루(HNB)와 수용해성 후보물질 35종을 증류수에 희석하여 각각 240 μM 농도로 시료를 준비하였다.
3) 마그네슘 이온 검출 특성 및
pH
안정성 평가
본 발명에 따른 후보물질이 마그네슘 이온과 반응하여 발색(변색)이 되는지 확인하였으며, 더불어 pH 변화와 무관하게 마그네슘 이온에만 반응하여 특이적으로 발색이 되는지 pH 안정성을 확인하였다.
96 well plate(12×6 hole)를 이용하여 대조군(HNB)과 35종의 후보 물질에 대해 blank, MgCl2 용액, pH 4, pH 7, pH 9 및 pH 11 조건하에서의 발색을 확인하였다. 구체적으로 palte의 1행은 3차 증류수(blank) 100 ㎕, 2행은 MgCl2 용액, 3 내지 6행은 각각 상기 a)단계에서 제조한 10 mM 인산나트륨 완충제를 이용하여 pH가 각각 4, 7, 9 및 11인 용액 100 ㎕를 넣었으며, plate의 열에는 240 μM 농도로 준비한 시료를 6개의 행에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 총 36종의 시료에 대한 스크리닝을 하였으며, 이를 하기 도 1에 나타내었다. 각 well에 함유된 MgCl2 용액의 최종농도는 100 mM이고, 시료의 최종농도는 120 μM이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 시료는 3차 증류수(blank)에서 고유의 색을 나타내었으며, 200 mM MgCl2 존재하에서 발색(변색)되는 화합물을 15종(1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-10, 1-18, 1-20, 1-37, 1-44, 1-45, 1-46, 1-54, 1-66, 1-67, 1-68)을 확인하였다.
특히, 1-1, 1-3 및 1-4 화합물은 마그네슘 이온 존재하에서 blank와 뚜렷히 구별이 되는 보색으로 발색되었으며, pH 변화에 대해서도 마그네슘 이온 존재하에서의 발색과 전혀 다른색으로 발색되어 pH 안정성이 우수한 것을 확인하였다.
1-1의 화합물은 마그네슘 이온이 존재하지 않는 조건에서는 주황색 또는 보라색으로 발색되나, 마그네슘 이온 존재하에서만 옅은 노란색으로 발색되며, 1-3 화합물은 마그네슘 이온이 존재하지 않는 조건에서는 주황 또는 보라로 발색되나, 마그네슘 존재하에서만 짙은 청색으로 발색되고, 1-4 화합물은 마그네슘 이온이 존재하지 않는 조건에서는 붉은색으로 발색되나, 마그네슘 존재하에서만 짙은 보라색으로 발색되어 뚜렷한 차이를 나타내었다. 한편, 1-2 화합물은 중성~염기성 조건에서는 마그네슘 이온 존재하의 조건과 확연히 차이가 있는 발색을 보여, 대조군인 HNB와 유사한 특성을 가지는 것으로 평가되었다. 1-46은 동일한 실험조건에서는 유사한 색으로 발색되었으나, 시료의 농도를 묽게하여 재실험한 결과 마그네슘 이온 존재하에서 발색되는 것을 확인하였다.
반면, 마그네슘 이온 존재하에서 발색되는 대표적인 발색제인 히드록시나프탈렌 블루(HNB)는 마그네슘 이온이 존재하지 않는 pH 7 내지 11의 산도 범위에서도 마치 마그네슘 이온이 존재할 때와 유사한 색으로 변색(발색) 되었다. 때문에, 히드록시나프탈렌 블루는 마그네슘 이온의 검출을 위해 시료를 산성, 바람직하게는 pH 4 부근으로 조절하여야 하는 불편함이 있으며 신뢰도가 떨어지는 문제점이 있는 것으로 확인되었다.
한편 물에 용해되지 않은 화합물 35종을 소량의 DMSO에 용해시킨 뒤, 증류수를 첨가하여 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 1-5, 1-7, 1-25, 1-38, 1-55에서 유의미한 결과를 얻었다.
상기 실험을 통해 1-1, 1-3 및 1-4 화합물은 pH 변화에 영향을 받지 않으면서, 마그네슘 이온 존재 하에서만 특정 파장으로 발색되어 마그네슘 이온 검출에 특히 효과적인 염료화합물임을 입증하였다.
4) 온도 안정성 평가
본 발명에 따른 후보물질이 온도에 따라 발색 변화가 있는지 확인하였다. 1.5ml 용량의 튜브에 2) 단계에서 준비한 시료(HNB 및 35종의 후보 물질) 100 ㎕ 및 3차 증류수 100 ㎕를 넣었다(최종 부피 200 ㎕, 최종 시료농도 120 μM). 상온에서 잘 희석한 다음 발색 상태를 촬영하고, 80 ℃에서 12시간 동안 배양한 뒤 색변화를 관찰하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 시료는 온도에 영향을 받지 않고 색이 보존되었다.
5) 몰흡광계수 평가
HNB 및 35종의 후보물질을 3차 증류수에 용해시켜 100 ㎍/ml 스탁을 제조한 뒤, 3차 증류수로 희석하여 50, 25 및 12.5 ㎍/ml의 샘플을 제조하였다. 다음으로, 분석 장비 UV-vis 분광계(spectrometer, Agilent 8453)를 이용하여 흡수 스펙트럼을 얻은 다음, 10 mg/ml의 농도에서의 흡광계수 값을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
| 번호 | 화합물 | 몰흡광계수 | 번호 | 화합물 | 몰흡광계수 | 번호 | 화합물 | 몰흡광계수 |
| 1 | HNB | 13,000 | 13 | 1-28 | 21,000 | 25 | 1-54 | 24,000 |
| 2 | 1-6 | 8,000 | 14 | 1-30 | 29,000 | 26 | 1-4 | 31,000 |
| 3 | 1-10 | 19,000 | 15 | 1-31 | 26,000 | 27 | 1-56 | 8,000 |
| 4 | 1-1 | 19,000 | 16 | 1-32 | 8,000 | 28 | 1-58 | 11,000 |
| 5 | 1-12 | 7,000 | 17 | 1-33 | 20,000 | 29 | 1-59 | 6,000 |
| 6 | 1-24 | 16,000 | 18 | 1-37 | 14,000 | 30 | 1-61 | 18,000 |
| 7 | 1-14 | 10,000 | 19 | 1-42 | 4,000 | 31 | 1-63 | 6,000 |
| 8 | 1-2 | 12,000 | 20 | 1-43 | 18,000 | 32 | 1-64 | 15,000 |
| 9 | 1-18 | 9,000 | 21 | 1-44 | 22,000 | 33 | 1-66 | 23,000 |
| 10 | 1-20 | 23,000 | 22 | 1-45 | 25,000 | 34 | 1-67 | 8,000 |
| 11 | 1-23 | 4,000 | 23 | 1-46 | 25,000 | 35 | 1-68 | 21,000 |
| 12 | 1-3 | 44,000 | 24 | 1-47 | 20,000 | 36 | 1-70 | 18,000 |
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 1-3은 몰 흡광계수가 44,000으로 가장 높았으며, HNB 보다 3.38배 높은 흡광계수를 가지고 있으며, 화합물 1-4는 31,000으로 HNB 보다 2.38배 높은 흡광계수를 가지고 있고, 화합물 1-1은 19,000으로 HNB 보다 1.46배 높은 흡광계수를 가지고 있는 것으로 확인되어 산업적으로 유용한 것으로 평가되었다.
시험예 3. 마그네슘 이온 민감성 평가
1) 10 mM 미만 농도의 마그네슘 이온 민감성 평가
상기 시험예 1, 2의 평가를 통해 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4가 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물로 특히 우수한 것으로 선정되었다. 선정된 4종 화합물과 HNB의 마그네슘 이온 검출 민감성을 평가하였다.
염화마그네슘을 3차 증류수에 용해시켜 각각 8, 10, 12, 14 및 16 mM로 희석하여 시료를 준비하였다. 다음으로, 염료 화합물은 HNB, 1-1, 1-2는 240 μM의 농도로 준비하였으나, 1-3 및 1-4는 몰흡광계수가 대조군(HNB) 보다 2배 이상 높기 때문에 120 μM로 50% 희석하여 준비하였다.
96 well plate의 각 행에는 염료 화합물을 1 ml씩 넣었고, 각 열에는 dilution한 염화마그네슘 용액을 각각 1 ml씩 넣은 뒤, 색변화의 관찰 및 흡광도를 측정을 하였다. 96 well plate 내의 염화마그네슘의 최종농도는 0, 4, 5, 6, 7, 8 mM이며, HNB, 1-1, 1-2의 최종농도는 120 μM이고, 1-3, 1-4의 최종농도는 60μM 이다.
하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 1-3의 화합물은 4 mM의 매우 낮은 농도로 희석된 염화마그네슘 용액에 함유된 마그네슘 이온을 검출하여 보색을 나타내어 마그네슘 이온에 대한 민감도가 매우 우수하였다. 따라서 DNA 증폭에서와 같이 소량의 마그네슘 이온이 방출되는 시료에 적용하여도 마그네슘 이온의 검출이 용이하여 산업적 이용 가능성이 매우 높다.
하기 도 5를 참고로 하면, 본 발명에 따른 염료 화합물 1-3은 마그네슘 이온에 의해 흡수스펙트럼이 500 nm에서 640nm로 이동한 것이 관찰이 되었다. 뿐만 아니라, 마그네슘 이온 농도에 대해 흡광도 변화가 뚜렷하기 때문에, 흡광도 평가를 통해 측정 샘플에 함유된 마그네슘을 정량적으로 계산할 수 있다.
2) 10 mM 이상 농도의 마그네슘 이온 민감성 평가
10 mM 미만의 마그네슘 이온 농도에 대해 변색되지 않은 HNB, 화합물 1-1, 1-2 및 1-4에 대한 마그네슘 이온 민감성을 평가하기 위하여 10 mM 이상의 농도에서 동일한 방법으로 추가실험하였다. 하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 96 well plate 내의 마그네슘 농도는 10 mM 부터 100 mM 까지 확인하였으며, 염료 화합물의 최종농도는 120μM으로 설정하였다.
하기 도 4를 참고로 하면, HNB는 10 mM 이상의 농도에서 발색이 되기 시작하였으며, 20-30 mM에서 보라색으로, 40 mM 이상에서는 진청색으로 발색되었고, 화합물 1-1은 10-20 mM 사이의 구간에서 주황색이 옅은 살구색으로 발색되었다. 화합물 1-2는 100 mM 이상의 구간에서 보라색이 선홍색으로 눈에 띄는 발색을 나타내었으며, 화합물 1-4는 10 mM 농도에서 적자색에서 자주색으로 발색이 시작되었으며, 20 mM농도 부근에서는 청보라색으로 발색되었다.
상기 실험에서와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 마그네슘 이온과 반응하여 흡수 스펙트럼이 이동하여 색변화(발색)가 있으며, 상기 화합물의 구조에 따라 마그네슘 이온의 검출 최저 농도가 다르다. 이에 본 발명에 따른 마그네슘 이온의 검출 최저 농도가 상이한 화합물들을 측정하고자 하는 샘플에 처리하고, 상기 샘플의 발색 여부 및 발색된 색상을 확인함으로써 샘플에 함유된 마그네슘의 이온의 농도의 확인을 육안으로 할 수 있다.
시험예 4.
상기 화합물 1-1, 1-3 및 1-4로부터 모델링하여 후보물질을 추가 합성하였다. 상기 1-71 내지 1-75의 화합물과 같이 [화학식 1]의 나프틸 백본에 히드록시기, 아민기 및 설폰산기(설폰산 또는 설폰산나트륨염)를 각각 1개 이상 포함되는 구조가 pH 안정성을 가지며, 마그네슘 이온과 결합하여 발색되는데 보다 효과적인 염료 화합물임을 확인하였다.
상기 실험으로 마그네슘 검출이 가능한 염료 화합물 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-7, 1-10, 1-18, 1-20, 1-25, 1-37, 1-38, 1-44, 1-45, 1-46, 1-54, 1-55, 1-66, 1-67, 1-68, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74 및 1-75를 선정하였으며, 각각 [화학식 2] 내지 [화학식 26]로 명명하였다.
제조예 1. 마그네슘 이온 검출 키트의 제조
상기와 같은 실험을 통해 본 발명의 발명자들은 마그네슘 이온의 검출 최저 농도가 상이한 화합물 stock solution 다수 개를 포함하여 육안으로 확인이 가능한 마그네슘 이온 정량 키트를 제조하였다.
상기 키트는 DNA 증폭 및 증폭량의 확인을 위한 진단키트로 이용될 수 있다.
Claims (12)
- 하기 [화학식 1a]로 표시되는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물:
[화학식 1a]
상기 [화학식 1a]에서
R1 및 R2 중 어느 하나는 히드록시기이고, 다른 하나는 아미노기 또는 수소이고;
R3은 수소이고;
R4는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, C1-6알킬 및 페닐 중에서 선택되며;
R5 및 R6 중 어느 하나는 설폰산기이고, 다른 하나는 수소이고;
R7 및 R8 중 어느 하나는 니트로기이고, 다른 하나는 수소, 설폰산기, 또는 니트로기이고,
상기 설폰산기는 설폰산(-SO3H) 또는 설폰산나트륨염(-SO3Na)이다. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 [화학식 1a]로 표시되는 화합물은 마그네슘 이온 부재하에서 pH에 변화에 의해 미발색되거나 또는 마그네슘 이온에 의한 발색과 상이한 색으로 발색되는 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출용 염료화합물. - 제1항에 있어서,
상기 검출은 비색법 또는 흡광광도법인 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물. - 제1항에 있어서,
상기 [화학식 1a]로 표시되는 염료 화합물은 하기 [화학식 3] 내지 [화학식 7], [화학식 9] 내지 [화학식 11], [화학식 14] 내지 [화학식 21], [화학식 25] 및 [화학식 26]으로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물:
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 25]
[화학식 26]
- 제1항에 있어서,
1 mM 내지 200 mM의 마그네슘 이온 존재하에서 발색되는 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물. - 하기 [화학식 1a]로 표시되는 염료 화합물을 포함하는 마그네슘 이온 검출 키트:
[화학식 1a]
상기 [화학식 1a]에서
R1 및 R2 중 어느 하나는 히드록시기이고, 다른 하나는 아미노기 또는 수소이고;
R3은 수소이고;
R4는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, C1-6알킬 및 페닐 중에서 선택되며;
R5 및 R6 중 어느 하나는 설폰산기이고, 다른 하나는 수소이고;
R7 및 R8 중 어느 하나는 니트로기이고, 다른 하나는 수소, 설폰산기, 또는 니트로기이고,
상기 설폰산기는 설폰산(-SO3H) 또는 설폰산나트륨염(-SO3Na)이다. - 제7항에 있어서,
상기 [화학식 1]로 표시되는 염료 화합물은 하기 [화학식 3] 내지 [화학식 7], [화학식 9] 내지 [화학식 11], [화학식 14] 내지 [화학식 21], [화학식 25] 및 [화학식 26]으로 표시되는 염료 화합물 중에서 선택되는 것으로, 상기 염료 화합물들은 마그네슘 이온과의 반응에서 각각 발색파장 또는 발색 임계 농도가 서로 상이한 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출 키트.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 25]
[화학식 26]
- 제8항에 있어서,
상기 마그네슘 이온 검출 키트는 상기 [화학식 3] 내지 [화학식 7], [화학식 9] 내지 [화학식 11], [화학식 14] 내지 [화학식 21], [화학식 25] 및 [화학식 26] 중에서 선택되는 염료 화합물 2 내지 18종을 포함하는 마그네슘 정량화용인 것을 특징으로 하는 마그네슘 이온 검출 키트. - 하기 [화학식 1a]로 표시되는 염료 화합물을 포함하는 PCR(polymerase chain reaction)의 DNA 증폭 육안 검사용 진단 키트.
[화학식 1a]
상기 [화학식 1a]에서
R1 및 R2 중 어느 하나는 히드록시기이고, 다른 하나는 아미노기 또는 수소이고;
R3은 수소이고;
R4는 수소, -NHRa 및 설폰산기 중에서 선택되고, 상기 Ra는 수소, C1-6알킬 및 페닐 중에서 선택되며;
R5 및 R6 중 어느 하나는 설폰산기이고, 다른 하나는 수소이고;
R7 및 R8 중 어느 하나는 니트로기이고, 다른 하나는 수소, 설폰산기, 또는 니트로기이고,
상기 설폰산기는 설폰산(-SO3H) 또는 설폰산나트륨염(-SO3Na)이다. - 하기 [화학식 3] 내지 [화학식 7], [화학식 9] 내지 [화학식 11], [화학식 14] 내지 [화학식 21], [화학식 25] 및 [화학식 26]의 화합물 중에서 선택되는 2 내지 18종의 염료 화합물에 검출시료를 투여하여 반응시키는 단계; 및
색변화를 확인하는 단계;를 포함하는 육안으로 마그네슘 이온을 정량화하는 방법:
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 25]
[화학식 26]
- 제11항에 있어서,
상기 [화학식 3] 내지 [화학식 7], [화학식 9] 내지 [화학식 11], [화학식 14] 내지 [화학식 21], [화학식 25] 및 [화학식 26]의 화합물은 각각 마그네슘 이온과의 반응에서 발색파장 또는 발색 임계 농도가 서로 상이한 것을 특징으로 하는 육안으로 마그네슘 이온을 정량화하는 방법.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160134192A KR101926696B1 (ko) | 2016-10-17 | 2016-10-17 | 마그네슘 이온 검출용 염료 화합물 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101926696B1 (ko) |
-
2016
- 2016-10-17 KR KR1020160134192A patent/KR101926696B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Anal. Chem., Vol. 32, No. 9, pp. 1120-1123, 1960 |
| ANALYST, Vol. 112, No. 12, pp. 1723-1729, 1987 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180041883A (ko) | 2018-04-25 |
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