CN115820922B - 一种检测隐球菌的引物探针组合、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测隐球菌的引物探针、试剂盒。本发明针对的线粒体基因的特定区域设计引物和探针，可快速实现新型隐球菌的两个亚种和格特隐球菌的五个亚种共七种常见隐球菌的联合检测，对已检测的22种其他菌均无交叉，具有灵敏度高、特异性好、重复性高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种检测隐球菌的引物探针组合、试剂盒。
背景技术
隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。目前发现的隐球菌有70多种，其中感染人的有7种：新型隐球菌的两个亚种和格特隐球菌的5个亚种，其中新型隐球菌病占所有隐球菌病的90％左右。隐球菌病的患病人群主要为免疫缺陷患者，如HIV感染、恶性肿瘤、干细胞或器官移植、自身免疫病和神经系统并发症的患者。
线粒体是真核生物细胞内一个重要的细胞器，因为有氧呼吸在线粒体内进行，线粒体又被称为真核细胞的能量供应站。作为半自主细胞器，线粒体内拥有一定量的独立于细胞核的遗传体系，称为线粒体基因。
由于真菌培养比较困难且生长缓慢，目前检测隐球菌临床上结合临床表现以及显微镜检查结果进行诊断，再通过真菌培养或组织染色加以确认。其缺点是镜检的灵敏度较低需要反复确认，培养耗时较长需要3-4天。目前还没有利选用线体基因作为检测靶标检测隐球菌的核酸检测试剂盒。
因为线粒体是真核细胞的能量供应站，很多细胞内都有多个线粒体，因此线粒体基因在绝大多数真核细胞内都是高拷贝基因。又因为不同物种之间线粒体基因差异较大，所以线粒体基因用于核酸检测试剂盒的检测靶标又不容易出现种间交叉。因此，选用线粒体基因用于核酸检测试剂盒的检测靶标，可以大大提高试剂盒的灵敏度和特异性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测隐球菌的引物探针组合、试剂盒。该引物探针组合可快速实现新型隐球菌和格特隐球菌的联合检测，灵敏度高、特异性好、重复性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测隐球菌的引物探针组合，包括：
检测新型隐球菌的引物、探针：SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的探针；和/或
检测格特隐球菌的引物、探针：SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO:6所示核苷酸序列的探针。
本发明针对隐球菌的线粒体基因的特异性保守区序列设计引物和探针，其中，新型隐球菌线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；格特隐球菌线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中：
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测隐球菌的试剂盒试剂盒中的应用；所述隐球菌包括新型隐球菌和/或格特隐球菌。
本发明还提供一种检测隐球菌的试剂盒，包括所述的引物探针组合。
本发明提供的试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针：核苷酸序列如SEQ IDNO.7～8所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针。
其中，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
本发明检测内参基因的引物和探针针对内参基因的保守序列设计，具体序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供的试剂盒还包括无菌水和ddPCRMix。
本发明还提供一种检测隐球菌的方法，以本发明所述的引物探针或试剂盒对待测样本进行检测。
本发明中，所述检测为PCR检测，检测的程序为：95℃5min，[98℃15s，60℃30s]×40cycles。
一些实施方案中，本发明所述检测为非诊断目的的检测，例如对环境的样本或对食品进行检测。例如所述环境中的样本包括水样或物体表面拭子。
本发明针对新型隐球菌和格特隐球菌的线粒体基因的特定区域设计引物和探针，可快速实现新型隐球菌和格特隐球菌的联合检测，对已检测的其他多种菌均无交叉，具有灵敏度高、特异性好、重复性高的特点。
具体实施方式
本发明提供了一种检测隐球菌的引物探针组合、试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
如无特殊说明，本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.1引物探针设计
1.1.1依据隐球菌(新型隐球菌、格特隐球菌)线粒体基因序列分析结果，采用Primer Express软件，分别各设计一对引物和一条探针；同时搭配一组外源内参的引物探针，具体信息如下：
表1
1.1.2样品
1.1.2.1菌DNA样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组DNA。
1.1.2.2人DNA样品：无菌痰液/肺泡灌洗液，磁珠法提取基因组DNA。
1.1.2.3外源内参模板：生物公司合成，溶解稀释后备用。
1.2数字PCR扩增体系
1.2.1引物探针混合液
表2
1.2.2 ddPCR反应体系
表3
| 试剂 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 水 | 5.195 | |
| 5XddPCR Mix | 3 | 1× |
| IC-S | 1 | |
| DNA | 5 | |
| 合计 | 15 |
1.2.3扩增程序
98℃5min【98℃15s，60℃30s】*40
1.3结果
表4
1.4结论
对以上多种病原菌，本发明试剂盒只检测出格特隐球菌和新型隐球菌，不会检出其他的病原菌。说明，本发明引物探针特异性高，能准确地、特异地将两种隐球菌检测出来。
实施例2
引物探针扩增效率检测：
表5
以新型隐球菌28sRNA为靶标设计引物探针，其序列如下：
表6
| 名称 | 序列 | 标记 |
| C.NEO-28s-F-1 | AGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAG | - |
| C.NEO-28s-R-1 | TTGAGCTCTTCCCGGTTCAC | - |
| C.NEO-28s-P-1 | ATTCCCTTAGTAACGGCG | FAM |
采用最优引物探针浓度，以以上3种人工合成DNA模板的浓度进行qPCR检测，结果浓度每降低10倍，Ct值就增加约3。因为2的3.3次方约等于10，说明在该体系中，引物探针的扩增效率均接近100％。
实施例3
分别使用以上的引物探针体系(28sRNA和C.NEO-MIT)，测4例新型球菌阳性的痰液样本。通过我们公司开发的痰液DNA提取试剂TF1提取以后，每个体系分别加样5μl为模板。其检测值如下：
表7
| 样本1(FAM) | 样本2(FAM) | 样本3(FAM) | 样本4(FAM) | |
| 28sRNA | 24.31copies/μl | 8.62copies/μl | 7.49copies/μl | 13.65copies/μl |
| C.NEO-MIT | 234.28copies/μl | 89.31copies/μl | 80.26copies/μl | 141.23copies/μl |
在真实的阳性样本检测中，以新型隐球菌线粒体基因为检测靶标的检测浓度是以28sRNA为检测靶标的检测浓度的10倍左右，因此对阳性样本的检出率更高，而以28sRNA为检测靶标的检测浓度较低，容易出现假阴性的结果。
实施例4空白检出限(LoB)值
每天提取20份去离子水，作为模板，在不同扩增仪上分别使用以上的引物探针体系(28sRNA和C.NEO-MIT)连续做三天，除所有检测值都为0的以外，使用spss23.0软件S-W分析检测结果是否服从正态分布，若服从正态分布则用参数法分析LoB值；若不服从正态分布则用非参数法分析LoB值。结果如下：
表8
线粒体基因为检测靶标取3次计算结果的最大值为LoB值，即新型隐球菌为0.11copies/μl，格特隐球菌为0copies/μl；28sRNA为检测靶标取3次计算结果的最大值为LoB值，即新型隐球菌为0.18copies/μl，格特隐球菌为0.09copies/μl。线粒体基因为检测靶标的引物探针体系的特异性高于28sRNA为检测靶标的引物探针体系。
实施例5最低检出限(LoD)值
1.1最低检出限(LoD)
若LoB＝0，则采用概率单位方案；若LoB≠0，则采用经典方案。配制3批试剂中最大的LOD作为最终报告值。
1.1.1概率单位方案
使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶菌已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用超纯水，分别进行梯度稀释。
使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶菌标本不同浓度梯度30次。
分别计算各个靶菌标本每个浓度梯度的阳性检出率，选择阳性检出率≥95％的最低浓度，作为各个靶菌的LoD值。
1.1.2经典方案
使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶菌已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用相应的超纯水，分别稀释至1×LoB、2×LoB、3×LoB、4×LoB、5×LoB五个浓度，作为低值标本。
使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶菌五个低值标本至少12次，合计至少60个低值标本测量结果。
分别计算各个靶菌LoD值，方法为：
1)分析每个批号试剂至少60个低值标本测量结果的数据分布。
2)若数据呈正态分布，则采用参数统计方法进行分析。
3)若数据呈偏态分布，则采用非参数统计方法进行分析。
结果如下表，检测限为LoD值。
表9
结果显示，本发明以线粒体基因为检测靶标的引物探针体系的灵敏度明显高于28sRNA为检测靶标的引物探针体系。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种检测隐球菌的引物探针组合，其特征在于，包括：
检测新型隐球菌的引物、探针：SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；和/或
检测格特隐球菌的引物、探针：SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有淬灭基团MGB。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备检测隐球菌的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述隐球菌包括新型隐球菌和/或格特隐球菌。
5.一种检测隐球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内参基因的引物、探针；
所述检测内参基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示；
所述检测内参基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括无菌水和ddPCR Mix。
9.非诊断目的检测隐球菌的方法，其特征在于，以权利要求5～8任一项所述的试剂盒对待测样本进行检测。
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