CN103276080A - 一种可早期诊断隐球菌感染的引物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可早期诊断隐球菌感染的引物及用途，该引物是针对新生隐球菌全球临床最常见的菌株类型H99菌株的IGS1序列为靶序列，利用LAMP专业引物设计软件设计的。通过有效性、特异性、敏感性实验证实，本发明的引物能用于早期诊断隐球菌感染，且快速、简便、操作性强、结果判读方便，解决了临床上隐球菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题，可制备成试剂盒，为临床上隐球菌感染的早期诊断和及时治疗提供了便利。

Description

一种可早期诊断隐球菌感染的引物及其用途

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，是一种可早期诊断隐球菌感染的引物及其用途。

背景技术

侵袭性真菌病（Invasive fungal diseases，IFDs）指病原真菌侵犯心、肝、脾、肺、肾、脑、血液等各系统内脏器官而引起的系统感染性疾病。近二十年来，由于免疫抑制剂、各种体内置管技术的广泛使用及HIV的持续蔓延，IFDs的发病率及死亡率在全球范围内呈持续上升趋势，中国医院感染监测网数据则显示IFDs现已成为我国院内感染第2位的重要组成（约占24.1%），其中白念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)分别是居于前3位的侵袭性真菌病致病真菌。

IFDs的预后与能否早期诊断密切相关，目前困扰临床医生最大的问题就是侵袭性真菌病缺乏理想的早期诊断学技术方法，往往使患者失去最佳治疗时机，临床医生常被迫采取抢先治疗方案，但这又易产生耐药菌株并加重损伤患者肝肾功能。因此，如何推动侵袭性真菌病诊断的研究，及时开发出快速、特异且易于操作的诊断技术方法，是目前临床上病原真菌检测技术研究迫切需要解决的重要问题。新生隐球菌及格特隐球菌最主要侵犯人类的中枢神经系统，引起致命的隐球菌性脑膜脑炎，能否早期诊断之间关系临床治疗的预后，国内外临床真菌实验室目前均主要采用墨汁镜检、体液乳胶凝集试验、咖啡酸琼脂培养基及尿素琼脂培养基培养及商品化的API-20C试剂盒来鉴定新生隐球菌，其特异性可以较好的满足临床需求，但存在假阴性率较高、耗时长（培养时间至少>1周）等缺陷，因此临床迫切需要研发早期、特异、灵敏的隐球菌病早期诊断技术。

隐球菌在真菌分类学上归入担子菌门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科、隐球菌属。导致临床感染的主要为新生隐球菌和格特隐球菌(>95%)。一般说来，新生隐球菌可以分为三种血清型：血清A、D和杂合子AD，两种变种：新生隐球菌grubii和neoformans变种；格特隐球菌包括两种血清型：血清B和C型。以培养、病理检查为代表的病原真菌形态学诊断方法虽有耗时长等局限，但仍是临床上侵袭性真菌病诊断的金标准，隐球菌病亦不例外。近年来，非培养诊断技术逐渐成为国内外侵袭性真菌病早期诊断技术研究的热点，其技术路线主要是基于免疫学原理的血清学方法和以核酸检测技术为代表的分子生物学方法。总体而言，这两大类技术方法各有优势，部分血清学技术方法已经较为成熟，敏感性及特异性均较高，但基于免疫学原理的固有属性也导致假阳性、假阴性等问题；而核酸检测等分子生物学技术方法虽尚未完全成熟，但具有很好地弥补目前血清学方法的弊端的技术优势，具有较强的临床应用价值。

基于核酸检测原理的隐球菌病早期诊断技术主要包括DNA条形码图谱技术和DNA序列分析等。理论上讲，DNA序列分析的是鉴定隐球菌的金标准。很多基因序列如包含5.8s rDNA区的ITS序列、IGS序列、线粒体B基因等都已成功用于新生隐球菌及格特隐球菌的分子鉴定。在诸多的基因中，ITS序列和IGS序列分析被认为是最方便、包含信息量较多的方法。Kastu M等曾经利用ITS序列分析将包含五种血清型的隐球菌分为7类分子类型。Diaz MR的研究团队则发现IGS区序列分析能更好的将隐球菌鉴定到种间甚至基因型或亚型水平，他们的研究指出根据IGS序列隐球菌可以分为六种基因亚型，其中IGS1型为新生隐球菌grubii变种，IGS2型为新生变种，IGS3-6型则分别对应格特隐球菌的四种基因型。

综上所述，基于DNA序列分析，尝试找出一种可以快速、简便、操作性强、结果判读方便的快速早期诊断隐球菌感染的技术方法，对于解决临床上隐球菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题具有十分重要的意义，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可早期诊断隐球菌感染的引物。

本发明的再一的目的是，提供上述引物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种可早期诊断隐球菌感染的引物，所述的引物对包含下列核苷酸序列中的任一种：

a）SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4所示的核苷酸序列；

b）SEQ NO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8所示的核苷酸序列；

c）SEQ NO.9、SEQ NO.10、SEQ NO.11、SEQ NO.12所示的核苷酸序列；

d）SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16所示的核苷酸序列。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的引物在制备早期诊断隐球菌感染的试剂中的用途；

如上所述的引物在制备检测样品中隐球菌存在的试剂中的用途；

如上所述的引物还可用于从劳伦特隐球菌、浅白隐球菌、浅黄隐球菌、土生隐球菌、指甲隐球菌、瘦弱隐球菌、斯金纳隐球菌、念珠菌属中的白念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌、隐球菌各不同种菌中鉴别出隐球菌。

本发明优点在于：

本发明针对新生隐球菌全球临床最常见的菌株类型H99菌株的IGS1序列为靶序列，利用LAMP专业引物设计软件设计出数套引物，从中筛选出反应速率快、扩增效率高的引物，并通过对临床上常见感染的新生隐球菌和格特隐球菌8个基因型菌株验证其有效性；同时与其他常见致病真菌如念珠菌、毛孢子菌等分别反应验证引物扩增的特异性；梯度稀释模板DNA浓度，检测其敏感性，获得最低阳性检出率的浓度，与传统PCR扩增比较两者各自最小检测浓度。结果证实本发明的引物能用于早期诊断隐球菌感染，且快速、简便、操作性强、结果判读方便，解决了临床上隐球菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题，可制备成试剂盒，为临床上隐球菌感染的早期诊断和及时治疗提供了便利。

附图说明

附图1A、图1B、图1C是本发明的第四套引物与靶序列结合并成环的结构位点图。图1A：首先FIP引物与模板DAN互补链上的互补区段结合（即FIP的F2与互补链F2c区段结合），通过链置换DNA聚合酶作用，以FIP引物的3’末端为一点，与模板DNA链相同序列的一条DNA单链便合成了，F3引物从FIP引物外侧与互补链F3c区段结合，以F3引物的3’末端为起点，通过链置换DNA酶的作用将刚由FIP引物合成的DNA链剥离，一边合成新的DNA链，通过碱基配对延伸，形成了与互补链互补的双链，而刚才被F3引物合成的DNA剥离的单链由于在其5’末端含有互补的F1和F1c区段，通过碱基互补形成环状结构；BIP引物与形成环状结构的DNA链进行碱基配对，以BIP引物的3’末端为合成起点，合成互补DNA链并将循环结构剥离延伸成直线结构，接着B3引物从BIP引物外侧插入进行碱基配对，以3’末端为起点，一边剥离之前合成的BIP引物DNA链，一边持续DNA合成；而以BIP引物为模板合成的单链剥离下后，由于其3’端有互补的F1c和F1区段，5’端有互补的B1和B1c区段，所以整条链自动弯曲形成哑铃状结构，这就是LAMP反应的起始结构。图1B：为四条引物的结构和其分别与靶基因DNA双链结合的位置。其中BIP由B2和B1c组成，B2是和靶序列互补链所对应的位置完全相同的一段序列，B1c则和靶序列的B1c段完全相同序列；同理，在与靶序列互补链上，FIP由F2和F1c组成，F2是和靶序列对应的位置完全相同的一段序列，即与互补链互补，而F1c则和靶序列的B1c段互补，即与该互补链的B1c段完全相同。图1C：靶基因IGS部分DNA序列以及根据LAMP引物设计程序设计出的引物IGS1-4与IGS1序列结合的位置。

附图2是根据IGS1序列设计出的LAMP四套引物以及阳性和阴性对照样本扩增曲线。

附图3是新生隐球菌H99及其他隐球菌八个基因型和部分其他标准菌株凝胶电泳图。1.CBS10083(WM161):VGIII；2.CBS10079(WM629):VNIV；3.CBS10078(WM179):VGI；4.CBS10085(WM148):VNI；5.CBS10080 (WM628):VNIII；6.CBS10082(WM178): VGII；7.CBS10083(WM626):VNII；8.CBS10101(WM779):VGIV；9.CBS7140: Cryptococcus laurentii；10.CBS2994 Cryptococcus uniguttulatus；11.CBS570 Cryptococcus curvatus；12.CBS5029  Cryptococcus fagi；13.CBS922 Cryptococcus skinneri；14.CBS8014 Cryptococcus luteolus；15.CBS2206 Cryptococcus macerans；16.CBS319 Rhodotorula minuta；17.CBS562  Candida albicans；18.CBS573 Candida krusei；19.CBS138 Candida glabrata；20.CBS7748 Trichosporon asahii；21.CBS605 Pichia anomala。

附图4是LAMP反应后各管浊度表现结果。1为新生隐球菌H99，2为CBS10079(WM629)，3为CBS10085(WM148) ，4为CBS10080 (WM628) ；5为CBS10082(WM178)；6为CBS922 Cryptococcus skinneri；7为CBS5029  Cryptococcus fagi；8为阴性对照。

附图5是LAMP对不同浓度DNA扩增效率曲线。

附图6是不同浓度梯度的H99基因组DNA可见性实验反应结果，第一排由左至右依次样本里DNA含量为20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、2pg、0.2pg、0.02pg、2fg、0.2fg、0.02fg、0.002fg，第一排最右侧未显示荧光绿的为阴性对照，即未加入模板DNA。第二排分别为阳性和阴性样本，即分别加入模板DNA和双蒸水的体系，LAMP反应体系下，63℃，60min后，表现为阳性样本显示荧光绿。

附图7是不同浓度DNA传统PCR 扩增后电泳图，其中1为阴性对照，2-10分别为DNA 浓度2ng、0.2ng、0.02ng、2pg、0.2pg、0.02pg、2fg、0.2fg、0.02fg。

附图8是不同浓度DNA LAMP扩增后电泳图，其中12为阴性对照，1-11为20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、2pg、0.2pg、0.02pg、2fg、0.2fg、0.02fg、0.002fg。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  用于早期诊断隐球菌感染的引物的筛选及其特异性和敏感性验证

一、主要实验材料及设备

1 菌株

选择了包括新生隐球菌及格特隐球菌所有8个基因型的标准菌株CBS10083(WM161)、CBS10079(WM629)、CBS10078(WM179)、CBS10085(WM148)、CBS10080(WM628)、CBS10082(WM178)、CBS10083(WM626)、CBS10101(WM779)（购于荷兰CBS国际真菌多样性研究中心）、H99、JEC20及用于验证LAMP法特异性的念珠菌等41株标准菌株及34株临床菌株，来源于上海市医学真菌分子生物学重点实验室菌种库，共计75株。

2 设备

超净工作台：CA-1390-1垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；生物安全柜：NUAIRE Biological Safefy Cabinet Class Ⅱ；隔水式电热恒温培养箱：Heraeus B5060 EK-CO₂；纯水机：HITECH water purification system；微量移液枪：0.5~10μl（FINNpipette），20~200μl（Eppendorf  Research），1000μl（Eppendorf Research）；高压消毒锅：SANYO AutoCLAVE MLS-3020；Colibri：上海达迈生物科技公司；Loopamp LA-320C实时浊度仪：北京蓝谱生物科技有限公司；高速离心机：Eppendorf centrifuge 5810R，Eppendorf North America, Inc.；制冰机：Scotsman AF100；恒温水浴箱：上海精密仪器；PCR仪器：BIO-RAD C1000 Touch，美国产；电泳仪：TAN ETS 300，国产；凝胶成像分析系统：FR-980复日生物电泳图像分析系统。

3 试剂及培养基

YPD培养基：1% Yeast Extract（酵母提取物）：OXOID，2% Peptone（蛋白胨）：OXOID，2% Dextrose（葡萄糖）：上海国药集团化学试剂有限公司。

沙堡弱氏培养基（SDA）：1% Peptone（蛋白胨）：OXOID，4% Dextrose（葡萄糖）：上海国药集团化学试剂有限公司，1.5%琼脂粉：上海国药集团化学试剂有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：20%马铃薯，2%葡萄糖，2%琼脂，100ml水，将马铃薯洗净，去皮并切成小块，立即投入水中煮沸20分钟，纱布过滤，保留滤液并加入其他成分，加热使琼脂融化，补足水量，分装，121℃灭菌20分钟，冷却至60℃左右，每个无菌培养皿分装15~20ml，凝固后倒置，4℃冰箱保存。

科玛嘉培养基：法国科玛嘉生物科技公司。

Loopamp DNA amplification kit：日本荣研化学株式会社。

Loopamp荧光目视检测试剂盒：日本荣研化学株式会社。

IGS1序列引物：上游引物IGS1F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3（SEQ ID NO.17）；下游引物IGS1R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（SEQ ID NO.18），引物由上海生工合成。

TIANGEN 2×pfu PCR MasterMix高保真酶，北京天根生物科技有限公司。

DNA Marker（DL2000）：上海宝生物工程有限公司（TAKARA）。

分析纯氯化苄：生工上海生物科技有限公司。

真菌DNA抽提液：1mL 1M Tris.Hcl，4mL 500mM EDTA，加ddH₂O定容至10mL。

AR级3M NaAc，20%SDS溶液，异丙醇溶液，70%乙醇溶液。

4 其它耗材

12CM培养皿：上海卓康生物科技有限公司；微量移液器吸头：上海卓康生物科技有限公司；EP管（1.5ml、5ml）：上海卓康生物科技有限公司；PCR八连管：Bio-Rad公司。

二、实验方法

（一）靶序列确定及引物设计

1 靶序列H99 IGS1

从美国NCBI核酸数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）获得已得到证实的新生隐球菌grubii变种H99所对应的IGS1序列，如SEQ ID NO.19所示，GenBank：EF211264。

2 引物设计

根据LAMP设计程序软件（http://primerexplorer.jp/e）设计出IGS1对应的LAMP反应引物，根据下列引物筛选条件筛选适合的几套引物，根据软件设计出的引物需满足以下条件：

（1）Tm（引物溶解温度）即与互补序列配对结合的引物达到50%是需要的温度，决定因素有序列中碱基G、C含量，引物本身的浓度，反应体系盐浓度。因此LAMP反应是在固定的反应条件下（引物浓度为0.1μM，阳离子浓度50mM）下进行，一套引物中不同的引物所对应的适宜Tm温度分别是：F1c和B1c在64-66℃，F2、B2、F3和B3的适宜Tm为59-61℃，环引物为64-66℃；

（2）各引物末端序列的稳定性：各个引物的末端是DNA合成的起始端，因此必须具备一定的稳定性，尤其是F1c的5’与F1的3’末端结合成为延长反应的起始，因此FIP的F1c序列5’末端序列十分重要。需满足的条件是dG（吉布斯自由能）≤－4kcal/mol，dG值越小，越容易与靶序列结合；

（3）引物序列中碱基G、C含量：一般认为40%-60%比较合适；

（4）引物的二级结构：要尽量避免二级结构的发生，尤其在FIP和BIP中，避免与3’段序列互补而导致引物自身结合形成二聚体；

（5）引物之间的距离：F2外侧至B2外侧（扩增区域）间隔120-160bp，F2的5’段至F1c的3’端间隔40-60bp。

通过上述条件筛选，共筛选出四套引物，序列如下所示：

第一套

IGS-1-F3：CTCTAACATGTTGGGTCTCGG（SEQ ID NO.1）

IGS-1-B3：CGCAACCTACTACAGTGAATGG（SEQ ID NO.2）

IGS-1-BIP：ACCCCTCCTAGAGTCATCCACAC-CTTGGATGTAAGGGGCTTTACG（SEQ ID NO.3）

IGS-1-FIP：CTGTGCCAGCCAGGCTGATAATAG-TATCAATGACCCAAGCTGAAGA（SEQ ID NO.4）

第二套

IGS-2-F3：GGCTTCCTCTAGAGACTTGGAT（SEQ ID NO.5）

IGS-2-B3：GCAACCTACTACAGTGAATGGA（SEQ ID NO.6）

IGS-2-BIP：GCACATTCTCAGACCCCTCCTAGA-GGGGCTTTACGCATTCGC（SEQ ID NO.7）

IGS-2-FIP: TGTGCCAGCCAGGCTGATAATAG-ATCAATGACCCAAGCTGAAGAC（SEQ ID NO.8）

第三套

IGS-3-F3：GGACTTGTACACAGTCTCATCA（SEQ ID NO.9）

IGS-3-B3：ATGCGACACAAGCACCAG（SEQ ID NO.10）

IGS-3-BIP：TCCGCAACCTACTACAGTGAATGG-GTCTTCAGCTTGGGTCATTGA（SEQ ID NO.11）

IGS-3-FIP：TGCAATTGAGACACTTACCAGGCC-ACGACCATAAAATCAGTAGCGT（SEQ ID NO.12）

第四套

IGS-4-F3：ATTCACTGTAGTAGGTTGCGG（SEQ ID NO.13）

IGS-4-B3：CAAGGCGTCTTACCCCAAG（SEQ ID NO.14）

IGS-4-BIP：TAGCGTACACTGCCAACTTGCG-GGACTTGAAAGTTCTCTCTGCA（SEQ ID NO.15）

IGS-4-FIP：TTGGGAGCTGGTGCTTGTGT-ATATGCTTCTCTTCCATCCGTC（SEQ ID NO.16）

以上引物与靶序列结合并成环的结构位点如图1A、图1B、图1C所示（以第四套引物为例）。

3 引物筛选

将设计出的引物分别与模板DNA（即新生隐球菌H99）按照LAMP反应体系加样，置于Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应，预设反应温度为63℃，反应时间为80min。

LAMP反应体系如下：总体积25 μL，包括1μL FIP (40μmol/L)、1μL BIP (40μmol/L)、1μL F3 (5μmol/L)、1μL B3 (5μmol/L)、12.5μL 2×Reaction Mix、1μL  Bst DNA Polymerase、5μL ddH₂O、2.5μL DNA。

反应结束后观察每套引物反应扩增曲线，并对各套引物进行特异性和敏感性实验。

（二）待验证菌株全基因组DNA抽提

1 菌株的复苏与培养

（1）各标准株的复苏与培养：取出－20℃保藏的隐球菌标准株及临床株，置于20℃下复苏24小时，使其恢复繁殖活力。在无菌条件下，分别将CBS10085、CBS10083、JEC20等10株隐球菌标准株及SCZ2等临床株转种到沙堡氏培养基（SDA）斜面培养基，30℃孵育培养48-72小时。

（2）临床分离菌株的培养和鉴定：临床标本来源菌株均来自于长征医院真菌检验室，经过SDA培养基或PDA培养基培养，念珠菌属转至科玛嘉培养基培养，通过培养观察培养基变色情况初步判断为热带念珠菌、近平滑念珠菌；丝状真菌通过镜检及培养等表型检测初步判断，所有隐球菌通过墨汁染色初步判断并转至咖啡酸培养基培养，观察是否产黑色素并对其进行DNA抽取和ITS测序鉴定至种。

2 氯化苄法抽提各标准菌株及部分临床隐球菌全基因组DNA

①EP管中加入500μL真菌DNA抽提液，从SDA培养基中挑取火柴头大小体积菌落，后剧烈震荡1min；

②在EP管中加入50μL 20%SDS和300μL氯化苄溶液，剧烈震荡，至溶液呈乳状，将EP管置于50℃水浴一小时，每十分钟震荡混合一次；

③水浴结束，加入300μL 3M NaAc（醋酸钠）冰水浴15分钟；

④将冰水浴后的EP管置于高速离心机中，选择6000rpm转速，15min后，小心吸出上清并转移至干净EP管中；

⑤在已转移出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，室温下沉淀20min，再次离心，转速为10000rpm，15min；

⑥取出EP管，小心弃上清，并在沉淀中加入等体积预冷的70%乙醇，再次10000rpm，10min离心；

⑦离心结束后，弃上清，小心将沉淀置于室温下风干，并50μL TE溶解。

将上述DNA置于－20℃冰箱冷藏保存。

3 分光分度计检测各菌株基因组DNA及其浓度

利用Eppendorf Biophotometer分光分度计，按操作手册操作检测基因组DNA的浓度。

（三） 特异性实验

1 将筛选出的各套引物分别与上述步骤已准备好的各标准菌株DNA及部分隐球菌临床株DNA按照LAMP体系，63℃，60min进行反应，观察分别的扩增反应情况。设立新生隐球菌H99 DNA作为阳性对照，双蒸水组作为阴性对照。

LAMP反应体系如下：总体积25μL，包括1μLFIP (40μmol/L)、1μLBIP (40μmol/L)、1μLF3 (5μmol/L)、1μLB3 (5μmol/L)、12.5μL 2×Reaction Mix、1μL  Bst DNA Polymerase、5μL ddH₂O、2.5μL DNA。

2  LAMP凝胶电泳检查

①用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12×6厘米的1.4%琼脂糖凝胶：在烧杯中加入1.4g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中，避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；

②在装有1×TAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，1mM EDTA)的电泳槽内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；

③每个PCR反应体系中抽取10μL，分别与5μL Ladder Buffer充分混合后上样于1.4%的琼脂凝胶；

④120伏电压电泳30min；

⑤将琼脂凝胶浸入EB溶液15min；

⑥小心取出后浸入双蒸水中10min；

⑦取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照。

3  LAMP可见性实验

重复上述特异性实验，在LAMP管中依次加入F3、B3、FIP、BIP引物及缓冲液，链置换DNA聚合酶等，依次加入新生隐球菌和格特隐球菌八个基因型以及其他种属的标准株或临床标本中分离出的菌株，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入1μL钙黄绿素以指示实验结果。63℃，60min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。

（四）敏感性实验

1 扩增曲线

将新生隐球菌H99全基因组DNA浓度分别十倍梯级稀释数次，使DNA含量分别为20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、2pg、0.2pg、0.02pg、2fg、0.2fg、0.02fg、0.002fg。将上述不同浓度梯度的DNA分别按照LAMP体系，63℃，60min反应，结束后观察扩增情况。设立不含DNA组为阴性对照。

2  LAMP可见性实验

重复上述步骤，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入1μL钙黄绿素以指示实验结果。63℃，60min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。

3 比对传统PCR扩增的敏感性差异

分别将上述浓度梯度的DNA用IGS1F/IGS1R引物通过传统PCR方法扩增，比较两者敏感性差异。用IGS1F/IGS1R引物PCR扩增隐球菌IGS1基因的反应体系为：总体积50μL，包含3μLDNA(20ng)、25μL 2×pfu PCR MasterMix、2μL ITS5 (5μmol/L)、2μL ITS4 (5μmol/L)、2μL MgCl₂(25μmol/L)、16μL ddH₂O； PCR反应条件为：

4  LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳检查

①用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12×6厘米的1.4％琼脂糖凝胶：在烧杯中加入1.4g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中，避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；

②在装有1×TAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，1mM EDTA)的电泳槽内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；

③每个PCR反应体系中抽取5μL，分别与1μL Ladder Buffer充分混合后上样于1.4%的琼脂凝胶；

④120伏电压电泳30min；

⑤将琼脂凝胶浸入EB溶液15min；

⑥小心取出后浸入双蒸水中10min；

⑦取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照，比较两种扩增方法对不同浓度DNA扩增效率差异。

三、实验结果

（一）引物验证及筛选

四套引物和阳性对照、阴性对照样本扩增曲线如图2所示。结果表明：（1）根据IGS1序列设计出的四套引物均可以引起扩增反应，其中IGS-2套引物引起扩增反应时间起始较晚，在60min以后，从反应速率看，IGS-4最快，在35min时刻即可开始扩增反应。其次为IGS-3引物引起的扩增反应起始于40min。（2）据IGS1序列设计出的四套引物自身均不会引起扩增反应。

（二）特异性实验

1 将筛选出的各套引物分别与各标准菌株DNA及部分隐球菌临床株DNA按照LAMP体系进行反应，观察分别的扩增反应情况。四套引物的新生隐球菌和格特隐球菌各基因型及其他标准菌株及部分临床来源菌株LAMP反应结果相同，具体如下表1、2所示。

表1  LAMP实验用标准菌株及其LMAP反应结果

注：*Y表示阳性反应，N表示阴性反应。

表2  临床菌株及其来源以及LAMP反应结果

注：1)SCZ为来源于长征医院皮肤科门诊患者或其他科室送至我科真菌检查室标本；2)SHCZ为上述第一部分实验中来源于隐脑患者中分离得到的菌株。

2针对第三套引物，新生隐球菌和格特隐球菌八个基因型和部分标准菌株凝胶电泳结果如图3所示。由此可知：基于新生隐球菌H99菌株的IGS1序列设计的第三套引物在LAMP反应体系具有良好的特异性，除了包含新生隐球菌和格特隐球菌八个基因型的菌株均出现阳性结果外，其他菌株包括劳伦特隐球菌、浅白隐球菌、浅黄隐球菌、土生隐球菌、指甲隐球菌、瘦弱隐球菌、斯金纳隐球菌、念珠菌属中的白念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌等均未出现扩增反应，且隐球菌临床分离株也均出现阳性扩增反应。使用第一套、第二套和第四套引物的新生隐球菌和格特隐球菌八个基因型和部分标准菌株凝胶电泳实验呈现相同的结果。初步验证了基于IGS1序列设计的LAMP反应具有较好的特异性。

3 可见性实验

针对第三套引物，LAMP反应后各管浊度表现结果见图4。第一套、第二套和第四套引物的可见性实验结果趋势与此相同。根据扩增反应结束后LAMP管浊度的变化可以初步判断是否发生了扩增，如发生扩增，则表示该反应管内含有目的基因，反之，如反应管清亮则表示无监测的目的基因，为未发生扩增反应。

（三） 敏感性实验

1 扩增曲线

针对第三套引物，不同浓度梯度的H99 DNA与引物反应后扩增曲线如图5所示。由图5的扩增曲线可以看出，基于新生隐球菌H99的核糖体内基因间隔区IGS序列的LAMP敏感程度可以达到0.002fg（即10^-6ng）。针对第一套、第二套和第四套引物，从其扩增曲线得出基于新生隐球菌H99的核糖体内基因间隔区IGS序列的LAMP敏感程度均可以达到0.002fg。

2 可见性实验

针对第三套引物，不同浓度梯度的H99基因组DNA可见性实验反应结果如图6所示。第一套、第二套和第四套引物的可见性实验结果趋势与此相同。

3 与传统PCR扩增效率差异

使用第三套引物进行LAMP反应的LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳检查，比较两种扩增方法对不同浓度DNA扩增效率差异，结果如图7和图8所示。使用第一套、第二套、第四套引物分别进行LAMP反应的LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳的结果同样显示LAMP产物亮度明显超出常规PCR产物的亮度。表明使用本发明的引物检测隐球菌相比于常规PCR方法敏感程度显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国人民解放军第二军医大学

<120>  一种可早期诊断隐球菌感染的引物及其用途

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<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ctctaacatg ttgggtctcg g                                               21

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

cgcaacctac tacagtgaat gg                                              22

<210>  3

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

acccctccta gagtcatcca caccttggat gtaaggggct ttacg                     45

<210>  4

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ctgtgccagc caggctgata atagtatcaa tgacccaagc tgaaga                    46

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ggcttcctct agagacttgg at                                              22

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

gcaacctact acagtgaatg ga                                              22

<210>  7

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

gcacattctc agacccctcc tagaggggct ttacgcattc gc                        42

<210>  8

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tgtgccagcc aggctgataa tagatcaatg acccaagctg aagac                     45

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

ggacttgtac acagtctcat ca                                              22

<210>  10

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

atgcgacaca agcaccag                                                   18

<210>  11

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

tccgcaacct actacagtga atgggtcttc agcttgggtc attga                     45

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<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

tgcaattgag acacttacca ggccacgacc ataaaatcag tagcgt                    46

<210>  13

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

attcactgta gtaggttgcg g                                               21

<210>  14

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

caaggcgtct taccccaag                                                  19

<210>  15

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

tagcgtacac tgccaacttg cgggacttga aagttctctc tgca                      44

<210>  16

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

ttgggagctg gtgcttgtgt atatgcttct cttccatccg tc                        42

<210>  17

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg                                              22

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

tcctccgctt attgatatgc                                                 20

<210>  19

<211>  782

<212>  DNA

<213>  新生隐球菌grubii

<400>  19

gcccttgttc tatagatttg tctctaacat gttgggtctc ggggggcttc ctctagagac     60

ttggatgtaa ggggctttac gcattcgcat aacttatgaa gtgtggatga ctctaggagg    120

ggtctgagaa tgtgctgtgc cagccaggct gataatagtt taattgttag cttggacttg    180

tacacagtct catcagtctt cagcttgggt cattgatatt ctgtaagtca aaacttatcc    240

attcactgta gtaggttgcg gaggacttga aagttctctc tgcaattgag acacttacca    300

ggccatcgca agttggcagt gtacgctact gattttatgg tcgtggggga cttgggagct    360

ggtgcttgtg tcgcatgagg tagagttgat atggacggat ggaagagaag catatgtgta    420

tgtcgcgggg gacttggggt aagacgcctt gcggcaagta gagtcaacca gtagtgactt    480

cttttagtcg tgggggactt tggtaatggt agtgagccgg aataagggat ggataaatgt    540

agtatggatg gtgacagggg gagcagcaga gcgtacgcag tgggtatgta tatagttgaa    600

aagggatggg cagtagaatt ttgagaaatt aatgacctaa gggtgattct aataggcttg    660

tcaagaaaaa agttaagttg aatcaagctg ggtcaagcaa agtctagaaa agatttattg    720

tcaccaataa ttgcccaagt cgcggggggc ttgtcacttc tcttgctcat tgtgggtcca    780

gt                                                                   782

Claims (4)

1.一种可早期诊断隐球菌感染的引物，其特征在于，所述的引物对包含下列核苷酸序列中的任一种：

a）SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4所示的核苷酸序列；

b）SEQ NO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8所示的核苷酸序列；

c）SEQ NO.9、SEQ NO.10、SEQ NO.11、SEQ NO.12所示的核苷酸序列；

d）SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的引物在制备早期诊断隐球菌感染的试剂中的用途。

3.权利要求1所述的引物在制备检测样品中隐球菌存在的试剂中的用途。

4.权利要求1所述的引物的用途，其特征在于，用于从劳伦特隐球菌、浅白隐球菌、浅黄隐球菌、土生隐球菌、指甲隐球菌、瘦弱隐球菌、斯金纳隐球菌、念珠菌属中的白念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌、隐球菌各不同种菌中鉴别出隐球菌。

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