CN103866023A - 一种检测cyp2c19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种检测cyp2c19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因多态性检测技术领域，尤其涉及一种检测CYP2C19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法。针对现有技术中DNA微阵列芯片法检测CYP2C19基因多态性，耗费时间长，成本较高，使用不灵活的缺陷，本申请提供一种检测CYP2C19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法。本发明提供的测序引物包括CYP2C19*2测序引物，其3'端碱基序列包括：-ccactatcattgattatttc-3'；还包括：CYP2C19*3测序引物，其3'端碱基序列包括：-ttgtaagcaccccct-3'。本发明提供的试剂盒检测时间短，检测成本低，使用灵活，检测方法易于操作。

Description

一种检测CYP2C19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因多态性检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法检测CYP2C19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
不同个体对药物的反应、毒性和治疗效应存在着很大的差异，产生这种个体差异的原因有很多，其中药物代谢酶基因多态性可能是导致许多药物在治疗中出现药效和不良反应个体差异的一个原因。随着药物代谢基因组学研究的不断深入，不同个体等位基因多态性影响个体对药物反应的差异性研究成为国内外研究热点。
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶系是人体重要的药物代谢酶，其中CYP2C19作为CYP450超家族一种重要的同工酶，其酶缺陷在亚洲人群中高达15%-23%，最主要的基因多态性位点为CYP2C19*2和CYP2C19*3两型。这种基因多态性导致的酶缺陷型对于临床常用抗凝剂（氯吡格雷）、抗癫痫药物（丙戊酸和苯妥英钠等）、质子泵抑制剂（奥美拉唑、兰索拉唑等）和抗抑郁药（西酞普兰等）的作用有显著影响。其中，CYP2C19*2为CYP2C19基因第五外显子上第681位点碱基G>A多态性，此位点的单个碱基多态性产生了一个异常的拼接位点，使相应的cDNA第5外显子5’端的前40bp碱基（643-682bp）发生缺失，并改变了随后的mRNA阅读框架，密码子过早出现导致蛋白的合成过早终止，结果生成了一个缺陷的无功能酶蛋白。CYP2C19*3是位于CYP2C19基因第四外显子上第636位点碱基G>A多态性，此位点的单个碱基多态性使得该酶第212位色氨酸突变为终止密码子使得酶蛋白合成提前终止，生成了功能缺陷的酶蛋白，导致酶催化活性降低。这种突变型对于氯吡格雷代谢的主要影响是使得氯吡格雷的活性代谢产物减少，能有效与血小板膜表面ADP受体结合的成分含量下降，导致相当一部分纤维蛋白原与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合，血小板相互聚集，进而降低了氯吡格雷抗血小板作用。这两个SNP位点为个体化用药提供参考，当临床检测出携带有此多态性位点的患者，可根据实际情况在充分评估用药风险的情况下考虑增大药量或换用其他药物，实现个体化治疗。
焦磷酸测序技术是介于一代测序到二代测序之间的一种测序手段，它既摒弃了一代测序（如桑格法（sanger）测序等）操作耗时、繁琐、通量受局限的缺点，又避免了二代测序成本高、检测DNA结果信息量过大、结果分析复杂等的局限性。基于焦磷酸测序技术而研究开发的PyroMark Q24MDx系统具有操作简单、快速、灵敏度高、高通量等优点，在检测单核苷酸多态性（SNP）位点、甲基化突变等基因变异中具有明显的优势。
发明内容
针对现有技术中DNA微阵列芯片法检测CYP2C19基因多态性，耗费时间长，成本较高，使用不灵活的缺陷，本申请提供一种焦磷酸测序法检测CYP2C19基因多态性的测序引物、试剂盒及检测方法，该试剂盒检测时间短，检测成本低，使用灵活，检测方法易于操作。
为了达到上述目的，本申请采用下述技术方案：
本发明提供一种检测CYP2C19基因多态性的测序引物，所述测序引物包括CYP2C19*2测序引物，该CYP2C19*2测序引物的3'端碱基序列包括：-ccactatcattgattatttc-3'。
上述CYP2C19*2测序引物的5'端包括长度为0-40bp的碱基序列。进一步的，上述CYP2C19*2测序引物的5'端包括长度为0-30bp，0-20bp，0-10bp或0-5bp的碱基序列。进一步的，CYP2C19*2测序引物的碱基序列为：5'-ccactatcattgattatttc-3'。
进一步的，上述检测CYP2C19基因多态性的测序引物还包括：CYP2C19*3测序引物，该CYP2C19*3测序引物的3'端碱基序列包括：-ttgtaagcaccccct-3'。
上述CYP2C19*3测序引物的5'端包括长度为0-40bp的碱基序列。进一步的，上述测序引物的5'端包括长度为0-30bp，0-20bp，0-10bp或0-5bp的碱基序列。进一步的，CYP2C19*3测序引物的碱基序列为：5'-ttgtaagcaccccct-3'。
本发明还提供一种检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，所述试剂盒包括本发明提供的上述测序引物。
进一步的，上述检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒包括本发明提供的上述测序引物，还包括CYP2C19*2扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，
所述CYP2C19*2上游扩增引物的3'端碱基序列包括：
-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
所述CYP2C19*2下游扩增引物的3'端碱基序列包括：-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记。
上述CYP2C19*2扩增引物的5'端包括长度为0-40bp的碱基序列。进一步的，上述扩增引物的5'端包括长度为0-30bp，0-20bp，0-10bp或0-5bp的碱基序列。进一步的，所述CYP2C19*2上游扩增引物的碱基序列为：
5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'，
所述CYP2C19*2下游扩增引物的碱基序列为：
5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'。
进一步的，上述检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒还包括CYP2C19*3扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，所述CYP2C19*3上游扩增引物的3'端碱基序列包括：-ccctgtgatcccactttcat-3'；所述CYP2C19*3下游扩增引物的3'端碱基序列包括：-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记。
上述CYP2C19*3扩增引物的5'端包括长度为0-40bp的碱基序列。进一步的，上述扩增引物的5'端包括长度为0-30bp，0-20bp，0-10bp或0-5bp的碱基序列。进一步的，所述CYP2C19*3上游扩增引物的碱基序列为：
5'-ccctgtgatcccactttcat-3'，
所述CYP2C19*3下游扩增引物的碱基序列为：
5'-atgtacttcagggcttggtca-3'。
本发明还提供一种检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，所述试剂盒包括：
CYP2C19*2上游扩增引物：5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；如SEQ ID No.1所示。CYP2C19*2下游扩增引物：5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'，如SEQ ID No.2所示。所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5'-ccactatcattgattatttc-3'，如SEQ ID No.3所示。进一步的，所得扩增产物的长度为200bp。
进一步的，所述试剂盒还包括：
CYP2C19*3上游扩增引物：5'-ccctgtgatcccactttcat-3'；如SEQ ID No.4所示。
CYP2C19*3下游扩增引物：5'-atgtacttcagggcttggtca-3'，如SEQ ID No.5所示。
所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*3测序引物：5'-ttgtaagcaccccct-3'，如SEQ ID No.6所示。进一步的，所得扩增产物的长度为251bp。
上述引物未使用时建议干粉状态-20度保存，保存期为一年。开封后用无菌蒸馏水稀释为保存液-20度保存，保存期为三个月。使用时再稀释至工作液。
上游扩增引物、下游扩增引物、测序引物的保存液浓度为100μM；工作液浓度为10μM；扩增引物在PCR体系中浓度为0.2-0.4μM；测序时，1μl测序引物工作液加入24μl退火缓冲液中，配制得测序引物退火缓冲液。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液。所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成。所述PCR扩增引物包括上游扩增引物、下游扩增引物。上述试剂盒的测试方法按照下列步骤进行：提取DNA、PCR扩增、单链分离纯化、焦磷酸测序反应和测序结果分析。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒还包括DNA聚合酶（DNApolymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)和反应底物；
所述反应底物为腺苷5-磷酸硫酸(adenosine5′phosphosulfate，APS)和荧光素(luciferin)的混合物。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒还包括用于检测PCR产物的SNP位点的焦磷酸测序试剂盒。该焦磷酸测序试剂盒为PyroMark Gold Q24Reagents（Cat.no.:970802）。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂盒。该PCR扩增试剂盒为2XEasyTaq PCR SuperMix(Cat.no:AS111,北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司)。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒还包括用于提取DNA的试剂盒。该提取DNA的试剂盒为E.Z.N.A.Boold DNAKit(Omega,Cat.no.:D3392-02)。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述退火缓冲液是PyroMarkAnnealing Buffer（Cat.no:979009）。所述结合缓冲液是PyroMark Bindng Buffer（Cat.no:979006）。所述洗涤缓冲液是PyroMark Wash Buffer concentrate（Cat.no:979008）。所述变性缓冲液是PyroMark Denaturation Solution（Cat.no:979007）。所述磁珠是Streptavidin Sepharose High Performance(链霉亲和素琼脂糖凝胶-HP，GE health Care,Cat.no:71-5004-40AE)。所述链霉亲和素琼脂糖凝胶-HP（Streptavidin Sepharose High Performance）也称为链霉亲和素琼脂糖珠（Streptavidin Sepharose beads），简称磁珠（Beads）。
进一步的，上述试剂盒，它的特点是，所述试剂盒还包括测序引物退火缓冲液，所述缓冲液由下述组份组成：10μmol/l测序引物工作液1μl加入24μlAnnealing Buffer（Cat.no.：979009）中，得到0.4μmol/l测序引物退火缓冲液。
进一步的，所述CYP2C19*2扩增引物的反应条件：94℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，58.2℃60s，72℃60s，进行35个循环，72℃保持5min，最终保持在4℃，得到扩增产物。
进一步的，所述CYP2C19*3扩增引物的反应条件：95℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行35个循环，72℃保持10min，最终保持在4℃，得到扩增产物。
本发明还提供一种焦磷酸测序法检测CYP2C19*2基因多态性的检测方法，它的特点是，所述方法包括如下步骤：
1）DNA样品的收集与提取；
2）引物：
CYP2C19*2上游扩增引物：5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
CYP2C19*2下游扩增引物：5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5'-ccactatcattgattatttc-3'；
3）PCR扩增；
在PCR扩增体系中加入步骤1）中得到的DNA提取液，利用步骤2）中的上游扩增引物和下游扩增引物对CYP2C19*2片段进行扩增。可以采用PCR试剂盒：2XEasyTaq PCR SuperMix(Cat.no:AS111,TransGen Biotech)，按说明书要求配置PCR扩增体系。可以配置50μl PCR扩增体系。
PCR扩增条件：94℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，58.2℃60s，72℃60s，进行35个循环，72℃保持5min，最终保持在4℃，得到扩增产物；
4）焦磷酸测序；
5）测序结果分析。
上述步骤4）焦磷酸测序中，向焦磷酸测序仪中输入的序列为：
CCYGGAACCCATAACAAATTACT，如SEQ ID No.7所示。
进一步的，上述步骤2）中的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。CYP2C19*2上游扩增引物加43μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液；工作液浓度为10μM，PCR体系中浓度为0.2-0.4μM。CYP2C19*2下游扩增引物加52μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液。CYP2C19*2测序引物加54μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液。
本发明还提供一种焦磷酸测序法检测CYP2C19*3基因多态性的检测方法，它的特点是，所述方法包括如下步骤：
1）DNA样品的收集与提取；
2）引物：
CYP2C19*3上游扩增引物：5'-ccctgtgatcccactttcat-3'；
CYP2C19*3下游扩增引物：5'-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*3测序引物：5'-ttgtaagcaccccct-3'；
3）PCR扩增；
在PCR扩增体系中加入步骤1）中得到的DNA提取液，利用步骤2）中的上游扩增引物和下游扩增引物对CYP2C19*3片段进行扩增。可以采用PCR试剂盒：2XEasyTaq PCR SuperMix(Cat.no:AS111,TransGen Biotech)，按说明书要求配置PCR扩增体系。可以配置50μl PCR扩增体系。
反应条件：95℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行35个循环，72℃保持10min，最终保持在4℃，得到扩增产物；
4）焦磷酸测序；
5）测序结果分析。
上述步骤4）焦磷酸测序中，向焦磷酸测序仪中输入的序列为：
GYATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGC，如SEQ ID No.8所示。
进一步的，上述步骤2）中的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。CYP2C19*3上游扩增引物加59μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液。CYP2C19*3下游扩增引物加50μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液。CYP2C19*3测序引物加75μl无菌蒸馏水至浓度为100μM作为保存液。
上述的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2或CYP2C19*3基因多态性的检测方法，其中，所述步骤4）焦磷酸测序包括如下步骤：
（1）测序引物退火缓冲液的配制将测序引物工作液加入Annealing Buffer中，得到0.4μmol/l测序引物退火缓冲液；
（2）将得到的PCR扩增产物加入结合缓冲液和含有链霉亲和素的磁珠，在常温下剧烈震荡10min，使得亲和素包被的Beads与生物素标记的单链充分结合；然后将扩增产物分别在体积比为70%的乙醇洗涤5秒、变性缓冲液中变性5秒，洗涤缓冲液中洗涤10秒，上述扩增产物变为单链DNA模板，再将所述单链DNA模板转入含有测序引物的退火缓冲溶液中，在80℃杂交2min，室温静置5min冷却。
（3）测序
准备好焦磷酸测序反应所用的酶混合物，底物混合物及dNTP，加入试剂舱，将步骤（2）中所得的产物放入焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序反应。
（4）检测结果分析
进一步的，上述步骤4）焦磷酸测序包括如下步骤：
（1）测序引物退火缓冲液的配制将10μmol/l测序引物工作液1μl加入24μlAnnealing Buffer（Cat.no.：979009）中，得到0.4μmol/l测序引物退火缓冲液；测序板上每个孔加入测序引物退火缓冲液25μl。
（2）配置单链DNA分离液2μlBeads+40μl Binding Buffer（Cat.no.：979006），加高纯水18μl配置成60μl单链DNA分离液。
（3）PCR产物固定每个PCR样本20μl加入60μl单链DNA分离液，在常温下剧烈震荡10min，使得亲和素包被的Beads与生物素标记的单链充分结合。（4）单链DNA模板的制备在真空工作站中，1号位加入70%（体积比）乙醇50ml，2号位加入Denaturation Buffer（变性缓冲液）40ml，3号位加入WashingBuffer（洗涤缓冲液）50ml，4号位加入高纯水50ml，5号位加入高纯水70ml；打开真空泵，将真空工具在高纯水中清洗15s，移动到PCR板吸附Beads15s，将扩增产物依次在1号位、2号位、3号位清洗5s、5s、10s；扩增产物变为单链DNA模板。
（5）引物杂交将真空工具箱的真空阀关闭，将步骤（4）得到的单链DNA模板放入含有测序引物的退火缓冲液中，充分摇动释放Beads，在80℃杂交2min，室温静置5min冷却。
（6）测序将步骤（5）得到的产物（与测序引物杂交后的单链DNA模板）加入到德国Qiagen公司焦磷酸测序仪PyroMark Q24MDx，利用PyroMark GoldQ24Reagents（Cat.no.:970802），按仪器和试剂说明书进行PCR产物的SNP位点的焦磷酸测序；质控采用Qiagen公司PyroMark Q24ControlOligo(cat.no:979203)。
本申请中的引物使用注意事项如下：
1.以高浓度的保存液保存，使用时再配成工作液；
2.实验过程中相关实验材料应进行高压灭菌以防止污染（包括实验中用到的蒸馏水），PCR需有相应阴性对照；
3.有生物素标记的引物应采取HPLC纯化方式，无标记的引物可采取HAP纯化方式。
焦磷酸测序法与DNA微阵列芯片法对比，主要具有下述优势：
1、检测时间
每一个样本检测时间取决于检测样本量以及仪器的最大通量。按照每检测一批样本为24个计算，由于前期提取DNA以及PCR的过程耗时相同，对比两者时不考虑。将扩增后的产物进行焦磷酸测序得到结果需要约半个小时，而基因芯片杂交需要约3小时。焦磷酸测序所需时间明显低于基因芯片杂交需要的时间，更有利于临床及时得到检验结果，同时也减轻操作者的负担。
2、检测成本
每一个样本检测成本根据使用的试剂与耗材的成本的和来计算，焦磷酸测序检测每个样本CYP2C19*2或CYP2C19*3单个位点所需成本为40元，检测CYP2C19*2和CYP2C19*3两个位点所需成本为80元，基因芯片杂交测序需要394元。基因芯片法成本比焦磷酸测序高近四倍，可见焦磷酸测序法相对成本较低。
3、结果判读
在临床检测实际应用中，焦磷酸测序目前只能一次测出一个位点而基因芯片杂交可根据不同组合将相应探针包被在同一个玻片上实现同时读取结果。然而，基因芯片法需要通过发光对应的不同位置来判断碱基序列，焦磷酸测序则直接读取序列的碱基类型。故基因芯片法结果读取比焦磷酸测序法更方便，但是焦磷酸测序法比基因芯片法的结果更直观。
4、使用灵活性
焦磷酸测序法和基因芯片法最大通量均为24个标本，且通量较灵活，可检测1-24个任意样本。在应用灵活性上，焦磷酸测序法能检测出目的碱基附近数十个碱基序列，可以了解基因其他位置碱基的信息，有利于自由组合项目和发现新的有意义的基因序列的变化。基因芯片法根据已知信息将固定的探针包被在玻片上，所以只能检测固定的目的碱基变化情况，不能获取其他基因信息。故比较而言，焦磷酸检测比基因芯片杂交法更灵活，同时更加有利于在临床发现更多基因序列方面的问题和提供科研思路。
本发明提供的CYP2C19基因多态性的测序引物可用于焦磷酸测序法检测CYP2C19基因多态性。
与现有基因芯片杂交法测序相比，本申请提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法所需时间短，成本低，结果更直观，检测更灵活，更有助于发现基因序列的新问题。以sanger测序法作为参考方法，本申请提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2基因和CYP2C19*3基因多态性的检测方法的准确率为100%。
附图说明
图1为用实施例1所提供的试剂盒检测第C4号DNA标本的CYP2C19*2基因多态性的结果图；
图2为用实施例1所提供的试剂盒检测第A6号DNA标本的CYP2C19*2基因多态性的结果图；
图3为用实施例2所提供的试剂盒检测另一批次的第A6号DNA标本的CYP2C19*2基因多态性的结果图；
图4为用实施例2所提供的试剂盒检测第C4号DNA标本的CYP2C19*3基因多态性的结果图；
图5为用实施例2所提供的试剂盒检测第A6号DNA标本的CYP2C19*3基因多态性的结果图；
图6A为CYP2C19*2扩增片段电泳图；
图6B为CYP2C19*3扩增片段电泳图；
图7A为CYP2C19*2未突变的焦磷酸检测结果图；
图7B为图7A相同样本的CYP2C19*2未突变的sanger测序结果图；
图8A为CYP2C19*2发生突变的焦磷酸检测结果图；
图8B为图8A相同样本的CYP2C19*2发生突变的sanger测序结果图；
图9A为CYP2C19*2发生突变的焦磷酸检测结果图；
图9B为图9A相同样本的CYP2C19*2发生突变的sanger测序结果图；
图10A为CYP2C19*3未突变的焦磷酸检测结果图；
图10B为图10A相同样本的CYP2C19*3未突变的sanger测序结果图；
图11A为CYP2C19*3发生突变的焦磷酸检测结果图；
图11B为图11A相同样本的CYP2C19*3发生突变的sanger测序结果图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2基因多态性的试剂盒，包括下述试剂：
CYP2C19*2上游扩增引物：5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
CYP2C19*2下游扩增引物：5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5'-ccactatcattgattatttc-3'；
E.Z.N.A.Boold DNA Kit(Omega,Cat.no.:D3392-02)；
2XEasyTaq PCR SuperMix(Cat.no:AS111,北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司)；
PyroMark Gold Q24Reagents（Cat.no.:970802）；
PyroMark Annealing Buffer（Cat.no:979009）；
PyroMark Bindng Buffer（Cat.no:979006）；
PyroMark Wash Buffer concentrate（Cat.no:979008）；
PyroMark Denaturation Solution（Cat.no:979007）；
Streptavidin Sepharose High Performance(链霉亲和素琼脂糖凝胶-HP，GEhealth Care,Cat.no:71-5004-40AE)。
实施例2
本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的试剂盒，包括下述试剂：
CYP2C19*2上游扩增引物：5’-ccagagcttggcatattgtatcta-3’；
CYP2C19*2下游扩增引物：5’-gtccatcgattcttggtgttct-3’，所述下游扩增引物进行5’端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5’-ccactatcattgattatttc-3’；
该试剂盒还包括：
CYP2C19*3上游扩增引物：5'-ccctgtgatcccactttcat-3'；
CYP2C19*3下游扩增引物：5'-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*3测序引物：5'-ttgtaagcaccccct-3'；
E.Z.N.A.Boold DNA Kit(Omega,Cat.no.:D3392-02)；
2XeasyTaq PCR SuperMix(Cat.no:AS111,北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司)；
PyroMark Gold Q24Reagents（Cat.no.:970802）；
PyroMark Annealing Buffer（Cat.no:979009）；
PyroMark Bindng Buffer（Cat.no:979006）；
PyroMark Wash Buffer concentrate（Cat.no:979008）；
PyroMark Denaturation Solution（Cat.no:979007）；
Streptavidin Sepharose High Performance(链霉亲和素琼脂糖凝胶-HP，GEhealth Care,Cat.no:71-5004-40AE)。
实施例3
采用本发明实施例1提供的试剂盒检测CYP2C19*2基因多态性的检测方法。
1.材料和方法
1.1研究对象
96例来自北京天坛医院住院处送检的彼此无亲缘关系的EDTA抗凝血样本。血样常温保存，采集后4小时内完成DNA的提取。患者均签署了知情同意书。将96例标本分成4批，每批24个标本。每批24个标本排成4×6的阵列，分别标为A1至A6，B1至B6，C1至C6，D1至D6。
1.2主要仪器设备
高速离心机（美国sigma公司）；聚合酶链式反应（PCR）仪（美国thermal公司）；焦磷酸测序仪（PyroMark Q24MDx，德国Qiagen公司）；全自动杂交仪（上海百傲科技有限公司）。
1.3主要试剂
实施例1提供的试剂盒中的试剂。
1.4将扩增产物5μl和6×loding buffer（上样缓冲液）1μl混匀，在2%琼脂糖凝胶电泳，获得清晰的扩增产物，大小为200bp。如图6A所示。
1.5焦磷酸测序
（1）引物。具体引物序列见表1。
（2）测序引物退火缓冲液的配制将10μmol/l测序引物工作液1μl加入24μlAnnealing Buffer中，得到0.4μmol/l测序引物退火缓冲液25μl。测序板上每个孔加入测序引物退火缓冲液25μl。
（3）配置单链DNA分离液2μlBeads+40μl结合缓冲液（Binding Bμffer），加高纯水18μl配置成60μl单链DNA分离液。
（4）PCR产物固定每个PCR扩增产物20μl加入60μl单链DNA分离液，在常温下剧烈震荡10min，使得亲和素包被的Beads与生物素标记的单链充分结合。
（5）单链DNA模板的制备在真空工作站中，1号位加入70%乙醇50ml，2号位加入变性缓冲液（Denaturation Buffer）40ml，3号位加入Washing Buffer50ml，4号位加入高纯水50ml，5号位加入高纯水70ml。打开真空泵，将真空工具在5号位清洗15s，移动到PCR板吸附Beads15s，将扩增产物依次在1号位、2号位、3号位清洗5s、5s、10s。上述扩增产物变为单链DNA模板。
（6）引物杂交将真空工具箱的真空阀关闭，将单链DNA模板放入检测板的含测序引物的退火缓冲液中，充分摇动释放Beads，在80℃杂交2min，室温静置5min冷却。
（7）测序使用德国Qiagen公司焦磷酸测序仪PyroMark Q24MDx和PyroMarkGold Q24Reagents（Cat.no.:970802），按仪器和PyroMark Gold Q24Reagents说明书进行PCR产物的SNP位点的焦磷酸测序。质控采用Qiagen公司PyroMarkQ24Control Oligo(cat.no:979203)。
向焦磷酸测序仪PyroMark Q24MDx输入的序列为：
CCYGGAACCCATAACAAATTACT
表1.检测CYP2C19*2基因多态性的焦磷酸测序引物序列
引物 序列' 修饰 产物长度
CYP2C19*2上游引物 5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3' 无
CYP2C19*2下游引物 5'-gtccatcgattcttggtgttct-3' 5'端生物素标记 200bp
CYP2C19*2测序引物 5'-ccactatcattgattatttc-3' 无
1.6sanger测序
由北京迈奥德恩生物科技有限公司使用ABI3730xl测序仪测序。
2.结果
表2.焦磷酸测序法与sanger测序法检测CYP2C19*2结果比较
Figure BDA0000476914990000151
以sanger测序作参照方法评价焦磷酸测序法检测CYP2C19*2基因多态性,
敏感性：53/53=100%
特异性：43/43=100%
符合率：（53+43）/(53+0+43+0)=100%
实施例4
采用本发明实施例2提供的试剂盒检测CYP2C19*3基因多态性的检测方法。
1.材料和方法
1.1研究对象
96例来自北京天坛医院住院处送检的彼此无亲缘关系的EDTA抗凝血样本。血样常温保存，采集后4小时内完成DNA的提取。患者均签署了知情同意书。
1.2主要仪器设备
高速离心机（美国sigma公司）；聚合酶链式反应（PCR）仪（美国thermal公司）；焦磷酸测序仪（PyroMark Q24MDx，德国Qiagen公司）；全自动杂交仪（上海百傲科技有限公司）。
1.3主要试剂
实施例2提供的试剂盒中的试剂。
1.4将扩增产物5μl和6×loding buffer1μl混匀，在2%琼脂糖凝胶电泳，获得清晰的扩增产物，大小为251bp。如图6B所示。
1.5焦磷酸测序
（1）引物。具体引物序列见表3。
（2）测序引物退火缓冲液的配制将10μmol/l测序引物工作液1μl加入24μlAnnealing Buffer中，得到0.4μmol/l测序引物退火缓冲液。测序板上每个孔加入测序引物退火缓冲液25μl。
（3）配置单链DNA分离液2μlBeads+40μl Binding Buffer，加高纯水18μl配置成60μl单链DNA分离液。
（4）PCR产物固定每个PCR扩增产物20μl加入60μl单链DNA分离液，在常温下剧烈震荡10min，使得亲和素包被的Beads与生物素标记的单链充分结合。
（5）单链DNA模板的制备在真空工作站中，1号位加入体积比为70%乙醇50ml，2号位加入变性缓冲液（Denaturation Buffer）40ml，3号位加入WashingBuffer50ml，4号位加入高纯水50ml，5号位加入高纯水70ml。打开真空泵，将真空工具在5号位清洗15s，移动到PCR板吸附Beads15s，将扩增产物依次在1号位、2号位、3号位清洗5s、5s、10s。
（6）引物杂交将真空工具箱的真空阀关闭，将单链DNA模板放入检测板的含有测序引物的退火缓冲液中，充分摇动释放Beads，在80℃杂交2min，室温静置5min冷却。
（7）测序使用德国Qiagen公司焦磷酸测序仪PyroMark Q24MDx和PyroMarkGold Q24Reagents（Cat.no.:970802），按仪器和PyroMark Gold Q24Reagents说明书进行PCR产物的SNP位点的焦磷酸测序。质控采用Qiagen公司PyroMarkQ24Control Oligo(cat.no:979203)。
向焦磷酸测序仪PyroMark Q24MDx输入的序列为：
GYATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGC
表3.检测CYP2C19*3基因多态性焦磷酸测序引物序列
引物 序列' 修饰 产物长度
CYP2C19*3上游引物 ccctgtgatcccactttcat 无
CYP2C19*3下游引物 atgtacttcagggcttggtca 5'端生物素标记 251bp
CYP2C19*3测序引物 ttgtaagcaccccct 无
1.6sanger测序
由北京迈奥德恩生物科技有限公司使用ABI3730xl测序仪测序。
2.结果
表4.焦磷酸测序法与sanger测序检测CYP2C19*3结果比较
Figure BDA0000476914990000171
以sanger测序作参照方法评价焦磷酸测序法检测CYP2C19*3基因多态性,
敏感性：17/17=100%
特异性：79/79=100%
符合率：（17+79）/(17+0+79+0)=100%
综上所述，以sanger测序作参考方法，本申请提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2、CYP2C19*3的敏感性、特异性、符合率均达到100%。
通过对上述实施例3和实施例4的检测结果进行分析，还得出下述结果：
突变类型分析
根据检测出的碱基序列判断突变类型（表5）：
表5.各种基因型对药物的代谢能力
Figure BDA0000476914990000181
表5中，CYP2C19*1/*1型为野生型，未发生突变。
本申请提供的焦磷酸测序法及sanger测序法分别检测96例标本结果见表6。
表6.二种方法检测结果
基因类型 代谢型 焦磷酸测序 sanger直接测序
CYP2C19*1/*1型 快代谢 33（34.4%） 33（34.4%）
CYP2C19*1/*2型 中间代谢 37（38.5%） 37（38.5%）
CYP2C19*1/*3型 中间代谢 10(10.4%) 10(10.4%)
CYP2C19*2/*2型 慢代谢 9(9.4%) 9(9.4%)
CYP2C19*3/*3型 慢代谢 0 0
CYP2C19*2/*3型 慢代谢 7(7.3%) 7(7.3%)
本发明的上述实验结果与国内外文献（K.-A.Kim，W.-K.Song，K.R.Kim，etal.Assessment of CYP2C19genetic polymorphisms in a Korean population using asimultaneous multiplex pyrosequencing method to simultaneously detect theCYP2C19*2,CYP2C19*3,and CYP2C19*17alleles[J].Journal of Clinical Pharmacy andTherapeutics,2010,35(6):697-703。PCR-Pyrosequencing快速检测药物代谢酶基因CYP2C19多态性方法的建立及应用[J].现代检验医学杂志，2012,27（1）：66-70。福建汉族氯吡格雷药物代谢相关基因CYP2C19的多态性分布研究[J].中华医学遗传学杂志,2012,29(4):420-425.）报道的数据基本一致，其中存在的一些差异，分析原因可能是由于标本数量不足、受试人群个体差异等原因导致，更准确的人群中CYP2C19多态性统计数据有赖于扩大检测标本数量。
下面结合图1至图11B，对本申请做进一步的说明。
图1利用实施例1提供的试剂盒，对一个DNA样品的检测结果，图1显示，该血样中的CYP2C19*2位点，有3%发生突变，有97%未发生突变。表示该DNA样本为CYP2C19*2GG的纯合体。图1中的CYP2C19*2位点，其发生突变的位点显示的数值是3%，未发生突变的位点显示的数值是97%。97%非常接近100%，3%非常接近0，这表示本发明提供的试剂盒及检测方法的检测精度非常高。
图2是利用实施例1提供的试剂盒，对DNA样品的检测结果，图2显示，该DNA样品中的CYP2C19*2位点，有51%发生突变，有49%未发生突变。表示该DNA样本为CYP2C19*2GA的杂合体。图2中的CYP2C19*2位点，其发生突变的位点显示的数值是51%，未发生突变的位点显示的数值是49%。51%非常接近50%，49%非常接近50%，这表示本发明提供的试剂盒及检测方法的检测精度非常高。
图3是利用实施例2提供的试剂盒，对DNA样品的检测结果，图3中的CYP2C19*2位点，其发生突变的位点显示的数值是99%，未发生突变的位点显示的数值是1%。表示该DNA样本为CYP2C19*2AA的纯合体。99%非常接近100%，1%非常接近0，这表示本发明提供的试剂盒及检测方法的检测精度非常高。
图4是利用实施例2提供的试剂盒，对一个DNA样品的检测结果，图4显示，该血样中的CYP2C19*3位点，有1%发生突变，有99%未发生突变。表示该DNA样本为CYP2C19*3GG的纯合体。图4中的CYP2C19*3位点，其发生突变的位点显示的数值是1%，未发生突变的位点显示的数值是99%。99%非常接近100%，1%非常接近0，这表示本发明提供的试剂盒及检测方法的检测精度非常高。
图5是利用实施例2提供的试剂盒，对DNA样品的检测结果，图5显示，该DNA样品中的CYP2C19*3位点，有49%发生突变，有51%未发生突变。表示该DNA样本为CYP2C19*3GA的杂合体。图4中的CYP2C19*3位点，其发生突变的位点显示的数值是49%，未发生突变的位点显示的数值是51%。51%非常接近50%，49%非常接近50%，这表示本发明提供的试剂盒及检测方法的检测精度非常高。
由图1至图5可以得出，本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的试剂盒与检测方法，检测准确度非常高。
图6A为CYP2C19*2扩增片段电泳图；图6A中：1是marker，2是阴性对照，3-6是样品，CYP2C19*2扩增产物的大小为200bp。
图6B为CYP2C19*3扩增片段电泳图；图6B中：1是marker，2是阴性对照，3-6是样品，CYP2C19*3扩增产物的大小为251bp。
图7A是利用实施例1提供的试剂盒，对CYP2C19*2的检测结果，如图7A所示，该DNA样品为CYP2C19*2G/G纯合体。
图7B是利用sanger测序检测CYP2C19*2的检测结果，检测样品与图7A中的样品相同，如图7B所示，该DNA样品为CYP2C19*2G/G纯合体。
图8A是利用实施例1提供的试剂盒，对CYP2C19*2的检测结果，如图8A所示，该DNA样品为CYP2C19*2G/A杂合体。
图8B是利用sanger测序检测CYP2C19*2的检测结果，检测样品与图8A中的样品相同，如图8B所示，该DNA样品为CYP2C19*2G/A杂合体。
图9A是利用实施例2提供的试剂盒，对CYP2C19*2的检测结果，如图9A所示，该DNA样品为CYP2C19*2A/A纯合体。
图9B是利用sanger测序检测CYP2C19*2的检测结果，DNA样品与图9A中的DNA样品相同，如图9B所示，该DNA样品为CYP2C19*2A/A纯合体。
图10A是利用实施例2提供的试剂盒，对CYP2C19*3的检测结果，如图10A所示，该DNA样品为CYP2C19*3G/G纯合体。
图10B是利用sanger测序检测CYP2C19*3的检测结果，DNA样品与图10A中的DNA样品相同，如图10B所示，该DNA样品为CYP2C19*3G/G纯合体。
图11A是利用实施例2提供的试剂盒，对CYP2C19*3的检测结果，如图11A所示，该DNA样品为CYP2C19*3G/A杂合体。
图11B是利用sanger测序检测CYP2C19*3的检测结果，DNA样品与图11A中的DNA样品相同，如图11B所示，该DNA样品为CYP2C19*3G/A杂合体。
利用本申请的实施例1或实施例2提供的试剂盒检测了96例CYP2C19*2和CYP2C19*3两个基因多态性位点的变化情况。结果显示，以sanger测序法作为参考方法，本申请提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的检测方法的准确率为100%。
因此，与现有基因芯片杂交法测序相比，本申请提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的检测方法所需时间短，成本低，结果更直观，检测更灵活，更有助于发现基因序列的新问题。而且，本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性的试剂盒与检测方法，检测准确度非常高。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。
Figure IDA0000476915050000011
Figure IDA0000476915050000021
Figure IDA0000476915050000031

Claims (10)

1.一种检测CYP2C19基因多态性的测序引物，其特征在于，所述测序引物包括CYP2C19*2测序引物，该CYP2C19*2测序引物的3'端碱基序列包括：
-ccactatcattgattatttc-3'。
2.根据权利要求1所述检测CYP2C19基因多态性的测序引物，其特征在于，所述测序引物还包括：CYP2C19*3测序引物，该CYP2C19*3测序引物的3'端碱基序列包括：-ttgtaagcaccccct-3'。
3.一种检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的测序引物，还包括CYP2C19*2扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，
所述CYP2C19*2上游扩增引物的3'端碱基序列包括：
-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
所述CYP2C19*2下游扩增引物的3'端碱基序列包括：-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记。
4.一种检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的测序引物，还包括CYP2C19*2扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，
所述CYP2C19*2上游扩增引物的3'端碱基序列包括：
-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
所述CYP2C19*2下游扩增引物的3'端碱基序列包括：-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
所述试剂盒还包括CYP2C19*3扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，
所述CYP2C19*3上游扩增引物的3'端碱基序列包括：-ccctgtgatcccactttcat-3'；
所述CYP2C19*3下游扩增引物的3'端碱基序列包括：-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记。
5.根据权利要求3所述的检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
CYP2C19*2上游扩增引物：5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
CYP2C19*2下游扩增引物：5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5'-ccactatcattgattatttc-3'。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
CYP2C19*3上游扩增引物：5'-ccctgtgatcccactttcat-3'；
CYP2C19*3下游扩增引物：5'-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*3测序引物：5'-ttgtaagcaccccct-3'。
7.一种检测CYP2C19基因多态性的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的测序引物。
8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19*2扩增引物的反应条件：94℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，58.2℃60s，72℃60s，进行35个循环，72℃保持5min，最终保持在4℃，得到扩增产物；
所述CYP2C19*3扩增引物的反应条件：95℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行35个循环，72℃保持10min，最终保持在4℃，得到扩增产物。
9.一种焦磷酸测序法检测CYP2C19*2基因多态性的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）DNA样品的收集与提取；
2）引物：
CYP2C19*2上游扩增引物：5'-ccagagcttggcatattgtatcta-3'；
CYP2C19*2下游扩增引物：5'-gtccatcgattcttggtgttct-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*2测序引物：5'-ccactatcattgattatttc-3'；
3）PCR扩增；
配置PCR扩增体系，
反应条件：94℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，58.2℃60s，72℃60s，进行35个循环，72℃保持5min，最终保持在4℃，得到扩增产物；
4）焦磷酸测序；
5）测序结果分析。
10.一种焦磷酸测序法检测CYP2C19*3基因多态性的检测方法，其特征在于，1）DNA样品的收集与提取；
2）引物：
CYP2C19*3上游扩增引物：5'-ccctgtgatcccactttcat-3'；
CYP2C19*3下游扩增引物：5'-atgtacttcagggcttggtca-3'，所述下游扩增引物进行5'端生物素标记；
CYP2C19*3测序引物：5'-ttgtaagcaccccct-3'；
3）PCR扩增；
配置PCR扩增体系，
反应条件：95℃，5min预变性；然后依次在94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行35个循环，72℃保持10min，最终保持在4℃，得到扩增产物；
4）焦磷酸测序；
5）测序结果分析。
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