CN113373221A - 成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种成人Ph‑B‑ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于包括探针、缓冲液、杂交混合液、连接酶混合液，所述探针为13个，13个探针分别为IKZF1、EBF1、CDKN2A/B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX‑AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探针。本发明采用MLPA(P335)试剂盒，可以同时检测13个基因缺失，无需患者大量骨髓单个核细胞标本，避免患者身体受到损伤。本申请的MLPA(P335)试剂盒成本相对较低，技术难度低，测试时仪器要求低，应用标本量小，并且可以一次实验同时检测多例患者的13种基因的缺失及扩增情况，可以很好地协助临床对成人ALL患者预后的评价，指导治疗。概括：检测基因全面，意义大，方便，快捷，易操作，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及急性淋巴细胞白血病检测领域，尤其涉及成人 Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法。
背景技术
成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的预后明显差于儿童ALL，随着儿童特点治疗方案的应用，成人ALL的疗效有了明显改善。但是，尽管采用同样的方案治疗，有一部分成人ALL(包括低危组)患者，预后仍然较差。成人ALL预后相关因素的研究明显落后于成人急性髓系白血病(AML)，较常用的危险因素仍以传统的诊断时白细胞计数、诊断分型、年龄、细胞遗传学异常、微小残留病等为主；而分子学异常用于预后评估缺乏共识。国际上儿童ALL的研究越来越多聚焦于一些特殊基因的分子学异常，比如IKZF1基因缺失与较差的预后相关；近期Stanulla等发现，IKZF1缺失常伴有其他基因缺失(如： CDKN2A/2B,PAX5，PAR1等基因)，定义并分析了IKZF1PLUS基因异常的发生率、临床特点以及患者的生存分析，提出IKZF1PLUS基因异常与更低的EFS及更高的累计复发率相关，提示非常差的预后。我们前期曾应用PCR或者MLPA的方法分析我们诊疗中心收治的成人B-ALL患者IKZF1基因缺失的情况，并进行了预后分析，得出 IKZF1缺失同样预示预后较差。但IKZF1基因缺失发生率(不同方法学)、伴发的子学异常、预后意义(尤其是不同疾病亚型的预后意义)在不同的研究报告中仍不一致。
成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的预后首先要进行检测，目前能使用的检测手段很多，但是都存在很大缺点，如RNA-seq法检测成本高，技术难度大，大多数医院无法实现，并且费用高昂加重病人经济负担；用PCR的方法检测，无法实现同时检测13种基因的缺失，需要多次重复相关实验步骤，并且需要大量的病人骨髓单个核细胞标本，容易增加患者身体负担。
发明内容
根据以上技术问题，本发明提供一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于包括探针、缓冲液、杂交混合液、连接酶混合液，所述探针为13个，13个探针分别为IKZF1、EBF1、 CDKN2A、CDKN2B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、 CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探针。
一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于利用MLPA技术进行检测，其具体检测方法为：
一、标本采集及单个核细胞的分离并提取骨髓单个核细胞的DNA；
二、MLPA步骤：
(1)DNA变性：取5ul(20ng/ul)的样品，98℃处理5min，温度降到25℃暂停；
(2)探针与DNA的杂交：取出上述步骤的样品，降至室温，加入3ul 的杂交混合液，其中1.5ul SASLAS probemix、1.5ulMLPA缓冲液，然后升温至95℃，保持1分钟，在进行60℃温浴18h，得到杂交探针；
(3)进行杂交探针的连接：
A、PCR仪降到54℃，打开管盖；
B、加入32ul连接酶混合液，54℃温浴15分钟；
C、98℃加热5min灭火连接酶后20℃暂停，得到连接探针；
(4)进行连接探针的PCR扩增：
A、从PCR仪中取出样品，降至室温；
B、加入10ul PCR混合液；
C、PCR扩增，95℃-30s，60℃-30s，72℃-60s，35个循环后，72℃ -20min，15℃暂停；
(5)PCR产物的毛细管电泳：取0.5ul样品、0.5ulLIZ SIZE Standard、9ul Hi-DiTMFormamide进行操作。
(6)结果分析：所得结果通过Coffalyser软件进行半定量分析，了解目的基因的片段缺失或扩增情况。
所述32ul连接酶混合液为3ul ligase bufferA、3ul ligase buffer B、 25ulwater、1ul ligase-65。
所述PCR混合液为7.5ul water、2ul PCR Primer Mix、0.5ul SALSAPolymerse。
所述探针上具有荧光标记和通用引物，所述通用引物为IKZF1、 EBF1、CDKN2A/B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8。
所述试剂盒为MLPA(P335)试剂盒。
本发明的有益效果为：本发明采用MLPA(P335)试剂盒，可以同时检测13个基因缺失，无需患者大量骨髓单个核细胞标本，避免患者身体受到损伤。
本申请的MLPA(P335)试剂盒成本相对较低，技术难度低，测试时仪器要求低，应用标本量小，并且可以一次实验同时检测多例患者的13种基因的缺失及扩增情况，可以很好地协助临床对成人ALL患者预后的评价，指导治疗。概括：检测基因全面，意义大，方便，快捷，易操作，成本低。
已有多篇文章报道ALL基因拷贝数变异和预后的关系。IKZF1 基因拷贝数变异以及新定义的IKZF1plus在儿童B-ALL中提示预后差，成人B-ALL中多种基因的拷贝数变异情况及预后意义研究较少，争议也比较大。利用本方法得到的数据更准确，对成人B-ALL患者基因拷贝数缺失具有重要的预后意义，具有基因缺失的Ph-B-ALL患者整体预后差于无任何缺失的Ph-B-ALL患者。在Ph-B-ALL患者中IKZF1基因缺失整体预后偏差，但异基因干细胞移植可以改善这部分患者的预后。CDKN2A/B基因缺失在成人Ph-B-ALL患者的预后意义更为显著，且移植无法改善其总生存情况。具有I&C缺失的Ph-B-ALL患者预后可能较单独具有IKZF1以及CDKN2A/B的患者预后更差，将来可以扩大样本量进一步研究验证。在Ph+ALL中，基因缺失对预后的影响不明显。在Ph-B-ALL中，可以结合MRD及基因缺失情况对患者进行危险度再分组。
具体实施方式
实施例1
一、标本采集及单个核细胞的分离并提取骨髓单个核细胞的DNA
二、MLPA步骤：
(1)DNA变性：取5ul(20ng/ul)的样品，98℃处理5min，25℃暂停。
(2)探针与DNA的杂交：取出样品，降至室温，加入3ul的杂交混合液(1.5ul SASLASprobemix+1.5ulMLPA缓冲液)，95℃1分钟， 60℃温浴18h。
(3)杂交探针的连接：A，PCR仪降到54℃，打开管盖；B，加入 32ul连接酶混合液，54℃温浴15分钟；C，98℃加热5min灭火连接酶后20℃暂停(连接酶混合液：3ul ligasebufferA+3ul ligase buffer B+25ul water+1ul ligase-65)。
(4)连接探针的PCR扩增：A，从PCR仪中取出样品，降至室温； B，加入10ul PCR混合液；C，PCR扩增，95℃-30s，60℃-30s，72℃ -60s，35个循环后，72℃-20min，15℃暂停(PCR混合液：7.5ul water +2ul PCRPrimerMix)+0.5ul SALSAPolymerse)。
(5)PCR产物的毛细管电泳：0.5ul样品+0.5ulLIZ SIZE Standard +9ul Hi-DiTMFormamide。
(6)结果分析：所得结果通过Coffalyser软件进行半定量分析，了解目的基因的片段缺失或扩增情况。
实施例2
本申请采用MLPA方法对211例成人B-ALL患者进行了13种基因拷贝数变异的检测。结果发现，IKZF1、CDKN2A/B、PAX5基因缺失的发生比例较高，其中，IKZF1基因在Ph+B-ALL患者(65.9％)中发生率显著高于Ph阴性组(20.3％)；IKZF1PLUS的发生率为21.3％，明显高于Martin等人报道的儿童BCP-ALL中IKZF1PLUS的比例(6％)。 CDKN2A/B基因缺失的发生率仅次于IKZF1基因缺失，该基因缺失患者在Ph阴性组(39.7％)发生率明显高于Ph阳性组(24.7％)，46.8％的 CDKN2A/B缺失患者同时伴有IKZF1基因的缺失。文献报道儿童ALL 中CDKN2A/B缺失的发生率约18–39％，明显低于成人患者。
在Ph-B-ALL患者的预后分析中，具有基因缺失的患者预后明显较无任何基因缺失的患者差。IKZF1缺失是ALL中最常见的缺失基因，其预后意义争议较大，尤其是单独IKZF1缺失的预后意义各家报道不同。Dorge等认为IKZF1基因缺失对儿童B-ALL预后有重要影响，可以纳入儿童ALL预后分层体系中，定义为高危组。而Martin等的研究认为，IKZF1缺失的儿童B-ALL患者的预后虽然较无缺失患者差，总体OS还是较好的，所以它的预后意义是有限的。Zhang等对8个国内外关于成人B-ALL中IKZF1基因缺失预后的研究进行了meta分析，认为IKZF1基因缺失提示预后差，但是这种预后意义仅存在于 Ph-B-ALL患者中。本研究126例Ph-B-ALL患者的单因素预后分析中，仅在未移植组IKZF1缺失患者具有较差的OS(未移植组：3年OS： P＝0.033)，可以认为：具有IKZF1缺失的患者单纯依靠化疗治疗，预后并不理想；异基因造血干细胞移植可以改善这部分患者的预后。
本研究回顾性分析了2009.10to 2018.12期间就诊于中国医学科学院血液病医院白血病诊疗中心的211例B-ALL患者。211例患者均采用MICM模式进行诊断，其中男性118例，女性93例；中位年龄32(14-69)岁，大于35岁者96例，小于35岁者115例。初诊中位白细胞数22.1(0.57-481.2)ⅹ109/L，大于30ⅹ109/L者94例，小于 30ⅹ109/L者117例。Ph阳性患者85例，Ph阴性126例。低危组患者45例，高危患者166例
所有患者应用统一的治疗方案(ChiCTR-TNC-09000397)： VDC(L)P方案诱导，缓解后均接受早期强化治疗，晚期巩固治疗，及维持治疗。接受异基因造血干细胞移植(Allo-SCT)103例，其中 Ph+B-ALL患者50例、Ph-B-ALL患者53例；108例患者未移植，Ph+ B-ALL患者25例，Ph-B-ALL患者73例。172例患者可获得微小残留病(MRD)结果(诱导治疗后及治疗第3个月流式残留结果，以下 MRD均为流式残留病的结果)，其余患者因相应检测点未进行检测或后期于外院进行治疗、具体MRD情况不详。根据MRD结果分组: 第1及3个月时均为阴性即MRD阴性，诱导后或者3个月有一个点为阳性即定义为MRD阳性；72例为Ph阳性患者(48例MRD阴性， 24例MRD阳性)；100例为Ph阴性患者(62例MRD阴性，38例 MRD阳性)。
1.基因缺失
211例患者中有144例(68.2％)患者检测到基因缺失，67例 (31.8％)患者无任何基因缺失。有基因缺失的患者中，70例(70/85， 82.4％)为Ph+B-ALL，74例(74/126，58.7％)为Ph-B-ALL(P＜0.01)，其中77例患者行造血干细胞移植(Ph阳性组42例，Ph阴性组35 例)。无任何基因缺失组患者中，15例(15/85，17.6％)为Ph+B-ALL，52例(52/126，41.3％)为Ph-B-ALL，26例患者行造血干细胞移植 (Ph阳性组8例，Ph阴性组18例)。可获得MRD结果(基因缺失组116例，无缺失组56例)的患者中，基因缺失组MRD阴性者占 59.5％(69/116)，MRD阳性者40.5％(47/116)；无任何基因缺失组 MRD阴性者占73.2％(41/56)，MRD阳性者26.8％(15/56)。
1.1 IKZF1基因缺失
211例患者中有82例(38.9％)检测到IKZF1基因缺失。其中Ph+ B-ALL组患者(N＝56)缺失比例明显高于Ph-B-ALL组患者(N＝26) (65.9％VS 20.6％,P＜0.01)。48例具有IKZF1缺失的患者进行了造血干细胞移植，36例为Ph+B-ALL患者(36/56，64.3％)，12例为Ph-B-ALL患者(12/26，46.1％)。34例具有IKZF1缺失的患者未进行造血干细胞移植，20例为Ph+B-ALL，14例为Ph-B-ALL患者。66 例具有IKZF1缺失的患者可获得MRD结果，47例为Ph+B-ALL患者 (26例患者MRD阴性，21例患者MRD阳性)，19例为Ph-B-ALL 患者(10例患者MRD阴性，9例患者MRD阳性)。
1.1.1 IKZF1PLUS
Martin等在儿童B-ALL中将IKZF1缺失同时合并CDKN2A/B、 PAX5、PAR1中至少一种基因缺失、且无ERG基因缺失的患者定义为IKZF1PLUS。本研究211例中有45例(21.3％)患者符合IKZF1PLUS缺失(Ph+B-ALL26例；Ph-B-ALL19例)。具体缺失类型如下：IKZF1 缺失合并CDKN2A/B缺失者36例，其中单纯CDKN2A/B缺失的患者22例(Ph+B-ALL10例；Ph-B-ALL12例)；IKZF1缺失合并PAX5 缺失的患者22例，合并单纯PAX5缺失的患者共8例(Ph+B-ALL： 6例，Ph-B-ALL：2例)；IKZF1合并PAR1缺失4例，单独合并PAR1 者1例。IKZF1缺失同时合并CDKN2A/B及PAX5缺失者14例 (Ph+B-ALL：9例，Ph-B-ALL：5例)(Figure 1)。Ph阳性组患者 IKZF1PLUS缺失比例高于Ph阴性组患者(30.6％VS 14.8％,P＜0.01)。 45例IKZF1PLUS缺失患者中有23例(Ph+B-ALL：15例，Ph-B-ALL： 8例)进行了造血干细胞移植，22例(Ph+B-ALL：11例，Ph-B-ALL：11例)未进行移植。36例IKZF1PLUS缺失患者可以获得MRD结果， 21例患者MRD为阴性，15例患者为阳性。
1.2 CDKN2A/B基因缺失
211例B-ALL患者中有77例(36.5％)患者具有CDKN2A/B缺失，71例(33.6％)患者为CDKN2A缺失，60例(28.4％)患者具有CDKN2B缺失，同时具有两种基因缺失患者为54例(25.6％)。 CDKN2A/B缺失患者在Ph-B-ALL发生率(53/126，42.1％)明显高于 Ph+B-ALL(24/85，28.2％,P＝0.041)。40例CDKN2A/B缺失患者进行了造血干细胞移植，Ph阳性组13例(13/24，54.2％)，Ph阴性组 27例(27/53，50.9％)，37例CDKN2A/B缺失患者未进行造血干细胞移植(Ph阳性组11例，Ph阴性组26例)。62例CDKN2A/B缺失患者可获得MRD结果，有36例为MRD阴性(21例为Ph-B-ALL， 15例为Ph+B-ALL)，26例患者为MRD阳性(20例为Ph-B-ALL，6 例为Ph+B-ALL)。
211例患者中同时具有IKZF1及CDKN2A/B缺失的共36例(Ph 阳性者19例，Ph阴性者17例)，其中共有17例患者进行了造血干细胞移植(Ph阳性组11例，Ph阴性组6例)。
1.3 PAX5基因缺失
211例B-ALL中共有53例(25.1％，)患者检测到PAX5基因缺失，其中Ph阳性组23例(27.1％)，Ph阴性组30例(23.8％)(P＝0.549)。在不同Ph染色体及危险度分组中，PAX5的发生率无明显统计学差异。21例患者进行了造血干细胞移植(Ph+者：10例，Ph-者：11例)。
1.4其他基因缺失
211例B-ALL患者中，ETV6、BTG1、EBF1、RB1基因缺失比例分别为13.6％(21/213)、9.9％(21/213)，9.9％(17/213)，8％(29/213)。各个基因在不同分组中的发生率亦无明显差异。
2.基因缺失在B-ALL患者中的预后意义
2.1 Ph-B-ALL患者中基因缺失组3年OS与RFS明显差于无任何基因缺失组。
126例Ph-B-ALL患者中有52例无任何基因缺失(18例行造血干细胞移植，占34.6％)、74例具有基因缺失(35例行造血干细胞移植，占47.3％)。无任何基因缺失的患者预后明显好于有基因缺失的患者， 3年OS：60.7±7.5％VS 41.7±6.1％，P＝0.01；RFS：55.6±7.2％VS 37.3±5.8％,P＝0.025，中位生存时间：27.76(6.37-123.96)VS 20.44(0.53-105.79)月。异基因干细胞移植可以改善具有基因缺失患者的整体预后，无任何基因缺失(N＝17)和有基因缺失(N＝34)的移植患者3年OS分别为68.4±12.1％VS 51±9％，P＝0.197；RFS分别为53.5 ±12.3VS 42.78.8％,P＝0.559；中位生存时间：28.81(8.75-123.96) VS 23.92(8.84-104.21)月。未移植的患者中，无任何基因缺失(N＝34) 患者的3年OS及RFS均好于有基因缺失(N＝39)患者(OS:57.2± 9.3％VS 33.8±7.9％,P＝0.01,RFS:56.6±8.9％VS 42.7±.8％,P＝0.011)。
Ph+B-ALL中具有基因缺失患者70例，无任何基因缺失患者15 例，两组间未发现明显的生存差异。
2.2.Ph-B-ALL患者中,IKZF1基因缺失在非移植组患者中是预后差的标志。
Ph-B-ALL中IKZF1缺失患者3年OS及RFS与无IKZF1缺失患者无明显统计学差异(3年OS：40.2±10.9％VS 44±6.3％P＝0.402， RFS:35.7±9.9％VS 47.4±5.2％，P＝0.261，3年累计复发率：48.7± 1.45％VS 30.5±0.23％,P＝0.725)。
进一步根据患者是否接受异基因干细胞移植进行分析：未移植组，IKZF1缺失患者(N＝14)的3年OS和RFS显著差于无IKZF1 缺失的患者(N＝59)(OS:17.9±11％VS 49.1±17％，P＝0.033,RFS:21.4 ±11％VS 49.4±6.7％，P＝0.024，中位生存时间：13.73(0.53-64.53) VS 25.53(0.59-123.96))。移植组，IKZF1缺失(N＝12)和无IKZF1缺失(N＝41)患者总的生存及复发情况无明显差别(3年OS:72.2± 13.8％VS 52.4±8.4％，P＝0.32,3年RFS:54±15.4％VS 44.4±8.1％， P＝0.552)。
2.3 Ph-B-ALL患者中，CDKN2A/B缺失具有重要预后意义。
Ph-B-ALL中，CDKN2A/B缺失患者共53例(42.1％)，预后明显差于无CDKN2A/B缺失患者(N＝73)，3年OS:34.6±7％VS 60.5± 6.2％，P＝0.001,RFS:31±7％VS 52.3±6.1％,P＝0.017，中位生存期： 18.43(0.53-104.21)VS 28.22(2-123.96)月。另外，Ph-B-ALL中，无论 SR组或HR组，具有CDKN2A/B的患者预后均差于无CDKN2A/B 缺失患者(SR组：3年OS:46.3±12.3％VS 84.1±7.4％，P＝0.005, RFS:47.1±12.1％VS 69.8±8.9％，P＝0.166；HR组：3年OS:29.5± 8.2％VS 47.3±8.1％，P＝0.041,RFS:29.6±7.8％VS 42.4±7.7％， P＝0.061)。
移植未能提高具有CDKN2A/B缺失的Ph-B-ALL患者的OS与 RFS。移植组：有CDKN2A/B缺失(N＝27)患者VS无该基因缺失 (N＝26)的患者3年OS:36.8±10％VS 77.8±9％，P＝0.003,RFS:35.6 ±9.5％VS 57.6±10.5％，P＝0.115，中位生存：20.44(8.84-104.21)VS28.91(8.57-123.96)月；未移植组：有CDKN2A/B缺失(N＝26)患者 VS无该基因缺失(N＝47)的患者3年OS:32.6±9.6％VS 51.5±7.8％， P＝0.017,RFS:34.2±9.4％VS 49±7.6％,P＝0.033，中位生存时间： 13.73(0.53-81.84)VS 26.48(2-119.59)月。
Ph+ALL中，无论移植与否，患者的预后均未受到CDKN2A/B 基因缺失的影响。。
2.3.1在Ph-B-ALL中单独CDKN2A/B缺失比无CDKN2A/B缺失患者预后差
Ph-B-ALL中36例患者仅有CDKN2A/B缺失(无IKZF1缺失)，这些患者与其他无CDKN2A/B及IKZF1缺失的患者(N＝64)相比较，具有更差的OS及RFS(35.8±8.5％VS 58.6±6.7％，P＝0.02,RFS:39 ±8.5％VS 53±6.5％，P＝0.11，中位生存时间：18.89(0.59-104.21) VS 27.76(2-123.96)月)。
在SR和HR组的Ph-B-ALL中，均发现CDKN2A/B单独缺失患者较其他无缺失(同时无IKZF1缺失)患者预后差，但无统计学意义(SR组：3年OS：54.4％±7.8％VS 83.1％±15％，P＝0.044,RFS:54.5 ±15％VS 68±9.3％，P＝0.11；HR组：3年OS：28.8％±8.6％VS 42.8％±8.9％，P＝0.139,RFS:32.5±9.9％VS 43.4±8.4％，P＝0.101)。 Ph-B-ALL患者中，Allo-SCT未能显著改善此类缺失患者的预后(移植组有CDKN2A/B单独缺失患者(N＝21)VS无该基因缺失患者 (N＝20)：3年OS：35.4％±11％VS 70.5％±11.7％，P＝0.021,RFS:38.6 ±11.2％VS 52.5±11.9％，P＝0.444，中位生存时间：21.88(8.84-104.21) VS28.22(8.57-123.96)月；未移植组有CDKN2A/B单独缺失患者(N＝15) VS无该基因缺失患者(N＝44)：3年OS：17.9％±11％VS 53.3％±8％， P＝0.063,RFS:38.9±12.9％VS 53.2±7.8％，P＝0.101，中位生存时间： 21.88(0.59-81.84)VS 28.22(2-119.59)月)。
Ph+B-ALL患者中，无论移植与否，单独CDKN2A/B缺失对患者的预后无明显影响。
2.3.2在Ph-B-ALL患者中，CDKN2A/B&IKZF1同时缺失患者预后较差。
Ph-B-ALL中有17例患者CDKN2A/B&IKZF1(I&C)同时缺失，该组患者预后明显差于无两种缺失的患者(N＝64)，3年OS:34.3±11.8％VS 58.5±6.7％，P＝0.007,RFS:29.4±11.1％VS 52.3±6.5％， P＝0.029，因各亚组病例数较少，未再进行相关分析，将来可以继续扩大样本量进行亚组分析。
Ph阳性ALL患者中，19例I&C同时缺失患者与无该缺失患者的生存及复发情况未见明显差异。
2.4在Ph-B-ALL患者中，CDKN2A/B&IKZF1缺失、单独CDKN2A/B 缺失患者的预后均明显差于无任何缺失患者
在Ph-B-ALL中，依据无任何缺失患者(N＝52)、I&C(N＝17)以及 CDKN2A/2B Only(N＝36)基因缺失分组，我们比较了三组间的生存差异(因单独具有IKZF1缺失的病例数较少，未同时进行分析)。无任何基因缺失者预后明显好于具有I&C或单独CDKN2A/B基因缺失组患者，而I&C、CDKN2A/2B Only基因缺失组患者中生存无明显统计学差异(无任何基因缺失VS I&C VS CDKN2A/B Only:3年OS:60.7 ±7.5％VS 34.3±11.8VS 35.8±8.5，1VS 2，P＝0.004，1VS 3， P＝0.007，2VS 3，P＝0.573；RFS：55.6±7.2％VS 29.4±11.1VS 37.7 ±8.3，1VS 2，P＝0.017，1VS 3，P＝0.046，2VS3，P＝0.42)。其他基因缺失类型因数量较少，未进行相应比较。
Ph+B-ALL中相同分组之间未见明显生存差异。
2.4在Ph-B-ALL and Ph+B-ALL患者中，其他基因缺失的预后意义
对其他缺失基因进行了单因素预后分析，PAX5、ETV6、BTG1、 EBF1、RB1等基因缺失在Ph-B-ALL及Ph+B-ALL中均无明显的预后意义。
2.5基因缺失与MRD状态联合对预后影响的分析
2.5.1 MRD阳性的Ph-B-ALL患者中，具有CDKN2A/B缺失的患者预后更差
100例Ph-B-ALL患者可获得MRD结果，38例患者MRD阳性 (22例行造血干细胞移植，占57.9％)，62例患者MRD阴性(22例患者行造血干细胞移植，占35.5％)。MRD阳性的患者中，具有基因缺失的患者(N＝27)较无任何基因缺失患者(N＝11)预后有较差的趋势(3年OS:25±8.5％VS 63.6±13.5％，P＝0.105，RFS：22.2±8％VS 45.5±15％，P＝0.277，中位生存时间：15.64VS 19.35个月)，但是样本量较小，将来需要扩大样本进行结果验证。MRD阴性的Ph-B-ALL 患者中有无基因缺失对预后无明显影响。
38例MRD阳性的Ph-B-ALL患者中有19例合并CDKN2A/B缺失，9例合并IKZF1缺失，7例I&C同时缺失。依据不同的基因缺失情况对38例患者进行了单因素预后分析。结果显示，CDKN2A/B缺失患者(N＝20)与无CDKN2A/B缺失患者(包含IKZF1缺失患者， N＝18)相比，具有更差的OS(3年OS:13.3±8.1VS 60±11.8％， P＝0.007,RFS:15±8VS 44.4±11.7％,P＝0.113)。IKZF1缺失患者 (N＝16)与其他无IKZF1缺失(且不包含CDKN2A/B缺失的，N＝9)患者相比，OS有较差的倾向(3年OS:22.2±13.9VS 54.7± 12.9％,P＝0.118,RFS:11.1±10.5％VS 37.5±12.1％,P＝0.433)。
MRD阴性的62例Ph-B-ALL患者中，有21例患者具有 CDKN2A/B缺失，10例患者具有IKZF1缺失，6例患者具有I&C缺失。MRD阴性Ph-B-ALL患者中，按照有无基因缺失，或者是否进行造血干细胞移植亚组分析，IKZF1、CDKN2A/B等基因缺失均未见明显预后意义。
Ph+B-ALL患者中，72例可获得MRD结果，48例为MRD阴性， 24例为MRD阳性，各种基因缺失在MRD阴性及阳性的患者，以及各亚组分析中均未发现明显预后意义。
3.COX回归分析
COX回归多因素分析结果与单因素分析结果一致。Ph-B-ALL中，在调整了年龄、白细胞数、分层/移植等因素后，具有基因缺失较无任何基因缺失具有独立的预后意义，IKZF1缺失的Ph-B-ALL患者在低危组、未移植组均有独立预后意义。CDKN2A/B在整个Ph-B-ALLcohort，以及亚组分析中：低危组、高危组，移植组、未移植组均有独立的预后意义。I&C缺失患者在整个Ph-B-ALL cohort，以及亚组分析中：低危组、未移植组均有独立的预后意义。Ph+B-ALL中各种基因缺失均未发现独立预后意义。
讨论
已有多篇文章报道ALL基因拷贝数变异和预后的关系。IKZF1 基因拷贝数变异以及新定义的IKZF1plus在儿童B-ALL中提示预后差，成人B-ALL中多种基因的拷贝数变异情况及预后意义研究较少，争议也比较大。
我们采用MLPA方法对211例成人B-ALL患者进行了13种基因拷贝数变异的检测。结果发现，IKZF1、CDKN2A/B、PAX5基因缺失的发生比例较高，其中，IKZF1基因在Ph+B-ALL患者(65.9％)中发生率显著高于Ph阴性组(20.3％)；IKZF1PLUS的发生率为21.3％，明显高于Martin[1]等人报道的儿童BCP-ALL中IKZF1PLUS的比例(6％)。 CDKN2A/B基因缺失的发生率仅次于IKZF1基因缺失，该基因缺失患者在Ph阴性组(39.7％)发生率明显高于Ph阳性组(24.7％)，46.8％的 CDKN2A/B缺失患者同时伴有IKZF1基因的缺失。文献报道儿童ALL 中CDKN2A/B缺失的发生率约18–39％，明显低于成人患者。其得到的结果相对于现有技术更加精确。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本发明提到的各个部件为现有领域常见技术，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于包括探针、缓冲液、杂交混合液、连接酶混合液，所述探针为13个，13个探针分别为IKZF1、EBF1、CDKN2A、CDKN2B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探针。
2.一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于利用MLPA技术进行检测，其具体检测方法为：
一、标本采集及单个核细胞的分离并提取骨髓单个核细胞的DNA；二、MLPA步骤：
(1)DNA变性：取5ul(20ng/ul)的样品，98℃处理5min，温度降到25℃暂停；
(2)探针与DNA的杂交：取出上述步骤的样品，降至室温，加入3ul的杂交混合液，然后升温至95℃，保持1分钟，在进行60℃温浴18h，得到杂交探针；
(3)进行杂交探针的连接：
A、PCR仪降到54℃，打开管盖；
B、加入32ul连接酶混合液，54℃温浴15分钟；
C、98℃加热5min灭火连接酶后20℃暂停，得到连接探针；
(4)进行连接探针的PCR扩增：
A、从PCR仪中取出样品，降至室温；
B、加入10ul PCR混合液；
C、PCR扩增，95℃-30s，60℃-30s，72℃-60s，35个循环后，72℃-20min，15℃暂停；
(5)PCR产物的毛细管电泳：取0.5ul样品、0.5ulLIZ SIZE Standard、9ul Hi-DiTMFormamide进行操作。
(6)结果分析：所得结果通过Coffalyser软件进行半定量分析，了解目的基因的片段缺失或扩增情况。
3.按照权利要求2所述的一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于所述杂交混合液为1.5ul SASLAS probemix、1.5ulMLPA缓冲液。
4.按照权利要求2所述的一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于所述32ul连接酶混合液为3ul ligase bufferA、3ul ligase bufferB、25ul water、1ul ligase-65。
5.按照权利要求2所述的一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于所述PCR混合液为7.5ul water、2ul PCRPrimerMix、0.5ul SALSAPolymerse。
6.按照权利要求1所述的一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于所述探针上具有荧光标记和通用引物，所述通用引物为IKZF1、EBF1、CDKN2A、CDKN2B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8。
7.按照权利要求1所述的一种成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒为MLPA(P335)试剂盒。
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- 2021-05-26 CN CN202110580112.9A patent/CN113373221A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 房秋云;郝其姗;弓晓媛;等: "急性T淋巴细胞白血病患者NOTCH1/FBXW7基因突变与CDKN2A/B基因缺失的特点及对预后的影响", 《中华血液学杂志》 * |
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