JP2020137505A - Ikzf1遺伝子変異を検出するための核酸プローブセット及び当該プローブセットを用いたikzf1遺伝子変異の検出方法 - Google Patents
Ikzf1遺伝子変異を検出するための核酸プローブセット及び当該プローブセットを用いたikzf1遺伝子変異の検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(2)第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,345,365〜50,394,617番目の領域である、(1)に記載の核酸プローブセット。
(3)第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,346,304〜50,394,617番目の領域である、(1)に記載の核酸プローブセット。
(4)第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,364,601〜50,394,617番目の領域である、(1)に記載の核酸プローブセット。
(5)第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,307,800番目の塩基の5'上流側500kbp以内の領域内に又は50,416,749番目の塩基の3'下流側500kbp以内の領域内に存在する30kbp以上の長さの領域である、(1)〜(4)のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
(6)第2のヒトゲノム領域が、30kbp〜200kbpの長さの領域である、(1)〜(5)のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
(7)第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,436,268〜50,606,123番目の領域である、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
(8)第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,417,095〜50,447,237番目の領域である、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
(9)第1及び第2の核酸プローブが、互いに異なる波長の蛍光を発する蛍光物質で標識されている、(1)〜(8)のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
(10)1)ヒト骨髄又は血液由来の細胞の染色体に対して(9)に記載の核酸プローブセットを用いたハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程、
2)染色体上の第1及び第2の核酸プローブの蛍光を観察する観察工程、並びに
3)第1及び第2の核酸プローブの蛍光が隣接して又は混ざった色として観察されたときはIKZF1遺伝子は正常であると判定し、第1の核酸プローブの蛍光が観察されないときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が欠失していると判定し、第1及び第2の核酸プローブの蛍光が離隔して観察されたときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が転座していると判定する判定工程
を含む、ヒトゲノムにおけるIKZF1遺伝子のエクソン欠失又は転座を検出する方法。
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(cds:コーディング配列)
本発明における第1の核酸プローブは、ヒト第7染色体の50,345,203〜50,395,925番目までの領域内に存在する長さ30kbp以上の領域であるヒトゲノム領域(第1のヒトゲノム領域)に特異的にハイブリダイズする核酸プローブである。
上記第1の核酸プローブと共にセットを構成する第2の核酸プローブは、ヒト第7染色体の50,307,800番目の塩基の5'上流側の領域又は50,416,749番目の塩基の3'下流側の領域であるヒトゲノム領域(第2のヒトゲノム領域)に特異的にハイブリダイズする核酸プローブである。
本発明の第1及び第2の核酸プローブは、当該技術分野において既知の標識物質を用いて、特に互いに区別して検出可能となるように標識されることが好ましい。標識は、核酸プローブと標識物質とが直接的に結合することで、又は標識物質がリンカー等を介して核酸プローブに間接的に結合することでそれぞれ行われてもよい。また標識されたヌクレオチドモノマーを用いて核酸プローブを合成することで、核酸プローブ全体を標識してもよい。
第1の核酸プローブと第2の核酸プローブは、IKZF1遺伝子のエクソン欠失を検出するための核酸プローブセットとして使用される。用語「セット」は、核酸プローブがIKZF1遺伝子のエクソン欠失を検出するために組み合わせて使用されるものであることを意味し、両核酸プローブが1つにパッケージされている態様には必ずしも限定されない。両プローブは、適当な容器に別々に収納され、互いに独立して取り扱われてもよく、それら容器がパッケージングされて取り扱われてもよく、又は両核酸プローブは混合物の状態で取り扱われてもよい。また、核酸プローブセットは、IKZF1遺伝子のエクソン欠失を検出する方法に用いることができる緩衝液その他の試薬、試薬等を保存するための容器、スライドガラス等その他の器具等を含んでいてもよい。
本発明の別の態様は、
1)ヒト骨髄又は血液由来の細胞の染色体に対して蛍光物質で標識されている上述の核酸プローブセットを用いたハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程、
2)染色体上の第1及び第2の核酸プローブの蛍光を観察する観察工程、並びに
3)第1及び第2の核酸プローブの蛍光が隣接して又は混ざった色として観察されたときはIKZF1遺伝子は正常であると判定し、第1の核酸プローブの蛍光が観察されないときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が欠失していると判定し、第1及び第2の核酸プローブの蛍光が離隔して観察されたときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が転座していると判定する判定工程
を含む、ヒトゲノムにおけるIKZF1遺伝子のエクソン欠失又は転座を検出する方法に関する。
1)第1の核酸プローブの作製
IKZF1遺伝子の全長を含むヒトゲノムDNAを鋳型として、以下の5組のプライマーセット及びLongAmp Taq DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)を用いたPCRを行い、長さがそれぞれ9kbp〜10kbpである5種類の増幅産物を得た。プライマーセット1はヒト第7染色体の50,345,365〜50,354,571番目までの領域を、プライマーセット2はヒト第7染色体の50,354,550〜50,364,592番目までの領域を、プライマーセット3はヒト第7染色体の50,364,601〜50,374,563番目までの領域を、プライマーセット4はヒト第7染色体の50,374,695〜50,384,651番目までの領域を、プライマーセット5はヒト第7染色体の50,384,713〜50,394,617番目までの領域を増幅するためのプライマーセットである。
IKZF1ΔF00:5'-GAGATCATGGCAAATCAGAGG-3'(forward) 配列番号1
IKZF1ΔR00:5'-CGTACAGTACAAAGACTGCTGC-3'(reverse) 配列番号2
プライマーセット2
IKZF1ΔF0 :5'-GCAGCAGTCTTTGTACTGTACG-3'(forward) 配列番号3
IKZF1ΔR0 :5'-CCTCTTGCTTGTCATAAGAAGC-3'(reverse) 配列番号4
プライマーセット3
IKZF1ΔF1 :5'-AGAGGCAGGACTGTCTTCAG-3'(forward) 配列番号5
IKZF1ΔR1 :5'-CCTTCACAAGGACTCCATAAGG-3'(reverse) 配列番号6
プライマーセット4
IKZF1ΔF2 :5'-CTTGTCTGTCAGTGTTAGGCTG-3'(forward) 配列番号7
IKZF1ΔR2 :5'-GTACCACCTTTGTCTCCAGG-3'(reverse) 配列番号8
プライマーセット5
IKZF1ΔF3 :5'-CATGCTAACCAGTGGTCTAGG-3'(forward) 配列番号9
IKZF1ΔR3 :5'-GAGCCTCAGAATAGCTCTGG-3'(reverse) 配列番号10
BACPACリソースセンター(https://bacpacresources.org)から入手したBACクローン:RP11-248J17(ヒト第7染色体の50,436,268〜50,606,123番目までの領域を含む。)を標準的なプロトコルに従って培養し、PhasePrep BAC DNAキット(Sigma-Aldrich)を用いてBAC-DNAを抽出した。Green-dUTP(Abbot Molecular)の存在下でのニックトランスレーションによってBAC-DNAの断片化及びGreen-dUTPでの蛍光標識を行った。ニックトランスレーション後のSpectrum Green標識DNAフラグメントの混合物は、長さが概ね200bp〜1kbpであった。この混合物中のDNAフラグメントは、第7染色体の50,436,268〜50,606,123番目までの約170kbpの領域にハイブリダイズすることができ、第2の核酸プローブとして利用することができる。等量の上記1)の第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを混合した後、さらに超音波処理されたサケ精子DNA(Stratagene)及びcot-1 DNA(Invitrogen)と混合し、核酸プローブセット1とした。
BACPAC Resources Centerから入手したFosmidクローン:G248P800745C8(ヒト第7染色体の50,346,304〜50,387,146番目までの40,842bpの領域を含む。)を標準的なプロトコルに従って培養し、PhasePrep BAC DNA Kit(Sigma-Aldrich)を用いてfosmid-DNAを抽出した。
1)第1の核酸プローブ
IKZF1遺伝子の全長を含むヒトゲノムDNAを鋳型として、実施例1の1)のプライマーセット3〜5(IKZFΔF1+IKZFΔR1、IKZFΔF2+IKZFΔR2、IKZF1ΔF3+IKZFΔR3)及びLongAmp Taq DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)を用いたPCRを行い、3種類の増幅産物を得た。
IKZF1遺伝子の3'末端下流(第7染色体の50,417,095〜50,447,237番目までの領域)を含むヒトゲノムDNAを鋳型として、以下の3組のプライマーセット及びLongAmp Taq DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)を用いたPCRを行い、3種類の増幅産物を得た。プライマーセット6はヒト第7染色体の50,417,095〜50,427,216番目までの領域を、プライマーセット7はヒト第7染色体の50,427,403〜50,437,322番目までの領域を、プライマーセット8はヒト第7染色体の50,437,521〜50,447,237番目までの領域を増幅するためのプライマーセットである。
プライマーセット6
IKZF3'F1:5'-CCTTGTGAAAGCTGCTATTTCC-3'(forward) 配列番号11
IKZF3'R1:5'-TCCCAAATTCTACTGGCAGG-3'(reverse) 配列番号12
プライマーセット7
IKZF3'F2:5'-GCATGAAAGACAGATAGTGCC-3'(forward) 配列番号13
IKZF3'R2:5'-TGAGTTGTATGAACTGCTTCTGC-3'(reverse) 配列番号14
プライマーセット8
IKZF3'F3:5'-CACAATCAGAAAGGTGGGAG-3'(forward) 配列番号15
IKZF3'R3:5'-TTACTTCGCAATTACATCTGGC-3'(reverse) 配列番号16
北海道大学病院の倫理委員会の承認の下で、北海道大学病院で保存されていた白血病22症例のカルノア固定(Carnoy's fixed)骨髄液を被験試料として使用した。22症例(Unique Patient Number 1-22、UPN-1などと表す。)は、19症例の白血病(9例のフィラデルフィア(Ph)染色体陽性急性リンパ性白血病Ph+B-ALL、7例のPh染色体陰性急性リンパ性白血病Ph−B-ALL及び3例の慢性骨髄性白血病CML-LC)、並びにIKZF1欠失ネガティブコントロールとしての3例の急性骨髄性白血病AMLを含んでいた。また、カットオフを確立するためのネガティブコントロールとして、10例の正常末梢血試料を用意した。
スライドガラス上にIKZF1欠失ネガティブコントロール試料及びIKZF1遺伝子のエクソン欠失が生じていることが予め確認されたIKZF1欠失ポジティブコントロール試料(PALL2)をそれぞれ滴下して乾燥した後、核酸プローブセット1を実施例3で作製した核酸プローブセット3に代えた以外は実施例4と同様にして、ハイブリダイゼーション及び蛍光観察を行った。撮影した画像の代表例を図3に示す。核酸プローブセット3では、第1の核酸プローブは緑色に、第2の核酸プローブは赤色として観察される。
Claims (10)
- ヒト第7染色体の50,345,203〜50,395,925番目までの領域内に存在する長さ30kbp以上の領域である第1のヒトゲノム領域に特異的にハイブリダイズする第1の核酸プローブと、ヒト第7染色体の50,307,800番目の塩基の5'上流側の領域又は50,416,749番目の塩基の3'下流側の領域である第2のヒトゲノム領域に特異的にハイブリダイズする第2の核酸プローブとからなる、IKZF1遺伝子のエクソン欠失を検出するための核酸プローブセット。
- 第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,345,365〜50,394,617番目の領域である、請求項1に記載の核酸プローブセット。
- 第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,346,304〜50,394,617番目の領域である、請求項1に記載の核酸プローブセット。
- 第1のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,364,601〜50,394,617番目の領域である、請求項1に記載の核酸プローブセット。
- 第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,307,800番目の塩基の5'上流側500kbp以内の領域内に又は50,416,749番目の塩基の3'下流側500kbp以内の領域内に存在する30kbp以上の長さの領域である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
- 第2のヒトゲノム領域が、30kbp〜200kbpの長さの領域である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
- 第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,436,268〜50,606,123番目の領域である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
- 第2のヒトゲノム領域が、ヒト第7染色体の50,417,095〜50,447,237番目の領域である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
- 第1及び第2の核酸プローブが、互いに異なる波長の蛍光を発する蛍光物質で標識されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸プローブセット。
- 1)ヒト骨髄又は血液由来の細胞の染色体に対して請求項9に記載の核酸プローブセットを用いたハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程、
2)染色体上の第1及び第2の核酸プローブの蛍光を観察する観察工程、並びに
3)第1及び第2の核酸プローブの蛍光が隣接して又は混ざった色として観察されたときはIKZF1遺伝子は正常であると判定し、第1の核酸プローブの蛍光が観察されないときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が欠失していると判定し、第1及び第2の核酸プローブの蛍光が離隔して観察されたときはIKZF1遺伝子の少なくともエクソン4からエクソン7までの領域が転座していると判定する判定工程
を含む、ヒトゲノムにおけるIKZF1遺伝子のエクソン欠失又は転座を検出する方法。
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